CN105918615A - 一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,属于生物饲料领域。本发明以稻麦秸秆为主要碳源,无机氮为主要氮源,高效纯种固态培养白腐菌菌酶制剂,并以大接种量转接到稻麦秸秆一期发酵培养基中,同时再接种系列木质纤维素降解菌和产朊假丝酵母菌,协同快速降解和转化,再添加芽孢杆菌和酿酒酵母进行二期发酵,乳酸菌三期发酵获得成品。本发明秸秆生物饲料木质素大幅度降低,真蛋白提高到11%以上,原料不需要灭菌,成品不需要干燥处理,菌酶丰富,生产成本极低,作为牛羊优质粗饲料和蛋白精料,添加量可达60%以上,也可以10%左右的添加量添加到单胃动物,适合大规模生产,饲养和经济效果很明显。

Description

一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法
技术领域
本发明属于生物饲料领域,涉及一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,特别涉及一种基于稻草、麦秆为原料的高效低成本的新型微生物粗饲料。
背景技术
在草原禁牧、提倡舍饲的环境下,粗饲料是牛羊等反刍动物的必需原料,特别是南方牛羊养殖的一个瓶颈是缺乏优质的粗饲料,种植苜蓿等牧草效果差,又占地,外地调运牧草成本高,也制约了长三角奶牛业的发展,但是南方稻草很多,麦秆也不少,是重要的粗饲料来源,但稻麦秸秆质地粗硬,粗蛋白2.5%左右,真蛋白2%以下,远低于玉米秸、花生秧、甘薯藤等的含氮量,也含有较多的木质素,目前秸秆大多数没有加工处理直接饲喂,但直接饲喂存在适口性差、采食量低、消化率不高、营养价值极低等缺点。
稻麦秸秆总能含量相当于干草,但其营养价值不到干草的一半,主要原因是可利用营养不足。众所周知,秸秆含有较多纤维素、半纤维和木质素。但木质素是由香豆醇、松柏醇、芥子醇和愈伤木基醇等交联聚合形成的苯基丙烷类聚合物,是植物细胞壁中主要支撑结构,并保持细胞壁的不通透性,抵抗微生物攻击及抗氧化等。木质素和半纤维素形成牢固结合层,紧紧地包围着纤维素,阻碍酶和其他物质与纤维素的接触,大大降低了纤维素的消化率。另一方面,虽然反刍动物瘤胃内含有大量微生物,可分泌纤维素酶,分解利用纤维素和半纤维素,但缺乏降解木质素的酶,木质素不能被瘤胃微生物降解;也直接影响了被木质素保护着的纤维素和半纤维素的有效降解和释放,这就限制了反刍动物对可消化的纤维素和半纤维素等营养成分的消化利用,这是导致秸秆的利用率降低的主要因素。因此,合理利用秸秆资源的前提就是极大程度地去除其中的木质素。加上稻草和麦秆的氮素、可溶性糖、维生素A、D、钙、镁、磷、锌、钴、铜、硫、硒等都极其贫乏,稻草和麦秆必须经系列有效加工才能真正具有饲用价值。
现今秸秆处理方法大体上可分为物理方法、化学方法和生物方法三大类,其中物理方法包括切割、揉丝、粉碎、碾压、热喷、汽爆等,主要是部分提高消化率、适口性,但不改变秸秆的化学组成,不能提高秸秆的营养成分,效果好些的蒸汽爆破设备投资大,特别是大规模生产时爆破设备产能跟不上,能耗要求较高,进而使得生产成本过高,不易推广。化学方法传统上包括碱化处理、酸化处理或其他药剂处理,虽然可以部分改变秸秆的化学组成,提高玉米秸秆的消化率,但是污染高成本大使这一技术不能很好地推广。氨化饲料经常有导致动物中毒的情况发生,对设备的要求较高,环境污染严重,氨的损失率大,并污染空气,真蛋白增加有限,纤维降解少,木质素不降解,只是部分溶解。这一系列问题都成了化学法处理秸秆饲料技术的瓶颈,总体上讲,这些方法都没有提高真蛋白和有机功能物质含量。
与之相比微生物处理具有环保、高效率等特点,秸秆生物饲料适口性好、消化率高、营养价值高。青贮、微贮、黄贮是目前秸秆生物处理的主要方法,也是主要的秸秆发酵饲料,即使有时添加了各种辅料或酶的发酵也是微贮范畴。青贮主要是利用不用于粮食生产的青秸秆的厌氧保存,在农区造成人畜争粮争地的矛盾。收获粮食后的秸秆用于微贮、黄贮又往往营养不够,木质纤维太多,处理很容易失败,如果加了其它较多高成本的辅料共发酵,饲用成本也增加。总体上讲,青贮、微贮、黄贮这些处理方法,主要是延长贮存保质期,并能够改善秸秆饲料的适口性,适当提高牲畜的采食量和采食速度,可以提高牲畜的机体免疫能力,预防并治疗肠道疾病,但是青贮、微贮、黄贮都不会真正提高真蛋白含量,没有降低木质素含量,纤维素和半维素转化也很有限,对动物的秸秆消化率没有明显提高,加上大规模青、黄贮在制作和饲用时都容易染菌而失败,特别是稻麦秸黄贮,相对玉米秸等,由于营养更低,不易微贮成功,几乎没有产业化案例。
因此,人们一直在研究提高秸秆生物处理的效果,提高蛋白质含量,降低木质纤维素,提高饲用效果。纤维降解菌和部分益生菌好氧共发酵秸秆研究较多,如发明专利CN102696865B、CN103392918B、CN100337555C、CN101690554B、CN102132762B、CN102113622B、CN101946853B、CN102578441B和CN102488084B等,一般选用木霉、白地霉、黑曲霉、米曲霉、酵母、芽孢杆菌、乳酸菌等几种进行好氧发酵,没有白腐菌对木质素的降解,自然也会影响纤维素的降解,也导致好氧发酵增加真蛋白不明显,有些靠辅料本身蛋白源增加蛋白质量,有些好氧发酵时间太长(如10天)易染菌,耗时长,成本也更高。以粗蛋白计算蛋白的增加量本来就不准确,发酵成品用干燥的处理方法也不太好,菌酶失活严重,能耗高,适口性也往往不太好。有些专利如CN1319464C,秸秆封膜包装厌氧共发酵,但会使好氧的木霉、白地霉发挥作用有限,尿素变真蛋白有限,木质纤维降解更有限。
为了提高木质素的降解,有些相对科学的发明专利进行纤维降解菌和白腐菌共发酵,如103146606B和103549129B,前者用黄孢原毛平革菌、木霉、酵母菌、枯草杆菌和乳酸菌的等共发酵,秸秆好氧发酵并和厌氧菌一起发酵,但是白腐菌生长慢和木霉生长快不协调,导致好氧发酵时间太长,成本高,易染菌;后者用生长慢的黄胞原毛平革菌,同生长快的木霉、青霉、曲霉共发酵会出现不协调,发酵时间长,木质素产酶高峰一般在7天后,发酵时间也要10天,压实和密封下木质素降解不显著,降解率一般不到20%。
