CN101407762B - 微生物固体菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明主要涉及微生物的发酵方法，尤其涉及利用食品行业产生的废液废渣制备F306酵母融合菌、G361白地霉菌和R根霉菌三菌组合的FGR固体菌剂的方法和应用。其在畜禽饲料添加剂上有很好的应用效果。一种微生物固体菌剂的制备方法，其步骤为：A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：B液体培养基的制备及液体菌种的培养：C.固体菌剂的培养。优点是：一方面是液体培养基是利用食品、饮料行业生产的废液，添加少量无机盐，调整pH值，因为这些废液营养丰富，适于菌种的快速生长繁殖。二是新鲜浆水或废水可以不灭菌，添加无机盐调整pH值后，可直接接入菌种进行液体发酵培养。这样节省了设备和能源，三是液体培养菌种，菌细胞繁殖快，菌液细胞浓度高，加入固体原料的菌量大可抵抗杂菌污染。
Description
技术领域：
本发明主要涉及微生物的发酵方法，尤其涉及利用食品行业产生的废液废渣制备酵母融合菌(F306)、白地霉菌(G361)和根霉菌(R)三菌组合的FGR固体菌剂的方法和应用。
背景技术：
传统的微生物菌剂的制备方法，所用原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、牛肉膏、维生素，无机盐和水配制成液体培养基，从试管斜面菌种上刮取菌苔接种在液体培养基中，经好氧或厌氧培养制备成液体菌剂或将液体菌种接种在由玉米粉、麸皮、豆面、籽饼、豆粕和米糠等原料组成的固料培养基上，发酵制备成固体菌剂。其缺点是：所用原料成本高，生产工艺复杂，不能节约能源。
传统的微生物菌剂制备所采用的微生物菌种大多是：从国家或地方菌种库或直接从自然界分离筛选出的菌种，其缺点是：1.微生物菌种的活性差；2.对有机物分解转化能力弱；3.这些菌种所制备的菌剂活细胞数少，大多数在108个/克。
混合菌剂传统做法，是将各种不同的菌种(好氧和厌氧)在各自不同的生长环境中培养菌种，然后从每个菌种的培养物中刮取菌苔制取每个菌的液体菌悬液，再转种于各自的液体培养液经通气或厌氧发酵培养后离心制取活性细胞菌，将沉淀物喷雾干燥制成粉剂，制成多菌的混合。其缺点是：制备工艺复杂，发酵周期长，成本高，应用受到限制。
发明内容：
本发明的目的在于避免现有微生物固体菌剂生产技术不足之处而提供一种微生物固体菌剂及其制备方法和应用。
使用F306酵母融合菌与G361白地霉菌和根霉菌科学配伍，以新鲜豆腐或粉丝或玉米或洋芋淀粉产生的废渣及农业秸秆为原料，添加少量无机盐，培养料不灭菌，三种菌在同一条件下制备F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌固体菌剂的制备方法。该方法是利用食品行业产生的废渣为原料，生产过程无“三废”污染，生产工艺简单，操作方便，节省人力，节省能源，其固体菌剂，即可用于有机废水净化剂，又可作为微生物饲料和微生物肥料，也可以用于石油开采、食品工业、环境工程、医疗和精细化工等行业。
本发明可以通过采用以下技术方案实现：一种微生物固体菌剂，其特点在于由F306酵母融合菌、G361白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)、根霉菌(Rhizopus)和固体培养基组成，其三种菌株总量的重量百分比为F306酵母融合菌为55～65％、G361白地霉菌为30～35％、根霉菌5～10％，所述的F306酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461，保藏日期为2008年4月21日，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae Hansen)。G361白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)是中国科学院微生物菌种中心保存的安全菌种，编号为AS.2.361，根霉菌(Rhizopus)是市场公开销售菌种。
所述的固体培养基包括有重量百分比为以干料计50-80％的糟渣，15-30％的玉米芯粉，8-12％的麸皮，0.5-0.8％的玉米面，0.1-3％的尿素，0.2-4％的硫酸铵，再加入新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水使其含水重量百分比为45-65％，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5。
所述的微生物固体菌剂的制备方法，其特点在于包括有如下步骤：
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；
b.菌种的培养：分别取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为一级菌种；
B液体培养基的制备及液体菌种的培养：
