CN102643864A - 一种酵母培养物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：酿酒酵母依次经过菌种扩大培养，液体有氧发酵，液体厌氧发酵，将液体发酵产物干燥后，与谷物培养基混合，进入固体厌氧发酵阶段：40～60℃厌氧发酵20～40h，加入水解酶，40～60℃保温2～8h，升温至70～90℃保温20s～10min，固体发酵产物干燥，粉碎，得酵母培养物。本发明采用液体厌氧发酵与固体厌氧发酵相结合的发酵工艺，制备的产物与单独的液体厌氧发酵、固体厌氧发酵制备的酵母培养物相比，粗蛋白含量和粗脂肪含量极显著提高；瘤胃微生物蛋白质的浓度极显著增加；断奶仔猪采食量、日增重极显著提高，饲料转化率显著提高；断奶仔猪存活率提高；猪的腹泻率降低。

Description

一种酵母培养物的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工艺，具体地说涉及一种酵母培养物的制备方法。

背景技术

酵母培养物是在特定工艺条件控制下由酵母在特制的培养基上经过充分发酵后所形成的微生态制品。其不同于常见的固态发酵的活细胞酵母产品，是由酵母细胞代谢产物和经过发酵后变异的培养基，以及已无活性的酵母细胞等所构成，富含B族维生素、矿物质、消化酶、较齐全的氨基酸及未知生长因子，是集营养与保健为一体的饲料添加剂，其作用效果不依赖于活酵母菌，保存期长，产品性能稳定。

酵母培养物一般的生产工艺主要有液态深层发酵法和固态发酵法。液体深层发酵法工艺具有产量大、机械化程度高、易于监控、深层转化率高的优点，但存在投资规模大，技术复杂，能源消耗大的缺点，且忽略了代谢产物的活性功能及生产中存在大量废液污染的问题。固态发酵法工艺简化了生产工艺，免去了液体发酵需脱水、收集、干燥等程序，特别是应用于对废渣废料的处理，易干燥、低能耗、高回收，可把发酵物包括菌体、代谢产物和底物全部利用，既保留了活性成分又没有废液污染之忧，而且原料来源丰富，成本低廉。但菌种经多级培养和开放式发酵易受杂菌感染，生产时间长，占地面积大，劳动强度大，各种条件不好控制，产品质量难以达到标准，其中杂菌污染是固体发酵生产中普遍存在的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酵母培养物的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：

1)      菌种扩大培养：将酿酒酵母接种至液体培养基中，扩大培养，得扩大培养液；

2)      液体有氧发酵：将扩大培养液以20～30%的接种量接种至液体培养基，28～30℃有氧发酵24～72h，得液体菌种溶液；

3)      液体厌氧发酵：将液体菌种溶液以10～25%的接种量接种至液体培养基，28～30℃厌氧发酵24～48h，得液体发酵产物；

4)      固体厌氧发酵：将液体发酵产物35～55℃干燥至含10～30wt% 的水分后，以1：3～6的重量比与谷物培养基混合，得半固态混合物，进行固体厌氧发酵阶段：40～60℃厌氧发酵20～40 h，加入水解酶，40～60℃保温2～8 h，升温至70～90℃保温20s～10min，得固体发酵产物；

5)      将固体发酵产物干燥，粉碎，得酵母培养物。

优选的，液体培养基的重量配比为：糖蜜8～20%、KH₂PO₄·7H₂O 0.08～1.5%、MgSO₄·7H₂O 0.08～1.5%、(NH₄)₂SO₄ 0.08～1.5%，余量为水，并调节pH为4.5～5.0。

优选的，谷物培养基的重量份配比为：玉米15～45份、麸皮2～10份、豆粕30～80份。

优选的，水解酶为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶中的至少一种。

优选的，液体有氧发酵过程中液体培养基的pH控制在4.5～5.0，残糖浓度控制在4～8wt%。

优选的，液体厌氧发酵过程中液体培养基的pH控制在4.5～5.0，残糖浓度控制在4～8wt%。

优选的，制备方法，包括如下步骤：

1)  菌种扩大培养：将酿酒酵母接种至液体培养基中，扩大培养，得扩大培养液；

2)  液体有氧发酵：将扩大培养液以25%的接种量接种至液体培养基，30℃液体有氧发酵48h，控制发酵过程中液体培养基的pH 4.8，残糖浓度8wt%，得液体菌种溶液；

