CN101805704A

CN101805704A - 一种高产核糖核酸的热带假丝酵母及应用

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Publication number: CN101805704A
Application number: CN201010105787A
Authority: CN
Inventors: 周长林; 方圆; 林忠; 邱蔚然; 曹静; 金由辛
Original assignee: Nantong Qiuzhiyou Bioscience & Biotechnology Co ltd; China Pharmaceutical University
Current assignee: Nantong Qiuzhiyou Bioscience & Biotechnology Co ltd; China Pharmaceutical University
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2010-02-03
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2030-02-03
Also published as: CN101805704B

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高产核糖核酸的热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)菌株及其应用，本发明的热带假丝酵母(Candida lipolytica)菌株于2009年12月30号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏号为：CGMCCNo.3558。本发明的菌株不但核酸含量很高并且具有解脂假丝酵母可利用石蜡油为碳源的特征，可应用于核酸的工业化生产。

Description

一种高产核糖核酸的热带假丝酵母及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高产核糖核酸(RNA)的热带假丝酵母菌株(Candida tropicalis)以及利用该菌株高产RNA的应用。

背景技术

核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)是生物体内的高分子化合物，广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物体内，常与蛋白质结合形成核蛋白，对维持机体的正常功能有重要作用，是特定生理条件下不可缺少的营养成分。核酸可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸，简称DNA，DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，而RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用。外源性核酸在机体营养、免疫调节和疾病防治等方面都有一定的功能。

RNA最大的应用是作为用分解法生产5’-核苷酸的工业原料。核糖核酸及其酶分解产物腺苷酸、胞苷酸，鸟苷酸，尿苷酸等在医药、食品、化妆品以及农业等行业中具有重要的用途。近年一些研究表明核糖核酸及其酶解物核苷酸具有维持机体免疫功能、抗氧化、提高机体蛋白质和铁的生物利用率、降低胆固醇和抗衰老等多种生理功能。核酸的国内外需求量巨大，预计仅国内用量就在1000吨以上，国外用量在数千吨以上。目前国内RNA最大生产量仅维持在200吨左右，仅能生产100吨核苷酸，远不能满足市场需求。因此，核糖核酸的开发研究越来越受到重视。

RNA的来源，与动植物相比，微生物体内的蛋白质生物合成非常活跃，含有丰富的RNA。关于微生物菌体内RNA的含量，自1940年以来，有许多报道，而其中酵母菌的RNA含量是相对较高的，因此RNA的制备大多数以酵母菌为原料，常用的菌种为酿酒酵母，RNA含量可达3％～7％。日本的山口等研究人员(参考文献：山口和夫，三上忠义，茨大农学术报告，13，69，1965)用含有2％葡萄糖的合成培养基研究比较了数十种酵母属，结果发现，假丝酵母属的酵母菌体内RNA积累能力为最佳，而菌体中RNA含量在对数生长期末为最高，且因糖的种类不同所引起的差异较小，无机氮源以硫酸铵而有机氮源以蛋白胨、酵母浸出液为佳。

目前用微生物生产的核苷酸及其衍生物有60多种，而微生物发酵法制备RNA的工业也日渐发展。在日本，自1962年以后有三个工厂利用亚硫酸纸浆废液、一个工厂利用糖蜜生产酵母，年产干燥酵母1～2万吨，酵母RNA含量分别为10％，15％左右。在我国，通过对石油酵母石油发酵脱蜡的进一步研究，汪猷，王大琛，李祥鹏等取得了“生产核酸和饲料蛋白的高产核酸酵母”研究成果，于1985年获中科院科技进步一等奖。他们通过对解脂假丝酵母Y-17菌株的诱变和处理，得到氯化钾敏感株K-79，使其核糖核酸含量从5.5％达到11.6％，又通过优化培养基和培养条件使其核糖核酸含量达到13.5％。为了适应K-79菌株连续培养和高供氧的要求，还专门设计了实验室用的容量60L的内循环气升式发酵设备，结构简便、易于放大。每生产1吨高核酸酵母，可得工业级RNA 80kg和脱核酸酵母700kg。取得建厂投产所需的技术数据。1984年此项技术推广应用到福建莆田糖厂，促进建立年产1500吨核酸酵母(即可年产150吨核糖核酸)的厂房，生产至今长盛不衰。

