CN109439701A

CN109439701A - 生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基

Info

Publication number: CN109439701A
Application number: CN201811605003.2A
Authority: CN
Inventors: 魏玉洁; 陆震; 贾玉倩; 孙元军; 陈雯雯; 石艳丽; 栾贻宏; 郭学平
Original assignee: BLOOMAGE FREDA BIOPHARM CO LTD; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109439701B; WO2020134687A1

Abstract

本发明涉及麦角硫因的生物合成制备方法和发酵培养基，该方法包括如下步骤：步骤1：将猴头菌(Hericium erinaceus)菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中培养，获得种子液；步骤2：将获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质培养，通过pH判断发酵至发酵终点，获得发酵液；步骤3：发酵结束后，加入酶，酶解至终点，升温灭酶，将菌丝体的细胞内的麦角硫因浸提至细胞外的发酵液中。利用本发明的方法，能够提高麦角硫因的产量，可快速简便地判断发酵终点，减少发酵副产物的产生，使用酶破碎菌丝体细胞，麦角硫因浸提完全。

Description

生物合成制备麦角硫因的方法和发酵培养基

技术领域

本发明涉及利用猴头菌菌丝体生物合成麦角硫因的方法和用于其的发酵培养基，属于微生物发酵工程领域。

背景技术

麦角硫因(ergothioneine，EGT)，学名为2-巯基-L-组氨酸三甲基内盐，其分子结构中含有以下通式(1)所示咪唑-2-硫酮基团。麦角硫因是存在于很多动植物体内，含量丰富的一种天然氨基酸，不能由动物机体自身合成，只能从食物中摄取，属于稀有氨基酸。

有研究表明，麦角硫因具有强抗氧化特效，还可以保护细胞免受紫外线和γ射线所导致的细胞损伤甚至死亡，因此在医药、食品和化妆品等行业具有广泛的应用前景。但是麦角硫因在绝大多数生物体中的含量均极少，且动物不能自身合成麦角硫因，只能通过食物获得。而进一步研究表明，许多微生物如真菌和放线菌都能够合成麦角硫因，因此利用生物发酵技术合成麦角硫因越来越受到人们的重视。

目前，关于麦角硫因的研究越来越多，如专利文献1公布了“生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法”，其特征在于利用糙皮侧耳CGMCC No.6232发酵合成麦角硫因，并通过搅拌、加热方式将麦角硫因从菌丝体细胞内浸提到水溶液中，但是这种浸提方式可能会造成菌丝体细胞破裂不充分，麦角硫因没有完全释放到胞外。

非专利文献1中提到，利用液态深层培养方式进行杏鲍菇菌丝体培养生产麦角硫因，并对发酵最适温度、接种量、起始pH值、碳源、氮源、氨基酸等进行探讨优化，最终发酵产量可到62.20mg/L。而辅酶在生物催化反应中必不可少，在发酵培养基中添加适量辅酶，有时会利于目的产物的产生，如果非专利文献1中在杏鲍菇菌丝体发酵时能添加合适的辅酶，可能会大大提高麦角硫因的产率。

非专利文献2中提到，利用香菇菌丝体液态深层发酵生产麦角硫因，产率可达3.45mg/g DW，折算成发酵液中麦角硫因含量为23.6mg/L。

专利文献2公布了“麦角硫因的生物合成制备方法”，其特征在于利用大型真菌的菌丝体在装有培养基的三角瓶中液态发酵，再将发酵液经过加热、搅拌，使菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，得到花脸香蘑的麦角硫因最高产量为51mg/L，肺形侧耳的最高产量为48mg/L，野生紫孢侧耳的最高产量为37mg/L。

综上所述，目前生物合成制备麦角硫因主要存在以下问题：

1、发酵产率较低，生产成本较高，无法大规模生产利用；

2、判断发酵终点的方法不明确。如果采用定期取样，处理后进行液相检测麦角硫因含量是否继续增高的方法判断，过程复杂，且终点判断不够及时。若为使麦角硫因充分合成而一味延长发酵时间，务必会增加其他发酵副产物，为后期纯化处理带来困难；

3、麦角硫因从菌丝体细胞内浸提到细胞外的方式多采用搅拌、加热的方式，细胞破碎可能不完全，麦角硫因不能完全浸出，造成浪费，且搅拌、加热能耗较高，从而增加了生产成本。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:CN103734022A

专利文献2:CN103184246A

非专利文献

非专利文献1:黄龄谊，高麦角硫因含量之杏鲍菇菌丝体深层培养及其生理活性[D].台湾：中兴大学，2010.