3)  液体厌氧发酵：将液体菌种溶液以20%的接种量接种至液体培养基， 30℃液体厌氧发酵36h，控制发酵过程中液体培养基的pH 4.8，残糖浓度8wt%，得液体发酵产物；

4)  固体厌氧发酵：将液体发酵产物在40℃干燥至含20wt% 的水分后，以1：5的重量比与谷物培养基混合，得半固态混合物，进行固体厌氧发酵阶段：50℃厌氧发酵30 h，加入半纤维素酶，50℃保温5 h，升温至80℃保温5 min，得固体发酵产物；

5)  将固体发酵产物干燥，粉碎，得酵母培养物；

所述液体培养基的重量配比为：糖蜜20%、KH₂PO₄·7H₂O 0.08%、MgSO₄·7H₂O 1.5%、(NH₄)₂SO₄ 1%，余量为水，并调节pH为4.8；

所述谷物培养基的重量份配比为：玉米35份、麸皮5份、豆粕50份。

本发明通过菌种扩大培养，将菌种复苏并扩大到一定量，然后进行液体有氧发酵，在氧气充足的情况下，酵母以指数级递增方式迅速增殖，从而获得大量的酵母细胞，再进行液体厌氧发酵，产生大量代谢产物，最后经过固体厌氧发酵，使酵母细胞有效的破壁，干燥、粉碎后得到菌母培养物。

本发明的有益效果是：

本发明采用液体厌养发酵与固体厌养发酵相结合的发酵工艺，制备的产物与单独的液体厌氧发酵、固体厌氧发酵制备的酵母培养物相比，粗蛋白含量和粗脂肪含量极显著提高；瘤胃微生物蛋白质的浓度极显著增加；断奶仔猪采食量、日增重极显著提高，饲料转化率显著提高；断奶仔猪存活率提高；猪的腹泻率降低。

与液体厌氧发酵工艺制成的酵母培养物相比，本发明的酵母培养物降低了仔猪腹泻率25.0%，降低疾病（喘气）发生率33.3%及死、淘率100%。

与固体厌氧发酵工艺制成的酵母培养物相比，本发明的酵母培养物降低了仔猪腹泻率40%，降低疾病（喘气）发生率50%及死、淘率200%。

本发明的酵母培养物品质优良，稳定性好，经试验证明其功效性强，作为营养均衡的饲料添加剂，可调控动物有益菌的代谢，促进其生长，在反刍及畜禽生产上均可广泛的应用。

本发明工艺缩短了发酵周期，大大降低了杂菌污染程度，且富含酵母细胞破壁后的细胞内容物、细胞壁、酵母代谢终产物和培养基等，是一种具有生物活性的饲料复合添加剂。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。

实施例1

一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：

1)  菌种扩大培养：将酿酒酵母接种至液体培养基中，置于恒温振荡培养箱中30℃、180r/min培养24小时，得扩大培养液；

2)  液体有氧发酵：将扩大培养液以25%的接种量接种至无菌液体培养基， 30℃有氧发酵48h，控制发酵过程中液体培养基的pH 4.8，残糖浓度8wt%，得液体菌种溶液；

3)  液体厌氧发酵：将液体菌种溶液以20%的接种量接种至无菌液体培养基， 30℃厌氧发酵36h，控制发酵过程中液体培养基的pH 4.8，残糖浓度8wt%，得液体发酵产物；

4)  固体厌氧发酵：将液体发酵产物40℃干燥至含20wt%水分后，按1：5的重量比与无菌谷物培养基混匀，得半固态混合物，进入固体厌氧发酵阶段： 50℃厌氧发酵30 h，然后加入半纤维素酶水解5 h，半纤维素酶的加入量为半固态混合物重量的2%，升温至80℃保持5min，得固体发酵产物；

5)  将固体发酵产物干燥，粉碎，得酵母培养物。

所述液体培养基的重量配比为：糖蜜20%、KH₂PO₄·7H₂O 0.08%、MgSO₄·7H₂O 1.5%、(NH₄)₂SO₄ 1%，余量为水，并调节pH为4.8。

所述谷物培养基的重量份配比为：玉米35份、麸皮5份、豆粕50份。

实施例2

一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：

1)  菌种扩大培养：将酿酒酵母接种至液体培养基中，置于恒温振荡培养箱中30℃、180r/min培养24小时，得扩大培养液；

2)  液体有氧发酵：将扩大培养液以15%的接种量接种至无菌液体培养基， 29℃有氧发酵24h，控制发酵过程中液体培养基的pH 5.0，残糖浓度4wt%，得液体菌种溶液；

