CN105754881A - 一种可高效降解木质素的白囊耙齿菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可高效降解木质素的白囊耙齿菌及其应用，所述白囊耙齿菌为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号CGMCC No.11920的ZK1白囊耙齿菌，用该菌发酵秸秆粉、羽毛粉和牡蛎壳粉混合料所制备的秸秆复合饲料，其多糖的含量最高达203.2μg/g，真蛋白的含量最高达72.68％，pH保持在7.5?8.5之间，木质素降解率最高达62.45％，纤维素的降解率最高达到45.48％，从而提高秸秆饲料的消化率和保健功能。

Description

一种可高效降解木质素的白囊耙齿菌及其应用
应用领域
本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一株白囊耙齿菌及其在秸秆饲料化中的应用
背景技术
农作物秸秆是一类重要的可再生生物质资源，主要由包括木质素、纤维素和半纤维素组成的有机物、水分以及少量的无机矿物元素组成，是畜禽，尤其是反刍动物重要的饲料来源。但由于木质素和半纤维素相互交联，并将纤维素镶嵌其内，形成牢固的醚键或酯键，导致其不易被动物消化或微生物分解，营养转化效率低。虽然如此，但秸秆的饲料化利用潜力仍然巨大，近年来我国在秸秆饲料化利用方面取得了一定的进展，目前主要包括物理、化学、生物法以及联合法等，由于物化法存在诸多技术上的制约，如能耗高、添加物用量大且难回收、易造成环境污染、营养流失以及能量转化质量低等，人们逐渐将注意力转移到利用微生物尤其是真菌的降解转化作用来提高秸秆制备饲料的质量上来。目前在基于微生物代谢作用的秸秆资源化利用方面，主要是利用一些白腐菌、酵母菌以及芽孢杆菌类微生物的单一菌株或复合菌系对秸秆进行一级或多级发酵。秸秆中的木质素由于结构稳定，很难被微生物降解，再加上秸秆的碳氮比高，微量元素缺乏和植酸磷含量高等缺点，使得微生物降解秸秆过程中往往出现pH值下降、营养失衡、微生物生长缓慢以及木质素降解率低的现象，导致秸秆转化不彻底、饲料中的木质素含量反而增高及菌体蛋白含量低等，从而制约了秸秆饲料的应用价值。因此秸秆饲料化的关键是获得能高效降解木质素的菌株，并且通过添加氮源、微量元素以及能缓冲pH值变化的添加剂来提高秸秆中木质素的降解率，促进微生物的持续生长和释放更多的有益代谢产物，最终提高秸秆的转化率和秸秆饲料的消化率及营养价值。
将家禽羽毛在高温高压下水解而成的羽毛粉粗蛋白含量高达80％以上，且还含有微量元素，甚至一些生长因子，但蛋白质主要是角蛋白，其化学结构稳定，很难被动物胃肠中的消化酶所消化，如果直接加入到饲料中会造成利用率低以及增加畜禽养殖废弃物中臭味物质的污染水平。牡蛎壳中含有90％以上的碳酸钙，以及镁、铁、锌、磷和钠等离子，其中碳酸钙具有缓冲pH值，缓慢释放Ca的作用。白囊耙齿菌是独产于长白山密林深处的一种珍贵的药用真菌，野生状态下主要寄生于油松上，可产生木质素酶、纤维素酶及漆酶等，对木材的腐朽能力很强，并且可产生具有很高医学价值的代谢物，如提高生物体抗炎活性和免疫能力的多糖和腺苷。
因此如果能从环境中获得一株可高效降解木质素和释放植酸磷，且还能同时利用羽毛粉和农作物秸秆混合物的白囊耙齿菌，可克服秸秆中碳氮比失衡和营养物质匮乏的缺点，从而提高微生物的生长量和有益代谢产物的含量，再加以利用牡蛎壳粉缓冲培养体系的pH值来实现微生物的最大化生长，将会从根本上解决目前秸秆饲料化利用过程中存在的技术问题，大大提高秸秆饲料的应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有秸秆饲料化利用技术中存在的问题，提高秸秆转化率和转化产物的营养价值，提供一种可高效降解木质素的白囊耙齿菌，并将该菌用于动物饲料，尤其是秸秆复合饲料的制备。
本发明提供所提供的一种可高效降解木质素的白囊耙齿菌为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号CGMCC No.11920的ZK1白囊耙齿菌。
本发明白囊耙齿菌由以下方式获得：
1、菌株初筛
从吉林省东部油松山区采集表面长有白色菌丝体的腐烂木头，表面消毒后利用手术刀将腐木剖开，取部分木质结构放在PDA培养基平板上培养，分离并纯化单一真菌菌株，将单一菌株分别接种于PDA-愈创木酚培养基、PDA-苯胺蓝培养基、羽毛粉培养基、植酸钙培养基上于30℃下培养3-5天。其中编号为ZK1的菌株在PDA-愈创木酚培养基上生长旺盛，培养基呈棕红色，使PDA-苯胺蓝培养基蓝色消退至无色，且能在植酸钙和羽毛粉培养基快速生长(见图1)；
PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，琼脂18g，加水至1 000mL，pH自然。
PDA-愈创木酚培养基：将PDA培养基加入4‰的愈创木酚。
PDA-苯胺蓝培养基：将PDA中加入0.1％苯胺蓝。
羽毛粉培养基：取过筛后羽毛粉5g，加自来水2.5ml，在121℃，灭菌20min。
植酸钙培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.2g，氯化镁5.0g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.1g，植酸钙2.0g，琼脂16g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.5，115℃灭菌20min。
2、菌种的鉴定与保藏
将初筛获得的菌株ZK1通过镜检观察、菌落特征观察和18S rRNA基因序列进行鉴定，从ZK1的系统发育树(图2)可以看出，菌株ZK1与白囊耙齿菌的亲缘关系最近，结合传统的形态特征观察结果，将菌株ZK1鉴定为耙齿菌，分类种名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)；
通过以下分子遗传学和分类鉴定方法对该ZK1菌株鉴定：
用接种环挑取适量孢子悬浮于1mL灭菌ddH2O中，置1.5mL离心管中100℃水浴10min。14,000×g离心3min后取上清，于-20℃保存。利用真菌通用引物ITS86和ITS4[1]，碱基序列分别为：
5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3’和5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，进行18SrDNA序列扩增。
PCR反应体系为：总体积50μL，其中含10×Ex Taq Buffer 5μl，dNTP Mixture 5μL，上、下游引物各2μL，模板DNA 5μL，Ex Taq DNA聚合酶5μL，灭菌ddH2O 30μL。
PCR反应程序：94℃初始变性10min后，以94℃30s、51℃30s，72℃40s循环30次，72℃充分延伸10min。将所得产物全部点样于1.2％的大孔琼脂糖凝胶上，100V恒压下电泳45min。紫外凝胶成像系统观察电泳结果，并进行产物的纯化。本实验采用北京百泰克生物技术有限公司的PCR产物回收试剂盒(离心柱型)对琼脂糖凝胶中分离的PCR产物进行纯化。纯化后的样品送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。
对最终测得序列构建系统发育树以确定其种属在分类系统中的位置：在NCBI数据库中通过BLAST选取与测定的基因序列亲缘关系较近的模式菌株的相应基因序列GenBank:JX290568.1,EU918701.1,JX311924.1,HQ670693.1,DQ912694.1,KP297476.1,KP135300.1,JX290580.1,KF937296.1,EU131640.1,EU131641.1,JQ409357.1,KM267725.1,KF986691.2,JF825468.1)，利用ClustalX 2.1multiple alignment(多序列比对排列)功能将目的基因序列与亲缘序列进行比对。再用MEGA 6.0软件将比对后的序列用Neighbor-joining method(邻接法)进行发育树的构建，并通过Boot-strap(自举分析)进行置信度检测，自举数据集次数为1000。
该菌株ZK1的菌种保藏：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为：ZK1白囊耙齿菌Irpexlacteus，保藏编号为CGMCC No.11920，保藏日期：2016年03月07日。
该菌株具有优异的产酶性能。利用产酶培养基生长可产生活性分别为13.4U/mL、10.6U/mL、9.24U/mL的漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶。
根据以上实验结果，本发明进一步提出一种应用本发明获得的ZK1白囊耙齿菌制备秸秆复合饲料的方法，包括以下步骤：
a.原料的准备：
将去肉的牡蛎壳在自来水中刷洗、晾干后粉碎研磨、过80-100目筛备用；将玉米秸秆清除杂质和霉变物质、清洗晾干、切块粉碎后过0.5mm筛，作为秸秆粉备用；