本发明采用生长速度比木霉、青霉、曲霉等更快的脉孢霉,纤维素酶系和半纤维素酶系比较全,其中不同种脉孢霉各含有漆酶(Lacs)、锰过氧化物酶(Mnps),配合好可加快木质素降解。在脉孢霉为优势菌群的同时,也配以能附带降解木质素酶的特殊米曲霉、青霉或木霉,进行共发酵。考虑到黄胞原毛平革菌是降解木质素最好的菌种之一,但生长慢,本发明特意另外固体纯种发酵,再以大接种量接到脉孢霉培养基中,和脉孢霉及其它几种霉菌共发酵,高效快速降解木质素。之后,再加酵母菌和芽孢杆菌搅拌混合二次发酵,经一天的菌群演变后,再添加乳酸菌等厌氧益生菌进行三次厌氧发酵,成品不需要干燥,菌酶活性全保留,能耗低,适口性好,饲用效果显著。
目前,脉孢霉降解稻草制作秸秆饲料的专利有CN103098983B、CN103229888B,但前者以过量体积石灰水浸泡及加热蒸煮,在实际大规模生产中费水、费热、费空间,操作不方便,不适合大规模生产,还要酸中和及添加大量玉米、米糠或渣粉等吸收大量浸泡蒸煮水分,生产成本高(1500元每吨)。发酵容器以竹筐、钢丝网承载只适合小农小作坊制作,但实际上小养殖户不会有意识和能力去实施,另外没有较全面的木质素酶系,对木质素降解很有限。后者用挥发性酸去预处理,如果大规模生产,靠酸的自然挥发除酸,会造成空气污染,也很浪费,而且稀酸处理主要是溶解半纤维素,对木质素几乎溶解很少,自然会影响脉孢霉降解稻草效果,另外只有粗糙脉孢霉降解稻草,木质素酶系不全,对木质素降解有限,严重影响饲料利用率。
总体上,上述发酵成品都进行干燥,菌酶活性损失大,能耗高,适口性差,后续处理没有优化集成。
发明内容
本发明目的是提供一种基于稻草、麦秆的微生物饲料的规模化加工方法,使其真蛋白大幅度增加,木质素大幅度降解,纤维素和半维素有效转化,益生菌、功能酶、功能营养物质丰富,必需氨基酸匀恒,饲养效果显著,价廉物美,保存期长,主要用于反刍动物,市场容量大,环境友好,社会和经济效益明显。
本发明所述的基于稻草、麦秆的微生物粗饲料是以粉碎的稻草、麦秆为主要碳源,添加尿素等无机氮为主要氮源,再大量添加预先发酵的白腐菌,然后经生长迅速且具有降解木质素能力的系列食品级纤维降解霉菌一期发酵预处理,再以好氧益生菌芽孢杆菌和酵母菌为发酵菌种进行二期发酵,最后再添加部分麸皮或米糠等低价干料调低水分,接种乳酸菌等充分混匀后,分装在单向膜厌氧袋中密封保存或发酵桶(池)厌氧发酵,即三期发酵获得成品。
本发明所有菌种中,霉菌为:粗糙脉孢霉(Neurospora crassa),好食脉孢霉(Neurospora sitophila),间型脉孢霉(Neurospora intermedia),米曲霉(Aspergillusoryzae),木霉属(Trichoderma sp.)的任意一种或多种;
白腐菌为黄胞原毛平革菌(Panerochaete chrysosporium);
酵母菌为:热带假丝酵母(Candida tropicalis),产朊假丝酵母(Candida utilis),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的任意一种或多种;
乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus),嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis),干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等的任意一种或多种;
芽孢杆菌为:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的任意一种或多种。
上述菌种为普通常规的商品化菌株,可在中国各大微生物菌种保藏管理中心或市场上购买到。
本发明的目的是这样实现的,一种高效规模化的稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,具体包括如下步骤:
S1.白腐菌菌酶制剂预生产
(1)白腐菌培养基
斜面培养基和平板培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,定容1L中,pH 5.0,110℃灭菌30min。接种37℃培养4-10天。
种子液体培养基:KH2PO4 2g,MgSO4 0.3g,CaCl2 0.3g,蛋白胨5g,酵母浸膏3g,麦芽汁3g,酒石酸氨1g,定容于1L中,其中FeSO4·7H2O、ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4.4H2O和CoCl2各0.000001-0.01%,pH 5.5。500mL三角瓶中加100mL培养基,110℃灭菌30min。
白腐菌固态纯种发酵培养基:按重量计,切割、揉丝、粉碎后的稻麦秸秆(20mm以下)占培养基的60-90%(以干料计),麸皮或米糠占10-35%,酒石酸胺、硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.01-1%,CaCO3占0.1-2%,KH2PO4占0.1-3%,MgSO4、Mg(NO3)2、或MgCl2占0.01-1%,FeSO4·7H2O占0.01-0.05%。ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、CoCl2、NaMoO4各占0.000001-0.01%,吐温80占0.01-1%,藜芦醇(3,4-二甲氧基苯甲醇,Veratryl alcohol)占0.001-0.1%,草酸占0.001-0.1%,培养基最终含水量为45-65%,用柠檬酸调整到pH 5-6。
(2)培养方法