3)  液体厌氧发酵：将液体菌种溶液以10%的接种量接种至液体培养基， 29℃厌氧发酵24h，控制发酵过程中液体培养基的pH 5.0，残糖浓度4wt%，得液体发酵产物；

4)  固体厌氧发酵：将液体发酵产物35℃干燥至含10%水分后，按1：3的重量比与无菌谷物培养基混匀，得半固态混合物，进入固体厌氧发酵阶段： 40℃厌氧发酵40 h，然后加入半纤维素酶、果胶酶水解2 h，半纤维素酶的加入量为半固态混合物重量的3%，果胶酶的加入量为半固态混合物重量的2%，升温至90℃保温20s，得固体发酵产物；

5)  将固体发酵产物干燥，粉碎，得酵母培养物。

所述液体培养基的重量配比为：糖蜜8%、KH₂PO₄·7H₂O 1%、MgSO₄·7H₂O 0.08%、(NH₄)₂SO₄ 1.5%，余量为水，并调节pH为5.0。

所述谷物培养基的重量份配比为：玉米15份、麸皮10份、豆粕80份。

实施例3

一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：

1)  菌种扩大培养：将酿酒酵母接种至液体培养基中，置于恒温振荡培养箱中30℃、180r/min培养24小时，得扩大培养液；

2)  液体有氧发酵：将扩大培养液以35%的接种量接种至无菌液体培养基， 28℃有氧发酵72h，控制发酵过程中液体培养基的pH 4.5，残糖浓度6wt%，得液体菌种溶液；

3)  液体厌氧发酵：将液体菌种溶液以25%的接种量接种至无菌液体培养基，混合， 28℃厌氧发酵48h，控制发酵过程中液体培养基的pH 4.5，残糖浓度6wt%，得液体发酵产物；

4)  固体厌氧发酵：将液体发酵产物55℃干燥至含30wt%水分后，按1：6的重量比与无菌谷物培养基混匀，得半固态混合物，进入固体厌氧发酵阶段： 60℃厌氧发酵20 h，然后加入纤维素酶水解8 h，纤维素酶的加入量为半固态混合物重量的0.1%，升温至70℃保温10min，得固体发酵产物；

5)  将固体发酵产物干燥，粉碎，得酵母培养物。

所述液体培养基的重量配比为：糖蜜10%、KH₂PO₄·7H₂O 0.08%、MgSO₄·7H₂O 1%、(NH₄)₂SO₄ 0.08%，余量为水，并调节pH为4.5。

所述谷物培养基的重量份配比为：玉米45份、麸皮2份、豆粕30份。

对比例1

一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：

1)  菌种扩大培养：同实施例1；

2)  液体有氧发酵：同实施例1；

3)  液体厌氧发酵：同实施例1；

4)  液态深层破壁：将步骤3）所得产物升温至50℃厌氧发酵30 h，然后加入半纤维素酶水解5 h，半纤维素酶的加入量为液体发酵产物重量的2%，升温至90℃保温20s，得深层破壁产物；

5)  将深层破壁产物脱水，干燥，粉碎，得酵母培养物。制备方法中所述液体培养基配方同实施例1。

对比例2

一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：

1)  菌种扩大培养：同实施例1；

2)  液体有氧发酵：同实施例1；

3)  固体厌氧发酵：将液体菌种溶液以20%的接种量接种至无菌谷物培养基中并混合均匀，形成湿混合料，28℃厌氧发酵36h，得固体发酵产物；

4)  固态深层破壁：同对比例1。

5)      将深层破壁产物干燥，粉碎，得酵母培养物。制备方法中所述液体培养基配方和谷物培养基配方同实施例1。 

实施例1得到大量菌种后，采用液体厌氧发酵和固体厌氧发酵相结合的工艺，对比例1得到大量菌种后，采用液体厌氧发酵工艺，对比例2得到大量菌种后，采用固体厌氧发酵工艺。将实施例1及对比例1、对比例2得到的酵母培养物进行常规营养指标分析，分析结果见表1，分析结果经过了显著差异分析，注：数值右上角标注的英文字母，同行不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），同行不同小写写字母表示差异显著（P<0.05），以下表同。由表可见，与单独的液体厌氧发酵、固体厌氧发酵相比，本发明方法提高了酵母培养物的营养成分，其中，本发明液固厌氧结合发酵极显著提高了产物粗蛋白量和粗脂肪水平（P<0.01）。

