CN109549215A - 一种驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，本发明首先将驴骨粉碎、脱脂处理，然后进行酶解，收集酶解液，再将酶解后的骨渣进行发酵处理，将发酵液与酶解液合并，经过滤、配液、灌装成驴骨胶原蛋白肽口服液。本发明方法将发酵技术与传统酶解制备骨胶原蛋白的方法相结合，提高了骨胶原蛋白肽的提取得率，保证了小分子肽的生物活性。制备的驴骨胶原蛋白肽口服液中同时含有不同类别的益生菌，提高了胶原蛋白肽的吸收利用率，同时起到调节肠胃健康的作用。本发明将驴骨胶原蛋白肽与益生菌有机结合，增加了产品的应用方向和价值，具有良好的市场前景。

Description

一种驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法
技术领域
本发明涉及骨胶原蛋白肽提取领域，尤其涉及一种驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法。
背景技术
我国是世界上养驴最多的国家，年存栏量约为1000万头，驴的性情温顺、耐受力强、寿命长、食量小，且集药、补、食三大功能于一体。驴肉中蛋白质含量高，脂肪含量较其它畜肉低，矿物质含量为1.1％左右，胆固醇含量较低，且有滋味清淡、鲜美、风味独特等特点而被作为餐桌上和休闲的美味佳肴；驴皮自古以来就有很高的药用价值，是制作“国药瑰宝”阿胶的主要原料；而驴骨跟驴皮含有同样的骨胶原蛋白肽类，故具有阿胶相同的补血养颜，调节肠胃、增强免疫力的功效，同时又因为它是骨类物质，故而还有强筋健骨、防治骨质疏松症等功效。
胶原蛋白肽之所以有很高的保健作用，是因为它是一种小分子的蛋白质，相比与普通胶原蛋白，它有更高的吸收率，食用胶原蛋白肽的吸收利用率可达100％，胶原蛋白肽可以被人体主动且无障碍吸收，供身体组织充分利用。胶原蛋白经人体充分的吸收利用后，将合成皮肤胶原，起到一定的美容作用，胶原蛋白的亲水性非常的好，可为皮肤提供诸多的美白、保湿、滋养的功效，从而达到改善肤质、美容的目的；胶原蛋白可促进骨的形成，增强低钙水平下的骨胶原结构，从而提高了骨强度，即达到了预防骨质疏松症的作用；胶原蛋白肽使筋骨保持柔软和弹性，强化它们在运动摩擦时的润滑度，降低关节炎发生率，可避免关节退化症；胶原蛋白能够改善焦虑、失眠状态，治疗神经衰弱；胶原蛋白有助于强化各组织器官功能，提升人体免疫力。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。益生菌有助于加快人体对胶原蛋白的体内代谢效率，能避免一部分人因使用胶原蛋白导致便秘的现象发生。
目前，动物骨胶原蛋白的提取主要是牛、羊、鸡、猪等，还没有对于驴骨胶原蛋白肽的提取方法的研究还处于空白。骨胶原蛋白的提取方法主要为二次酶解法，此方法步骤较为繁琐，用时较长，产物分子量分布范围较广，不集中，胶原蛋白肽的提取得率较低，成品应用方向单一。随着驴产业的发展越来越受到人们的关注，驴骨胶原蛋白的开发也成为提高驴产业附加值得一个方向。提供一种能提取适合人体吸收分子量段的骨胶原蛋白肽，能加快胶原蛋白在体内代谢的方法也是闲着亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，该方法将酶解技术与发酵技术相结合，提高了驴骨胶原蛋白肽的提取效率，保证了小分子肽的生物活性，制备的骨胶原蛋白肽分子量集中，且含有益生菌，更利于人体吸收，同时增加了产品的应用方向和价值。
为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
一种驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，包括如下步骤：破骨、粉碎、脱脂、酶解、酶解液收集、骨渣发酵、过滤、配液、灌装。
具体步骤为：
S1.破骨：将驴骨用破骨机处理成2～6cm的小骨渣，然后送清洗机清洗；
S2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
作为优选的，所述骨泥含70％～75％的水分；
S3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4-5h，进行脱脂；
S4.酶解：将上述脱脂后的驴骨泥按1:2～4(w：v)比例加入蒸馏水，用0.5mol/L乙酸溶液和1.6％～2.0％胃蛋白酶在36.5～37.5℃的条件下，酶解24～48h；
S5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，6000～10000r/min的条件下离心，收集上清液，于2～8℃保存于储液罐中；
S6.骨渣发酵：将上述酶解后的骨渣配制成发酵液，加入经益生菌发酵的种子液，于发酵罐中38～42℃，发酵48～72h；发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵；具体步骤为：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液。
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液。
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h。
作为优选的：所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按3％～5％的比例，加入发酵液中，在38～42℃，发酵48～72h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。
S7.过滤：发酵结束后，停止搅拌，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
S8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
S9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
本发明在S4酶解步骤也可采用二次酶解的方法，具体步骤为：
S1.破骨：将驴骨用破骨机处理成2～6cm的小骨渣，然后送清洗机清洗；
S2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
