CN116004399A - 一株粗糙脉孢菌dz01菌株及其在发酵杜仲叶饲料中的应用 - Google Patents

一株粗糙脉孢菌dz01菌株及其在发酵杜仲叶饲料中的应用 Download PDF

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CN116004399A CN202211434132.6A CN202211434132A CN116004399A CN 116004399 A CN116004399 A CN 116004399A CN 202211434132 A CN202211434132 A CN 202211434132A CN 116004399 A CN116004399 A CN 116004399A
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Abstract

本发明涉及粗糙脉孢菌DZ01菌株及其在发酵杜仲叶饲料中的应用，有效解决利用粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵杜仲叶饲料，显著提高杜仲叶饲料中营养成分和生物功效成分含量，有效降低杜仲叶饲料中木质纤维素类、单宁、植酸等抗营养成分含量，大大提高杜仲叶的饲用价值和畜禽保健价值的问题，一株粗糙脉孢菌DZ01菌株，分类命名为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，于2022年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：40194，本发明采用固体发酵，在液体发酵培养种子的基础上结合固体发酵，单位体积的生物量产出高，固体发酵培养物中代谢产物更加丰富，培养基含水量低，不需进行废水处理，环境污染少，符合国家发展生态农业和无公害食品的产业化需要。

Description

一株粗糙脉孢菌DZ01菌株及其在发酵杜仲叶饲料中的应用
技术领域
本发明涉及微生物及其发酵饲料，特别是一株粗糙脉孢菌DZ01菌株及其在发酵杜仲叶饲料中的应用。
背景技术
随着经济快速发展和人民生活水平的不断提高，市场对畜产品需求量大幅增长，饲料来源不足成为制约畜牧养殖业发展的重要因素。2021年我国大豆进口总量为9653.70万吨，玉米进口总量为2835万吨，且呈逐年上升趋势，其中进口大豆的70%和进口玉米的50%被用于饲料，表明目前我国蛋白类饲料、能量类饲料缺口严重。因此，开发新型蛋白饲料资源以及具备特种功效作用的饲料和饲料添加剂对促进我国畜牧养殖业健康快速发展，满足市场对动物产品日益增长需求具有重要意义。
杜仲（ Eucommia ulmoides）属杜仲科、杜仲属的多年生落叶乔木，是我国特有珍稀的传统中药材。《神农本草经》记载杜仲性温、味甘、无毒。杜仲叶不仅含有丰富的蛋白质、微量元素、维生素等营养物质，还具备药理和生理活性功能。研究表明，杜仲叶和杜仲皮有相似的活性成分，在消炎、杀菌、抗氧化、提高机体免疫力等药理方面具备相似的功效。在日粮中添加杜仲叶饲料，能显著改善动物机体免疫功能，增强对疾病的抵抗能力，促进动物健康，提高生产性能，增加饲料利用效率，改善肉质和风味。2012年，我国已将杜仲叶、杜仲皮列入《饲料原料目录》。杜仲叶及其提取物作为一类功能型饲料原料，应用于畜禽、水产及部分反刍动物饲料效果显著，市场前景广阔。
杜仲叶富含纤维素、半纤维素及木质素，这些木质纤维素成分相互交联，阻碍杜仲叶中饲用营养成分和生物功效成分的释放和利用。杜仲叶中单宁易与饲料中的营养成分结合，造成营养成分利用不充分，降低饲料的营养价值。单宁含量过高，还影响饲料的适口性，导致动物采食量下降。杜仲叶中的植酸影响单胃动物蛋白质、矿物质代谢以及消化酶的活性。通过微生物发酵技术对杜仲叶进行处理，借助于微生物发酵作用和微生物在生长代谢过程中释放的多种生物活性物质，可使杜仲叶的木质纤维素成分降解，显著提高杜仲叶中饲用营养成分和生物功效成分的含量，有效降低木质纤维素类、单宁、植酸等抗营养成分含量，大大提高杜仲叶的饲用价值和畜禽保健价值。
目前国内外缺乏利用微生物发酵杜仲饲料、研发优质高效杜仲饲料产品、增加杜仲饲料在畜禽养殖生产中的应用范围和应用效果等方面的研究。粗糙脉孢菌( Neurospora  crassa)是子囊菌门（Ascomycoya）、子囊菌纲（Ascomycetes）、粪壳目（Sordariales）、粪壳科（Sordariaceae）、脉胞菌属（ Neurospora）的真菌，其代谢产生的纤维素酶、漆酶和多种生物活性物质为其发酵含木质纤维素较高的木本植物饲料资源奠定了良好的基础。因此，选育出一株新的具有发酵杜仲叶功能的粗糙脉孢菌以及该菌株在发酵杜仲叶饲料的应用具有十分重要的价值，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株粗糙脉孢菌DZ01菌株及其在发酵杜仲叶饲料中的应用，有效解决利用粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵杜仲叶饲料，显著提高杜仲叶饲料中营养成分和生物功效成分含量，有效降低杜仲叶饲料中木质纤维素类、单宁、植酸等抗营养成分含量，大大提高杜仲叶的饲用价值和畜禽保健价值的问题。
