CN105602856A - 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 - Google Patents
黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105602856A CN105602856A CN201510945197.0A CN201510945197A CN105602856A CN 105602856 A CN105602856 A CN 105602856A CN 201510945197 A CN201510945197 A CN 201510945197A CN 105602856 A CN105602856 A CN 105602856A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lovastatin
- fermentation
- bacterial strain
- strain
- aspergillus niger
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 62
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 title claims abstract description 62
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 title claims abstract description 62
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 58
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 9
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 8
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Inorganic materials [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 5
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 3
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims description 3
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 abstract 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 abstract 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 abstract 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 abstract 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000009599 head growth Effects 0.000 description 1
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- -1 pectase Proteins 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/66—Aspergillus
- C12R2001/685—Aspergillus niger
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的黑曲霉（<i>Aspergillus？niger</i>）An-19菌株、用途和发酵生产方法。黑曲霉（<i>Aspergillus？niger</i>）An-19菌株，保藏编号为：CCTCC？M？2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年11月11日。本发明所涉及的An-19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18S？rDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉（<i>Aspergillus？niger</i>）。经培养基配方和培养条件优化后，5？L发酵罐发酵116？h，Lovastatin产量可达267.02？mg/L。
Description
技术领域
本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株、用途和发酵生产方法。
背景技术
黑曲霉（Aspergillusniger）是在自然界广泛存在的一种丝状真菌，属半知菌门、丝孢纲（Hyphomycetes）、丛梗孢目（Moniliales）、丛梗孢科（Moniliaceae）。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，生长适宜pH为3~7。是重要的工业发酵菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。也是美国食品药品监督局（FDA）认定的GRAS（GenerallyRegardedAsSafe）菌株之一，在有机酸、工业酶制剂方面应用广泛。此外有些菌株还会产生具有重要应用价值的生理活性物质如Lovastatin等。
1980年，Alberts等从土曲霉（Aspergillusterreus）中提取到称为洛伐他汀（Lovastatin）的化合物。Lovastatin是降血脂的他汀类药物，具有抑制体内生物合成胆固醇的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG）的活性，可用于治疗心血管疾病。美国和日本等国家通过发酵的方式开发出一系列的Lovastatin药物，但我国对降脂曲霉的研究生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因主要是缺乏优良的生产菌株和适宜的发酵工艺。因而筛选出高产Lovastatin的曲霉菌株并对其发酵工艺进行优化，具有良好的理论意义和应用前景。
本发明所筛选的黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，具有高产Lovastatin、生长速度快、培养方法简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为26℃条件下，An-19菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5L发酵罐发酵116h，Lovastatin产量可达267.02mg/L。
发明内容
针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本发明的目的是提供1株高产Lovastatin黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株和发酵生产Lovastatin的方法。
本发明所述黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCCM2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，中国武汉大学。保藏日期为：2015年11月11日。
黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，后变成黑褐色粉粒状，15d菌落直径达60mm，有环形沟纹；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6μm~8μm的分支状；分生孢子头丰富，黑褐色，球状，直径150μm～350μm；分生孢子梗茎长短不一，壁较薄，光滑黄褐色；顶囊膨大成球形，双层小梗；分生孢子呈褐色球形或近球形，表面粗糙，直径4~5μm×4~4.5μm。