作为优选的，所述骨泥含70％～75％的水分；
S3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4-5h，进行脱脂；
S4.酶解：将上述脱脂后的驴骨泥按1:2～4(w：v)比例加入蒸馏水，用0.5mol/L乙酸溶液和1.6％～2.0％胃蛋白酶在36.5～37.5℃的条件下，酶解24～48h，收集上清液；之后将此上清液用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值到7～9，按终浓度为1.5～2.0％加胰酶，50℃酶解2～2.5h后，在100℃恒温水浴锅，酶灭活15min后，迅速冷却；
S5.酶解液收集：将上述二次酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，6000～10000r/min的条件下离心20min，收集上清液，于2～8℃保存于储液罐中；
S6.骨渣发酵：将上述酶解后的骨渣配制成发酵液，加入经益生菌发酵的种子液，于发酵罐中38～42℃，发酵48～72h；发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵；具体步骤为：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液。
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液。
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h。
作为优选的：所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按3％～5％的比例，加入发酵液中，在38～42℃，发酵48～72h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。
S7.过滤：发酵结束后，停止搅拌，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
S8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
S9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
本发明的有益效果在于：
第一，本发明方法将发酵技术与传统酶解制备骨胶原蛋白的方法相结合，提高了骨胶原蛋白肽的提取效率，保证了驴骨胶原蛋白肽的生物活性。
第二，本发明方法制备的驴骨胶原蛋白肽口服液中同时含有不同类别的益生菌、维生素等有益物质，提高了胶原蛋白肽的吸收利用率，同时起到调节肠胃健康的作用。
第三，本方法制备的口服液具有特有的发酵香味，使消费者更能接受。
第四，本发明将驴骨胶原蛋白肽与益生菌有机结合，增加了产品的应用方向和价值，具有良好的市场前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚地展示，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
如图1所示，本发明提供的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，包括如下步骤：破骨、粉碎、脱脂、酶解、酶解液收集、骨渣发酵、过滤、配液、灌装。其中酶解过程可以采用一次酶解，也可采用二次酶解，两种方法的区别是，二次酶解+发酵的方法所得骨胶原蛋白的得率略高于一次酶解+发酵的方法所得骨胶原蛋白的得率，但二次酶解相较一次酶解要费时，对工作环境要求更高。
本发明制备率骨胶原蛋白肽的方法将酶解技术和发酵技术相结合，酶解技术的运用保证了驴骨中胶原蛋白肽的有效提取，发酵技术的运用降低了对制作环境的要求，降低了生产成本，同时在发酵过程中能够产生大量乳酸、蛋白酶、维生素B族和维生素K等大量有益物质，丰富了产品的有益效果和应用方向。
本发明是通过以下技术方案实现的：
1.破骨：将驴骨处理成2～6cm的块状后清洗；
2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4-5h，进行脱脂。
4.酶解：<一次酶解法>：将上述脱脂后的驴骨泥按1:2～4(w：v)比例加入蒸馏水，用0.5mol/L乙酸溶液和1.6％～2.0％胃蛋白酶在36.5～37.5℃的条件下，酶解24～48h；
<二次酶解法>：将上述脱脂后的驴骨泥按1:2～4(w：v)比例加入蒸馏水，用0.5mol/L乙酸溶液和1.6％～2.0％胃蛋白酶在36.5～37.5℃的条件下，酶解24～48h，收集上清液；之后将此上清液用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值到7～9，按终浓度为1.5～2.0％加胰酶，50℃酶解2～2.5h后，在100℃恒温水浴锅，酶灭活15min后，迅速冷却；
5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，6000～10000r/min离心，收集上清液，于2～8℃保存于储液罐中；
6.骨渣发酵：将上述酶解后的骨渣配制成发酵液，加入经益生菌发酵的种子液，于发酵罐中38～42℃，发酵48～72h；发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵；具体步骤为：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液。
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液。
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h；
作为优选的：所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按3％～5％的比例，加入发酵液中，在38～42℃，发酵48～72h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。其中，活性钙采用GB5009.92—2016的标准检测。