非专利文献2:Pramvadee Tepwong et al.Mycobial enhancement ofergothioneine by submerged cultivation of edible mushroom mycelia and itsapplication as an antioxidative compound compound[J].Food Chemistry，2012，131：247～258

发明内容

本发明人为了解决上述问题，本发明提供了一种麦角硫因的生物合成制备方法及其发酵培养基，通过利用猴头菌CCTCC No：M 2018567菌丝体液体深层发酵而制备麦角硫因。

具体来说，本发明涉及以下内容。

1、一种麦角硫因的生物合成制备方法，所述方法包括如下步骤：

将猴头菌(Hericium erinaceus)菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中培养，获得种子液；

将获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质培养，通过pH判断发酵至发酵终点，获得发酵液；以及

发酵结束后，加入酶，酶解至终点，升温灭酶，将菌丝体的细胞内的麦角硫因浸提至细胞外的发酵液中。

2、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述猴头菌为猴头菌 (Hericiumerinaceus)CCTCC No：M 2018567。

3、根据项1所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃、100～300rpm 振荡条件下，培养5～10天，获得种子液。

4、根据项1所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃、100～300rpm 振荡条件下，培养7～15天，获得发酵液。

5、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下组分：1～10％(w/v)蔗糖、1～5％(w/v)的豆饼粉、0.01～1％(w/v)的磷酸二氢钠，0.01～1％(w/v)的硫酸钠，pH 4.0～6.0。

6、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：2～6％(w/v)碳源、1～3％(w/v)的有机氮源、0.01～1％(w/v)的无机盐、0.0001～0.001％(w/v)的微量元素，0.0001～0.001％(w/v)的辅酶，pH 4.0～6.0。

7、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述前体物质包括以下一种或多种的组合：半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甜菜碱。

8、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，发酵终点时发酵液pH≥6.0，残糖为0。

9、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶包括以下一种或多种的组合：崩溃酶、蜗牛酶、透明质酸酶、溶壁酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶，进一步优选为蜗牛酶和崩溃酶。

10、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的碳源包括以下的一种或多种的组合：可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、玉米粉、半乳糖、麦芽糊精。

11、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的氮源包括以下的一种或多种的组合：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、黄豆粉、小麦蛋白胨、豆饼粉、豆粕、麸皮、酪蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、大豆肽粉、尿素。

12、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的无机盐包括以下的一种或多种的组合：氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。

13、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的微量元素包括以下的一种或多种的组合：硫酸锰、氯化亚铁、氯化锌、氯化锰、硫酸亚铁。

14、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的辅酶包括以下的一种或多种的组合：生物素、烟酸、磷酸吡哆醛、维生素B₆、维生素B₁₂、核黄素、维生素B₁。

15、根据项6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的组成为：2～6％(w/v) 葡萄糖、1～3％(w/v)的牛肉膏、0.01～0.05％(w/v)的磷酸二氢钠、 0.01～0.05％(w/v)硫酸钠、0.0001～0.001％(w/v)的氯化锌，0.0001～0.001％(w/v) 的烟酸，其余为水。

16、根据项1～15中任一项所述的制备方法，还包括将酶解后的发酵液离心，取上清液过滤，得到麦角硫因提取液的步骤。

17、根据项1～16中任一项所述的制备方法，其中，麦角硫因的产量为 240mg/L以上。

18、一种判断麦角硫因发酵终点的方法，将发酵液pH≥6.0且残糖为0 时作为发酵终点。

19、一种发酵培养基，其组成为2～6％(w/v)葡萄糖、1～3％(w/v)的牛肉膏、0.01～0.05％(w/v)的磷酸二氢钠、0.01～0.05％(w/v)硫酸钠、 0.0001～0.001％(w/v)的氯化锌，0.0001～0.001％(w/v)的烟酸，其余为水。

20、根据项19所述的发酵培养基，其组成为4％(w/v)的葡萄糖、1.5％(w/v) 的牛肉膏、0.05％(w/v)的磷酸二氢钠，0.02％(w/v)硫酸钠、0.0002％(w/v)的氯化锌，0.0006％(w/v)的烟酸，其余为水。