将白腐菌在斜面培养基上划单菌落复壮,再挑选强壮的单菌落,各接种在新的白腐菌斜面培养基30-40℃生长,斜面培养基菌种中的孢子用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中,装液量100-250ml/L三角瓶,150-220r/min,25-38℃,培养48-192h,再各以0.1-1%(V/V)接种量,混合转接到200L-1000L的种子罐中,于30-40℃,150-220r/min通无菌空气培养24-48h,活菌总数为1×107cfu/ml以上,再以1-10%接种量(重量)转接到上述白腐菌固态发酵种子培养基(气相脉动双动态固态发酵罐),充分搅拌后,30-40℃,发酵48-192h,获得高活性白腐菌菌酶制剂,大生产可以多级放大生产种子。
S2.第一期稻麦秸秆发酵
(1)脉孢霉等纤维降解霉菌种子培养基和生产培养基
脉孢霉等斜面培养基和平板培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,定容1L中,pH 5.0,110℃灭菌30min。接种32℃培养2-5天。
脉孢霉等种子液体培养基:KH2PO4 2g,MgSO4 0.3g,CaCl2 0.3g,蛋白胨5g,酵母浸膏3g,麦芽汁或红糖3g,硫酸氨或尿素5g,FeSO4·7H2O 0.005g,ZnSO40.0014g,MnSO4·4H2O 0.0016g,CoCl20.002g,定容于1L中,pH 5.5。500mL三角瓶中加100mL培养基,110℃灭菌30min。
产朊假丝酵母等酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100mL):葡萄糖2g、酵母浸出物1g、蛋白胨1g、尿素1g,琼脂2g,pH值约6.0。
产朊假丝酵母等酵母菌液态培养基:成分同斜面培养基,不加琼脂。
脉孢霉等固态发酵种子培养基:按重量计,切割、揉丝、粉碎后的稻麦秸秆(20mm以下)占培养基的70-95%(以干料计),麸皮或米糠占5-30%,硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.1-2%,尿素0.1-2%,碳酸钙0.1-5%,磷酸二氢钾0.1-3%,硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-1%,培养基最终含水量为53-65%,用柠檬酸调整到pH 5-6。
稻麦秸秆一期发酵培养基:按重量计,切割、粉碎后的稻麦秸秆(20mm以下)占培养基的90%以上(以干料计),麸皮或米糠占0-5%,硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.5-5%,尿素0.5-5%,碳酸钙0.1-5%,磷酸二氢钾0.1-3%,硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-1%。FeSO4.7H2O,ZnSO4,CuSO4·5H2O,MnSO4.4H2O,CoCl2,NaMoO4各占0.000001-0.01%,吐温80占0.01-1%,培养基最终含水量为45-65%,用柠檬酸调整到pH 5-6。
(2)培养方法
将脉孢霉、米曲霉、木霉等分别在斜面培养基上划单菌落复壮,再分别挑选强壮的单菌落,各接种在新的脉孢菌等斜面培养基25-38℃生长,斜面培养基菌种中的孢子分别用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中,装液量100-250ml/L三角瓶,150-220r/min,25-38℃,培养24-48h,再各以0.1-1%(V/V)接种量(脉孢霉、米曲霉、木霉比例为8:1:1),混合转接到200L-1000L的种子罐中,于25-38℃,150-220r/min培养24-48h,活菌总数为1×107cfu/ml以上。再以1-10%接种量(重量)转接到上述脉孢霉等固态发酵种子培养基,充分搅拌后,25-38℃,通无菌空气发酵24-96h,作为固态发酵生产种子。
产朊假丝酵母或热带假丝酵母在上述酵母液态培养基上培养放大,根据生产规模确定放大级别,得到用于秸秆一期固态发酵的酵母种子液。
脉孢霉等固态发酵生产种子以1-15%接种量(重量)接种到上述稻麦秸秆发酵培养基,另加0.1-1%(重量比)上述酵母种子液,再以1-15%接种量(重量比)接入上述自制的白腐菌菌酶制剂,和0.01-0.5%(重量比)的商品漆酶,充分搅拌后,移入发酵室通气规模发酵(室内分层通气、散热),25-38℃,发酵24-72h,完成一期发酵。进入连续生产阶段,一期固态发酵接种生产种子为上次一期秸秆预处理发酵后的产物(也是固态菌剂),按1-15%接种量接种(重量比),另加3-15%(重量比)新鲜的白腐菌菌酶制剂,及0.01-0.1%的商品漆酶(重量比),再充分搅拌后好氧发酵。
S3.第二期稻麦秸秆发酵
(1)芽孢杆菌培养基
芽孢杆菌斜面和平板菌种培养基:蛋白胨10g,牛肉膏粉5g,氯化钠5g,琼脂15g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml,最终pH7.0±0.2。110-121℃灭菌20-30min。
芽孢杆菌摇瓶种子培养基和种子罐液态培养基:牛肉膏5.0g/L,蛋白胨20.0g/L,葡萄糖5.0g/L,FeCl2·6H2O 0.07g/L,MnC12·7H2O 0.01g/L,MgSO4·7H2O0.15g/L,pH 6.5-7.0,110-121℃灭菌20-30min。
(2)酿酒酵母培养基
酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100ml):葡萄糖2g、酵母浸出物1g、蛋白胨2g、琼脂2g,pH值约6.0。
摇瓶种子培养基和种子罐液态培养基:成分同斜面培养基,不加琼脂。
(3)二期稻麦秸秆固态发酵培养基由一期发酵产物,加5-10%(重量比)稻麦秸秆粉组成,含水量为40-50%(重量比)。首次启动二期发酵要制作酵母菌和芽孢杆菌液体种子液,以0.1-5%接种量(重量比)接到一期秸秆发酵产物中。