发明内容

本发明通过将热带假丝酵母ATCC14246进行诱变筛选，得到一株高产RNA的热带假丝酵母菌株，简称CPU-1，它不但核酸含量很高并且具有解脂假丝酵母可利用石蜡油为碳源的特征。本发明通过优化其发酵培养基和发酵培养条件，使该菌株的RNA产量有效提高，可应用于核酸的工业化生产。

本发明的可高产RNA的热带假丝酵母菌株CPU-1(Candida tropicalis，CPU-1)，已于2009年12月30号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏号为：CGMCCNo.3558。

本发明以实验室保藏的热带假丝酵母ATCC14246为原始菌株，先利用以石蜡油为碳源的发酵培养基培养出能够利用石蜡油的酵母菌，用稀释平板法纯化出单菌落作为诱变的出发菌株。根据一定范围内不同浓度和时间梯度的NTG致死率曲线，得到合适的诱变条件后，用一定浓度的NTG对出发菌株进行诱变。由于本菌株有对高浓度氯化钾敏感的特性，所以用影印平板法进行筛选出氯化钾敏感菌株，接着再将它们进行3次紫外诱变，最后得到一株RNA含量可达到16％的菌株CPU-1，较原始菌株热带假丝酵母ATCC14246的核糖核酸含量提高了3倍以上。

在此诱变筛选的过程中，所用的培养基为以下几种。氯化钾敏感性筛选培养基A：葡萄糖3％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.3％，尿素0.5％，FeSO₄·7H₂O 0.01％，琼脂2.5％；氯化钾敏感性筛选培养基B为：培养基A中加入1.5mol/L KCl；分离单菌落的平板培养基及斜面培养基C：葡萄糖3％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.3％，尿素0.5％，FeSO4·7H2O 0.01％，琼脂2.5％；利用石蜡油菌株的筛选培养基D：石蜡油1％，(NH4)2SO4 1.5％，KH2PO4 0.9％，K2HPO40.3％，MgSO4·7H₂O 0.3％，FeSO₄·7H₂O 0.003％，酵母膏0.3％，玉米浆0.3％；种子培养基S：葡萄糖4％，(NH₄)₂SO₄ 1.5％，KH₂PO₄ 0.9％，K₂HPO₄ 0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.3％，FeSO₄·7H₂O 0.003％，酵母膏0.3％，玉米浆0.3％，CaCO₃0.5％；筛选发酵培养基M：石蜡油1％，尿素0.8％，80％磷酸0.3％，KCl 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.1％，FeSO₄·7H₂O 0.003％，CaCl₂·2H₂O 0.01％，NaCl 0.1％，酵母膏0.3％，玉米浆0.3％。

具体地，此诱变筛选的方法为，首先将热带假丝酵母ATCC14246于培养基D中28℃培养16～18小时后挑取单菌落，该菌落即为可利用石蜡油的菌株，它作为诱变的出发菌株。接着，用0.5mg/ml亚硝基胍(NTG)在30℃诱变45min，也可以用1.5mg/ml或2.0mg/mNTG诱变30min，用影印平板法筛选出一株核酸含量达10％的氯化钾敏感菌株D12，此处的影印平板法为：在培养基A和B两块平皿的相同位置接种该菌，如果该菌株是对氯化钾的敏感菌株，则会只在A平板上生长，不在B平板上生长，如果该菌株对氯化钾不敏感，则会在A和B平板上都生长。然后，D12再通过三次紫外诱变，照射时间为60s，筛选出一株核酸含量可高达16％的KCl敏感菌株菌株CPU-1，它同时还具有解脂假丝酵母的特征，可利用石蜡油为碳源，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.3558。