黑曲霉An-19菌株用于产生洛伐他汀（Lovastatin）的应用。黑曲霉An-19菌株的发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。
本发明所涉及的An-19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18SrDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉（Aspergillusniger）。经培养基配方和培养条件优化后，5L发酵罐发酵116h，Lovastatin产量可达267.02mg/L。
高产洛伐他汀（Lovastatin）的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d；
2）取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子；
3）在种子培养液中，按种子培养液质量2~10%加入一级种子，摇床培养1~3d成二级种子；
在发酵培养基中，按发酵培养基质量10~20%接入二级种子，发酵培养时间为110h~120h。
作为优选，发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。
作为优选，发酵培养的发酵罐搅拌桨转速200r/min，通气量120L/h，罐压0.1MPa~0.5MPa。
作为优选，一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0。
作为优选，二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0。
作为优选，发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5。
取上述制得发酵液10mL，加甲醇40mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，可达220mg/L~270mg/L。黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株5L发酵罐发酵110h~120h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin，与滤液混合；用远藤章教授方法提取Lovastatin，蒸干后得微黄色块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明Lovastatin提取物结构与Lovastatin标准品一致。
黑曲霉在食品生产中已获得了长期的实践证明，其生产和应用均不存在安全隐患，An-19菌株可用于Lovastatin的生产，是较有潜力的工业菌株。
附图说明
图1An-19菌株PDA培养基上培养15d菌落正面。
图2An-19菌株PDA培养基上培养5d分生孢子头生长的显微特征（100X）。
图3An-19菌株分生孢子头显微特征（呈球状，200X）。
图4An-19菌株分生孢子显微特征（400X）。
图5An-19菌株18SrDNA基因序列（1302bp）。
图6基于16株曲霉属（Aspergillus）18SrDNA基因序列建立的An-19菌株系统发育树。
图7An-19菌株在5L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。
图8An-19菌株发酵液中Lovastatin提取物外观（10X）。
保藏声明
黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCCM2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年11月11日。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株的筛选和鉴定
1培养基
①PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%，水1L，pH5.5~6.0。用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。
②PD培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1L，pH5.5~6.0。用于高产Lovastatin曲霉菌株的筛选。
实验方法
2.1曲霉菌株的分离纯化
从不同生境收集的自然发酵样品表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，26℃培养24h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3d产生孢子后，显微镜观察具有曲霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。将分离纯化获得的曲霉菌株编号保存于25%甘油中，置于4℃冰箱备用。
高产Lovastatin曲霉菌株的筛选
用高效液相色谱法（HPLC）检测曲霉各菌株发酵液中Lovastatin产量进行筛选。曲霉各保存菌株26℃PDA平板培养3d后，用打孔器取1菌饼（直径0.8mm）转接种于PD培养液中，26℃、200r/min摇床培养7d。取发酵液1mL，加甲醇4mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，利用HPLC法检测Lovastatin产量，筛选高产Lovastatin的曲霉菌株。色谱条件：AgilentPrep-C18液相色谱柱，波长：λ=237nm。
菌株的鉴定
An-19菌株PDA培养基平板上26℃培养5d，显微镜观察An-19菌株的菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等的形态特征。
提取An-19菌株的基因组DNA，扩增18SrDNA基因序列，送上海生物工程公司测序。根据形态特征和18SrDNA基因序列，参考曲霉属《TheGenusAspergillus》分种检索表，确定分类地位。
实验结果
3.1曲霉菌株的获得和高产Lovastatin曲霉菌株的筛选
通过分离纯化从各地不同生境收集的自然发酵样品（食品、土壤、有机质等）中分离纯化共获得256株曲霉纯菌株。
利用高效液相（HPLC）法对256株曲霉纯菌株发酵液进行Lovastatin产量检测，经筛选获1株Lovastatin产量较高的曲霉菌株，编号为An-19菌株，该菌株分离自自然发酵的稻谷。
菌株的鉴定结果
An-19菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，后变成黑褐色粉粒状，15d菌落直径达60mm，有环形沟纹（附图1）；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6μm~8μm的分支状；分生孢子头丰富，黑褐色球状，直径150μm～350μm（附图2）；分生孢子梗茎长短不一，壁较薄，光滑黄褐色；顶囊膨大成球形，双层小梗（附图3）；分生孢子呈褐色球形或近球形，表面粗糙，直径4~5μm×4~4.5μm（附图4）。
18SrDNA基因序列分析结果表明，其长度为1302bp（附图5），与黑曲霉（Aspergillusniger）（附图6）。根据An-19菌株的形态特征和18SrDNA基因序列，结合曲霉属（Aspergillus）分种检索表，将An-19菌株鉴定为黑曲霉（Aspergillusniger）。
实施例2An-19菌株在5L发酵罐中的生长曲线、Lovastatin的产生和制备
1菌株：An-19曲霉菌株。
培养基
①PDA培养基：配方同实施例1。
②PD培养液：配方同实施例1。
③一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0。
④二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0。
⑤发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5。
实验方法
3.1An-19菌株的培养