(4)培养方法
芽孢杆菌液体菌种培养:
无菌条件下分别将4℃保存的芽孢杆菌菌种,即地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)各接一环至斜面培养基中,32-37℃培养12-36h复苏菌种。再在平板上划单菌落,挑取健壮种子,分别接种到上述芽孢杆菌摇瓶种子培养基,装液量100-300ml/L三角瓶,150-240r/min,28-38℃,培养12-24h,再各以0.1-1%的接种量接种到同一100L-1000L种子罐培养基混合扩大培养,150-240r/min,通气量为20-50L/min,培养12-24h后制得复合芽孢杆菌液体种子,活菌总数为2×108cfu/ml以上。
酵母菌液体菌种培养:
无菌条件下分别将4℃保存的酿酒酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae),接一环至斜面培养基中,28-38℃培养24-48h复苏菌种。再挑单菌落各在平板上划单菌落,挑取健壮种子,分别接种到上述酵母菌摇瓶种子培养基,装液量100-300ml/L三角瓶,150-240r/min,28-38℃,培养12-36h,再以各以0.1-1%的接种量接种100L-1000L种子罐培养基扩大培养,150-240r/min,通气量为20-50L/min,培养24-48h后制得酿酒酵母液体种子,活菌总数为2×108cfu/ml以上。
二期稻麦秸秆固态发酵:
上述一期稻麦秸秆发酵活性产物通过输送带送到开放式大型搅拌罐上,添加5-10%(重量比)的稻麦秸秆组成二期发酵培养基,上述芽孢杆菌液体种子以0.1-5%接种量(重量比),酿酒酵母菌液以0.1-5%接种量(重量比),都接种到二期稻麦秸秆发酵培养基中,充分搅拌,28-38℃好氧发酵12-72h,基本完成菌群演变,得到第一批二期稻麦秸秆固态发酵产物。进入连续生产阶段,种子为上次第二期稻麦秸秆发酵的剩余产物(活性固态菌剂),按1-20%接种量(重量比),接种到下次二期稻麦秸秆发酵培养基中,这样循环接种利用。
S4.第三期稻麦秸秆固态发酵
(1)乳酸菌培养基
MRS斜面培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,牛肉膏5,葡萄糖20,柠檬酸二铵2,吐温80 1.0ml,乙酸钠25,K2HPO4 2,MgSO4·7H2O 0.58,MnSO4·4H2O0.25,琼脂20,pH 7.0。
摇瓶和种子罐乳酸菌种子液态培养基:大豆低聚糖2.25%、葡萄糖2.00%、蛋白胨1.25%、酵母粉1.25%、番茄汁6.50%、吐温80.10%、磷酸氢二钾0.20%。pH 6.5,1L的三角瓶装液量200ml。
以上培养基配好后均在115-120℃条件下高压灭菌20-30min。
(2)三期发酵培养基
在二期稻麦秸秆固态好氧发酵后的产物上,加5-15%(重量比)麸皮或米糠,充分混匀,组成三期发酵培养基,含水量为33-40%(重量比)。首次启动三期发酵要制作乳酸菌液体种子液,以0.1-3%(重量比)接种量接到三期发酵培养基进行三期发酵。
(3)培养方法
乳酸菌液态种子培养:
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus),嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),乳酸乳杆菌(Lactobacilluslactis),干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等在MRS斜面培养基上划线活化,在33-38℃培养24-72h进行复壮,并形成单菌落,再各挑取单菌落,接种到摇瓶乳酸菌种子培养基,通入氮气,35-38℃静置培养24-72h,定时取样,测定生物量。再各按0.1-1%接种量接种到种子罐乳酸菌种子培养基,通入氮气,静置混合培养24-60h,定时取样,测定生物量,活菌总数为5×108cfu/mL以上。
第三期稻麦秸秆固态发酵:
在三期稻麦秸秆固态发酵培养基上,以0.1-3%接种量(重量比)接种乳酸菌种子液到三期发酵培养基上,经开放式大型搅拌罐中充分搅拌后,尽快装入单向膜厌氧袋、厌氧桶或厌氧池中常温下保存,即进行三期厌氧发酵,含水量33-40%(重量比),产品保质期可达1到2年,保存二到三个星期活菌数达到高峰,可达1亿cfu/g固体。
进入连续发酵阶段,三期发酵二个星期后,以此成品为种子,按1-10%(重量比)接种量,接到上述三期稻麦秸秆固态发酵培养基中,搅拌充分后,装入单向膜厌氧袋、厌氧桶或厌氧池,常温下保存,即进行三期厌氧发酵。
本发明有以下明显优点:
(1)技术集成度高,产品附加值高。稻麦秸秆经粉碎及添加自制的白腐菌高活性菌酶制剂,经系列木质纤维素降解菌和益生菌三步发酵成成品,木质素大幅度降低,真蛋白从2%提高到11%以上,只需添加一定的能量饲料,就可以用于反刍动物,基本不需很贵的蛋白精料,产品品质明显好于青贮,保质期一年以上。由于成品不需要干燥处理,活菌数极高,酶量丰富,杂菌极少,饲养效果明显:大幅度提高饲料利用率,提高产量,改善肠道环境,提高免疫力和抵抗力,代替抗生素,改善肉质。
(2)设备投资少,但适合大规模产业化。秸秆饲料靠一般小农作坊实行不太现实,多少年来一直得不到真正推广,本发明秸秆不需要蒸煮或汽爆预先处理,只是种子罐才需要纯种培养,生产物料不需要高温灭菌处理,可以好氧粗放式大规模发酵,厌氧发酵灵活化,产品不需干燥处理,因此设备投资少,适合大规模化生产。