a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；
b.分别取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；
c.分别取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；
d.分别将重量百分比为F306酵母融合菌为55～65％、G361白地霉菌为30～35％、根霉菌5～10％三级菌种再扩大培养，三种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌混合菌剂，或为四级菌种继续逐级扩大培养，用此菌剂作为制备固体菌剂的菌种；
C.固体菌剂的培养：
将含水比为60-80％新鲜的豆腐渣或粉丝渣或玉米淀粉渣或洋芋淀粉或啤酒、白酒糟，加入经0.5-1.2％H2SO4处理的玉米芯粉和麸皮、玉米面，其中玉米芯粉、麸皮、玉米面的重量比为2～4∶1～3∶0.5～1，并加入相对于干料的0.2-4％的硫酸铵，相对于干料的0.1-3％的尿素，均匀搅拌，使其含水量达到45-65％，用1％的石灰水调节PH至5.5～6.5，然后加入相对于干料总量为8-12％F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌混合菌液，充分搅拌混合均匀后，在发酵和干燥两用发酵池中经温度28～32℃通风搅拌发酵18～24小时后，再经40～60℃通热风干燥，制成F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌固体菌剂。
所述的F306酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌(Canadida tropicalis)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液液反复冲洗，涂布于高渗选择型培养基和高渗完全培养基平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出F306酵母融合菌。
F306酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
所述的微生物固体菌剂在畜禽饲料添加剂中的应用。所述的糟渣为啤酒酒糟或白酒糟或豆腐渣或粉丝渣或玉米淀粉渣或洋芋渣。
我们采用先进的单亲灭活原生质体融合技术，对热带假丝酵母(Candidatropicalis)968和酒精酵母(Saecharomycescervsiar)2.399两亲本菌株做融合，构建新的基因工程菌，这些融合菌即具有双亲的生物特性，又具有优于双亲的活性酶，絮凝性和耐高温的生物特性。能充分利用豆腐、粉丝和玉米洋芋淀粉废渣中有机物的营养物质进行生长繁殖，利用F306酵母融合菌配伍G361白地霉菌和根霉菌(R)三菌组合制备F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌液固体菌剂。G361白地霉菌是一种很粗营养价值类似产肮假丝酵母的微生物，又能利用硫酸铵和尿素合成蛋白质，纯菌体蛋白质含量高达40％以上，根霉菌能分泌活性强的糖化酶，能将淀粉结构中的a-1，a-4和a-6键打断，而完成将淀粉转化为纯度高的葡萄糖供F306酵母融合菌和G361白地霉菌利用，三菌的科学配比在同一条件下，同一发酵时间完成各自的发酵功能，起到菌种间的互补，有效的利用糟渣秸秆原料，提高糟渣秸秆的营养价值，所有培养料不灭菌，这一技术既节省了培养基的原料，减少原料配制和高压灭菌的工序，节省了能源，也解决了这些行业治污的难题，是一项变废为宝，一举多得的生物技术。
F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌固体菌剂即可作为有机废水处理净化剂，又可在农、林、牧、渔业上应用，也可作为生物絮凝剂，表面活性剂，生物吸附剂等应用于石油开采、食品工业、环境工程、医疗和精细化工等行业，具有较广的应用价值。
本发明固体菌剂制备方法的特点在于其使用液态培养基，优点是：一方面是液体培养基是利用食品、饮料行业生产的废液，添加少量无机盐，调整pH值，因为这些废液营养丰富，适于菌种的快速生长繁殖。二是新鲜浆水或废水可以不灭菌，添加无机盐调整pH值后，可直接接入菌种进行液体发酵培养。这样节省了设备和能源，三是液体培养菌种，菌细胞繁殖快，菌液细胞浓度高，加入固体原料的菌量大可抵抗杂菌污染。
附图说明：
图1：本发明固体菌剂的制备流程图。
图2：本发明和豆粕中主要氨基酸含量的对比曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：见图1
见图1，实施例1
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于15×1.5cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO40.5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)
