CN107058139A - 一株高产谷胱甘肽的酵母菌株 - Google Patents

一株高产谷胱甘肽的酵母菌株 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产谷胱甘肽的酵母菌株，属于微生物技术领域。本发明所提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12789。所述菌株能够耐受对葡萄糖的耐受能力达到300g/L，对L‑半胱氨酸的耐受能力也远高于出发菌株，利于其在高浓度葡萄糖条件下生产谷胱甘肽，5L发酵罐中发酵生产GSH终浓度达到3308mg/L。

Description

一株高产谷胱甘肽的酵母菌株
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株高产谷胱甘肽的酵母菌株。
背景技术：
谷胱甘肽(GSH)，是L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的生物活性三肽化合物，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中。其在生物体内有着多种重要的生理功能，特别是对维持生物体内适宜的氧化还原环境起着重要的作用，因而被广泛应用于临床、食品和化妆品行业中。
GSH的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法等。化学合成法是以三种前体氨基酸为原料进行化学合成，但因为所得活性产物不易分离致使产品纯度不高而限制其应用。酶法合成是利用三种底物氨基酸和生物体内的GSH合成有关的酶，通过添加少量ATP来合成GSH，该法操作复杂成本较高。发酵法可利用廉价的糖为原料，通过特定的微生物代谢合成GSH，操作简单，成本较低，且生产速度快，易于扩大规模。因此，发酵法生产GSH越来越受到人们的重视。
在微生物界，GSH产生菌主要集中在真核酵母和革兰氏阴性菌中。野生酿酒酵母和产朊假丝酵母本身具有相对较高的GSH含量，并且能够持续保持GSH的合成能力，因此他们成为工业生产GSH最常见的菌种。
申请号为201511003961.9的中国发明专利申请《一种高产谷胱甘肽的酿酒酵母及其用途》公开了一种高产谷胱甘肽的酿酒酵母及其用途。该酵母经发酵培养后谷胱甘肽的产量高，且发酵周期短。该发明采用流加补料的方式，分别流加碳氮源、维生素、前体氨基酸促进谷胱甘肽的合成，使酵母胞内谷胱甘肽的含量提升，有效解决了酵母合成谷胱甘肽能力低及干酵母中谷胱甘肽含量低的问题。
虽然野生酿酒酵母和产朊假丝酵母本身具有较高的GSH含量，但其产量仅适用于实验室研究，无法满足工业生产的需要。通过物理诱变或化学诱变，在特定的培养基上筛选GSH高产菌株是提高菌种产量、性能的主要手段。
一般情况下，微生物细胞中的GSH含量不高，仅为细胞干重的0.1-1％。过高含量的GSH容易破坏细胞内业已平衡的氧化还原环境，GSH是胞内产物，实际生产过程中需要提取，较低的含量无疑会大大提高生产成本。因此，如何提高细胞密度以及细胞内的GSH含量，成为发酵法生产GSH的关键问题。
申请号为200810105972.1的中国专利《一种酵母菌株、富含还原型谷胱甘肽的干酵母及其制备方法》提供了一株通过紫外诱变方法筛选出的还原型谷胱甘肽含量较高性能稳定的酵母菌株(CCTCC M 205130)。本发明的该菌株不进行谷胱甘肽的提取和纯化，直接和酵母细胞一起使用，得到富含还原型谷胱甘肽的干酵母。
此外，GSH的许多功能主要是由分子中的巯基来体现的，而该巯基在GSH的合成过程中是由L-半胱氨酸提供的，通常情况下细胞内自身合成的L-半胱氨酸量较少，这也成为了胞内GSH大量合成的限制性因素，因此通过外源添加L-半胱氨酸的方式对GSH合成速率的提高更为有效。
专利号为ZL03113418.1的中国发明专利《一种提高朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽产量的方法》提供了一种发酵生产谷胱甘肽的方法，该方法采用朊假丝酵母为发酵菌株，经过斜面培养和种子培养后，在发酵培养基中添加L-半胱氨酸，增加发酵液中的L-半胱氨酸的供应，以提高谷胱甘肽的合成速度和产量。
但是过量的L-半光氨酸将影响细胞的生长。现有技术中尚未出现克服此屏障的方法。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一株诱变获得的酿酒酵母菌株，该菌株具有较高的耐高渗能力，可以在高浓度葡萄糖条件下生长，提高细胞密度，同时能够在胞内大量积累GSH，提高发酵生产GSH的产量。
所述酿酒酵母菌株具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)tlj2016，该菌株已于保藏于2016年7月15日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12789，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
所述酿酒酵母tlj2016的最适生长pH为6.0-6.5,最适生长温度为28-35℃；