21.一种组合物，其包括猴头菌(Hericium erinaceus)和发酵液，所述发酵液包含麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度为240mg/L以上。

其中，用于生产发酵液的发酵培养基包括以下组分：2～6％(w/v)碳源、 1～3％(w/v)的有机氮源、0.01～1％(w/v)的无机盐、0.0001～0.001％(w/v)的微量元素，0.0001～0.001％(w/v)的辅酶，pH 4.0～6.0。

具体地，本发明提供一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将猴头菌(Hericium erinaceus)菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中培养，获得种子液；

步骤2：将获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质培养，通过pH判断发酵至发酵终点，获得发酵液；

步骤3：发酵结束后，加入酶，酶解至终点，升温灭酶，将菌丝体的细胞内的麦角硫因浸提至细胞外的发酵液中。

上述猴头菌优选为猴头菌(Hericium erinaceus)CCTCC No：M 2018567。

在步骤1中，具体地，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养5～10 天，获得种子液；

猴头菌可以获自PDA斜面菌种；

上述种子培养基可以包括以下组分：1～10％(w/v)蔗糖、1～5％(w/v)的豆饼粉、0.01～1％(w/v)的磷酸二氢钠，0.01～1％(w/v)的硫酸钠，pH 4.0～6.0；

种子培养温度为15～30℃，优选20℃；转速为100～300rpm，优选150rpm；培养时间为5～10天，优选7天。

在步骤2中，具体地，步骤2中，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养7～15天，获得发酵液；

种子液接种至发酵培养基中的接种量可以为1～10％(v/v)，优选5％(v/v)；

上述前体物质包括以下一种或多种的组合：半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甜菜碱；

发酵液中前体物质添加量分别为1～20mM，优选5mM；添加时间为发酵1～5天，优选3天；

发酵的温度为15～30℃，优选23℃；转速为100～300rpm，优选180rpm；培养时间为7～15天；

将发酵液pH≥6.0且残糖为0作为发酵终点。上述pH值测定，可使用 pH计直接检测。上述残糖含量、具体地为残余葡萄糖含量测定可采用常用的化学法所如DNS法、斐林试剂法、间接碘量法或者旋光法等，或使用 SBA-40D型生物传感分析仪进行检测；

上述发酵培养基可以包括以下组分：2～6％(w/v)碳源、1～3％(w/v)的有机氮源、0.01～1％(w/v)的无机盐、0.0001～0.001％(w/v)的微量元素， 0.0001～0.001％(w/v)的辅酶，pH 4.0～6.0；

进一步，上述碳源可以包括以下的一种或多种的组合：可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、玉米粉、半乳糖、麦芽糊精，优选为葡萄糖、麦芽糖和/或蔗糖，最优选为葡萄糖；

上述氮源可以包括以下的一种或多种的组合：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、黄豆粉、小麦蛋白胨、豆饼粉、豆粕、麸皮、酪蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、大豆肽粉、尿素，优选为牛肉膏和/或胰蛋白胨，最优选为牛肉膏；

上述无机盐可以包括以下的一种或多种的组合：氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾；

上述微量元素可以包括以下的一种或多种的组合：硫酸锰、氯化亚铁、氯化锌、氯化锰、硫酸亚铁；

上述辅酶可以包括以下的一种或多种的组合：生物素、烟酸、磷酸吡哆醛、维生素B₆、维生素B₁₂、核黄素、维生素B₁，优选为烟酸，特别是浓度为0.0006％(w/v)的烟酸；

在一个具体的实施方式中，上述发酵培养基的组成为：2～6％(w/v)葡萄糖、1～3％(w/v)的牛肉膏、0.01～0.05％(w/v)的磷酸二氢钠、0.01～0.05％(w/v) 硫酸钠、0.0001～0.001％(w/v)的氯化锌，0.0001～0.001％(w/v)的烟酸，其余为水。

在步骤3中，具体地，上述酶可以包括以下一种或多种的组合：崩溃酶、蜗牛酶、透明质酸酶、溶壁酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶，优选蜗牛酶和崩溃酶，酶活优选为5000～10000U/g，酶的添加量为发酵液的 0.001～0.01％(w/v)；