用接种针挑少量An-19菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；取平皿中1菌饼（直径0.8mm）接种于PD培养液中，摇床培养3d，制得一级种子；在种子培养液中，按6%加入一级种子，200r/min摇床培养2d成二级种子；在5L发酵罐中按15%接入二级种子进行发酵培养。
发酵培养条件：26℃、pH5.5、转速200r/min，通气量120L/h，罐压0.1MPa~0.5MPa。
菌丝干重的测定
1.5mL空离心管放于在85℃的烘箱中烘干取出，称取空离心管质量为m；每管吸取1mL培养液，在4℃，10000r/min离心10min，弃上清；加无菌蒸馏水洗3次，10000r/min离心10min，弃上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，称取质量为M；菌丝干重质量为M-m。每隔4h取1mLAn-19菌株发酵液测定菌丝干重。以取样时间为横坐标，An-19菌株菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线。
产量随发酵时间变化曲线分析
每隔4h取发酵液1mL，加甲醇4mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，以培养时间为横坐标，An-19菌株的Lovastatin产量为纵坐标，绘制An-19菌株Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。
发酵液中Lovastatin的分离纯化和鉴定
An-19菌株5L发酵罐发酵110h~120h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin成分，与滤液混合；用远藤章教授方法分离纯化Lovastatin，蒸干后得晶体；将晶体样品分别溶于甲醇和氘代氯仿中，核磁共振波谱技术分析鉴定。
实验结果
4.1An-19菌株的生长曲线
每隔4h取样测定菌丝干重，An-19菌株生长曲线见图7。An-19菌株0~20h生长速度慢，为迟缓期；24h~68h快速生长，菌体量大增，为对数生长期；发酵至72h后，长势趋于平缓，菌体量达到最高，为稳定生长期，菌丝干重达260.5g/L；104h后出现泡沫，进入衰亡期。
发酵液中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线
每隔4h取样用HPLC法测定An-19菌株发酵液Lovastatin产量，Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线见图7，发酵至116h后，发酵液中Lovastatin产量不再增高，最大值为267.02mg/L。
发酵液中Lovastatin提取物及其鉴定
用远藤章教授方法提取Lovastatin，得到微黄色块状晶体（附图8）；用核磁共振波谱技术对Lovastatin标准品和发酵液中Lovastatin提取物分析比对，结果表明Lovastatin提取物结构与Lovastatin标准品一致，纯度较高。
Claims (9)
1.黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2015673，保藏日期为：2015年11月11日。
2.权利要求1所述的黑曲霉An-19菌株用于产生洛伐他汀（Lovastatin）的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于：黑曲霉An-19菌株的发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。
4.高产洛伐他汀（Lovastatin）的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d；
2）取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子；
3）在种子培养液中，按种子培养液质量2~10%加入一级种子，摇床培养1~3d成二级种子；
4）在发酵培养基中，按发酵培养基质量10~20%接入二级种子，发酵培养时间为110h~120h。
5.根据权利要求4所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。
6.根据权利要求4所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：发酵培养的发酵罐搅拌桨转速200r/min，通气量120L/h，罐压0.1MPa~0.5MPa。
7.根据权利要求4所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0。
8.根据权利要求4所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0。
9.根据权利要求4所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510945197.0A CN105602856B (zh) | 2015-12-16 | 2015-12-16 | 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510945197.0A CN105602856B (zh) | 2015-12-16 | 2015-12-16 | 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105602856A true CN105602856A (zh) | 2016-05-25 |
| CN105602856B CN105602856B (zh) | 2019-04-16 |
Family
ID=55983205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510945197.0A Active CN105602856B (zh) | 2015-12-16 | 2015-12-16 | 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105602856B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108004279A (zh) * | 2016-11-01 | 2018-05-08 | 北大方正集团有限公司 | 用于提高洛伐他汀发酵水平的发酵培养基及补料方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0556699A1 (en) * | 1992-02-10 | 1993-08-25 | Novopharm Ltd. | Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production |
| CN101928701A (zh) * | 2009-06-23 | 2010-12-29 | 华东理工大学 | 提高真菌产酶和次级代谢物的方法 |
| CN104561166A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-04-29 | 山东中惠食品有限公司 | 一种高产洛伐他汀的生产方法 |
-
2015
- 2015-12-16 CN CN201510945197.0A patent/CN105602856B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0556699A1 (en) * | 1992-02-10 | 1993-08-25 | Novopharm Ltd. | Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production |
| CN101928701A (zh) * | 2009-06-23 | 2010-12-29 | 华东理工大学 | 提高真菌产酶和次级代谢物的方法 |