将高温高压水解并烘干后的鸡羽毛粉过0.5mm筛后备用；
b.发酵液的制备：
将本发明获得的ZK1白囊耙齿菌接种于PDA固体培养基中，在30℃下培养3-4天，取直径为7mm的菌饼，以每50mL PDA液体培养基中加入2-3个菌饼的比例接入菌种，在30℃和150rpm下培养3-5天，即制得发酵液；
c.混合料的制备：
将步骤a备用的秸秆粉、羽毛粉和牡蛎壳粉以质量比1:(0.5-1):(0.02-0.1)混合均匀，用无菌水将混合料调节湿度至70％-75％，在115～121℃下灭菌20-30min、冷却至常温；
该混合料优选地为：秸秆粉、羽毛粉和牡蛎壳粉的质量比为1:1:0.1；
d.混合料的发酵：
将步骤c制得的混合料和与其体积质量比为5-8％的步骤b制得的发酵液混合均匀后在30℃下发酵20-25天(期间每3-5天翻动一次)后，在60-80℃下烘干3-5h，即得高消化率和营养价值的秸秆复合饲料。
通过测试鉴定，本方法所获得的秸秆复合饲料中多糖的含量最高达203.2μg/g，真蛋白的含量最高达72.68％，pH保持在7.5-8.5之间，木质素降解率最高达62.45％，纤维素的降解率最高达到45.48％。
本发明所述菌株ZK1对农作物秸秆中的木质素和纤维素均有降解作用，且对木质素的降解率最高(木质素降解率最大值为62.45％，纤维素降解率最大值为45.48％)，同时还可将秸秆中的磷释放为溶解性磷酸根以及将羽毛粉中的角蛋白转化为菌体蛋白。本发明的菌株ZK1可在秸秆粉、羽毛粉和牡蛎壳粉的混合物中快速大量地生长及降解秸秆、产生菌体蛋白以及具有提高免疫力的多糖，从而提高秸秆饲料的消化率和保健功能，具有很好的应用前景。
附图说明
图1是菌株ZK1在PDA-愈创木酚、PDA-苯胺蓝、植酸钙和羽毛粉培养基上的生长图；
图2是菌株ZK1基于18S rDNA构建的系统发育树图；
图3是白囊耙齿菌ZK1降解玉米秸秆皮的电镜扫描图；
图4是白囊耙齿菌ZK1的产酶特征曲线图；
图5是白囊耙齿菌ZK1对植酸磷的释放特征图；
图6是秸秆粉、羽毛粉和牡蛎壳粉混合比例对发酵后的秸秆复合饲料中真蛋白含量(a)、木质素和纤维素降解率(b)和多糖含量(c)的影响图。
具体实施方式
通过以下实施例的阐述以便对本发明更进一步理解。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明ZK1白囊耙齿菌对秸秆皮的降解作用实验。
将干燥后的玉米秸秆进行皮囊分离，取部位及外观观察结果一致的秸秆皮，将其剪成长5cm，宽0.5cm的长条，加入到试管中，再加入无机营养盐润湿秸秆，接种1个菌饼培养，培养至秸秆上分布满菌丝后停止培养，将秸秆皮上的菌丝体轻轻去掉，将秸秆放在超声波清洗器中清洗10-15min，然后利用无菌水反复冲洗，用滤纸请轻轻吸干，再在40℃下干燥2h，进行利用扫描电镜进行观察，结果如图3所示。从图中可以看出，与对照相比，秸秆皮明显增加许多小孔，表明真菌可分解表面的木质素以及其他难降解的物质。同时实验中还发现菌丝铺满部位的秸秆皮吸水性非常好，水洗后无法用滤纸彻底吸干，与对照相比湿润度明显增加。
实施例2
本发明ZK1白囊耙齿菌产酶特征分析实验。
菌株ZK1接种至PDA固体培养基中培养，制取7mm菌饼，在100mL产酶培养基中加入3块菌饼于30℃下培养，定期采集样品测定酶的活性。分别利用Azure B法、硫酸锰法和ABTS法测定木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)的活性，结果如图4所示。从图中可以看出，菌株ZK1在基础培养基中可产生漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，三种酶的活性分别为13.4U/mL、10.6U/mL、9.24U/mL，说明菌株ZK1产漆酶能力最强，其次为锰过氧化物梅，产木质素过氧化物酶的能力相对弱一些，这些预示着菌株ZK1在降解木质素方面具有很高的应用价值。
产酶培养基：葡萄糖20g、蛋白胨4g、MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO4 0.2g、MnSO4 0.035g、CuSO4·5H2O 0.007g，加蒸馏水至1000mL。
实施例3
本发明白囊耙齿菌释放植酸磷能力的分析实验。
将3块ZK1菌饼接种至植酸钙液体培养基中，30℃和150r/min下培养，每5天取样，测定磷酸根的含量，结果如图5所示。随着培养时间的延长，菌株ZK1释放磷酸根离子的量逐渐增加，到第20d时菌株ZK1从植酸钙中释放的溶解性磷酸盐浓度高达680mg/L，是对照组的7.5倍，表明菌株在利用秸秆的过程中可能从植酸磷中释放出活性磷酸根离子，提高秸秆中磷的利用率，从而减低废弃物中磷的含量，对降低畜禽养殖导致的水体富营养化问题具有重要意义。