(3)液体扩大培养生产菌种
取新鲜豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO4 10g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜豆腐废水不灭菌，将重量百分比为55％的F306酵母融合菌、35％的G361白地霉菌、和10％的R根霉菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其发酵液即为F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌液体菌剂，活细胞数为1.0～2.0×1010个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量；
(6)取含水分65％的新鲜豆腐渣2000kg，加入经0.5％H2SO4处理的玉米芯粉和麸皮、玉米面，其中玉米芯粉、麸皮、玉米面的重量比为2∶1∶0.5，并加入相对于干物质硫酸铵为4％、尿素3％，充分混合后调固体发酵含水分45％，用1％的石灰水调节PH至5.5～6.5，然后加入相对于干料总量为10％的FGR液体菌剂，充分搅拌混合均匀后，在发酵和低温干燥两用发酵池中经温度28～32℃通风搅拌发酵18～24小时后，再经40～60℃通热风干燥，制成F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌固体菌剂。该F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌固体菌剂活细胞数为1.1×1010个/克，粗蛋白28.6％。
实施例2
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜粉丝废水100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜粉丝废水1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)。
(3)液体扩大培养生产菌种：
取新鲜粉丝废水10000ml，加入(NH4)2SO4 10g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为65％的F306酵母融合菌、30％的G361白地霉菌、和5％的R根霉菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌液体菌剂，活细胞数为0.8～1.8×1010个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量；
(6)取含水分70％的新鲜蚕豆粉丝渣2000kg，加入经0.75％H2SO4处理的玉米芯粉和麸皮、玉米面，其中玉米芯粉、麸皮、玉米面的重量比为3∶2∶1，并加入相对于干物质硫酸铵为3％、尿素2％，调固体发酵含水分50％，充分混合均匀后用1％的石灰水调节PH至6.0，然后加入相对于干料总量为11％的FGR液体菌剂，充分搅拌混合均匀后，在发酵和低温干燥两用发酵池中经温度28～32℃通风搅拌发酵18～24小时后，再经40～60℃通热风干燥，制成F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌固体菌剂，该F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌固体菌剂活细胞数为1.0×1010个/克，粗蛋白28.2％。
实施例3
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)
(2)三角烧瓶液体菌种的培养
取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)
(3)液体扩大培养生产菌种
取新鲜玉米淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO410g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为60％的F306酵母融合菌、32％的G361白地霉菌、和8％的R根霉菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌液体菌剂，活细胞数为1.2～2.2×1010个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量；