本发明解决的技术方案是，一株粗糙脉孢菌DZ01菌株，分类命名为粗糙脉孢菌( Neurospora crassa)，于2022年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：40194，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
该粗糙脉孢菌DZ01菌株在发酵杜仲叶饲料中的应用方法，包括以下步骤：
（1）制备培养基：
①制备试管斜面培养基(PDA培养基)：称取马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂2%，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制成试管斜面培养基(PDA培养基)；
②制备液体发酵种子培养基：葡萄糖30.0g，蛋白胨20.0g，NaNO3 3.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1.0g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min；
③杜仲叶固体发酵培养基：将质量比（m/m）为90%杜仲叶干粉、5%糖蜜、3%硫酸铵、2% BHT（二丁基羟基甲苯）的培养基原料混合均匀，加水使其含水量达到58～65%，自然pH，121℃灭菌120min；
所述的杜仲叶干粉制备：采于7～8月、3～5年生的杜仲幼树，高、中、低部位随机摘取，烘干或自然条件下晾晒至含水量10%以下，粉碎过30目筛；
所述的糖蜜是制糖工业的副产物，产品不仅含有糖类、蛋白质、维生素、矿物质的营养物质，还含有低聚糖、磷脂、酚类的生物活性物质，在畜牧养殖业生产领域，糖蜜可作为能量饲料来提高动物的生产性能和饲料转化效率，在发酵培养基中通常为微生物生长代谢的能量营养来源，市售糖蜜是一种粘稠、黑褐色、呈半流动的物质，总糖含量48.0～49.0%，粗蛋白含量达到3～6%；
所述的硫酸铵为市售饲料添加剂，纯品为无色透明斜方晶系结晶，水溶液呈酸性，易吸湿，吸湿后固结成块，有效成分含量≥95.0%，在发酵培养基中通常为微生物生长代谢的氮营养来源；
所述的BHT（二丁基羟基甲苯）为市售饲料添加剂，用于饲料抗氧化剂，无色、白色或类白色结晶或结晶性粉末，有效成分含量≥98.5%，在发酵培养基中可作为发酵助剂影响微生物代谢产物中抗氧化物质的含量；
（2）扩增培养
取1环粗糙脉孢菌DZ01菌株接种到试管斜面培养基(PDA培养基)上进行扩增培养，28～30℃暗光培养115～120h；
（3）种子液体发酵培养
在容器中装入140～160mL液体发酵种子培养基，接入试管斜面培养基(PDA培养基)扩增培养的粗糙脉孢菌DZ01菌株孢子粉，在28～30℃，摇床转速为180～220r/min条件下，暗光培养70～75h；
（4）杜仲叶固体发酵
将恒温培养箱、不锈钢发酵盘、垫布、盖布、铁铲、量杯等发酵用具进行灭菌，先用垫布铺在不锈钢发酵盘底部，同时覆盖发酵盘四个边缘，称取杜仲叶固体发酵培养基，覆盖发酵盘厚度8cm，按杜仲叶固体发酵培养基总质量6～8%的比例，用量杯量取种子培养液倒入杜仲叶固体发酵培养基中，搅拌均匀，再在培养基表面盖上盖布，然后将发酵盘送入培养箱内；恒温培养箱在0～72h设定温度为29～31℃，72h以后设定温度为27～29℃，培养箱湿度在0～48h保持相对湿度75～85%，49～72h保持相对湿度68～72%，72h以后保持培养箱自然的相对湿度；发酵96h以后，每24h观察一次，当培养基表面布满菌丝，且菌丝深入到培养基底部，培养基形成菌块，则表明发酵培养完成；将发酵培养物送入沸腾流化床干燥箱中，低于60℃进行干燥；或将发酵培养物置于室内，菌块自然风干，当含水率达到10%以下，粉碎成过30目筛的粉状物，分装，即成发酵杜仲叶饲料。
本发明以粗糙脉孢菌( Neurospora crassa）DZ01菌株作为发酵菌株，采用固体发酵工艺，在液体发酵培养种子的基础上结合了固体发酵单位体积的生物量产出比液体发酵高，固体发酵培养物中代谢产物更加丰富，发酵培养基含水量低，不需要进行废水处理，环境污染少的优势。结果表明，发酵后杜仲叶饲料营养成分和生物功效成分含量显著提高，木质纤维素类、单宁、植酸等抗营养成分含量显著降低，大大增强了杜仲叶饲料的饲用价值和畜禽保健价值。在国家禁止饲料和养殖环节添加抗生素后，本发明创制的以粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵制备杜仲叶饲料具备替代抗生素及化学合成药物的潜能和功效，符合国家大力发展生态农业和无公害食品的产业化需要，可产业化推广应用，市场前景广阔，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明粗糙脉孢菌DZ01菌株平板菌落特征图。