通过体外法研究实不同工艺发酵的酵母培养物对人工瘤胃发酵的影响：

人工瘤胃由8个容积为1000ml发酵罐组成，恒温水浴，温度维持在39±0.5℃，封闭式连接，罐内充入CO₂以保证厌氧环境。发酵罐中加入450ml过滤的瘤胃液，450ml预热的缓冲液，调节蠕动泵，使缓冲液的稀释速率为0.034/h。日粮（由质量比为7：0.5：2.5的稻草：玉米：豆粕组成）装在尼龙袋中投放，添加量为10g/d，实施例1、对比例1及对比例2的酵母培养物分别混在日粮中一起投放，添加量均为1g/d。测定指标为发酵16h后的 pH值、液氨态氮（NH₃-N）浓度、挥发性脂肪酸（VFA）浓度和微生物蛋白（MCP）浓度，各参数的测定结果见表2。由表可知，本发明的酵母培养物极显著增加了瘤胃微生物蛋白质的浓度（p<0.01），这与其刺激了瘤胃部分微生物繁殖有关。

通过动物实验研究不同工艺发酵的酵母培养物对瘤胃发酵的影响：

    选取体重接近、体况良好的荷斯坦奶牛9只，手术安装瘤胃瘘管，术后恢复一个月。采用单因子试验设计，随机分为3个处理组，每个组3个重复，饲喂相应的试验组饲粮，分别为实施例1及对比例1、对比例2的酵母培养物10g+基础日粮，为期20d，前15d为过渡期，在5d的试验期内进行采样。

日粮每日分3次饲喂，每次精料1.45kg，羊草1.45kg，中午和晚上各饮温水一次。日粮配制参考NRC（2001）及试验要求，日粮及营养水平组成见表3。

试验期每日于6:30，8:30，10:30，12:30及14:30在瘤胃腹囊部用自制负压采样器取瘤胃液30ml，经100目棉纶网过滤后分为两份，一份取10ml放入小瓶中厌氧-20℃保存，用于测定纤维素酶的活力。另一份分别取10ml，分装于两个带盖小瓶中，分别加入10%三氯醋酸2.1ml，25%偏磷酸2.5ml和2滴饱和氯化汞，立即放于-20℃冰箱中冷冻保存。以备分析瘤胃液氨态氮、挥发性脂肪酸（VFA）的含量。纤维素酶活力的测定采用CMC-Na法，氨态氮的测定采用靛酚蓝比色法，挥发性脂肪酸采用气相色谱分析仪进行测定。具体结果见表4、5、6。

由表4可知，本发明工艺条件下制得的酵母培养物营养丰富，相对于对比例1、对比例2的酵母培养物，极显著提高了各个采样点奶牛瘤胃液纤维素酶活性（p<0.01），有利于营养物质的消化。

瘤胃NH₃-N和MCP水平共同反应了瘤胃微生物对饲料中氮源的降解和利用情况。若NH₃-N水平过高，则说明瘤胃微生物降解氮源释放NH₃的速率超过了微生物利用NH₃，这会增加瘤胃氮循环中氮素的损失，而NH₃-N浓度过低会影响MCP的产量。由表5可知，本工艺条件下制得的酵母培养物相对于对比例1、对比例2的酵母培养物，对瘤胃NH₃-N的浓度无显著影响。

 

VFA是瘤胃微生物降解日粮中的碳水化合物而产生的，是机体能量的重要来源。乙酸是泌乳反刍动物乳腺合成乳脂中脂肪酸的重要底物。而高浓度的VFA，尤其是高浓度的丙酸可保证牛奶中乳糖的含量。由表6可知，本工艺条件下制得的酵母培养物，相对于对比例1、对比例2的酵母培养物，可提高总挥发性脂肪酸的浓度和乙酸/丙酸的比例，有利于瘤胃发酵。

研究不同工艺发酵的酵母培养物对断奶仔猪生长性能的影响：

选取21日龄的杜长大三元杂交断奶仔猪225头，随机分成3组，每组设3个重复，每个重复25头。A组：饲喂基础日粮+实施例1的液固结合厌氧发酵酵母培养物，B组和C组分别在基础日粮中添加对比例1的液体厌氧发酵和对比例2的固体厌养发酵工艺条件下的酵母培养物。日粮及营养水平组成见表7。

