CN116515644B - 一种用于利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法 - Google Patents

Abstract

一种用于玉米秸秆黄贮饲料的复合菌剂，所述复合菌剂是以黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、产朊假丝酵母、副干酪乳杆菌按照质量比为1:1:0.5:0.5组合形成。本发明通过复合菌剂对玉米秸秆的发酵制备饲料，复合菌剂有效降解玉米秸秆中的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维，降解率分别为8.14%和12.92%，为部分微生物提供更多的营养成分，有效增加了饲料的的粗蛋白含量和乳酸含量，从而提高黄贮饲料的发酵品质，其中粗蛋白含量提升了19.53%，乳酸含量提升了265.5%，提高了饲料营养价值的同时改善了饲料的适口性，此外，有效降低了饲料中霉菌毒素含量，提高饲料的有氧稳定性。

Description

一种用于利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法。

背景技术

玉米秸秆是我国最丰富的农业副产物之一，常常用于发酵制备动物饲料，由于玉米秸秆青贮的制作时期一般是在玉米乳熟末期到蜡熟初期之间，饲料制作的窗口期较短。玉米秸秆黄贮相对于青贮来说不受时间限制，全年均可发酵。饲喂玉米秸秆黄贮饲料的荷斯坦奶牛与饲喂青贮饲料的相比，产奶量虽有所下降但不显著，而乳脂率略有提高，因此玉米秸秆黄贮饲料可以在奶牛的饲养过程中替代一部分青贮饲料，既降低培养成本，也可以解决因为季节原因导致的青贮饲料短缺问题。

但因为纤维含量高、蛋白含量低、营养价值低，所以玉米秸秆并不是反刍动物的理想饲料。但是将其黄贮处理后，制备的黄贮玉米秸秆饲料是刍动物重要的粗饲料资源之一。对于反刍动物而言，3kg经过黄贮的玉米秸秆粗饲料的营养价值与1kg的玉米的营养价值相当。对玉米秸秆进行精细加工处理，制作得到高营养的粗饲料，不但有利于发展畜牧业，还可以产生更好的经济效益和生态效益。

玉米秸秆黄贮饲料是一种通过微生物厌氧发酵得到的发酵饲料，发酵饲料是在人工控制的条件下降外源微生物添加到饲料基层中进行发酵，发酵的过程中不仅可以将抗营养因子分解或转化为无毒成分，还可以提高有益的益生菌、酶、代谢产物的浓度。但是目前的玉米秸秆黄贮仍然存在发酵过程中会损失过多营养物质的现象，从而造成饲料营养成分低，其次在发酵过程中会产生异味的物质，导致适口性差等缺点。

发明内容

基于上述技术问题，本发明目的在于提供一种用于玉米秸秆黄贮饲料的复合菌剂。

提供一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，制备的黄贮饲料无需添加任何抗生素，可以有效提高黄贮饲料的营养价值、适口性，并能有效减少反刍动物消化疾病的发生。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种用于玉米秸秆黄贮饲料的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂是以黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、产朊假丝酵母、副干酪乳杆菌按照质量比为1:1:0.5:0.5组合形成。

一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，其特征在于：在玉米秸秆中加入尿素、食盐和磷酸氢钙制备成发酵底物，然后加入由黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、产朊假丝酵母、副干酪乳杆菌所混合制成的复合菌剂进行发酵28～35天。

进一步，所述玉米秸秆需要进行预处理，具体是将玉米秸秆粉碎成2～3cm长的小段，在秸秆表面均匀喷洒水使其含水量为60-65％。

进一步，在预处理后的玉米秸秆中加入尿素、食盐和磷酸氢钙，混合后作为发酵底物，玉米秸秆、尿素、食盐和磷酸氢钙的质量比为100:1～1.5:0.5～0.8:0.5。

进一步，所述复合菌剂接种至发酵底物中的接种质量比例为4～8％。

优选的，所述复合菌剂接种至发酵底物中的接种质量比例为5.6～6％。

进一步，所述复合菌剂中产朊假丝酵母与副干酪乳杆菌的复合菌、黄孢原毛平革菌和白囊耙齿菌和的质量比为1:1:1。

进一步优选的，产朊假丝酵母与副干酪乳杆菌的质量比为1:1。

混合发酵中的各个菌种组成了一个整体，在生长繁殖的过程中相互促进又相互竞争，只有选择合适的菌种以及比例才能使发酵得到一个理想的结果，因此适合的菌种以及比例至关重要。