酶解的pH为4.5～7.5，优选6.5；酶解温度为30～60℃，优选40℃；酶解时间为2h～4h，将麦角硫因含量不再增加作为酶解的终点；

升温将酶灭活(灭酶)的过程为升温至90～100℃，保持10～20min。

本发明的麦角硫因的生物合成制备方法还包括将酶解后的发酵液离心，取上清液过滤，得到麦角硫因提取液的步骤。

根据麦角硫因的生物合成制备方法，麦角硫因的产量可达到240mg/L 以上。

本发明提供一种判断麦角硫因发酵终点的方法，其中，将发酵液pH≥ 6.0且残糖为0时作为发酵终点。

另外，本发明还提供一种发酵培养基，其组成为2～6％(w/v)葡萄糖、 1～3％(w/v)的牛肉膏、0.01～0.05％(w/v)的磷酸二氢钠、0.01～0.05％(w/v)硫酸钠、0.0001～0.001％(w/v)的氯化锌，0.0001～0.001％(w/v)的烟酸，其余为水

在一个具体的实施方式中，发酵培养基的组成为4％(w/v)的葡萄糖、 1.5％(w/v)的牛肉膏、0.05％(w/v)的磷酸二氢钠，0.02％(w/v)硫酸钠、 0.0002％(w/v)的氯化锌，0.0006％(w/v)的烟酸，其余为水。

发明具有以下优点：

本发明通过对发酵培养基中的碳源、氮源、辅酶等因素进行优化，可显著提高麦角硫因的产量，在优化的条件下，麦角硫因的产量达到240mg/L 以上，最高可达412.6mg/L。

本发明通过对发酵液pH值的测定，可快速简便地判断发酵终点，及时结束发酵，减少发酵副产物的产生。

本发明使用酶破碎菌丝体细胞，可充分将细胞破碎，使麦角硫因更加完全地浸提到发酵液中，且条件温和，高温时间较短，节约能耗，减少发酵液中其他活性成分的损失。

附图说明

图1为不同发酵碳源的麦角硫因产量的示意图；

图2为不同葡萄糖浓度的麦角硫因产量的示意图；

图3为不同发酵氮源的麦角硫因产量的示意图；

图4为不同牛肉膏浓度的麦角硫因产量的示意图；

图5为不同发酵辅酶的麦角硫因产量的示意图；

图6为不同烟酸浓度的麦角硫因产量的示意图；

图7为不同发酵初始pH的麦角硫因产量的示意图；

图8为发酵液中pH、残余葡萄糖含量及麦角硫因含量变化的示意图；

图9为麦角硫因含量测定的HPLC图谱，其中(a)为标准品(麦角硫因含量浓度为9.4μg/mL)的HPLC图谱，(b)为烟酸含量0.0004％(w/v)的发酵液的 HPLC图谱，(c)为烟酸含量0.0005％(w/v)的发酵液的HPLC图谱，(d)为烟酸含量0.0006％(w/v)的发酵液的HPLC图谱。

发明的具体实施方式

以下将对本发明做以详细说明。

本发明提供的麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：

本发明通过pH判断发酵至发酵终点，可快速简便地判断发酵终点，及时结束发酵，减少发酵副产物的产生。

本发明使用酶破碎菌丝体细胞，可充分将细胞破碎，使麦角硫因完全浸提到发酵液中，且条件温和，高温时间较短，节约能耗，减少发酵液中其他活性成分的损失。

步骤1

步骤1：将猴头菌(Hericium erinaceus)菌丝体斜面菌种接种至液体种子培养基中培养，获得种子液。

其中，猴菇菌为真菌类担子菌纲多孔菌目齿菌科猴头菌Hericium erinaceus(Rull ex F.)Pers.，是一种腐生菌，也是一种著名的食用菌。全形似刺猬或猴头，故俗称猴头菇或猴菇。其中，猴头菌优选为猴头菌(Hericium erinaceus)HT-3 CCTCC No：M2018567，已于2018年8月23日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，该菌株是本申请人发现的新的猴头菌种，而且发现其可用于麦角硫因的生物合成。

单一丝网状细胞称为菌丝,包括营养菌丝和气生菌丝，菌丝集合在一起构成一定的宏观结构称为菌丝体。

关于斜面菌种，将培养基装在试管内，经过高温灭菌以后，将培养基摆成斜坡式培养基，而接种在该斜面培养基上的菌种就叫做斜面菌种。

在一个具体的实施方式中，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养 5～10天，获得种子液。

在一个具体的实施方式中，猴头菌获自PDA斜面菌种，其中，PDA培养基(PotatoDextrose Agar Medium)是马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称。