图2为本发明粗糙脉孢菌DZ01菌株ITS序列琼脂糖凝胶PCR电泳图。
图3为本发明粗糙脉孢菌DZ01菌株ITS测序Blast比对结果图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明一株粗糙脉孢菌DZ01菌株，分类命名为粗糙脉孢菌( Neurospora crassa)，于2022年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo：40194，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
所述的粗糙脉孢菌DZ01菌株以粗糙脉孢菌( Neurospora crassa）为原始菌株，利用紫外线微生物诱变技术，选育出一株能够发酵杜仲叶饲料的粗糙脉孢菌DZ01菌株，该菌株发酵杜仲叶饲料，可使其营养成分和生物功效成分含量显著提高，木质纤维素类、单宁、植酸等抗营养成分含量显著降低，大大增强了杜仲叶饲料的饲用价值和畜禽保健价值。对该菌株进行形态特征观察、微生物培养实验以及分子生物学鉴定等，将其分类命名为粗糙脉孢菌( Neurospora crassa) DZ01菌株，具体选育方法包括：
1.材料：
1.1菌种
粗糙脉孢菌( Neurospora crassa）的原始菌种来源于中国科学院微生物研究所；
1.2培养基
试管斜面培养基(PDA培养基)：称取马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂2%，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20 min，制成试管斜面培养基；
诱变培养基（平皿培养基）：称取蔗糖10g，CaCl2 0.1g，NaCl 0.1g，NH4NO3 1g，酒石酸铵5g，生物素4ug，MgSO4.7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，微量元素溶液1mL，2%琼脂，蒸馏水定容至1000mL，pH6.0，121℃灭菌20min，制成诱变培养基（平皿培养基）；
所述微量元素溶液配制：称取NaB4O7.10H2O 88mg，CuSO4.5H2O 393mg，Fe2(SO4)3.10H2O 910 mg，ZnSO4.7H2O 8807mg，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
液体发酵种子培养基：葡萄糖30.0g，蛋白胨20.0g，NaNO3 3.0g，MgSO4 0.5g，KCl0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1.0g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
杜仲叶固体发酵培养基：将质量比（m/m）为90%杜仲叶干粉、5%糖蜜、3%硫酸铵、2%BHT（二丁基羟基甲苯）的培养基原料混合均匀，加水使其含水量达到58～65%，121℃灭菌120min。
所述的杜仲叶干粉制备：采于7～8月、3～5年生的杜仲幼树，高、中、低部位随机摘取，烘干或自然条件下晾晒至含水量10%以下，粉碎过30目筛；
所述的糖蜜是制糖工业的副产物，产品不仅含有糖类、蛋白质、维生素、矿物质等营养物质，还含有低聚糖、磷脂、酚类等生物活性物质，在畜牧养殖业生产领域，糖蜜可作为能量饲料来提高动物生产性能和饲料转化效率，在发酵培养基中通常为微生物生长代谢的能量营养来源，市售糖蜜是一种粘稠、黑褐色、呈半流动的物质，总糖含量48.0～49.0%，粗蛋白含量3.0～6.0%；
所述的硫酸铵为市售饲料添加剂，纯品为无色透明斜方晶系结晶，水溶液呈酸性，易吸湿，吸湿后固结成块，有效成分含量≥95.0%，在发酵培养基中通常为微生物生长代谢的氮营养来源；
所述的BHT（二丁基羟基甲苯）为市售饲料添加剂，主要用于饲料抗氧化剂，无色、白色或类白色结晶或结晶性粉末，有效成分含量≥98.5%，在发酵培养基中可作为发酵助剂影响微生物代谢产物中抗氧化物质的含量；
2.筛选方法
2.1原始菌种活化
取1环粗糙脉孢菌原始菌种接种于试管斜面培养基（PDA培养基）上，28℃暗光培养120h；
2.2诱变孢子悬液制备
取1管经活化培养的粗糙脉孢菌试管斜面培养基菌种，在超净工作台内将试管斜面培养的粗糙脉孢菌孢子置入内含玻璃珠、50mL蒸馏水的250mL的灭菌三角瓶中，在28℃、摇床转速200r/min条件下震荡30min，观察孢子团完全打开后，取孢子悬液用灭菌蒸馏水进行稀释，用血球计数板计数，制备孢子悬液浓度为1×104个/mL；