(6)取含水分75％的新鲜玉米淀粉渣2000kg，加入经1％H2SO4处理的玉米芯粉和麸皮、玉米面，其中玉米芯粉、麸皮、玉米面的重量比为4∶3∶1，并加入相对于干物质硫酸铵为4％、尿素2％，调固体发酵含水分55％，充分混合均匀后用1％的石灰水调节PH至6.5，然后加入相对于干料总量为12％的FGR液体菌剂，充分搅拌混合均匀后，在发酵和低温干燥两用发酵池中经温度28～32℃通风搅拌发酵18～24小时后，再经40～60℃通热风干燥，制成F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌固体菌剂，该F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌固体菌剂活细胞数为1.2×1010个/克，粗蛋白26.8％。
实施例4
(1)试管液体菌种的培养，取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液100ml，加入(NH4)2SO4 0.1g，H3PO4 0.05ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于15×1.2cm的干燥试管中，经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，分别接种F306酵母融合菌、G361白地霉菌、和R根霉菌于试管液体培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为试管液体菌种(一级菌种)。
(2)三角烧瓶液体菌种的培养：
取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入(NH4)2SO4 1g，H3PO4 0.5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28～32℃培养24～48小时，即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种)
(3)液体扩大培养生产菌种：
取新鲜洋芋淀粉废水，经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入(NH4)2SO410g，H3PO4 5ml，充分溶解后调节PH至5.5～6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112℃，30分钟高压灭菌，冷却至32℃，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培养，振幅为100～120r/min，经温度28～32℃培养18～24小时发酵培养，其培养液为三级菌种。
(4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜粉丝废水不灭菌，将重量百分比为60％的F306酵母融合菌、35％的G361白地霉菌、和5％的R根霉菌三菌培养液接入后，经28～32℃培养18～24小时，通气搅拌发酵培养，其成熟的发酵液即为F306酵母融合菌、G361G361白地霉菌、和R根霉菌液体菌剂，活细胞数为1.2～2.2×1010个/ml；
(5)根据需要可逐级扩大产量；
(6)取含水分60％的新鲜洋芋渣2000kg，加入经1.2％H2SO4处理的玉米芯粉和麸皮、玉米面，其中玉米芯粉、麸皮、玉米面的重量比为4∶3∶1，并加入相对于干物质硫酸铵为4％、尿素3％，调固体发酵含水分50％，充分混合均匀后用1％的石灰水调节PH至6.5，然后加入相对于干料总量为12％的FGR液体菌剂，充分搅拌混合均匀后，在发酵和低温干燥两用发酵池中经温度28～32℃通风搅拌发酵18～24小时后，再经40～60℃通热风干燥，制成FGR固体菌剂，该FGR固体菌剂活细胞数为1.3×1010个/克，粗蛋白30.2％。
实施例5
一种F306酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌(Canadida tropicalis)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇(PEG)的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液(PBS)液反复冲洗，涂布于高渗选择型培养基(MMS)和高渗完全培养基(YPDS)平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出F306酵母融合菌。
所述的F306酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
实施例6：本发明作为畜禽饲料添加剂：将FGR固体菌剂以5～25％的比例加在猪、羊、奶牛饲料中进行饲喂。
本发明的F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌固体菌剂的产品质量分析及在作为畜禽饲料添加剂的实施效果：
通过多次重复计数检验，按上述工艺生产的微生物菌剂，其细胞总数随发酵参数的不同而存在差异，处于10×109～2×1011～12个/克之间，而活性细胞数量占到细胞总数的80％以上。