在一个具体的实施方式中，上述种子培养基包括以下组分：1～10％(w/v) 蔗糖、1～5％(w/v)的豆饼粉、0.01～1％(w/v)的磷酸二氢钠，0.01～1％(w/v)的硫酸钠，pH 4.0～6.0。种子培养温度为15～30℃，优选20℃；转速为100～300rpm，优选150rpm；培养时间为5～10天，优选7天。通过在上述条件下培养猴头菌，更适合菌种的生长，能够获得活性好的菌种。

步骤2

步骤2：将获得的种子液接种至发酵培养基中发酵并添加前体物质培养，通过pH判断发酵至发酵终点，获得发酵液。

发酵指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。

在一个具体的实施方式中，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养 7～15天，获得发酵液。

在一个具体的实施方式中，种子液接种至发酵培养基中的接种量没有特别限制，可以为1～10％(v/v)，优选5％(v/v)。

上述前体物质可以包括以下一种或多种的组合：半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甜菜碱。发酵液中前体物质添加量分别为 1～20mM，优选5mM；添加时间为在发酵1～5天时添加，优选发酵3天时添加。通过添加前体物质，能够对猴头菌提供更好的营养，利于其生长、代谢。

关于发酵的具体条件，发酵的温度可以5～30℃，优选23℃；转速为 100～300rpm，优选180rpm；培养时间为7～15天，该条件下更适合猴头菌产生代谢产物。

关于发酵至终点的判断方法，将发酵液pH≥6.0且残糖为0作为发酵的终点。上述pH值测定，可使用pH计直接检测。上述残糖含量、具体地为残余葡萄糖含量测定可采用常用的化学法所如DNS法、斐林试剂法、间接碘量法或者旋光法等，或使用SBA-40D型生物传感分析仪进行检测。本发明通过对发酵液pH值的测定，可快速简便地判断发酵终点，及时结束发酵，减少发酵副产物的产生。

在一个具体的实施方式中，上述发酵培养基包括以下组分：2～6％(w/v) 碳源、1～3％(w/v)的有机氮源、0.01～1％(w/v)的无机盐、0.0001～0.001％(w/v) 的微量元素，0.0001～0.001％(w/v)的辅酶，pH 4.0～6.0。

进一步，上述碳源没有特别限定，可以包括以下的一种或多种的组合：可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、玉米粉、半乳糖、麦芽糊精，优选为葡萄糖、麦芽糖和/或蔗糖，最优选为葡萄糖。

上述氮源没有特别限定，可以包括以下的一种或多种的组合：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、黄豆粉、小麦蛋白胨、豆饼粉、豆粕、麸皮、酪蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、大豆肽粉、尿素，优选为牛肉膏和/ 或胰蛋白胨，最优选为牛肉膏。

上述无机盐没有特别限定，可以包括以下的一种或多种的组合：氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。

上述微量元素没有特别限定，可以包括以下的一种或多种的组合：硫酸锰、氯化亚铁、氯化锌、氯化锰、硫酸亚铁。

上述辅酶没有特别限定，可以包括以下的一种或多种的组合：生物素、烟酸、磷酸吡哆醛、维生素B₆、维生素B₁₂、核黄素、维生素B₁，优选为烟酸，特别是浓度为0.0006％(w/v)的烟酸。

步骤3

酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。酶解也就是通过酶的催化作用让物质自体分解。

上述酶只要能够充分将细胞破碎，就没有特别限定，可以包括以下一种或多种的组合：崩溃酶、蜗牛酶、透明质酸酶、溶壁酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶，优选蜗牛酶和崩溃酶，酶活优选为5000～10000U/g，酶的添加量为发酵液的0.001～0.01％(w/v)。

关于酶解的具体条件，只要能够充分将细胞破碎且不破坏麦角硫因的条件，就没有特别限定，具体地，酶解的pH为4.5～7.5，优选6.5；酶解温度为30～60℃，优选40℃；酶解时间为2～4h，另外，将麦角硫因含量不再增加作为酶解的终点。