(3)产品成本低,市场规模和潜力巨大。本发明固体原料价格低廉,不需高温灭菌,基本不需要购买木质素酶、纤维素酶制剂来降解木质纤维质原料,成品不需要干燥处理。本秸秆饲料产品的原料为150元每吨,包括前处理是粉碎等,三个期发酵水、电40元每吨,人工费用80元每吨,添加麸皮或米糠等为100元每吨,尿素等氮素及微量元素共计40元,菌种培养费用为40元每吨产品计,设备折旧和厂房租费为30元每吨产品计,本发明稻麦秸秆饲料生产成本为480元每吨(自用),如果是加上包装袋200元每吨,共计680元每吨(对外销售用)。含有11%真蛋白的生物饲料目前出售价格为2400元以上每吨,因此本产品利润空间及让利空间巨大。目前牛羊生物饲料市场几乎为空白,本产品是高蛋白活性粗饲料,几乎不需要添加蛋白饲料,只需添加能量饲料和预混料,可达60%以上的添加量,所以市场空间巨大,真正解决农区或南方养殖业的优质牧草缺乏的粗料瓶颈,促进中国反刍动物的大规模兴起,及工厂化生产。另外,也可以10%左右的添加量添加到单胃动物。
(4)生产周期短,经济效益高。一般白腐菌生长慢,同木霉等共发酵时间也长,很容易染菌,所以白腐菌处理的秸秆无法产业化。本发明秸秆饲料,采用生长极快的脉孢霉作为主要菌种,并接种量大,再加产木质素酶的米曲霉和木霉为辅助菌种,另外大接种量添加单独预先培养的白腐菌,加上粗糙脉孢霉产漆酶和好食脉孢霉产锰酶的协同,及激活剂的促进作用,木质素降解快速明显,除了制种时间多几天外,生产周期很短,一般一期发酵为2天,二期发酵为1天,三期发酵就是库存期(二到三星期),实际上共为3天的生产期,销售得当时,周转周期为二到四星期,资金周转快,加上产品成本低,售价高,经济效益极高。
(5)明显的生态和社会效益。本发明化废为宝,同时消除栏舍恶臭,有利于消除农副业和养殖业的污染,增加养殖业和饲料业的收入,改善肉质,提高肉产量,降低粮食饲用,解决三农问题和民生问题,及食品安全和粮食安全问题,因此本发明是具有明显的生态和社会意义,符合国家绿色发展方向的朝阳产业。
具体实施方式
下述实施案例中所用的菌种仅为举例说明,不是对本发明的限制,本发明保护范围中的菌种都实现发明目的。
实施例1:白腐菌菌酶制剂预生产
(1)白腐菌培养基。
斜面培养基和平板培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,定容1L中,pH 5.0,110℃灭菌30min。接种37℃培养4天。
种子液体培养基:KH2PO4 2g,MgSO4 0.3g,CaCl2 0.3g,蛋白胨5g,酵母浸膏3g,麦芽汁或葡萄糖3g,酒石酸氨1g,定容于1L中,其中FeSO4·7H2O、ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4.4H2O和CoCl2各0.001%,pH 5.5。500ml三角瓶中加100ml培养基,110℃灭菌30min。
白腐菌固态发酵种子培养基:按重量计,切割、揉丝、粉碎后的稻麦(20mm以下)占培养基的70%(以干料计),麸皮或米糠占25%,酒石酸胺、硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.2%,CaCO3占1%,KH2PO4占1%,MgSO4、Mg(NO3)2、或MgCl2占0.05%,FeSO4.7H2O占0.01%。ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4.4H2O、CoCl2、NaMoO4各占0.001%,吐温80占0.1%,藜芦醇(3,4-二甲氧基苯甲醇,Veratryl alcohol)0.025%,草酸0.05%,培养基最终含水量为55%,用柠檬酸调整到pH 5.5。
(2)培养方法
将一种典型白腐菌,即黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium,CICC40719)在斜面培养基上划单菌落复壮,再挑选强壮的单菌落,各接种在新的白腐菌斜面培养基35℃生长,斜面培养基菌种中的孢子用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中,装液量200ml/L三角瓶,200r/min,37℃,培养36h,再各以0.1%(V/V)接种量,混合转接到200L的种子罐中,于37℃,200r/min通无菌空气培养36h,活菌总数为1×107cfu/ml以上,再以2%接种量(重量)转接到上述白腐菌固态发酵种子培养基(气相双动态固态发酵罐),充分搅拌后,37℃,通气发酵124h,获得固态发酵白腐菌菌酶制剂。
实施例2:第一期稻麦秸秆发酵
(1)脉孢霉等纤维降解菌种子培养基和生产培养基。
脉孢霉等斜面培养基和平板培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,定容1L中,pH 5.0,110℃灭菌30min。接种32℃培养2天。
脉孢霉等种子液体培养基:KH2PO4 2g,MgSO4 0.3g,CaCl2 0.3g,蛋白胨5g,酵母浸膏3g,麦芽汁或红糖3g,硫酸氨或尿素5g,FeSO4·7H2O 0.005g,ZnSO40.0014g,MnSO4·4H2O 0.0016g,CoCl2 0.002g,定容于1L中,pH 5.0。500ml三角瓶中加100ml培养基,110℃灭菌30min。
产朊假丝酵母菌等斜面培养基和平板菌种培养基(100ml):葡萄糖2g,酵母浸出物1g,蛋白胨1g,尿素1g,琼脂2g,pH值约6.0。
产朊假丝酵母液态培养基:成分同斜面培养基,不加琼脂。
脉孢霉等固态发酵种子培养基:按重量计,切割、揉丝、粉碎后的稻、麦(20mm以下)占培养基的80%(以干料计),麸皮或米糠占16%,硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占1%,尿素1%,碳酸钙占1%,磷酸二氢钾占0.5%,硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.05%,培养基最终含水量为55%。