从2005年和2006年批量生产的微生物菌剂中各选择一批，按采用要求采取样品送甘肃草原生态研究所进行分析，结果见表1
表1 微生物菌剂中常规营养成分含量 ％
无氮浸出物(％)＝100-(水分％+粗蛋白质％+粗纤维％+粗脂肪％)
样品1＝2005年生产微生物菌剂之一批，以下同
样品2＝2006年生产微生物菌剂之一批，以下同
经多次检验，微生物菌剂干物质中粗蛋白质含量介于26.8％～30.2％之间，其差异主要来自原料配比与结构的不同。一般底物粗蛋白质含量越高，其产品的粗蛋白质越高。从表1可以看出，利用各种糟渣发酵生产的微生物菌剂，粗纤维含量较高。微生物菌剂主要矿物质含量分析结果见表2。
表2 微生物菌剂中主要矿物质元素含量
由表2可见，微生物菌剂中除钙比较缺乏外，钾、铁、锌、铜等元素含量较高。氨基酸含量18种氨基酸分析结果见表3。
表3 微生物菌剂中18种氨基酸含量 ％
主要有毒有害成分选择2006年生产的微生物菌剂样品，由甘肃省兽药饲料监察所分析了有毒有害含量，结果见表4。
表4 微生物菌剂中主要有毒有害成分含量
以样品2为基础，将微生物菌剂氨基酸的比例和结构与其他饲料或畜产品进行比较，结果见表5。
表5 微生物菌剂的11种氨基酸与有关饲料及畜产品氨基酸含量对比
*2号微生物菌剂的氨基酸含量
**牛肉、猪肉的氨基酸以100克蛋白质为基础，其他数据以国家饲料数据库为准
#R：微生物菌剂的氨基酸和表中其他饲料或畜产品中氨基酸的相关系数
样品2中18种氨基酸的总和为21.78％，占粗蛋白质的81.30％，说明产品粗蛋白的质量优良。
从18种氨基酸中选择与动物生产关系较为密切的11种，分别与啤酒酵母、豆粕、玉米蛋白粉、秘鲁鱼粉、肉粉、苜蓿草粉的氨基酸含量进行对比。借助相关分析法，计算微生物菌剂的氨基酸含量与上述几种饲料和牛肉、猪肉氨基酸含量的相关系数。
从表5可见，菌体蛋白的氨基酸与上述5种饲料氨基酸的相关系数，从大到小的顺序依次为：豆粕＞肉粉＞苜蓿草粉＞秘鲁鱼粉＞啤酒酵母。说明微生物菌剂氨基酸比例和结构与豆粕最为相似，其次为肉粉。此外，与猪肉蛋白的氨基酸相关系数也高达0.9174，说明菌体蛋白氨基酸结构与猪肉蛋白氨基酸也非常相似；与秘鲁鱼粉的相关系数是0.8172，提示当以菌体蛋白代替饲料中的鱼粉时，需要特别注意用其他原料将氨基酸调配平衡。
微生物菌剂的氨基酸和豆粕的非常相似，粗蛋白含量约为豆粕的50％，说明两倍数量的微生物菌剂中，氨基酸含量与豆粕基本相等，从图2可以看出，两者之间的变化趋势也非常接近。由此可见，在氨基酸方面，微生物菌剂是豆粕的良好替代品。
见图2，在配制饲料时，以2份的微生物菌剂代替1份的豆粕时，除赖氨酸与异亮氨酸略显不足外，其他主要氨基酸基本与豆粕基本相同。
微生物菌剂保存试验与饲喂效果
取同期生产的奶牛精料补充料、微生物菌剂、微生物菌剂奶牛精料补充料(含微生物菌剂5％)三种饲料，分别存放于白色磨口瓶中置于阴凉避光处，定期观察。结果表明，不含微生物菌剂的奶牛精料补充料在5个月时出现了霉变与结块和异味；微生物菌剂奶牛精料补充料保存9个月时出现霉变征兆和轻微的异味；微生物菌剂存放18个月时，仍具有酸香味，且无霉变征兆。
①利用微生物菌剂配制精料补充料进行奶牛养殖试验，结果见表6。
表6 微生物菌剂饲养奶牛效果试验数据*
*精料补充料中含微生物菌剂5％
②将微生物固体菌剂精料中饲喂奶牛，测定鲜奶成分变化，结果见表7。
表7 精料补充料中添加发酵液前后牛奶主要成分变化*
*按精料的5％喷洒微生物发酵液，试验在甘肃农业科学院奶牛场进行
③微生物固体菌剂浓缩饲料对欧拉成年羊的育肥效果见表8。
表8 肥育羊出栏活重和屠宰情况*
*试验在玛曲县萨合牧民新村产业基地完成，试验羊20只，每组5只。
使用本发明做育肥猪饲喂实验，在兰州市七里河区综合畜牧场和榆中万泉养殖场，分别作了育肥猪饲喂效果试验。
选择同品种，同日龄即60日龄20头育肥猪，实验组与对照组各10头。90日龄育肥猪84头，实验组与对照组各42头，每组为三群。试前20-30天驱虫、防疫。空腹称重。
在原日量中，分别减少0.5或1公斤混合料，加入0.5或1公斤微生物菌剂，其饲料配比如下表9：
表9 饲料配比
表10 育肥猪增重变化
饲喂结果：实验组与对照组比较，日增重T测量P＞0.05。差异均不显著。
微生物菌剂的成本主要由原料成本和生产费用两部分构成。
其原料成本决定于原料种类和配比，由于主要原料属于秸秆和各种下脚料，因此成本较低，平均930元/吨。
如果不采用此技术，一般以日产12吨、年产3000吨为例，估算生产成本为：
年生产销售3000吨，需流动资金25万元，固定资产投资约60万元。生产定员11人(人均月工资1500元)，管理人员4人(人均月工资1800元)，福利按工资的4％提取。估算成本为1145元/吨。
动物饲喂试验证明，微生物菌剂可以提高奶牛日产奶量1.55～2.75kg、乳脂率0.01～0.03个百分点、提高乳中非脂固形物0.05个百分点，总脂肪和总蛋白的日产量相应得到提高，乳糖降低0.04个百分点；微生物菌剂用于肉羊肥育，日增重提高29.1g/d～33.7g/d。将FGR固体菌剂以15～25％的比例加在猪饲料中进行饲喂，比对照猪增重96克/日.头。