本发明中白囊耙齿菌会优先利用木糖作为碳源，因此会优先降解半纤维素。其降解得到的可溶性糖可作为产朊假丝酵母和副干酪乳杆菌所需要的优质碳源，从而提高粗蛋白含量，同时产朊假丝酵母还能生成小分子醇醛，在提升蛋白含量的同时还能提高饲料的适口性，使饲料产生醇香味。黄孢原毛平革菌会产生降解木质素的漆酶等酶，降低木质素含量，可提高相对饲用价值，复合菌剂中的白囊耙齿菌、黄孢原毛平革菌及产朊假丝酵母在初期消耗发酵秸秆中存在的氧气，在在自身生长繁殖的过程中缓慢形成厌氧环境，促进发酵菌剂中含有的乳酸菌可在厌氧环境中生长繁殖，促进体系中生成大量的乳酸，降低发酵时的pH值，同时复合菌剂体系有效抑制了乳酸向丙酸等会降低适口性的物质的转化。

最具体的，一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，其特征在于，按如下步骤进行：

(1)制备发酵底物

将玉米秸秆粉碎成2～3cm长的小段，在秸秆表面均匀喷洒水使其含水量为60-65％，然后加入尿素、食盐和磷酸氢钙混合形成发酵底物，其中玉米秸秆、尿素、食盐和磷酸氢钙的质量比为100:1～1.5:0.5～0.8:0.5；

(2)发酵

在发酵底物中加入复合菌剂，密封自然发酵28～35天，所述复合菌剂是以黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、产朊假丝酵母和副干酪乳杆菌质量比为1:1:0.5:0.5组合形成的，复合菌剂的接种量为4～8％。

本发明具有如下技术效果：

本发明通过复合菌剂对玉米秸秆的发酵制备饲料，复合菌剂有效降解玉米秸秆中的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维，降解率分别为8.14％和12.92％，为部分微生物提供更多的营养成分，有效增加了饲料的的粗蛋白含量和乳酸含量，从而提高黄贮饲料的发酵品质，其中粗蛋白含量提升了19.53％，乳酸含量提升了265.5％，提高了饲料营养价值的同时改善了饲料的适口性，此外，有效降低了饲料中霉菌毒素含量，提高饲料的有氧稳定性。

附图说明

图1：本发明中真菌之间拮抗实验结果图。

图2：本发明中细菌与真菌之间拮抗实验结果图。

图3：复合菌剂组合对玉米秸秆发酵粗蛋白和相对饲用价值的影响。

图4：接种比例对于玉米秸秆发酵粗蛋白和相对饲用价值的影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

拮抗实验：

(1)真菌拮抗实验：

将白囊耙齿菌、黄孢原毛平革菌、里氏木霉分别接种到PDA培养基中，相互之间隔3cm左右。将前3中真菌接种到画十字线的PDA固体培养基正中间，然后将产朊假丝酵母按十字线区间划线，与真菌接种点间隔3cm。

通过实验发现，里氏木霉和产朊假丝酵母之间互不相容，产生拮抗，而白囊耙齿菌、黄孢原毛平革菌和产朊假丝酵母之间可以相互生长、相互融合。

(2)细菌与真菌拮抗实验：

副干酪乳杆菌在画十字线的MRS固体平板中按十字线区间划线，后将真菌在十字线中心接种。将副干酪乳杆菌和产朊假丝酵母两两在MRS固体平板上进行井字划线，观察菌株生长边缘交接处的交连现象。