该菌株具有以下特征：

1.菌落形态特征：见附图1。如图1所示，在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD培养基：酵母粉1％，葡萄糖2％，蛋白胨2％)的琼脂培养基上菌落为白色到奶油色，无光泽或稍有光泽，黏湿，软而平滑或部分有皱纹，易被挑起。

2.菌体形态特征：在YPD液体培养基中培养，28℃，3天，细胞呈球形或卵球，大小为4～8×6～11μm。

3.菌株的生长及核酸含量曲线：见附图2。如图2所示，0～12h为菌生长的对数期，培养基中的葡萄糖含量急剧下降，菌浓也快速增长，pH下降，而核酸增长则较平稳；12h以后，菌进入稳定期，葡萄糖基本消耗完毕，菌体总量的增长幅度不再显著，核酸的含量与对数生长期相比有主见降低的趋势。这是因为在RNA聚合酶的活性在酵母对数生长期较高，经过了对数生长期以后，随着时间的增加，RNA聚合酶活性降低，所以菌体内RNA的含量变少。而酵母菌在生长过程中代谢产生有机酸使培养液pH下降。因此在保持较高菌浓的前提下，确定种子培养和发酵培养的时间为10-12h。且在间歇发酵过程中，酵母菌的比生长速率μ最大可达到0.5h^-1。

本发明利用上述高产核酸的热带解脂假丝酵母CPU-1高产核酸的培养方法包括：在种子培养基中培养CPU-1菌株，在培养后将菌液转接发酵培养基中发酵培养即得。

进一步地，在种子培养基中培养CPU-1，在一定培养条件下培养一定时间后将菌液转接发酵培养基。在优化的发酵培养基中以一定的发酵培养条件培养该菌株，培养基的优化包括碳源的组成和葡萄糖的浓度，氮源中有机氮和无机氮的成分和浓度，无机磷的浓度，以及碳、氮、磷源的比例和所添加的金属离子的浓度。并通过添加不同氨基酸来提高该菌株体内RNA含量。

优选的种子培养基含：葡萄糖4％、(NH₄)₂SO₄ 1.5％、KH₂PO₄ 0.9％、K₂HPO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.3％、FeSO₄·7H₂O 0.003％、酵母膏0.3％、玉米浆0.3％和CaCO₃0.5％，为重量百分比。培养基基质为水。

优选的种子培养基中的发酵培养条件为：摇瓶培养的温度为30℃，搅拌转数为200r/min，接种量为5％，种龄为16小时。

优选的发酵培养基的组成为：葡萄糖5％、酵母膏1.2％、玉米浆0.9％、(NH4)₂SO₄ 1.0％、KH₂PO₄ 0.3％。培养基基质为水。

优选的发酵培养条件为：200rpm，30℃，培养16小时。

其中发酵培养基还应有适当的碳源和氮源的比例，碳源为5％葡萄糖，氮源为1.2％的酵母膏、0.9％的玉米浆和1.0％的(NH₄)₂SO₄。而在氮源中，有机氮和无机氮的比例为2∶1，有机氮为1.2％的酵母膏和0.9％的玉米浆的组合，无机氮为1.0％的(NH₄)₂SO₄。

其中发酵培养基中还优选含有1.25mmol/L的Zn²⁺和Fe²⁺。金属离子的加入有助于本发明菌株体内RNA含量的积累且菌体浓度保持稳定水平。

培养基中还含有谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)中的一种或几种。

研究发现，添加不同氨基酸可以提高CPU-1菌株体内RNA含量，单独添加Glu、Ser、Met、Gly分别使RNA含量提高42％、56％、45％、18％，而添加氨基酸混合物可使RNA含量提高85％，添加蛋白胨则可使RNA含量提高90％。