7.过滤：发酵结束后，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
实施例一
1.破骨：取新鲜的驴骨10kg于破骨机中将新鲜的驴骨经过破碎为2cm左右的小骨渣，然后送清洗机，用纯化水清洗2次；
2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4h，进行脱脂。
4.酶解：将3kg上述脱脂后的驴骨泥按1:2(w：v)比例加入6L蒸馏水，用180mL乙酸溶液和1.6％胃蛋白酶在37.5℃的条件下，酶解24h；
5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，6000r/min的条件下离心20min，收集上清液，于5℃保存于储液罐中；
6.骨渣发酵：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液；
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液；
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h；
所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按3％的比例，加入发酵液中，在38℃，发酵72h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。其中，活性钙采用GB5009.92—2016的标准检测。
其中，发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵。
7.过滤：发酵结束后，停止搅拌，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
实施例二
1.破骨：取新鲜的驴骨10kg于破骨机中将新鲜的驴骨经过破碎为4cm左右的小骨渣，然后送清洗机，用纯化水清洗2次；
2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4.5h，进行脱脂。
4.酶解：将3kg上述脱脂后的驴骨泥按1:3(w：v)比例加入9L蒸馏水，用270mL乙酸溶液和1.8％胃蛋白酶在37℃的条件下，酶解36h；
5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，8000r/min的条件下离心20min，收集上清液，于5℃保存于储液罐中；
6.骨渣发酵：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液；
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液；
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h；
所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按4％的比例，加入发酵液中，在40℃，发酵60h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。其中，活性钙采用GB5009.92—2016的标准检测。
其中，发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵。
7.过滤：发酵结束后，停止搅拌，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
实施例三
1.破骨：取新鲜的驴骨10kg于破骨机中将新鲜的驴骨经过破碎为6cm左右的小骨渣，然后送清洗机，用纯化水清洗2次；
2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流5h，进行脱脂；
4.酶解：将3kg上述脱脂后的驴骨泥按1:4(w：v)比例加入12L蒸馏水，用360mL乙酸溶液和2.0％胃蛋白酶在36.5℃的条件下，酶解48h；
5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，10000r/min的条件下离心20min，收集上清液，于5℃保存于储液罐中；
6.骨渣发酵：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液；
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液；
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h；
所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按5％的比例，加入发酵液中，在42℃，发酵48h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。其中，活性钙采用GB5009.92—2016的标准检测。
其中，发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵。
7.过滤：发酵结束后，停止搅拌，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
实施例四
1.破骨：取新鲜的驴骨10kg于破骨机中将新鲜的驴骨经过破碎为2cm左右的小骨渣，然后送清洗机，用纯化水清洗2次；
2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流5h，进行脱脂。
4.酶解：将3kg上述脱脂后的驴骨泥按1:4(w：v)比例加入12L蒸馏水，用360mL乙酸溶液和2.0％胃蛋白酶在37.5℃的条件下，酶解48h，收集上清液；之后将此上清液用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值到7，按终浓度为1.5％加胰酶，50℃酶解2.5h后，在100℃恒温水浴锅，酶灭活15min后，迅速冷却；
5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，6000r/min的条件下离心20min，收集上清液，于5℃保存于储液罐中；