灭酶就是将酶灭活，灭酶的条件只要使酶失活就没有特别限定，具体地灭酶的过程可以为升温至90～100℃，保持10～20min。

另外，本发明的麦角硫因的生物合成制备方法还包括将酶解后的发酵液离心，取上清液过滤，得到麦角硫因提取液的步骤。由此能够获得纯度更高的麦角硫因。

此外，本发明还提供一种发酵培养基，其组成为2～6％(w/v)葡萄糖、 1～3％(w/v)的牛肉膏、0.01～0.05％(w/v)的磷酸二氢钠、0.01～0.05％(w/v)硫酸钠、0.0001～0.001％(w/v)的氯化锌，0.0001～0.001％(w/v)的烟酸，其余为水。

在一个具体的实施方式中，发酵培养基的组成为4％(w/v)的葡萄糖、 1.5％(w/v)的牛肉膏、0.05％(w/v)的磷酸二氢钠，0.02％(w/v)硫酸钠、0.0002％(w/v)的氯化锌，0.0006％(w/v)的烟酸，其余为水。在该条件下，麦角硫因产量最高，可达412.6mg/L。

本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其他的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。

实施例

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

分别称取5000～10000U/g的蜗牛酶、崩溃酶配制成酶液，酶活均为5000 U/mL，供实施例中使用，蜗牛酶、崩溃酶均为市购。

实施例1：猴头菌CCTCC NO：M 2018567的麦角硫因发酵

液体种子培养基：4％(w/v)的蔗糖、1.5％(w/v)的豆饼粉、0.2％(w/v)的磷酸二氢钠，0.1％(w/v)的硫酸钠，其余为水，pH 4.0～4.5，于121℃灭菌20min。

发酵培养基：3％(w/v)的麦芽糖、2％(w/v)的玉米浆、0.05％(w/v)的磷酸二氢钠，其余为水，pH 4.0～4.5，于121℃灭菌20min。

向每瓶液体种子培养基中接种从菌种斜面上挑取的约1×1cm大小的猴头菌CCTCCNo：M 2018567菌苔，在20℃摇床150rpm培养7天，得到种子液。将种子液按体积比5％的接种量接入发酵培养基，23℃摇床180rpm培养，发酵3天时补充前体物质半胱氨酸、甜菜碱、甲硫氨酸各5mM，发酵结束后即得到猴头菌CCTCC No：M 2018567菌丝体发酵液，麦角硫因在菌丝体的细胞内积累。

实施例2：利用蜗牛酶和崩溃酶的麦角硫因的浸提

发酵结束后，将发酵液pH调至6.5±0.1，升温至40±2℃，加入0.005％(w/v) 的蜗牛酶和0.005％(w/v)的崩溃酶，40±2℃保温2.5h，酶解结束后将发酵液温度升至90℃，保持20min，将酶灭活。将酶解后的发酵液经过离心、取上清液，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm滤芯过滤除菌即可得到麦角硫因的提取液。

实施例3：不同发酵碳源对麦角硫因产量的影响

将上述发酵培养基的碳源分别替换为：可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、玉米粉、半乳糖、麦芽糊精，按照实施例1的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因(EGT) 的含量，结果见表1和图1。葡萄糖做碳源时，发酵液中麦角硫因的含量为151.7mg/L，产量提高幅度较大，可作为猴头菌菌丝体液体发酵生产麦角硫因的优选碳源，其次为麦芽糖(麦角硫因含量为135.7mg/L)和蔗糖(麦角硫因含量为132.4mg/L)。

表1

碳源	发酵液中麦角硫因的含量(mg/L)
		可溶性淀粉	83.7
甘油	100.2
		葡萄糖	151.7
蔗糖	132.4
		果糖	77.2
麦芽糖	135.7
		乳糖	52.7
甘露醇	57.3
		麦芽糖醇	61.3
玉米粉	22.1
		半乳糖	67.9
麦芽糊精	86.6

实施例4：不同葡萄糖浓度对麦角硫因产量的影响

将发酵培养基中的葡萄糖分别添加0％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、 3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)，按照实施例1 的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表 2和图2。葡萄糖浓度为0时，无麦角硫因产生，随着添加量的提高，麦角硫因产量逐渐增多，在添加量为4％(w/v)时，产量达到最高，再继续提高葡萄糖添加量，产量不再增加，且有缓慢下降趋势。