RNA含量的测定方法如下：取10ml发酵菌液进行离心8000rpm，10min，弃去上清，称菌体湿重。用10ml生理盐水悬浮细胞，离心8000rpm，10min，再用生理盐水悬浮后取2ml菌悬液于干净试管，再加入2ml高氯酸，70℃水浴20min，水浴过程中每5min震荡一次，水浴后取1ml加入EP管中混匀，用紫外分光光度计于260nm处测OD。RNA含量测定的公式为：

其中，A为OD₂₆₀吸光值，32为文献单位光吸收值，W为菌体湿重g·L^-1，R为酵母菌的干湿重比。

本发明通过将热带假丝酵母ATCC14246进行诱变筛选，得到一株高产RNA的热带假丝酵母菌株CPU-1，它是一株RNA含量很高并具有解脂假丝酵母可利用石蜡油为碳源的特征。本发明又通过优化其发酵培养基和发酵培养条件等，使此菌株的产RNA能力有效提高，可应用于核酸的工业化生产。

附图说明

图1热带假丝酵母菌株CPU-1的菌落形态

图2热带假丝酵母菌株CPU-1的菌株生长与核酸含量曲线

图3不同碳源对CPU-1体内积累RNA的影响

图4不同葡萄糖浓度对CPU-1体内积累RNA的影响

图5不同无机氮对CPU-1体内积累RNA的影响

图6不同硫酸铵浓度对CPU-1体内积累RNA的影响

图7不同有机氮对CPU-1体内积累RNA的影响

图8不同无机磷(磷酸二氢钾)浓度对CPU-1体内积累RNA的影响

图9不同金属离子及其不同浓度对CPU-1体内积累RNA的影响

图10添加不同氨基酸对CPU-1菌体RNA积累的影响

具体实施方式

实施例1

高产核糖核酸(RNA)的热带假丝酵母菌株的筛选

1.1.菌种

热带假丝酵母(Candidatropicalis)，ATCC14246，(购自美国标准菌种收藏所)，本实验室保藏

1.2.培养基

(1)氯化钾敏感性筛选培养基A(％)：葡萄糖3，牛肉膏0.3，酵母膏0.3，尿素0.5，FeSO₄·7H₂O0.01，琼脂2.5；氯化钾敏感性筛选培养基B：培养基A中加入1.5mol/L KCl

(2)种子培养基S(％)：葡萄糖4，(NH₄)₂SO₄1.5，KH₂PO₄0.9，K₂HPO₄0.3，MgSO₄·7H₂O 0.3，FeSO₄·7H₂O 0.003，酵母膏0.3，玉米浆0.3，CaCO₃0.5

(3)筛选发酵培养基M(％)：石蜡油1，尿素0.8，80％磷酸0.3，KCl 0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，FeSO₄·7H₂O 0.003，CaCl₂·2H₂O 0.01，NaCl 0.1，酵母膏0.3，玉米浆0.3

(4)分离单菌落的平板培养基及斜面培养基C(％)：葡萄糖3，牛肉膏0.3，酵母膏0.3，尿素0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，琼脂2.5

(5)利用石蜡油菌株的筛选培养基D(％)：石蜡油1，(NH₄)₂SO₄1.5，KH₂PO₄0.9，K₂HPO₄0.3，MgSO₄·7H₂O 0.3，FeSO₄·7H₂O 0.003，酵母膏0.3，玉米浆0.3

1.3.菌体诱变筛选方法

将热带假丝酵母ATCC14246于培养基D中28℃培养16～18小时后挑取单菌落，该菌落即为可利用石蜡油的菌株，它作为诱变的出发菌株。接着，用0.5mg/ml亚硝基胍(NTG)在30℃诱变45min，也可以用1.5mg/ml或2.0mg/mNTG诱变30min，用影印平板法筛选出一株核酸含量达10％的氯化钾敏感菌株D12，此处的影印平板法为：在培养基A和B两块平皿的相同位置接种该菌，如果该菌株是对氯化钾的敏感菌株，则会只在A平板上生长，不在B平板上生长，如果该菌株对氯化钾不敏感，则会在A和B平板上都生长。然后，D12再通过三次紫外诱变，照射时间为60s，筛选出一株核酸含量可高达16％的氯化钾敏感菌株菌株CPU-1，于2009年12月30号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏号为：CGMCC No.3558。它同时还具有解脂假丝酵母的特征，可利用石蜡油为碳源。