所述酿酒酵母tlj2016是从一株宁夏果园中分离得到的酿酒酵母出发菌株经以下步骤得到：
原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(DES)诱变→高渗平板筛选→亚硝基胍(NTG)诱变筛选→高渗平板初筛→摇瓶筛选→发酵复筛(产GSH能力)→传代稳定性试验。
经过诱变后获得的菌株tlj2016其葡萄糖耐受能力以及L-半胱氨酸耐受能力均得到提高，一方面在高浓度葡萄糖培养下能够提高细胞密度，另一方面L-半胱氨酸耐受能力的提高将有利于GSH在胞内大量合成，从而提高菌株大规模生产GSH的能力。
有益效果：
1、本发明所提供的酿酒酵母对葡萄糖的耐受能力达到300g/L，利于其在高浓度葡萄糖条件下生产GSH；
2、本发明所提供的酿酒酵母在5L发酵罐中发酵生产GSH终浓度达到3308mg/L；
3、本发明所提供的酿酒酵母耐受L-半胱氨酸的能力远高于出发菌株，在5mmol/LL-半胱氨酸作用下仍能缓慢生长，在40mmol/LL-半胱氨酸作用下仍能保持GSH大量合成；
4、本发明所提供的酿酒酵母耐盐能力达到18％，有利于扩展其应用领域。
具体实施方式：
实施例1 菌种诱变
1.DES诱变选育
1)在超净台上取试管斜面上的出发菌株1一环，接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养10h左右，使菌体处于对数生长前期。
2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
4)取32mL pH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1％(v/v)。
5)在30℃摇床中150rpm反应30min，取1mL混合液，加入0.5mL 25％Na2S2O3溶液中止反应。
6)稀释涂布于含150g/L KCl的麦芽汁培养基平皿中，在30℃培养2～3天后挑取菌落最大的菌株1。
2.亚硝基胍诱变
1)在超净台上取试管斜面上的酿酒酵母菌菌株1一环，接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养10h左右，使菌体处于对数生长前期。
2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
4)取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
5)在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
6)适当稀释涂，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于含200g/L KCl的麦芽汁培养基平皿中。在30℃培养2～3天后挑取菌落20支。
3.摇瓶初筛
1)在超净台上分别取上述20支酿酒酵母菌各一环，分别接入装有50mL麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
2)取5mL菌液，接入装有50mL高渗麦芽汁培养基(葡萄糖浓度为300g/L)中的250mL三角瓶中，200rpm，30℃培养3-4天，每天检测葡萄糖浓度和乙醇浓度变化。发酵结束后，比较20株菌种的葡萄糖和乙醇消耗速率、最终残糖浓度和乙醇浓度、葡萄糖对乙醇的转化率以及杂酸含量。
3)选择葡萄糖消耗速率快、最终残糖浓度低和乙醇浓度高的5株菌命名为Y-1，Y-2，Y-3，Y-4，Y-5。
4、发酵复筛
将步骤3中所得的5株菌Y-1，Y-2，Y-3，Y-4，Y-5以及出发菌株，分别按照10％接种量，在装有30mL液体培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h，取发酵液测定GSH浓度；
液体培养基(g/L)：(NH4)2SO4 6、葡萄糖35、K2HPO4·3H2O 3、KH2PO4 0.5、酵母粉11、MnSO4 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO4·7H2O 0.1；
GSH测定方法：发酵液离心洗涤后得新鲜酵母，30℃下，40％乙醇处理3h，离心取上清液做GSH测定样品；
采用四氧嘧啶法进行GSH测定：其原理为GSH上的-SH与四氧嘧啶反应，生成的物质在305nm处有吸收峰，且与谷胱甘肽浓度成线性关系，故可用紫外分光光度计进行定量测定GSH含量。
表1：GSH检测结果
菌株 出发菌株 Y-1 Y-2 Y-3 Y-4 Y-5
GSH浓度(mg/L) 127.9 195.7 172.3 263.2 216.5 185.2
由表1结果可知，菌株Y-3具有最高的GSH发酵能力，因此确定Y-3为最终的生产菌株，并将其命名为tlj2016。
5.遗传稳定性试验
将tlj2016菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
实施例2 高糖条件下tlj2016发酵产GSH能力实验
(1)摇瓶培养