稻麦秸秆发酵培养基:按重量计,切割、揉丝、粉碎后的稻、麦秸秆(20mm以下)占培养基的90%(以干料计),麸皮2%,硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占2%,尿素2.5%,碳酸钙占2%,磷酸二氢钾占1%,硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.2%。FeSO4.7H2O,ZnSO4 0.0014g,CuSO4·5H2O 0.0015g,MnSO4.4H2O 0.0016g,CoCl2,NaMoO4各占0.001%,0.1%吐温80,培养基最终含水量为55%,用柠檬酸调整到pH 5.5。
(2)培养方法
将粗糙脉孢霉(Neurospora crassa,CGMCC3.1600)、好食脉孢霉(Neurosporasitophila,CGMCC3.1618)、间型脉孢霉(Neurospora intermedia,CGMCC 3.591)、米曲霉(Aspergillus oryzae var.effusus CGMCC 3.2825)、木霉(Trichodermasp.CICC 40261)等分别在斜面培养基上划单菌落复壮,再分别挑选强壮的单菌落,各接种在新的脉孢菌等斜面培养基35℃生长,斜面培养基菌种中的孢子分别用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中,装液量200ml/L三角瓶,220r/min,35℃,培养36h,再各以0.1%(V/V)接种量(粗糙脉孢霉、好食脉孢霉、间型脉孢霉、米曲霉、木霉比例为3:3:2:1:1),混合转接到200L的种子罐中,于35℃,200r/min培养24h,活菌总数为1×107cfu/ml以上。再以3%接种量(重量)转接到上述脉孢霉等固态发酵种子培养基,充分搅拌后,35℃,发酵48h,作为固态发酵生产种子。
热带假丝酵母(Candida tropicalis,CGMCC 2.637),产朊假丝酵母(Candidautilis,CGMCC 2.1180)在上述酵母液态培养基上培养放大,根据生产规模确定放大级别。
脉孢霉等固态发酵生产混合种子以4%接种量(重量)接种到上述稻、麦秸秆发酵培养基,另加0.4%上述酵母液,及5%上述自制白腐菌菌酶制剂,和0.04%的商品漆酶(苏柯汉,酶活力:380LCU/g,下同),充分搅拌后,移入发酵室通气规模发酵(室内分层通气、散热),35℃,发酵48h,完成一期发酵。进入连续生产阶段,一期固态发酵接种生产种子为上次一期秸秆预处理发酵后的固态菌剂,按5%接种量接种,另加5%新鲜的白腐菌菌酶制剂,0.05%的商品漆酶,再充分搅拌后好氧发酵。
实施例3:第二期稻麦秸秆发酵
(1)芽孢杆菌培养基
芽孢杆菌斜面和平板菌种培养基:蛋白胨10g,牛肉膏粉5g,氯化钠5g,琼脂15g,葡萄糖20g,蒸馏水1000ml,最终pH7.0±0.2。121℃灭菌20min.
芽孢杆菌摇瓶种子培养基和种子罐培养基:牛肉膏5.0g/L,蛋白胨20.0g/L,葡萄糖5.0g/L,FeCl2·6H2O 0.07g/L,MnC12·7H2O 0.01g/L,MgSO4·7H2O 0.15g/L,pH 6.5-7.0,110-121℃灭菌20min。
(2)酿酒酵母培养基
酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100ml):葡萄糖2g,酵母浸出物1g,蛋白胨2g,琼脂2g,pH值约6.0。
摇瓶种子培养基和液态种子罐培养基:成分同斜面培养基,不加琼脂。
(3)二期稻麦秸秆固态发酵培养基由一期发酵产物,加5%稻、麦秸秆粉组成,含水量为50%。首次启动二期发酵要制作酿酒酵母菌和芽孢杆菌液体种子液,以2%接种量接到一期秸秆发酵产物中。
(4)培养方法
芽孢杆菌液体菌种培养:
无菌条件下分别将4℃保存的芽孢杆菌菌种,即地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis,CGMCC 1.813)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,CGMCC 1.884)各接一环至斜面培养基中,37℃培养24h复苏菌种。再在平板上划单菌落,挑取健壮种子,分别接种到上述芽孢杆菌摇瓶种子培养基,装液量200ml/L三角瓶,220r/min,37℃,培养16h,再各以0.1%的接种量接种到同一200L种子罐培养基混合扩大培养,220r/min,通气量为50L/min,培养16h后制得复合芽孢杆菌液体种子,活菌总数为2×108cfu/ml以上。
酵母菌液体菌种培养:
无菌条件下分别将4℃保存的酿酒酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae,CGMCC 2.1527),接一环至斜面培养基中,32℃培养24h复苏菌种。再挑单菌落各在平板上划单菌落,挑取健壮种子,分别接种到上述酵母菌摇瓶种子培养基,装液量200ml/L三角瓶,220r/min,32℃,培养16h,再以各以0.2%的接种量接种200L种子罐培养基扩大培养,220r/min,通气量为30L/min,培养24后制得酿酒酵母菌液体种子,活菌总数为2×108cfu/ml以上。
二期稻麦秸秆固态发酵:
上述一期稻麦秸秆发酵活性产物通过输送带送到开放式大型搅拌罐上,添加5%稻、麦秸秆碎粉组成二期发酵培养基,上述芽孢杆菌液体种子以1%接种量,酿酒酵母菌液以1%接种量,都接种到二期稻、麦秸秆发酵培养基中,充分搅拌,35℃好氧发酵24h,基本完成菌群演变,得到第一批二期稻、麦秸秆固态发酵产物。进入连续生产阶段,种子为上次第二期稻、麦秸秆发酵的剩余产物(活性固态菌剂),按5%接种量,接种到下次二期稻、麦秸秆发酵培养基中,这样循环接种利用。
实施例4:第三期稻麦秸秆固态发酵
(1)乳酸菌培养基
MRS斜面培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,牛肉膏5,葡萄糖20,柠檬酸二铵2,吐温80 1.0ml,乙酸钠25,K2HPO4 2,MgSO4·7H2O 0.58,MnSO4·4H2O0.25,琼脂20,pH 7.0。