1.4.所筛选出来的解脂假丝酵母CPU-1具有以下特征：

(1)菌落形态特征：见附图1。如附图1所示，在YPD琼脂培养基上菌落为白色到奶油色，无光泽或稍有光泽，黏湿，软而平滑或部分有皱纹，易被挑起。

(2)菌体形态特征：在YPD液体培养基中培养，28℃，3天，细胞呈球形或卵球，其中大小为4～8×6～11μm。

(3)菌株的生长及核酸含量曲线：见附图2。如图所示，0～12h为菌生长的对数期，培养基中的葡萄糖含量急剧下降，菌浓也快速增长，pH下降，而核酸增长则较平稳；12h以后，菌进入稳定期，葡萄糖基本消耗完毕，菌体总量的增长幅度不再显著，核酸的含量与对数生长期相比有主见降低的趋势。这是因为在RNA聚合酶的活性在酵母对数生长期较高，经过了对数生长期以后，随着时间的增加，RNA聚合酶活性降低，所以菌体内RNA的含量变少。而酵母菌在生长过程中代谢产生有机酸使培养液pH下降。因此在保持较高菌浓的前提下，确定种子培养和发酵培养的时间为10-12h。且在连续发酵过程中，酵母菌的比生长速率μ最大可达到0.5h^-1。

实施例2

热带假丝酵母菌株CPU-1高产RNA的培养基

1.种子培养基(％)：葡萄糖4，(NH₄)₂SO₄1.5，KH₂PO₄0.9，K₂HPO₄0.3，MgSO₄·7H₂O 0.3，FeSO₄·7H₂O 0.003，酵母膏0.3，玉米浆0.3，CaCO₃0.5。200rpm，30℃培养16小时。发酵培养条件为：摇瓶培养的温度为30℃，搅拌转数为200r/min，接种量为5％，种龄为16小时。

2.优化的发酵培养基(％)：葡萄糖5，酵母膏1.2，玉米浆0.9，(NH₄)₂SO₄1.0，KH₂PO₄0.3。发酵培养条件为：200rpm，30℃，培养16小时。

实施例3

高产核糖核酸热带解脂假丝酵母发酵培养基的优化

3.1.培养基

3.1.1.种子培养基(％)：见实施例2

3.1.2.摇瓶发酵培养基(％)：葡萄糖4，80％磷酸0.3，(NH₄)₂SO₄0.5，KCl 0.15，MgSO₄·7H₂O0.1，FeSO₄·7H₂O 0.003，CaCl₂·2H₂O 0.01，NaCl 0.1，酵母膏0.3，玉米浆0.3

3.2.培养基的优化

碳源的优化：将CPU-1从种子斜面培养基上转接入50ml种子液体培养基中，200rpm、30℃摇瓶培养16h。按5％接种量接种于100ml摇瓶发酵培养基中，分别以山梨醇、果糖、蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖和半乳糖为唯一碳源，200rpm、30℃摇瓶培养16h，测定RNA含量(附图3)；结果是选择葡萄糖为碳源。又配制了从1％到10％不同葡萄糖浓度的10种培养基，将CPU-1进行摇床发酵培养，测定RNA含量(附图4)，结果选择4％的葡萄糖浓度作为碳源。

氮源的优化：实验中，用氯化铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、尿素、硫酸铵5种无机氮源，经24小时摇床培养后，测定菌体湿重和RNA含量(附图5)。结果选择用硫酸铵作为无机氮源。又测定了不同硫酸铵浓度对菌体湿重和RNA含量的影响(附图6)，结果选择2.0％的浓度。而有机氮源对发酵的影响，则用酵母膏+玉米浆、酵母膏、玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨对酵母菌积累RNA的影响作了6组实验，(附图7)结果选择酵母膏作为有机氮源。