取tlj2016斜面菌种一环，接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养30h得种子液；
摇瓶培养基(g/L)：(NH4)2SO4 6、葡萄糖35、K2HPO4·3H2O 3、KH2PO4 0.5、酵母粉11、MnSO4 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO4·7H2O 0.1，pH6.0；
(2)5L发酵罐培养
将种子液按10％接种量，接入装有3L发酵培养基的发酵罐中，30℃,通气量6L/min,罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至30h时，一次性添加终浓度为25mmol/L的L-半胱氨酸，总发酵时间为50h；
发酵培养基(g/L)：(NH4)2SO4 10、葡萄糖100、K2HPO4·3H2O 8、KH2PO40.5、酵母粉11、MnSO4 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO4·7H2O 0.1,pH6.0；
发酵结束后，测定发酵液中GSH的含量为3308mg/L.
实施例3 L-半胱氨酸耐受力实验
将出发菌株以及tlj2016斜面菌种各一环，分别接入装有30mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中150rpm,30℃培养进行培养，在培养至12h时，向摇瓶中加入不同终浓度的L-半胱氨酸，再培养10h，测定细胞干重，结果表2、3；
摇瓶培养基(g/L)：(NH4)2SO4 6、葡萄糖20、K2HPO4·3H2O 3、KH2PO4 0.5、酵母粉11、MnSO4 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO4·7H2O 0.1，pH6.0；
表2：出发菌株L-半胱氨酸耐受力
L-半胱氨酸浓度mmol/L 0 5 10 15 20 40
出发菌株干重g/L 22.6 15.7 10.2 4.3 2.2 0.8
GSH浓度(mg/L) 35.6 46.7 43.2 40.7 37.9 25.3
表3 tlj2016L-半胱氨酸耐受力
L-半胱氨酸浓度mmol/L 0 5 10 15 20 40
tlj2016干重g/L 25.7 28.5 23.6 21.2 20.6 18.7
GSH浓度(mg/L) 73.2 98.3 113.5 121.7 127.5 135.8
从表2的结果可以看出，对于出发菌株，培养基中添加L-半胱氨酸，细胞停止生长，并且开始自溶，导致GSH增长率随着L-半胱氨酸浓度的升高而降低；而低浓度L-半胱氨酸下，tlj2016仍能够缓慢生长，随着L-半胱氨酸浓度的提高，tlj2016菌株的细胞干重缓慢下降，而GSH浓度持续增长，这一结果将有利于GSH生产过程中通过添加前体氨基酸-L-半胱氨酸提促进GSH的生产。
实施例4 耐盐能力实验
取tlj2016菌液1mL接种菌种于含有不同NaCl浓度的(含量梯度为0％、2％、5％、10％、15％、18％)的10mL YPD液体培养基(pH＝6.5)，置于30℃下分别培养24h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于YPD固体平板中涂布，于30℃生化培养箱中倒置培养36小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表4，可知该菌的耐盐浓度为18％，说明tlj2016不仅可以在常规环境中生存，在高盐条件下依然具有活力，可应用于酱油、腌制品等高盐食品加工过程中耗糖产谷胱甘肽。
表4 耐盐能力检测(×107cfu/ml)
NaCl含量 0％ 2％ 5％ 10％ 15％ 18％
原始菌株 5.16±0.42 4.38±0.42 2.15±0.21 0.12±0.11 0 0
tlj2016 5.33±0.28 5.10±0.71 4.83±0.42 3.98±0.33 2.57±0.48 0.83±0.15

Claims (3)

1.一株酿酒酵母，其特征在于,所述酿酒酵母具体为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)tlj2016，保藏编号CGMCC No.12789。
2.一种使用权利要求1所述的酿酒酵母生产谷胱甘肽的方法，其特征在于，菌株经过种子培养后，将种子液按10％接种量，接入发酵培养基中，30℃,通气量6L/min，罐压0.03MPa，500rpm,恒pH6.0条件下进行发酵培养，发酵至30h时，一次性添加终浓度为25mmol/L的L-半胱氨酸，总发酵时间为50h；
发酵培养基按g/L计：(NH4)2SO4 10、葡萄糖100、K2HPO4·3H2O 8、KH2PO4 0.5、酵母粉11、MnSO4 0.1、KCL 0.1、FeSO4 0.1、MgSO4·7H2O 0.1,pH6.0。
3.权利要求1所述酿酒酵母在谷胱甘肽生产中的应用。
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