Claims (4)
1.一种微生物固体菌剂的制备方法，微生物固体菌剂由F306酵母融合菌、G361白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)、根霉菌(Rhizopus)和固体培养基组成，其三种菌株总量的重量百分比为F306酵母融合菌为55～65％、G361白地霉菌为30～35％、根霉菌5～10％，所述的F306酵母融合菌的保藏号为CGMCC 2461；所述的G361白地霉菌(Geotrichum Candidum Link)是中国科学院微生物菌种中心保存的安全菌种，编号为AS.2.361；其特征在于包括有如下步骤：
A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；
b.菌种的培养：分别取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为一级菌种；
B液体培养基的制备及液体菌种的培养：
a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 5.5-6.5，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；
b.分别取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28-32℃、24-48小时培养，其培养液为二级菌种；
c.分别取F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100～120r/min、温度28～32℃、18～24小时培养，其菌液为三级菌种；
d.分别将重量百分比为F306酵母融合菌为55～65％、G361白地霉菌为30～35％、根霉菌5～10％三级菌种再扩大培养，三种菌在同一个发酵罐，经28-32℃、18-24小时的通气搅拌发酵培养，其菌液为F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌混合菌剂，或为四级菌种继续逐级扩大培养，用此菌剂作为制备固体菌剂的菌种；
C.固体菌剂的培养：
将含水比为60-80％新鲜的豆腐渣或粉丝渣或玉米淀粉渣或洋芋淀粉，加入经0.5-1.2％H2SO4处理的玉米芯粉和麸皮、玉米面，其中玉米芯粉、麸皮、玉米面的重量比为2～4∶1～3∶0.5～1，并加入相对于干料的0.2-4％的硫酸铵，相对于干料的0.1-3％的尿素，均匀搅拌，使其含水量达到45-65％，用1％的石灰水调节PH至5.5～6.5，然后加入相对于干料总量为8-12％F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌混合菌液，充分搅拌混合均匀后，在发酵和干燥两用发酵池中经温度28～32℃通风搅拌发酵18～24小时后，再经40～60℃通热风干燥，制成F306酵母融合菌、G361白地霉菌和根霉菌固体菌剂。
2.如权利要求1微生物固体菌剂的制备方法，其特征在于所述的F306酵母融合菌的制备有如下步骤：将酒精酵母菌(Saecharomycescervsiar)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1％的纤维素酶和1％蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33℃，得到酒精酵母原生质体；将热带假丝酵母菌(Canadida tropicalis)作母种的斜面转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5％的纤维素酶和0.5％的蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小时，温度33℃，得到热带假丝酵母原生质体；将热带假丝酵母原生质体经0.1％碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1∶1混合，将沉淀悬于35％聚乙二醇的促溶剂中，30℃水浴静止处理，pH 6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗，涂布于高渗选择型培养基和高渗完全培养基平板培养基上，经30℃、7天培养，平板生长出F306酵母融合菌。
3.如权利要求2所述的微生物固体菌剂的制备方法，其特征在于所述的F306酵母融合菌的培养基为：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用。
4.如权利要求1所述的微生物固体菌剂的应用，其特征在于：所述的微生物固体菌剂在畜禽饲料添加剂中的应用。
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