无机磷浓度的优化：在磷酸二氢钾浓度0.5％～4.0％之间设8个不同浓度来测定磷酸二氢钾浓度对菌体湿重和RNA含量的影响(附图8)，结果选择0.5％的磷酸二氢钾作为磷源。

金属离子浓度的优化：通过在发酵培养基中添加不同金属离子，浓度分别为0mmol/L，1.25mmol/L，2.5mmol/L，3.75mmol/L，5.0mmol/L.分别添加Mn²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺，结果(附图9)证明添加1.25mmol/L的Zn²⁺和Fe²⁺有助于酵母菌RNA含量的积累且菌体浓度保持稳定水平。

正交优化实验：选择葡萄糖(A)、酵母膏(B)、磷酸二氢钾(C)、硫酸铵(D)、玉米浆(E)五个因素，分别以不同浓度选择四个水平确定正交实验设计方案(见表1)。

将CPU-1从种子斜面培养基上转接入50ml种子液体培养基中，200rpm、30℃摇瓶培养16h。按表1中的设计，以5％接种量接种于100ml摇瓶发酵培养基，结果见表2。

因此，通过单因素实验研究了碳源、氮源、磷源种类和浓度对发酵产RNA的影响，并且用正交试验确定了最优培养基为：葡萄糖5％，酵母膏1.2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸铵1.0％，玉米浆0.9％，200rpm、30℃摇瓶培养16h，RNA含量达到12％左右，湿重达到50g/L。

表1正交实验设计方案

注：A——葡萄糖 B——酵母膏 C——酸铵 D——磷酸氢二钾 E——玉米浆

表2正交实验结果

实施例4

添加不同氨基酸对酵母菌体RNA积累的影响

通过在培养基中添加不同的氨基酸组分，进一步分析不同单一氨基酸组分(His、Glu、Ser、Met、Gly、mix of amino acids、peptone)对酵母湿重及RNA水平的影响。单一组分的添加量根据20g蛋白胨中含有的单一氨基酸含量进行添加。结果如附图10所示.

由附图10可见，除His外，单一组分的氨基酸对菌体内RNA积累有一定的促进作用，蛋白胨促进作用更明显，能使RNA含量增加90％左右，Glu(42％)，Ser(56％)，Met(45％)，Gly(18％)或者氨基酸混合物(85％)。

Claims

1.一种高产核糖核酸的热带假丝酵母菌菌株，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号是：CGMCC No.3558。

2.一种高产核糖核酸的方法，该方法包括：在种子培养基中发酵培养权利要求1的菌株，在培养后将菌液转接发酵培养基中发酵培养即得。

3.权利要求2的方法，其中种子培养基含：葡萄糖4％、(NH₄)₂SO₄ 1.5％、KH₂PO₄ 0.9％、K₂HPO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.3％、FeSO₄·7H₂O 0.003％、酵母膏0.3％、玉米浆0.3％和CaCO₃ 0.5％，为重量体积百分比。

4.权利要求2的方法，其中在种子培养基中的发酵培养条件为：摇瓶培养的温度为30℃，搅拌转数为200rpm，接种量为5％，种龄为16小时。

5.权利要求2的方法，其中发酵培养基含：葡萄糖5％、酵母膏1.2％、玉米浆0.9％、(NH4)₂SO₄1.0％、KH₂PO₄ 0.3％，为重量体积百分比。

6.权利要求2的方法，其中发酵培养条件为：200rpm，30℃，培养16小时。

7.权利要求2的方法，其中发酵培养基中还含有1.25mmol/L的Zn²⁺和1.25mmol/L的Fe²⁺。

8.权利要求2的方法，其中发酵培养基中还含有谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、甘氨酸中的一种或几种。