  

  试验为期25d，其中预试期4d，正式试验期21d。试验期前后及试验过程中，检测到各组断奶仔猪生产性能见表8，试验结束后统计各组断奶仔猪的健康状况见表9。

由表8可知，与单独的液体厌氧发酵、固体厌氧发酵产物工艺条件下制成的酵母培养物相比，本发明的酵母培养物能极显著提高断奶仔猪采食量和日增重（p<0.01），显著提高饲料转化率（p<0.05）。

　

由表9知，与对比例1液体厌氧发酵工艺条件下制成的酵母培养物相比，本发明的酵母培养物降低了仔猪腹泻率25.0%，降低疾病（喘气）发生率33.3%及死、淘率100%。与对比例2固体厌氧发酵工艺条件下制成的酵母培养物相比，本发明的酵母培养物降低了仔猪腹泻率40%，降低疾病（喘气）发生率50%及死、淘率200%。

Claims (7)

1.一种酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：

1)菌种扩大培养：将酿酒酵母接种至液体培养基中，扩大培养，得扩大培养液；

2)液体有氧发酵：将扩大培养液以20～30%的接种量接种至液体培养基，28～30℃有氧发酵24～72h，得液体菌种溶液；

3)液体厌氧发酵：将液体菌种溶液以10～25%的接种量接种至液体培养基，28～30℃厌氧发酵24～48h，得液体发酵产物；

4)固体厌氧发酵：将液体发酵产物35～55℃干燥至含10～30wt% 的水分后，以1：3～6的重量比与谷物培养基混合，得半固态混合物，进入固体厌氧发酵阶段：40～60℃厌氧发酵20～40 h，加入水解酶，40～60℃保温2～8 h，升温至70～90℃保温20s～10min，得固体发酵产物；

5)将固体发酵产物干燥，粉碎，得酵母培养物。

2.根据权利要求1所述的酵母培养物的制备方法，其特征在于：液体培养基的重量配比为：糖蜜8～20%、KH₂PO₄·7H₂O 0.08～1.5%、MgSO₄·7H₂O 0.08～1.5%、(NH₄)₂SO₄ 0.08～1.5%，余量为水，并调节pH为4.5～5.0。

3.根据权利要求1所述的酵母培养物的制备方法，其特征在于：谷物培养基的重量份配比为：玉米15～45份、麸皮2～10份、豆粕30～80份。

4.根据权利要求1所述的酵母培养物的制备方法，其特征在于：水解酶为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的酵母培养物的制备方法，其特征在于：液体有氧发酵过程中液体培养基的pH控制在4.5～5.0，残糖浓度控制在4～8wt%。

6.根据权利要求1所述的酵母培养物的制备方法，其特征在于：液体厌氧发酵过程中液体培养基的pH控制在4.5～5.0，残糖浓度控制在4～8wt%。

7.根据权利要求1～6所述的酵母培养物的制备方法，其特征在于：制备方法，包括如下步骤：

1)菌种扩大培养：将酿酒酵母接种至液体培养基中，扩大培养，得扩大培养液；

2)液体有氧发酵：将扩大培养液以25%的接种量接种至液体培养基，30℃液体有氧发酵48h，控制发酵过程中液体培养基的pH 4.8，残糖浓度8wt%，得液体菌种溶液；

3)液体厌氧发酵：将液体菌种溶液以20%的接种量接种至液体培养基， 30℃液体厌氧发酵36h，控制发酵过程中液体培养基的pH 4.8，残糖浓度8wt%，得液体发酵产物；

4)固体厌氧发酵：将液体发酵产物在40℃干燥至含20wt% 的水分后，以1：5的重量比与谷物培养基混合，得半固态混合物，进行固体厌氧发酵阶段：50℃厌氧发酵30 h，加入半纤维素酶，50℃保温5 h，升温至80℃保温5min，得固体发酵产物；

5)将固体发酵产物干燥，粉碎，得酵母培养物；

所述液体培养基的重量配比为：糖蜜20%、KH₂PO₄·7H₂O 0.08%、MgSO₄·7H₂O 1.5%、(NH₄)₂SO₄ 1%，余量为水，并调节pH为4.8；

所述谷物培养基的重量份配比为：玉米35份、麸皮5份、豆粕50份。