2.3紫外线诱变处理
取制备的孢子悬液1mL涂于诱变培养基（平皿培养基）上，打开培养皿的盖，在超净工作台内吹干，将培养皿置于30W紫外灯下30cm处，照射时间设定为0、240s、300s、360s、420s、480s、540s、600s，照射后的培养皿盖上盖迅速包起，每组做三个平行培养，28℃避光培养144h，每24h观察记录菌丝体生长情况，计算各照射时间下的菌丝体生长率，选择菌丝体生长率在70～80％照射时间作为紫外线最佳照射剂量；
2.4平板初筛
挑取经紫外线最佳剂量照射，且在平皿培养基上生长迅速、菌丝体透明，无色或略成红色、分生孢子圆满形、桔黄色或粉红色的待分离的材料，在无菌诱变培养基（平皿培养基）上进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，直到微生物能够完全分散开；经28℃避光培养，在平皿培养基表面得到单菌落，挑选菌落比较大的单菌落进行平皿培养基再培养，反复进行3次培养，挑选所选目标菌落，获得编号为DZ01、DZ02、DZ03、DZ04、DZ05的平板初筛菌株；
2.5发酵复筛
取平板初筛获得的5株菌株进行500mL三角瓶固体发酵试验，在500mL三角瓶中装入杜仲叶固体发酵培养基20～30g，接入平板初筛获得的单菌落，28℃培养96h，以产纤维素酶酶活的高低作为菌株发酵复筛的选育指标，测定其中纤维素酶酶活，结果如表1；
表1发酵复筛菌株产纤维素酶的能力
菌株编号 DZ01 DZ02 DZ03 DZ04 DZ05
酶活（μ/g） 5.76 3.89 4.38 4.55 3.65
表1表明，平板初筛获得的DZ01菌株发酵产纤维素酶的能力最强，表明该菌株在发酵杜仲叶饲料过程中降解木质纤维素类抗营养成分潜力最佳。所述的纤维素酶酶活的定义及其检测方法按GB/T 23881-2009（饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法）规定执行。
2.6 DZ01菌株遗传稳定性
按“发酵复筛”的方法，进行DZ01菌株固体发酵杜仲叶饲料试验。试验连续进行5代发酵培养，分别测定其产纤维素酶酶活，结果如表2：
表2 DZ01菌株产纤维素酶遗传稳定性
菌株代数 F1 F2 F3 F4 F5
酶活（μ/g） 5.76 5.77 5.74 5.75 5.73
由表2可知，DZ01菌株连续5代发酵杜仲叶饲料，其产纤维素酶酶活可持续保持在5.76μ/g左右，表明DZ01菌株产纤维素酶具有良好的遗传稳定性。
2.7 DZ01菌株鉴定与保藏
DZ01菌株在平皿培养基上培养，菌落生长具有疏松网状的长菌丝，壁上有带状条纹，菌丝体透明，无色或略成红色，有隔膜、分枝、多核，直径0.015mm。无性繁殖能形成分生孢子，一般为卵圆形，壁上无条纹，在气生菌丝顶部形成分枝链，直径0.006mm，分生孢子呈桔黄色或粉红色，DZ01菌株平皿培养基上培养特征如图1所示。由此可以看出，DZ01菌株符合真菌的基本形态特征和生物学特性。
对DZ01菌株进行真菌的内源转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)鉴定及基因组测序。取平板培养基培养的DZ01菌株少许，以提取的DNA样品作为PCR反应的扩增模板，分别采用真菌通用引物ITS1和ITS4进行扩增。PCR 反应体系 (25.0μL)：PCR Mix21.0μL，正、反向引物 (5p)各1.0µL，模板（ng/μL）2.0µL。PCR反应条件：96℃预变性5min，96℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。72℃延伸10min，最后4℃恒温保存备用。DZ01菌株ITS序列琼脂糖凝胶PCR电泳图如图2所示。经凝胶回收纯化后的PCR 扩增产物由华大基因技术服务有限公司进行基因测序。DZ01菌株ITS基因全长560bp，测序序列结果如下：
TGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGC
CTCGGCGCTGGCGGTCCGGAAAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTG
CCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATAAGTCAAAA
CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATC
AGTGGCGGGCTCGCTAGTCACACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCC
GTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATC
将DZ01菌株ITS测序序列结果递交GenBank网站进行BLAST同源性比对分析，结果如图3所示。图3结果表明，本发明提供的DZ01菌株ITS基因序列与粗糙脉孢菌（ Neurospora  crassa）(genbank:MH860307.1) 相似度高达99％以上。综合DZ01菌株的形态特征、生物学特性以及ITS序列的分析结果，将其鉴定为粗糙脉孢菌( Neurospora crassa)菌株，于2022年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：40194，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
该粗糙脉孢菌DZ01菌株在发酵杜仲叶饲料中的应用方法，包括以下步骤：
（1）制备培养基：
①制备试管斜面培养基(PDA培养基)：称取马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂2%，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制成试管斜面培养基(PDA培养基)；
②制备液体发酵种子培养基：葡萄糖30.0g，蛋白胨20.0g，NaNO3 3.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1.0g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min；
③杜仲叶固体发酵培养基：将质量比（m/m）为90%杜仲叶干粉、5%糖蜜、3%硫酸铵、2% BHT（二丁基羟基甲苯）的培养基原料混合均匀，加水使其含水量达到58～65%，自然pH，121℃灭菌120min；
（2）扩增培养
取1环粗糙脉孢菌DZ01菌株接种到试管斜面培养基(PDA培养基)上进行扩增培养，28℃暗光培养120h；
（3）种子液体发酵培养
在500mL的三角瓶中装入150mL液体发酵种子培养基，接入试管斜面培养基(PDA培养基)扩增培养的粗糙脉孢菌DZ01菌株孢子粉，在28℃，摇床转速为200r/min条件下，暗光培养72h；
（4）杜仲叶固体发酵
将恒温培养箱、不锈钢发酵盘、垫布、盖布、铁铲、量杯用具进行灭菌，先用垫布铺在不锈钢发酵盘底部，同时覆盖发酵盘四个边缘，称取杜仲叶固体发酵培养基，覆盖发酵盘厚度8cm，按杜仲叶固体发酵培养基总质量6～8%的比例，用量杯量取种子培养液倒入杜仲叶固体发酵培养基中，搅拌均匀，再在培养基表面盖上盖布，然后将发酵盘送入恒温培养箱内；恒温培养箱在0～72h设定温度为30℃，72h以后设定温度为28℃，恒温培养箱湿度在0～48h保持相对湿度80%，49～72h保持相对湿度70%，72h以后保持恒温培养箱自然的相对湿度；发酵96h以后，每24h观察一次，当培养基表面布满菌丝，且菌丝深入到培养基底部，培养基形成菌块，则表明发酵培养完成；将发酵培养物送入沸腾流化床干燥箱中，低于60℃进行干燥；或将发酵培养物置于室内，菌块自然风干，当含水率达到10%以下，粉碎成过30目筛的粉状物，分装，即成发酵杜仲叶饲料。
本发明发酵杜仲叶饲料可有效用于畜禽饲养。本发明采用固体发酵工艺，在液体发酵培养种子的基础上结合固体发酵单位体积的生物量产出比液体发酵高，固体发酵培养物中代谢产物更加丰富，发酵培养基含水量低，不需要进行废水处理，环境污染少的优势，发酵后杜仲叶饲料营养成分和生物功效成分含量显著提高，木质纤维素类、单宁、植酸等抗营养成分含量显著降低，大大增强了杜仲叶饲料的饲用价值和畜禽保健价值，有关实验资料如下：
1.杜仲叶发酵对其饲用价值和畜禽保健价值的影响
1.1实验方法
随机抽取实施例发酵前后样品各1000kg，分装于4个样品袋，每袋500g。分别测定发酵前后杜仲叶中营养成分含量、抗营养成分含量和生物功效成分含量，平行样品检测结果取其平均数。
1.2测定方法
营养成分粗蛋白、游离氨基酸、粗脂肪、有机物含量分别按GB/T6432-2018、GB/T30987-2020、GB/T6433-2006、GB/T6438-2007的检测方法进行。抗营养成分粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、植酸、单宁含量分别按GB/T6434-2006、GB/T20806-2006、NY/T1459-2007、GB/T20805-2006、GB5009.153-2016、GB/T27985-2011的检测方法进行。功效成分绿原酸、总黄酮按GB/T22250-2008、NY/T2010-2011的检测方法进行；桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸按刘静等（刘静,吕海涛.正交试验法优选杜仲叶中桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的提取工艺研究[J].中南药学,2010,8(9):661-664.）的方法进行；总多酚按张琳杰等（张琳杰,彭胜,张昌伟,等.响应面法优化杜仲叶中总多酚超声波辅助提取工艺研究[J].食品工业科技,2014,35(8):228-233.）的检测方法进行；番茄红素按李陈陈等（李陈陈,陈钢,苏伟,等.固体培养粗糙脉孢菌产番茄红素及抗氧化活性研究[J].中国酿造,2017,36(4):30-35.）的检测方法进行。