摇瓶和种子罐乳酸菌种子液态培养基:大豆低聚糖2.25%、葡萄糖2.00%、蛋白胨1.25%、酵母粉1.25%、番茄汁6.50%、吐温80.10%、磷酸氢二钾0.20%。pH 6.5,1L的三角瓶装液量200ml。
以上培养基配好后均在120℃条件下高压灭菌20min。
(2)三期发酵培养基
在二期稻、麦秸秆固态好氧发酵后的产物上,加14%麸皮或米糠,充分混匀,组成三期发酵培养基,含水量为35%。首次启动三期发酵要制作乳酸菌液体种子液,以0.5%接种量接到三期发酵培养基进行三期发酵。
(3)培养方法
乳酸菌液态种子培养:
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,CGMCC 1.557),保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus,CGMCC 1.1482),嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus,CGMCC 1.2467),乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis,CGMCC 1.2467),干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,CGMCC 1.62)等在MRS斜面培养基上划线活化,在37℃培养36h进行复壮,并形成单菌落,再各挑取单菌落,分别接种到摇瓶乳酸菌种子培养基,通入氮气,37℃静置培养36h,定时取样,测定生物量。再各按0.1%接种量接种到种子罐乳酸菌种子培养基,通入氮气,混合静置培养48h,定时取样,测定生物量,活菌总数为5×108cfu/ml以上。
第三期稻麦秸秆固态发酵:
在三期稻、麦秸秆固态发酵培养基上,以0.5%接种量接种乳酸菌种子液到三期发酵培养基上,开放式大型搅拌罐中充分搅拌后,尽快装入单向膜厌氧袋,即进行三期厌氧发酵,含水量35%,产品保质期可达1到2年,保存二到三个星期益生菌活菌数达到高峰,可达1亿cfu/g固体。其中25℃放置二星期后产品经测定,结果如表1。
进入连续发酵阶段,三期发酵二个星期后,以此成品为种子,按2%接种量,接到上述三期稻、麦秸秆固态发酵培养基中,搅拌充分后,装入单向膜厌氧袋,常温下保存,即进行三期厌氧发酵,得到产品。
表一 三步发酵前后水稻、小麦秸秆生物粗饲料主要成份测定
实施例5:本发明生物饲料的饲用效果
本发明生物饲料在江苏省丹阳市访仙镇访东村羊场进行湖羊饲用试验,挑选体重和状况相近的4月龄湖羊,随机分为试验组和对照组,每组各10头,公母各半并去势。试验期为60d,预饲期10d内进行体内外驱虫、健胃,预饲期与试验期管理相同,试验期开始清晨空腹开始称重,试验期结束时清晨空腹称重,每只试验羊均为单栏饲喂,自由饮水,采食控制,全期精粗干料比约为1:3,精料全期以日均0.4kg左右为标准,前期少后期多,适量变化,对照组精料A由玉米、豆粕、麸皮和预混料等组成,精料A价格2500元每吨,试验组精料B为精料A的15%豆粕被15%玉米代替,即精料B的能量更多些,蛋白少些,精料B价格为2350元每吨,对照组粗料为玉米青贮秸秆(70%水份),价格为450元每吨,试验组粗料为本发明稻草微生物粗饲料(35%水份),价格为480元每吨,记录每只羊每天采食量,每天早晨清扫食槽,观察是否有剩料,记录剩料量,做到不剩料,更不浪费料!试验结果如表二。
表二 本发明稻草生物饲料的湖羊饲喂效果
从上表看出稻草生物饲料和玉米青贮秸秆按干料算平均日耗干粗料几乎是一样的,平均日耗精料也很接近,但平均日增重还是稻草生物饲料高些(0.005kg/日·头)kg,可能因为木质素已大部分降解有关。总体上讲,稻草生物饲料组增重1kg的饲料成本只是玉米青贮秸秆组的63.47%,按饲料成本占养殖成本的65%算,稻草生物饲料组养殖成本为13.06元每公斤重,按2015年下半年的低价20元每公斤羊来算,利润率竟高达53.14%,而玉米青贮秸秆组(对照组)增重1kg的养殖成本为20.53元,在这样的价格下要亏本了。目前青贮是最好的反刍动物粗料之一,而本微生物粗料经济效益明显好于青贮,因此,在反刍动物中有巨大饲用空间。
除了反刍动物,本生物饲料也可以10%左右的添加量添加到中、大猪,尤其是怀孕母猪,也有明显的经济效益和养殖环境效果。
实施例6:
其它按实施例1-4,以下变为在实施例2中加入15%上述自制白腐菌菌酶制剂,和0.5%的商品漆酶,充分搅拌后,移入发酵室通气规模发酵完成一期发酵。再如同实施例3和4,得到成品,25℃放置二星期后产品经测定,结果如表三。
表三 三步发酵前后水稻、小麦秸秆生物粗饲料主要成份测定
实施例7:
其它按实施例1-4,以下变为在实施例2中加入1%上述自制白腐菌菌酶制剂,和0.01%的商品漆酶,充分搅拌后,移入发酵室通气规模发酵完成一期发酵。再如同实施例3和4,得到成品,25℃放置二星期后产品经测定,结果如表四。
表四 三步发酵前后水稻、小麦秸秆生物粗饲料主要成份测定
本发明并不局限于上述实施例,一般地在保护数据范围内变化,可以实现本发明效果,在本发明公开的技术方案基础上,本领域的技术人员根据公开的技术内容,不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形,这些替换和变形均在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,所述方法是以稻麦秸秆和无机氮为主要原料,生产高蛋白低木质素微生物粗饲料的高效规模化生产方法。
2.根据权利要求1所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤:
(1)以稻麦秸秆为主要原料,添加无机氮源、合适无机盐和激活剂为培养基,纯种固态发酵预先培养获得白腐菌菌酶制剂;