如图1所示，A、B、C、D、E、F分别为白囊耙齿菌、黄孢原毛平革菌、里氏木霉和产朊假丝酵母两两之间的拮抗实验结果。通过实验发现，A、B、C、D、E均可见两种菌之间可以相互生长、相互融合，即副干酪乳杆菌和囊耙齿菌、黄孢原毛平革菌以及产朊假丝酵母之间均无拮抗，而F可见里氏木霉和产朊假丝酵母之间互不相容，产生拮抗。如图2所示，A、B、C分别为副干酪乳杆菌和产朊假丝酵母、黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌的拮抗结果。从A中可看出副干酪乳杆菌和产朊假丝酵母无拮抗。B、C中可看出副干酪乳杆菌和黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌均无拮抗。

通过以上拮抗实验，选择以副干酪乳杆菌和囊耙齿菌、黄孢原毛平革菌以及产朊假丝酵母作为复合菌剂的组分。

实施例1

一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，按如下步骤进行：

(1)制备发酵底物

将玉米秸秆粉碎成2～3cm长的小段，在秸秆表面均匀喷洒水使其含水量为65％，然后加入尿素、食盐和磷酸氢钙混合形成发酵底物，其中玉米秸秆、尿素、食盐和磷酸氢钙的质量比为100:1.5:0.5:0.5；

(2)发酵

在发酵底物中加入复合菌剂，密封自然发酵35天，所述复合菌剂是以黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、产朊假丝酵母和副干酪乳杆菌质量比为1:1:0.5:0.5组合形成的，发酵底物和复合菌剂的质量比为100:0.56。

经过实验室前期实验表明，当产朊假丝酵母和副干酪乳杆菌比例为1：1时，发酵效果和对霉菌毒素的去除作用最好。以黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、质量比为1:1的产朊假丝酵母和副干酪乳杆菌的添加比例为3个因素，每个因素3个水平，设计9组发酵模型，具体配比比例如表1所示。

表1：复合菌剂中各菌的比例

处理	黄孢原毛平革菌	白囊耙齿菌	酵母菌+乳杆菌
				X1	1	1	1
X2	2	1	1
				X3	1	2	1
X4	2	2	1
				X5	3	2	1
X6	2	3	1
				X7	3	3	1
X8	1	2	2
				X9	1	2	3
CK	0	0	0

粗蛋白含量可作为玉米秸秆发酵饲料的营养价值的体现，而相对饲用价值(RFV)是目前美国唯一广泛应用的对粗饲料品质进行综合评价的指数，测定得到粗饲料中性洗涤纤维含量和酸性洗涤纤维含量即可得到该粗饲料的相对饲用价值。结果如图3所示，各处理组进行发酵玉米秸秆得到的饲料中，实施例1(X1)处理组的粗蛋白含量(P＜0.05)和相对饲用价值(P＜0.01)远高于其他处理组，分别为8.14±0.19％和80.06±0.72％。因此，处理组X1的菌种比例黄孢原毛平革菌：白囊耙齿菌：副干酪乳杆菌：产朊假丝酵母为1:1:0.5:0.5为最适用于制作玉米秸秆黄贮饲料的菌种配比。

如图4所示，当接种比例为6％时，玉米秸秆发酵得到的粗蛋白含量最高为5.94±0.34％，相对饲用价值最高为80.55±0.88％。

接种比例的大小会影响菌种的生长周期，当接种比例过大时，发酵菌剂的生长过快，会导致生产的代谢物过多，形成反馈抑制从而影响后续菌的生长。当接种比例过小时，会导致发酵菌剂的生长过慢，需要较长的时间才能生长到对数期。综合考量后，选择接种比例为6％为最佳的后续黄贮条件。

实施例2

将实施例1制备的饲料作为A组，以单独的副干酪乳杆菌：产朊假丝酵母为1:1作为复合菌剂，按照玉米秸秆：复合菌剂质量比为100:5.6混合，密封发酵制备得到的饲料为B组；将白囊耙齿菌和黄孢原毛平革菌更换成产木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌和产漆酶的疣孢漆斑菌，与副干酪乳杆菌和产朊假丝酵母形成复合菌剂(各菌种之间无拮抗)，按照玉米秸秆：复合菌剂质量比为100:5.6混合，密封发酵得到的饲料为C组；通过购买的黄贮发酵剂(由乳酸片球菌、植物乳杆菌和布氏乳杆菌组成)按照发酵底物：黄贮发酵剂质量比为100:5.6混合，密封发酵制备得到的饲料为D组；将制备的发酵底物直接密封到发酵袋中进行发酵得到的产物作为空白CK组。