1.3检测结果
发酵前后杜仲叶饲料中营养成分含量、抗营养成分含量和生物功效成分含量由河南海瑞正检测技术有限公司进行检测，检测结果如表3。
表3杜仲叶饲料发酵前后组成成分含量测定结果
项目 发酵前 发酵后 检测依据
粗蛋白 % 13.25 16.70 GB/T6432-2018
游离氨基酸mg/g 1.24 3.61 GB/T30987-2020
粗脂肪 % 7.35 9.24 GB/T6433-2006
有机物 % 90.37 91.85 GB/T6438-2007
粗纤维 % 10.35 7.66 GB/T6434-2006
中性洗涤纤维 % 43.50 33.91 GB/T20806-2006
酸性洗涤纤维 % 33.80 25.51 NY/T1459-2007
酸性洗涤木质素 % 16.45 12.20 GB/T20805-2006
植酸mg/g 4.30 2.12 GB5009.153-2016
单宁   % 1.60 0.55 GB/T27985-2011
绿原酸 % 2.48 4.05 GB/T22250-2008
总黄酮 % 3.05 4.49 NY/T2010-2011
桃叶珊瑚苷 % 1.36 1.75 刘静等.正交试验法优选杜仲叶桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的提取工艺研究[J].中南药学，2010,8(9):661-664
京尼平苷酸 % 2.23 2.66 刘静等.正交试验法优选杜仲叶桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸的提取工艺研究[J].中南药学，2010,8(9):661-664
总多酚 % 8.75 10.10 张琳杰等.响应面法优化杜仲叶中总多酚超声波辅助提取工艺研究[J].食品工艺科技，2014,35(8):228-233
番茄红素mg/g 0 1.95 李陈陈等.固体培养粗糙脉孢菌产番茄红素及抗氧化活性研究[J].中国酿造，2017,36(4):30-35
杜仲叶饲料发酵前后营养成分含量、抗营养成分含量和生物功效成分含量变化情况如表4所示。
表4杜仲叶饲料发酵前后组成成分含量变化情况
项目 发酵前 发酵后 变化比率(＋表示增加，－表示减少)
粗蛋白 % 13.25 16.70 ＋26.04%
游离氨基酸 mg/g 1.24 3.61 ＋191.13%
粗脂肪 % 7.35 9.24 ＋25.71%
有机物 % 90.37 91.85 ＋1.64%
粗纤维 % 10.35 7.66 －25.99%
中性洗涤纤维 % 43.50 33.91 －22.05%
酸性洗涤纤维 % 33.80 25.51 －24.53%
酸性洗涤木质素 % 16.45 12.20 －25.84%
植酸   mg/g 4.30 2.12 －50.70%
单宁   % 1.60 0.55 －65.63%
绿原酸 % 2.48 4.05 ＋63.31%
总黄酮 % 3.05 4.49 ＋47.21%
桃叶珊瑚苷 % 1.36 1.75 ＋28.68%
京尼平苷酸 % 2.23 2.66 ＋19.28%
总多酚 % 8.75 10.10 ＋15.43%
番茄红素 mg/g 0 1.95 ＋195.00%
杜仲叶中富含粗蛋白、氨基酸、粗脂肪、有机物等动物所需要的营养成分，是一种优良的木本饲料资源。杜仲叶经粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵，其中所含的部分非蛋白氮经微生物的新陈代谢作用转化为菌体蛋白，同时又将杜仲叶中的蛋白质降解成小肽、游离氨基酸等，不仅提高了发酵杜仲叶饲料中粗蛋白含量，还提高了氨基酸的消化利用率。杜仲叶饲料中的粗脂肪和有机物含量也得到提高。表4的结果表明，与发酵前相比，发酵杜仲叶饲料中粗蛋白含量提高了26.04%，游离氨基酸含量提高了191.13%，粗脂肪含量提高了25.71%，有机物含量提高了1.64%，表明粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵杜仲叶饲料，显著提高了杜仲叶饲料的营养价值。