6.骨渣发酵：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液；
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液；
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h；
所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按3％的比例，加入发酵液中，在42℃，发酵48h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。其中，活性钙采用GB5009.92—2016的标准检测。
其中，发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵。
7.过滤：发酵结束后，停止搅拌，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
实施例五
1.破骨：取新鲜的驴骨10kg于破骨机中将新鲜的驴骨经过破碎为4cm左右的小骨渣，然后送清洗机，用纯化水清洗2次；
2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4.5h，进行脱脂。
4.酶解：将3kg上述脱脂后的驴骨泥按1:3(w：v)比例加入9L蒸馏水，用270mL乙酸溶液和1.8％胃蛋白酶在37℃的条件下，酶解36h，收集上清液；之后将此上清液用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值到8，按终浓度为1.8％加胰酶，50℃酶解2.2h后，在100℃恒温水浴锅，酶灭活15min后，迅速冷却；
5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，8000r/min的条件下离心20min，收集上清液，于5℃保存于储液罐中；
6.骨渣发酵：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液；
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液；
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h；
所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按4％的比例，加入发酵液中，在40℃，发酵60h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。其中，活性钙采用GB5009.92—2016的标准检测。
其中，发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵。
7.过滤：发酵结束后，停止搅拌，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
实施例六
1.破骨：取新鲜的驴骨10kg于破骨机中将新鲜的驴骨经过破碎为6cm左右的小骨渣，然后送清洗机，用纯化水清洗2次；
2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4h，进行脱脂。
4.酶解：将3kg上述脱脂后的驴骨泥按1:2(w：v)比例加入6L蒸馏水，用180mL乙酸溶液和1.6％胃蛋白酶在36.5℃的条件下，酶解24h，收集上清液；之后将此上清液用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值到9，按终浓度为2％加胰酶，50℃酶解2h后，在100℃恒温水浴锅，酶灭活15min后，迅速冷却；；
5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，10000r/min的条件下离心20min，收集上清液，于5℃保存于储液罐中；
6.骨渣发酵：
(1)混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成种子液；
(2)混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌，配制成发酵液；
(3)将驯化好的，适宜在驴骨泥中发酵的益生菌，按比例配比加入种子液中，在38℃，发酵48h；
所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
(4)将发酵好的种子液按5％的比例，加入发酵液中，在38℃，发酵72h。发酵过程中，每隔12h，取样检测活性钙离子浓度的增长情况及PH值的变化和三株乳酸菌的生长情况。当发酵液的PH值降到4.0，活性钙离子含量高于180mg/100ml时，停止发酵。其中，活性钙采用GB5009.92—2016的标准检测。
其中，发酵过程中每隔30min，搅拌10min，以免骨渣沉淀到罐底不能充分发酵。
7.过滤：发酵结束后，停止搅拌，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测骨胶原蛋白肽含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
对本实施例3方法制得的驴骨胶原蛋白肽口服液的小分子肽含量、氨基酸含量、钙含量、磷含量进行检测，检测结果如表1所示。
表1 小分子肽含量、氨基酸含量、钙含量、磷含量进行检测结果
主要成分 含量指标
小分子肽，mg/ml ≥2.0
氨基酸，mg/ml ≥7.5
钙，mg/100ml ≥180.0
磷，mg/100ml ≥90.0
由表1可以看出，采用实施例3的方法制得口服液中小分子肽的含量在2.0mg/ml以上，运用酶解技术与益生菌发酵技术结合的方法，除了可产生小分子肽、钙、磷、氨基酸等主要成分外，还能产生许多有益物质，其中包括乳糖酶，维生素(如泛酸、尼克酸、B1，B2，B6及维生素K)、短链脂肪酸、抗氧化剂等物质。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.破骨：将驴骨处理成块状清洗；
S2.粉碎：将上述驴骨处理成骨泥；
S3.脱脂：将上述处理后的骨泥进行脱脂；