表2

实施例5：不同发酵氮源对麦角硫因产量的影响

将上述发酵培养基的氮源分别替换为：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、黄豆粉、小麦蛋白胨、豆饼粉、豆粕、麸皮、酪蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、大豆肽粉、尿素，按照实施例1的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表3和图3。牛肉膏做氮源时，发酵液中麦角硫因的含量为191.3mg/L，产量最高，可作为猴头菌菌丝体液体发酵生产麦角硫因的优选氮源，其次为胰蛋白胨(麦角硫因含量为177.5 mg/L)。

表3

实施例6：不同牛肉膏浓度对麦角硫因产量的影响

将发酵培养基中的牛肉膏分别添加0％(w/v)、0.5％(w/v)、1％(w/v)、 1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)、4％(w/v)，葡萄糖添加量为4％(w/v)，按照实施例1的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表4和图4。牛肉膏浓度为0时，几乎无麦角硫因产生，随着添加量的提高，麦角硫因产量逐渐增多，在添加量为1.5％(w/v) 时，产量达到最高，继续提高牛肉膏添加量，产量有缓慢下降趋势。

表4

牛肉膏添加量％(w/v)	发酵液中麦角硫因的含量(mg/L)
		0	0.3
0.5	100.4
		1	153.9
1.5	201.4
		2	194.5
2.5	193.7
		3	191.5
3.5	183.4
		4	172.5

实施例7：不同辅酶对麦角硫因产量的影响

发酵培养基：4％(w/v)的葡萄糖、1.5％(w/v)的牛肉膏、0.05％(w/v)的磷酸二氢钠，0.02％(w/v)硫酸钠、0.0002％(w/v)的氯化锌，其余为水，pH 4.0～6.0，于121℃灭菌20min。

在上述发酵培养基中分别添加0.0003％(w/v)的生物素、烟酸、磷酸吡哆醛、维生素B₆、维生素B₁₂、核黄素、维生素B₁，按照实施例1的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表5和图5。加入辅酶后，麦角硫因产量都有所提高，其中加入烟酸的产量最高，发酵液中麦角硫因的含量达到303.2mg/L。

表5

辅酶	发酵液中麦角硫因的含量(mg/L)
		生物素	234.1
烟酸	303.2
		磷酸吡哆醛	245.3
维生素B<sub>6</sub>	222.6
		维生素B<sub>12</sub>	217.9
核黄素	251.7
		维生素B<sub>1</sub>	268.9

实施例8：不同烟酸添加量对麦角硫因产量的影响

在上述发酵培养基中分别添加0.0001～0.001％(w/v)的烟酸，按照实施例 1的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表6和图6。烟酸添加量为0.0006％(w/v)时，麦角硫因产量最高，可达 412.6mg/L。

表6

实施例9

将培养基中组成分别按照2～6％(w/v)葡萄糖、1～3％(w/v)的牛肉膏、 0.01～0.05％(w/v)的磷酸二氢钠、0.01～0.05％(w/v)硫酸钠、0.0001～0.001％(w/v) 的氯化锌，0.0001～0.001％(w/v)的烟酸制备发酵培养基，按照实施例1的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因(EGT)的含量，结果见表7。从结果可以看出，最佳发酵培养基其组成为4％(w/v)的葡萄糖、1.5％(w/v) 的牛肉膏、0.05％(w/v)的磷酸二氢钠，0.02％(w/v)硫酸钠、0.0002％(w/v)的氯化锌，0.0006％(w/v)的烟酸，其余为水。

表7最优发酵培养基组成与麦角硫因产量

对比例1

中国专利CN105296559A中，以糙皮侧耳CGMCC No：6232菌丝体进行发酵，挑取PDA斜面菌种CGMCC No：6232的菌苔接入种子培养基，25℃ 150rpm摇床培养4天，得到种子液。将种子液按体积比5％的接种量接入发酵培养基，25℃摇床150rpm培养15天，得到菌丝体发酵液。将菌丝体发酵液置于90℃水浴，200rpm搅拌条件下浸提15min，过滤，收集滤液，使用截留分子量为4kDa的超滤膜过滤，得到的透过液即为发酵液中麦角硫因含量检测的待测样，最高产量达到315.7mg/L。

种子培养基：玉米粉30g/L，豆粕粉15g/L，α-淀粉酶80U/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min。

发酵培养基：酪蛋白胨60g/L，甘油75g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁 1.5g/L，蛋氨酸14mmol/L，半胱氨酸7.5mmol/L，其余为水，于121℃灭菌 20min。