植酸钙液体培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.2g，氯化镁5.0g，硫酸镁0.5g，氯化钙0.1g，植酸钙2.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.5，115℃灭菌20min。
实施例4
用本发明获得的ZK1白囊耙齿菌制备秸秆复合饲料。
a.原料的准备：
将去肉的牡蛎壳，在自来水中刷洗、晾干后先打碎成2-3cm的小块，然后用粉碎机磨碎，过80-100目筛子，作为牡蛎壳粉备用；
将玉米秸秆清除杂质和霉变物质、清洗晾干、切块粉碎后过0.5mm筛，作
为秸秆粉备用；
采购吉林省某羽毛粉厂生产的高温高压水解鸡羽毛粉，过0.5mm筛后备用。
b.发酵液的制备：
将本发明获得的白囊耙齿菌ZK1接种于PDA固体培养基中，在30℃下培养3-4天，取直径为7mm的菌饼，以每50mLPDA液体培养基中加入2-3个菌饼的比例接入菌种，在30℃和150rpm下培养3-5天，即制得发酵液；
c.混合料的制备：
将步骤a备用的秸秆粉、羽毛粉和牡蛎壳粉分别以1:1:0.1、1:1:0.02、1:0.5:0.02、1:0.5:0.1的质量比混合均匀；并同时做不加牡蛎壳粉的对照组，即秸秆粉：羽毛粉以1:1和1:0.5混合均匀；分别将上述各组混合料用无菌水调节湿度至70％-75％，在115～121℃下灭菌20-30min、冷却至常温。
d.混合料的发酵：
将步骤c制得的各组混合料和分别与其体积质量比为5-8％的步骤b制得的发酵液混合均匀后在30℃下发酵20-25天(期间每3-5天翻动一次)后，在60-80℃下烘干3-5h，即得秸秆复合饲料。
对固体发酵过程的观察发现表面，菌株ZK1可在混合物上快速生长，3-4天菌丝体可铺满固体表面，7-9天菌丝体可深入混合培养基底部，12天左右菌丝体开始包裹混合物形成块状物。发酵培养20天后采集样品分别测定不同混合比例下发酵秸秆饲料中总糖和还原糖(两者之差为多糖)以及木质素、纤维素和真蛋白。结果如图6所示。图中可以看出，ZK1白囊耙齿菌在固体混合发酵基质中能够快速大量地生长，降解木质素、纤维素，产生菌体蛋白和多糖，但三种物料的混合比例对菌株降解木质素和纤维素以及产生菌体蛋白和多糖具有明显的影响。秸秆粉和羽毛粉的比例为1:1时对木质素的降解率明显高于1:0.5时的降解率。羽毛粉添加比例越大，木质素和纤维素的降解率越高，并且对木质素降解率的影响明显大于对纤维素降解率的影响。添加贝壳粉可明显增加菌株ZK1的产糖量，添加比例越大，木质素和纤维素的降解率越高，多糖产量越多。当秸秆粉和羽毛粉的比例为1:0.5时菌体蛋白的生成量明显大于1:1时的生成量。

Claims (3)

1.一种可高效降解木质素的白囊耙齿菌，为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号CGMCC No.11920的ZK1白囊耙齿菌。
2.一种用权利要求1所述的ZK1白囊耙齿菌制备秸秆复合饲料的方法，包括以下步骤：
a.原料的准备：
将去肉的牡蛎壳在自来水中刷洗、晾干后粉碎研磨、过80-100目筛备用；将玉米秸秆清除杂质和霉变物质、清洗晾干、切块粉碎后过0.5mm筛，作为秸秆粉备用；
将高温高压水解并烘干后的鸡羽毛粉过0.5mm筛后备用；
b.发酵液的制备：
将本发明获得的ZK1白囊耙齿菌接种于PDA固体培养基中，在30℃下培养3-4天，取直径为7mm的菌饼，以每50mL PDA液体培养基中加入2-3个菌饼的比例接入菌种，在30℃和150rpm下培养3-5天，即制得发酵液；
c.混合料的制备：
将步骤a备用的秸秆粉、羽毛粉和牡蛎壳粉以质量比1:(0.5～1):(0.02～0.1)混合均匀，用水将混合料调节湿度至70％-75％，在115～121℃下灭菌20-30min、冷却至常温；
d.混合料的发酵：
将步骤c制得的混合料和与其体积质量比为5-8％的步骤b制得的发酵液混合均匀后在30℃下发酵20-25天后，在60-80℃下烘干3-5h，即得高消化率和营养价值的秸秆复合饲料。
3.根据权利要求2所述的制备秸秆复合饲料的方法，其特征在于，步骤c所述的混合料，秸秆粉、羽毛粉和牡蛎壳粉的质量比为1:1:0.1。
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