杜仲叶饲料中通常含有较高的抗营养成分含量。木质纤维素类成分含量往往影响单胃动物对营养物质的消化吸收。单宁易与饲料中的营养成分结合，造成营养成分利用不充分，降低饲料的营养价值，单宁含量过高，还影响饲料的适口性，导致动物采食量下降。杜仲叶饲料中的植酸影响单胃动物蛋白质、矿物质代谢以及消化酶的活性。表4的结果表明，杜仲叶饲料中粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、植酸、单宁等抗营养成分含量与发酵前相比分别降低了25.99%、22.05%、24.53%、25.84%、50.70%、65.63%，表明粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵杜仲叶饲料，显著改善了杜仲叶饲料的饲用价值。
杜仲叶饲料中除含粗蛋白、氨基酸、粗脂肪、有机物等饲用营养成分外，还富含绿原酸、总黄酮、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、总多酚等自身独有的生物功效成分。这些生物功效成分的协同作用，不仅使杜仲叶饲料具有饲用价值，同时还具有药用和保健价值。研究表明，绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，同时绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、停乳链球菌、沙门氏菌、乳房链球菌等均有一定的抑菌作用，能够缓解动物肠道氧化应激和炎症反应，维持肠道平衡和免疫功能，保障动物肠道健康。总黄酮、总多酚是杜仲叶饲料中最活跃的抗氧化剂，一方面改善抗氧化酶活性，提高动物机体抗氧化能力，另一方面还可以增强动物机体的免疫功能。桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸对动物机体具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化等功能。表4的结果表明，发酵后杜仲叶饲料中绿原酸含量提高了63.31%，总黄酮含量提高了47.21%，桃叶珊瑚苷含量提高了28.68%，京尼平苷酸含量提高了19.28%，总多酚含量提高了15.43%。番茄红素是一种不含氧的类胡萝卜素，由11个共轭双键和2个非共轭双键组成的异戊二烯类化合物，具有很强的抗氧化作用。番茄红素发酵前无检出，发酵后含量达到1.95mg/g，表明发酵过程除提高绿原酸、总黄酮、总多酚、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸含量外，还增加了杜仲叶饲料中具备抗氧化性功能的番茄红素含量。粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵杜仲叶饲料，增加了发酵杜仲叶饲料中功效成分的种类和含量，增强了产品的畜禽保健价值，有助于提高产品的应用效果和经济价值。
综上所述，本发明提供了一株粗糙脉孢菌DZ01菌株及其在发酵杜仲叶饲料中的应用，粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵杜仲叶饲料，显著提高了杜仲叶饲料中粗蛋白、游离氨基酸、粗脂肪、有机物等营养成分含量，同时又显著降低了粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、植酸、单宁等抗营养成分含量，有效提高了杜仲叶饲料的饲用价值。杜仲叶饲料还具有药食同源特性，通过粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵制备的杜仲叶饲料，含有大量的绿原酸、黄酮类、多酚类、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、番茄红素等生物活性物质，可显著提高畜禽生产性能、增强机体免疫力和抗氧化能力。在国家禁止饲料和养殖环节添加抗生素后，本发明创制的粗糙脉孢菌DZ01菌株发酵杜仲叶饲料具备在畜禽养殖环节替代抗生素及化学合成药物的潜能和功效，符合国家大力发展生态农业和无公害食品的产业化的需要，产品可产业化推广应用，市场前景广阔，经济和社会效益巨大。

Claims (3)

1.一株粗糙脉孢菌DZ01菌株，分类命名为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，于2022年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：40194，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的粗糙脉孢菌DZ01菌株在发酵杜仲叶饲料中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备培养基：
①制备试管斜面培养基：称取马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂2%，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制成试管斜面培养基；