(2)以稻麦秸秆为主要原料,经粉碎后加入无机氮、无机盐、激活剂为一期发酵培养基,接入步骤(1)获得的白腐菌菌酶制剂、脉胞霉等木质纤维素降解霉菌经培养后得到的固态发酵生产种子、自发酵的产朊假丝酵母液或热带假丝酵母液、及商品漆酶,进行一期固态发酵;
(3)步骤(2)得到的一期秸秆固态发酵产物,添加稻麦秸秆粉组成二期秸秆固态发酵培养基,接入芽孢杆菌和酵母菌混匀,进行二期好氧发酵;
(4)二期好氧发酵产物添加麸皮或米糠组成三期发酵培养基,再接入乳酸菌进行三期厌氧发酵,库存放置后获得成品。
3.根据权利要求2所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,步骤(1)中所述的白腐菌固态纯种发酵培养基为:按重量计,切割、揉丝、粉碎后的稻麦秸秆占培养基的60-90%(以干料计),麸皮或米糠占10-35%,酒石酸胺、硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.01-1%, CaCO3占0.1-2%,KH2PO4占0.1-3%,MgSO4、Mg(NO3)2、或MgCl2占0.01-1%,FeSO4·7H2O 占0. 0.01-0.05%,ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、CoCl2、NaMoO4各占0.000001-0.01%,吐温80占0.01-1%,藜芦醇(3,4-二甲氧基苯甲醇, Veratryl alcohol) 占0.001-0.1%,草酸占0.001-0.1%,培养基最终含水量为45-65%,用柠檬酸调整到 pH 5-6;
所述白腐菌菌酶制剂的固态发酵培养条件为30-40℃,发酵48-192h。
4.根据权利要求2所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,步骤(2)中所述脉孢霉等木质纤维降解霉菌培养基为:按重量计,切割、揉丝、粉碎后的稻麦秸秆占培养基的70-95%(以干料计),麸皮或米糠占5-30%,硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.1-2%,尿素0.1-1%,碳酸钙占0.1-1%,磷酸二氢钾占0.1-3%,硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-1%,培养基最终含水量为53-65%,用柠檬酸调整到 pH 5-6。
5.根据权利要求2所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,步骤(2)中所述一期发酵培养基为:按重量计,切割、粉碎后的稻麦秸秆占培养基的90%以上(以干料计),麸皮或米糠占0-5%,硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.5-5%,尿素0.5-5%,碳酸钙占0.1-5%,磷酸二氢钾占0.1-3%,硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-1%;FeSO4.7H2O,ZnSO4,CuSO4·5H2O,MnSO4.4H2O,CoCl2 NaMoO4各占0.000001-0.01%,吐温80占0.01-1%,, 培养基最终含水量为45-65%,用柠檬酸调整到 pH 5-6。
6.根据权利要求2所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,步骤(2)中所述一期固态发酵中接入步骤(1)获得的白腐菌菌酶制剂按1-15%接种量、脉胞霉等木质纤维素降解霉菌经培养后得到的固态发酵生产种子按1-15%接种量、自发酵的酵母液按0.1-1%接种量、及商品漆酶按0.01-0.5%接种量;
所述一期固态发酵条件为25-38℃,发酵24-72h,进入连续生产阶段,接种种子为上次一起秸秆预处理发酵后的固态菌剂,按1-15%接种量接种,另加3-25%新鲜白腐菌菌酶制剂、0.01-0.5%的商品漆酶。
7.根据权利要求2所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,步骤(3)中所述二期秸秆固态发酵培养基为一期秸秆固态发酵产物添加5-10%稻麦秸秆粉组成,含水量为40-50%;所述接入芽孢杆菌和酵母菌为首次启动二期好氧发酵需制作酵母菌和芽孢杆菌液体种子液,均按0.1-5%接种量接种,28-38℃好氧发酵12-72h,进入连续生产阶段,种子为上次二期稻麦秸秆发酵的剩余产物,按1-20%接种量,循环利用。
8.根据权利要求2所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,步骤(4)中所述三期发酵培养基为二期好氧发酵产物添加5-15%麸皮或米糠,含水量33-40%;所述接入乳酸菌为首次启动三期发酵要制作乳酸菌液体种子液,以0.1-3%接种量进行三期厌氧发酵,进入连续生产阶段,种子为上次三期发酵成品,按1-10%接种量。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法,其特征在于,所述脉胞霉等木质纤维素降解霉菌为粗糙脉孢霉、好食脉孢霉、间型脉孢霉、降解木质素的米曲霉、和木霉属的任意一种或多种;
所述白腐菌为黄胞原毛平革菌;
所述酵母菌为热带假丝酵母、产朊假丝酵母、酿酒酵母的任意一种或多种;所述乳酸菌为植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌干酪乳杆菌的任意一种或多种;
所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的任意一种或多种。
10.根据权利要求1或2所述的一种规模化稻麦秸秆微生物饲料的生产方法所制备的微生物饲料,其特征在于,所述饲料是以粉碎的稻草或麦秆为主要原料,经过发酵得到的高蛋白低木质素微生物粗饲料。
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