实施例10：不同pH对麦角硫因产量的影响

发酵培养基：4％(w/v)的葡萄糖、1.5％(w/v)的牛肉膏、0.05％(w/v)的磷酸二氢钠，0.02％(w/v)硫酸钠、0.0002％(w/v)的氯化锌，0.0006％(w/v)的烟酰胺，其余为水，分别调发酵初始pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、 7.0，于121℃灭菌20min。

发酵结束后测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表8和图7。发酵初始pH在4.0～4.5时，产量最高，初始pH在6.0以上时，菌体量少且生长速度较慢，产量急剧下降。

表8

发酵初始pH	发酵液中麦角硫因的含量(mg/L)
		3.5	364.5
4.0	411.1
		4.5	409.9
5.0	385.4
		5.5	367.8
6.0	197.4
		6.5	100.4
7.0	23.9

实施例11：发酵终点判定

发酵培养基：4％(w/v)的葡萄糖、1.5％(w/v)的牛肉膏、0.05％(w/v)的磷酸二氢钠，0.02％(w/v)硫酸钠、0.0002％(w/v)的氯化锌，0.0006％(w/v)的烟酸，其余为水，pH4.0～4.5，于121℃灭菌20min。

按照实施例1的方法进行发酵培养，发酵4天即补充前体氨基酸后第二天开始定期取样，测发酵液pH、残糖及麦角硫因含量的变化，结果见图8。发酵液pH比较稳定时，耗糖速度较快，菌丝体大量合成麦角硫因。随着培养基中葡萄糖将要耗尽，麦角硫因合成减缓，同时pH逐渐上升，可能细胞在无糖条件下产生其他物质。在发酵液pH≥6.0，残糖为0时，麦角硫因达到最大产量，继续培养，产量不再增多。结合实施例4和实施例10中的结果，葡萄糖含量为0时，无麦角硫因产生，pH≥6.0时，菌体生长状态较差，因此，将发酵终点定为发酵液pH≥6.0，残糖为0。

实施例12：发酵液中葡萄糖含量的检测

打开SBA-40D型生物传感分析仪预热半小时后，使用100mg/dL的葡萄糖标准品进行定标，定标通过后，取发酵液，稀释至一定倍数(测量范围为 0～100mg/dL)，经过0.22μm针式滤器过滤后，取滤液使用SBA-40D型生物传感分析仪进行检测，进样量为25μL。

实施例13：麦角硫因含量的检测

以实施例9中的烟酸含量分别为0.0004％(w/v)、0.0005％(w/v)、 0.0006％(w/v)的发酵液稀释10倍后为试验样品，采用高效液相色谱法进行麦角硫因含量测定，HPLC条件：色谱柱：Hypersil ODS C18柱(250mm×4.6 mm，粒径5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-水(3∶97)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL。色谱图如图9所示，其中a)为标准品(麦角硫因含量浓度为9.4μg/mL)，b)为烟酸含量0.0004％(w/v)的发酵液，c)为烟酸含量0.0005％(w/v)的发酵液，d)为烟酸含量0.0006％(w/v)的发酵液。

Claims

1.一种麦角硫因的生物合成制备方法，所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述猴头菌为猴头菌(Hericiumerinaceus)CCTCC No：M 2018567。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养5～10天，获得种子液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃、100～300rpm振荡条件下，培养7～15天，获得发酵液。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下组分：1～10％(w/v)蔗糖、1～5％(w/v)的豆饼粉、0.01～1％(w/v)的磷酸二氢钠，0.01～1％(w/v)的硫酸钠，pH 4.0～6.0。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：2～6％(w/v)碳源、1～3％(w/v)的有机氮源、0.01～1％(w/v)的无机盐、0.0001～0.001％(w/v)的微量元素，0.0001～0.001％(w/v)的辅酶，pH 4.0～6.0。

7.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述前体物质包括以下一种或多种的组合：半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甜菜碱。

8.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，发酵终点时发酵液pH≥6.0，残糖为0。

9.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶包括以下一种或多种的组合：崩溃酶、蜗牛酶、透明质酸酶、溶壁酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶，进一步优选为蜗牛酶和崩溃酶。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述发酵培养基的碳源包括以下的一种或多种的组合：可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、玉米粉、半乳糖、麦芽糊精。