②制备液体发酵种子培养基：葡萄糖30.0g，蛋白胨20.0g，NaNO3 3.0g，MgSO4 0.5g，KCl0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1.0g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min；
③杜仲叶固体发酵培养基：将质量比为90%杜仲叶干粉、5%糖蜜、3%硫酸铵、2%二丁基羟基甲苯的培养基原料混合均匀，加水使其含水量达到58～65%，自然pH，121℃灭菌120min；
所述的杜仲叶干粉制备：采于7～8月、3～5年生的杜仲幼树，高、中、低部位随机摘取，烘干或自然条件下晾晒至含水量10%以下，粉碎过30目筛；
（2）扩增培养
取1环粗糙脉孢菌DZ01菌株接种到试管斜面培养基(PDA培养基)上进行扩增培养，28～30℃暗光培养115～120h；
（3）种子液体发酵培养
在容器中装入140～160mL液体发酵种子培养基，接入试管斜面培养基(PDA培养基)扩增培养的粗糙脉孢菌DZ01菌株孢子粉，在28～30℃，摇床转速为180～220r/min条件下，暗光培养70～75h；
（4）杜仲叶固体发酵
将恒温培养箱、不锈钢发酵盘、垫布、盖布、铁铲、量杯发酵用具进行灭菌，先用垫布铺在不锈钢发酵盘底部，同时覆盖发酵盘四个边缘，称取杜仲叶固体发酵培养基，覆盖发酵盘厚度8cm，按杜仲叶固体发酵培养基总质量6～8%的比例，用量杯量取种子培养液倒入杜仲叶固体发酵培养基中，搅拌均匀，再在培养基表面盖上盖布，然后将发酵盘送入培养箱内；恒温培养箱在0～72h设定温度为29～31℃，72h以后设定温度为27～29℃，培养箱湿度在0～48h保持相对湿度75～85%，49～72h保持相对湿度68～72%，72h以后保持培养箱自然的相对湿度；发酵96h以后，每24h观察一次，当培养基表面布满菌丝，且菌丝深入到培养基底部，培养基形成菌块，则表明发酵培养完成；将发酵培养物送入沸腾流化床干燥箱中，低于60℃进行干燥；或将发酵培养物置于室内，菌块自然风干，当含水率达到10%以下，粉碎成过30目筛的粉状物，分装，即成发酵杜仲叶饲料。
3.根据权利要求2所述的粗糙脉孢菌DZ01菌株在发酵杜仲叶饲料中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备培养基：
①制备试管斜面培养基：称取马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂2%，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制成试管斜面培养基；
②制备液体发酵种子培养基：葡萄糖30.0g，蛋白胨20.0g，NaNO3 3.0g，MgSO4 0.5g，KCl0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1.0g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min；
③杜仲叶固体发酵培养基：将质量比为90%杜仲叶干粉、5%糖蜜、3%硫酸铵、2%二丁基羟基甲苯的培养基原料混合均匀，加水使其含水量达到58～65%，自然pH，121℃灭菌120min；
（2）扩增培养
取1环粗糙脉孢菌DZ01菌株接种到试管斜面培养基上进行扩增培养，28℃暗光培养120h；
（3）种子液体发酵培养
在500mL的三角瓶中装入150mL液体发酵种子培养基，接入试管斜面培养基扩增培养的粗糙脉孢菌DZ01菌株孢子粉，在28℃，摇床转速为200r/min条件下，暗光培养72h；
（4）杜仲叶固体发酵
将恒温培养箱、不锈钢发酵盘、垫布、盖布、铁铲、量杯发酵用具进行灭菌，先用垫布铺在不锈钢发酵盘底部，同时覆盖发酵盘四个边缘，称取杜仲叶固体发酵培养基，覆盖发酵盘厚度8cm，按杜仲叶固体发酵培养基总质量6～8%的比例，用量杯量取种子培养液倒入杜仲叶固体发酵培养基中，搅拌均匀，再在培养基表面盖上盖布，然后将发酵盘送入恒温培养箱内；恒温培养箱在0～72h设定温度为30℃，72h以后设定温度为28℃，恒温培养箱湿度在0～48h保持相对湿度80%，49～72h保持相对湿度70%，72h以后保持恒温培养箱自然的相对湿度；发酵96h以后，每24h观察一次，当培养基表面布满菌丝，且菌丝深入到培养基底部，培养基形成菌块，则表明发酵培养完成；将发酵培养物送入沸腾流化床干燥箱中，低于60℃进行干燥；或将发酵培养物置于室内，菌块自然风干，当含水率达到10%以下，粉碎成过30目筛的粉状物，分装，即成发酵杜仲叶饲料。
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