| CN104561166A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-04-29 | 山东中惠食品有限公司 | 一种高产洛伐他汀的生产方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| J.L. CASAS LÓPEZ A,ET AL.: "Production of lovastatin by Aspergillus terreus: effects of the C:N ratio and the principal nutrients on growth and metabolite production", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 * |
| RAGHUNATH R，ET AL.: "PRODUCTION AND CYTOTOXICITY STUDIES OF LOVASTATIN FROM Aspergillus niger PN2 AN ENDOPHYTIC FUNGI ISOLATED FROM Taxus baccata", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED BIOLOGY AND PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY》 * |
| SADIA JAVED,ET AL.: "Screening of Indigenously Isolated Fungi for Lovastin Production and its in vivo Evaluation", 《CURRENT PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY》 * |
| SYARIFAH ABDUL RASHID,ET AL.: "EFFECT OF CULTURAL CONDITIONS ON LOVASTATIN PRODUCTION BY ASPERGILLUS NIGER SAR I USING COMBINATION OF RICE BRAN AND BROWN RICE AS SUBSTRATE", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED BIOLOGY AND PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108004279A (zh) * | 2016-11-01 | 2018-05-08 | 北大方正集团有限公司 | 用于提高洛伐他汀发酵水平的发酵培养基及补料方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105602856B (zh) | 2019-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11242502B2 (en) | Low urea-producing and flavor-producing Wickerhamomyces anomalus strain and use thereof in food production | |
| CN103025862B (zh) | 新型破囊壶菌类微藻及用其生产生物油的方法 | |
| CN106978350A (zh) | 一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用 | |
| CN104893989B (zh) | 小孢根霉须状变种zjph1308及在制备西他列汀中间体中的应用 | |
| CN107177519A (zh) | 粟酒裂殖酵母菌、其组合物和应用 | |
| CN102703339B (zh) | 高产精氨酸脱亚胺酶菌株及用它生产l-瓜氨酸的方法 | |
| CN106047713B (zh) | 一株嗜松篮状菌菌株Li-93及其应用 | |
| CN102972211A (zh) | 一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法 | |
| CN102827777B (zh) | 海绵共附生土曲霉及制备(+)-terrein的用途 | |
| CN105219653B (zh) | 产洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株及其应用 | |
| CN102766663B (zh) | 桑黄活性多糖的制备方法 | |
| CN104277985A (zh) | 红曲霉(Monascus purpureus)M-24菌株及其用于Monacolin K制备中应用 | |
| CN104611236B (zh) | 刺孢小克银汉霉FAR3及其发酵制备γ-亚麻酸油脂的方法 | |
| CN106754430A (zh) | 高产洛伐他汀枝状枝孢菌Cc‑106菌株及其用途 | |
| CN105602917A (zh) | 一种橙皮苷酶的生产方法及应用 | |
| CN102021212A (zh) | 一种灵芝多糖的制备方法 | |
| CN106479900B (zh) | 高产洛伐他汀草酸青霉Po-25菌株及其用途 | |
| CN101487022A (zh) | 抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法 | |
| CN105602856A (zh) | 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 | |
| CN108949595A (zh) | 一种产香酵母菌及其在红曲黄酒酿造中的应用 | |
| CN1141377C (zh) | 高海藻糖含量的酿酒酵母及其生产方法 | |
| CN104862238B (zh) | 一株酿酒酵母及其应用 | |
| CN112094762B (zh) | 一株葡萄牙棒孢酵母菌株及其应用 | |
| CN101008000A (zh) | 一种生产β－胡萝卜素的粘性红圆酵母、β－胡萝卜素及其生产方法 | |
| CN103865804B (zh) | β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备白藜芦醇中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240130 Address after: Room 2920, Building B, No. 9 Hisense Tianchen Road, Jinan City, Shandong Province, 250000 Patentee after: Zhuofan (Jinan) Technology Innovation Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 321004 No. 688 Yingbin Road, Zhejiang, Jinhua Patentee before: ZHEJIANG NORMAL University Country or region before: China |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240206 Address after: 710100 Building 6, No. 381 Kunchi 1st Road, Xiliu Street Office, High tech Zone, Xi'an City, Shaanxi Province Patentee after: Shaanxi Didu Pharmaceutical and Chemical Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Room 2920, Building B, No. 9 Hisense Tianchen Road, Jinan City, Shandong Province, 250000 Patentee before: Zhuofan (Jinan) Technology Innovation Co.,Ltd. Country or region before: China |