经发酵0d、7d、14d、21d、28d、35d后，去除上层3～5cm，按五点取样法分别取出100g样品，将取得的样品烘干后，一半先粉碎后储存起来用于测定中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗蛋白、干物质和霉菌毒素，另外一半每份称取4g放于试管中，再加入36g水，在50℃超声波水浴中浸取30min，取出过滤，取出上清液储存于4℃，用于测定pH值、可溶性糖、氨态氮、有机酸。

指标测定：

中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗蛋白、干物质、可溶性糖和氨态氮均参照杨胜的《饲料分析及饲料质量检测技术》中的测定方法测定。有机酸和pH值参照李红宇的《玉米秸秆营养价值评定及其发酵饲料的研究》中的方法测定。黄曲霉毒素按照国标GB/T 17480-2008中的方法检测，玉米赤霉烯酮按照国标GB/T 19540-2004中的方法检测。有氧稳定性按照高祎妍的《玉米秸秆发酵菌剂的筛选优化及对黄贮效果影响研究》中的方法测定。

在发酵过程中第0d、7d、14d、21d、28d、35d，检测干物质(DM)含量和pH值，实验结果如下表2。

表2

由上述表2可知，A组在发酵结束后DM含量均高于其他各组，说明实施例1所用复合菌剂在利用玉米秸秆作为底物进行发酵后仍保留了玉米秸秆中较多的营养物质，发酵菌剂在降解木质纤维素的同时还产生其他的营养物质，提高饲料的营养价值，而其他各组中B组、C组和D组的玉米秸秆在发酵过程中存在较多的分解流失，CK组由于没有得到较好的发酵，干物质保留最多。

A组、B组、C组、D组和CK组在黄贮发酵过程中第0d、7d、14d、21d、28d、35d，分别检测中性洗涤纤维(NDF)含量和酸性洗涤纤维(ADF)含量，实验结果如表3所示。

表3：

由上述表3可知，实施例1发酵结束时NDF和ADF降解率均高于其他各处理组，达到8.14％和12.92％。

A组、B组、C组、D组和CK组在黄贮发酵过程中第0d、7d、14d、21d、28d、35d，分别检测粗蛋白(CP)含量和氨态氮(AN)含量，实验结果如表4所示。

表4：

由上述表4可知，A组发酵结束后其CP含量与发酵前相比提高了19.53％，极显著高于其他处理组，说明A组的发酵菌剂在降解木质纤维素的同时产生了大量CP，提高了饲料的营养价值，而B组和C组中CP变化差异不大，及C组在B组的基础上，虽然降解了木质纤维素，但是并没有产生大量的CP。A组发酵结束后的AN含量下降了34.36％，显著高于B组、C组和CK组，与D组相比变化不大。

A组、B组、C组和D组和CK组在黄贮发酵过程中第0d、7d、14d、21d、28d、35d，分别检测可溶性糖(WSC)含量、乳酸(LA)含量、乙酸(AA)含量、丙酸(PA)含量，实验结果如表5所示。

表5：

由上述表5可知，A组的WSC含量在发酵过程中下降较为平滑，说明A组中所用的复合菌剂在利用玉米秸秆中的WSC的同时还能产生一部分WSC，为酵母的繁殖生成菌体蛋白、副干酪乳杆菌生产乳酸提供更适合的碳源。A组的LA含量在发酵结束时增长了265.5％，高于其他各处理组，A组饲料中乳酸最终含量达到51.9g/kg，说明其A组中，白囊耙齿菌、黄孢原毛平革菌以及产朊假丝酵母等菌种的发酵对于乳杆菌的发酵起到明显的协同促进作用，AA含量高于CK组，但低于B组、C组和D组，PA含量也低于其他各组，说明了在B组、C组和D组中存在以乳酸为底物转化为丙酸，造成乳酸含量衰减的情况，而乳酸是可以明显改善适口性的物质，相反丙酸会使得饲料产生难闻的恶臭，使得饲料适口性下降，影响反刍动物的采食。从A组、B组和C组的比较也可以看出，白囊耙齿菌、黄孢原毛平革菌及产朊假丝酵母的参与发酵，有效抑制了发酵过程中乳酸转化为乙酸和丙酸。