S4.酶解：将上述脱脂后的骨泥在蛋白酶的作用下进行酶解；
S5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经离心、收集，保存于储液罐中；
S6.骨渣发酵：将上述酶解后的骨渣制成发酵液，加入益生菌进行发酵；
S7.过滤：经沉淀后，将上述发酵后的原液进行过滤，合并；
S8.配液：调PH值后，测量合并后的上清液中骨胶原蛋白肽的含量；
S9.灌装：经过滤、除菌、灌装即得成品。
2.根据权利要求1所述的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1.破骨：将驴骨处理成2～6cm的块状后清洗；
S2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
S3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4-5h，进行脱脂；
S4.酶解：将上述脱脂后的驴骨泥按1:2～4(w：v)比例加入蒸馏水，用0.5mol/L乙酸溶液和1.6％～2.0％胃蛋白酶在36.5～37.5℃的条件下，酶解24～48h；
S5.酶解液收集：将上述酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，6000～10000r/min的条件下离心，收集上清液，于2～8℃保存于储液罐中；
S6.骨渣发酵：将上述酶解后的骨渣配制成发酵液，加入经益生菌发酵的种子液，于发酵罐中38～42℃，发酵48～72h；
S7.过滤：发酵结束后，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
S8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测合并后的上清液中骨胶原蛋白肽的含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
S9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
3.根据权利要求1所述的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1.破骨：将驴骨处理成2～6cm的块状后清洗；
S2.粉碎：将上述粉碎、清洗后的驴骨用胶体磨和骨泥磨处理成骨泥；
S3.脱脂：将上述处理后的骨泥在60℃水浴条件下低温回流4-5h，进行脱脂；
S4.酶解：将上述脱脂后的驴骨泥按1:2～4(w：v)比例加入蒸馏水，用0.5mol/L乙酸溶液和1.6％～2.0％胃蛋白酶在36.5～37.5℃的条件下，酶解24～48h，收集上清液；之后将此上清液用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值到7～9，按终浓度为1.5～2.0％加胰酶，50℃酶解2～2.5h后，在100℃恒温水浴锅，酶灭活15min后，迅速冷却；
S5.酶解液收集：将上述二次酶解后的酶解液经过桶式过滤器过滤，然后将过滤液在4℃，6000～10000r/min的条件下离心，收集上清液，于2～8℃保存于储液罐中；
S6.骨渣发酵：将上述酶解后的骨渣配制成发酵液，加入经益生菌发酵的种子液，于发酵罐中38～42℃，发酵48～72h；
S7.过滤：发酵结束后，经充分沉淀，向发酵罐中打入无菌净化空气，使发酵成熟的原液，通过过滤器，过滤到储液罐中与酶解得上清液混合；
S8.配液：用2.0mol/L的HCl溶液和2.0mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5之间，福林酚法测合并后的上清液中骨胶原蛋白肽的含量，蒸馏水配液；使骨胶原蛋白肽含量≥2.0mg/mL；
S9.灌装：将上述配液后的液体，经5000Da的超滤膜过滤，收集超滤透过物，然后将收集的超滤透过物采用0.1μm除菌过滤器除菌，灌装即得成品。
4.根据权利要求2或3所述的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，所述S6中发酵液的配制方法为：混合30％骨渣和10％白砂糖，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌。
5.根据权利要求2或3所述的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，所述S6中种子液的配制方法为：混合10％骨渣、5％白砂糖和5％脱脂乳粉，用蒸馏水定容，在125℃，0.2Mpa的条件下保持45min进行灭菌。
6.根据权利要求2或3所述的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，所述益生菌的配比为，嗜酸乳杆菌：鼠李糖乳杆菌：干酪乳杆菌：长双歧杆菌：短双歧杆菌＝1:1:1:1:1。
7.根据权利要求2或3所述的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，所述S6中发酵好的种子液按3％～5％的体积比加入发酵液。
8.根据权利要求2或3所述的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，当发酵液的PH值降到3.5～4.5，活性钙离子含量高于180～200mg/100ml时，停止发酵。
9.根据权利要求2或3所述的驴骨胶原蛋白肽口服液的制备方法，其特征在于，所述S2中骨泥含70％～75％的水分。
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Applicant after: Inner Mongolia Yuanben Biomedical Technology Co.,Ltd.

Address before: 010000 Business Incubation Park of Wuchuan County, Hohhot City, Inner Mongolia Autonomous Region 302-303 (West Building of Agricultural Bank of Wuchuan Kezhen)

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