A组、B组、C组和D组和CK组在黄贮发酵过程中第0d、7d、14d、21d、28d、35d，分别检测霉菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)实验结果如表6所示，检测有氧稳定性结果如表7所示。

表6：

由上述表6可知，A组饲料的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量均低于其他各处理组，说明实施例1所用复合菌剂可以有效降解和吸附霉菌毒素。

表7：

组别	有氧稳定时间/6h(s)
		A组	21
B组	23
		C组	22
D组	22
		CK组	12

从上表可知，A组-D组的有氧稳定性能差异不大，基本保持为同一水平。

由上述实验结果可得，本发明所用制备得到的玉米秸秆黄贮饲料具有较高的适口性，营养价值高，所用方法生产工艺简单、节省劳力和成本，易于推广应用。

实施例3

一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，按如下步骤进行：

(1)制备发酵底物

将玉米秸秆粉碎成2～3cm长的小段，在秸秆表面均匀喷洒水使其含水量为60％，然后加入尿素、食盐和磷酸氢钙混合形成发酵底物，其中玉米秸秆、尿素、食盐和磷酸氢钙的质量比为100:1:0.8:0.5；

(2)发酵

在发酵底物中加入复合菌剂，密封自然发酵30天，所述复合菌剂是以黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、产朊假丝酵母和副干酪乳杆菌质量比为1:1:0.5:0.5组合形成的，发酵底物和复合菌剂的质量比为100:0.4；

实施例4

一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，按如下步骤进行：

(1)制备发酵底物

将玉米秸秆粉碎成2～3cm长的小段，在秸秆表面均匀喷洒水使其含水量为62％，然后加入尿素、食盐和磷酸氢钙混合形成发酵底物，其中玉米秸秆、尿素、食盐和磷酸氢钙的质量比为100:1.2:0.6:0.5；

(2)发酵

在发酵底物中加入复合菌剂，密封自然发酵28天，所述复合菌剂是以黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、产朊假丝酵母和副干酪乳杆菌质量比为1:1:0.5:0.5组合形成的，发酵底物和复合菌剂的质量比为100:0.8。

实施例2和实施例3制备的发酵饲料中各组分情况如表8和表9所示。

表8：

表9：

本发明各实施例中使用的微生物菌剂中，黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌和副干酪乳杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号依次为CGMCC3.7212、CGMCC5.1259、CGMCC1.9088，产朊假丝酵母购于武汉淼灵生物科技有限公司，黄贮发酵剂购自于河南好旺农生物科技有限公司，产木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌和产漆酶的疣孢漆斑菌是实验室自己分离的菌株。

Claims (4)

1.一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，其特征在于：在玉米秸秆中加入尿素、食盐和磷酸氢钙制备成发酵底物，然后加入由黄孢原毛平革菌、白囊耙齿菌、产朊假丝酵母、副干酪乳杆菌按照质量比为1:1:0.5:0.5混合制成的复合菌剂进行发酵28~35天。

2.如权利要求1所述的一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，其特征在于：所述玉米秸秆需要进行预处理，具体是将玉米秸秆粉碎成2~3cm长的小段，在秸秆表面均匀喷洒水使其含水量为60-65%。

3.如权利要求1或2所述的一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，其特征在于：在预处理后的玉米秸秆中加入尿素、食盐和磷酸氢钙，混合后作为发酵底物，玉米秸秆、尿素、食盐和磷酸氢钙的质量比为100:1~1.5:0.5~0.8:0.5。

4.如权利要求3所述的一种利用发酵菌剂制备玉米秸秆黄贮饲料的方法，其特征在于：所述复合菌剂接种至发酵底物中的接种质量比例为4~8%。