CN104561166A - 一种高产洛伐他汀的生产方法 - Google Patents
一种高产洛伐他汀的生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产洛伐他汀的生产方法及该生产方法所用到的红曲菌，其包括菌种的诱变以及利用该诱变菌种进行发酵，本发明的有益效果是：本发明的诱变菌株及其生产洛伐他汀的方法，与常规红曲霉生产菌株及生产方法相比，其洛伐他汀产量可达到1650mg/L以上，洛伐他汀生产能力更高，提高了洛伐他汀的质量。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产洛伐他汀的生产方法及该生产方法所用到的红曲菌。
背景技术
洛伐他汀是一种能够抑制体内胆固醇合成的生理活性物质，自1987年美国Merck公司将洛伐他汀系列开发推出新一代的降胆固醇药物以来，洛伐他汀作为新型的调整血脂药，深受广大患者的欢迎。
目前，洛伐他汀的生产菌株主要为土曲霉和红曲霉。土曲霉发酵产量高，但出于安全考虑，土曲霉发酵物需经有机溶剂提取，或再进行化学合成等步骤，得到的为纯品闭环洛伐他汀。这些是目前市场上医药类降脂药物的主要成分。闭环洛伐他汀本身无活性，需经人体内的羟基酯酶水解，从而增加肝、肾负担，属美国处方药物管辖。而开环洛伐他汀可以被人体直接利用，一般只有在天然发酵的红曲霉中能够得到。目前红曲霉的洛伐他汀产量较低，但红曲霉发酵具有其独特的优势：其发酵产物中除了含有洛伐他汀之外，还有一系列洛伐他汀结构类似物、γ-氨基丁酸等生理活性物质存在，这些相关成分和洛伐他汀相联合，不仅具有协同调节血脂的功效，而且还极大地降低了纯品洛伐他汀的副作用。因此，以红曲霉开发的保健食品、保健药品在国内、国际市场上都非常受欢迎。
红曲霉的发酵工艺主要有两种，即固态发酵和液态发酵。目前红曲霉生产洛伐他汀主要采用固态发酵的方式。固态发酵具有生产过程简单，投资少，产量高，后处理简单等优点。固态发酵也有缺点，如周期较液态发酵长，条件不易控制，容易染菌等。在工业化固态发酵时，培养基和培养条件对其产量和品质的影响很大，获得的产品品质参差不齐，已逐渐失去市场竞争力。液态发酵法具有规模大，自动化程度高，人力成本低，生产过程易控制等显著优点。但是，由于受到产量和生产成本的限制，液体发酵生产洛伐他汀的研究一直停留在实验室水平，没有形成产业化规模。
因此，通过诱变育种获得洛伐他汀产量更高的红曲霉菌株，并通过优化发酵条件提高红曲霉的洛伐他汀的产量对推动红曲类降脂产品的发展具有举足轻重的作用。
发明内容
本发明的目的之一高产洛伐他汀的生产方法，并提供能够有效提高洛伐他汀产量的诱变菌株红曲霉。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高产洛伐他汀的生产方法，包括下述步骤：
a、 菌种诱变：以生理盐水从初始菌株紫色红曲菌生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h左右，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液，收集单孢子悬液然备用；
在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时，最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应；
吸取1 mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射。照射时间为8-12min，激光波长：630-640 nm 照射功率密度为15-18 mw/cm2；
将诱变处理后的菌液稀释后涂布PDA固体平板，26-32℃培养3-4 d；
将长出的单菌落转接到固体PDA平板的一侧，26-32℃培养4-5 d后，在平板另一侧转接构巢曲霉，26-32℃下进行对峙培养7-8 d；
b、 选取构巢曲霉菌落直径为3.0-5.0cm的红曲霉菌株，从平板上刮取红曲霉孢子转接到种子培养基上，26-32℃培养2-5 d，按照12-16%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基中，26-32℃摇床120-180 r/m培养2-5 d后，20-25℃摇床120-180 r/m培养18-25d。
上述种子培养基包括米粉2-5g、碳源1-3g、氮源 0.1-0.5g、蛋白胨1.0-2.0g、MgSO4·7H2O 0.02-0.08g、KH2PO4 0.10-0.20g，加水至100 mL。
优化的，上述碳源为葡萄糖、乳糖或木糖，所述氮源为NaNO3。
作为上述种子培养基的一种优化，上述种子培养基包括米粉3g、葡萄糖2g、NaNO3 0.2g、蛋白胨1.5g、MgSO4·7H2O 0.05g、KH2PO4 0.15g，加水至100 mL。
上述发酵培养基包括米粉5-10 g、碳源 1-5 mL、氮源 0.1-0.5 g、蛋白胨1.0-2.0g、MgSO4·7H2O 0.02-0.08g、KH2PO4 0.10-0.20g、加水至100 mL。
优化的，上述碳源为甘油或葡萄糖，所述氮源为NaNO3。
作为上述发酵培养基的一种优化，上述发酵培养基包括米粉7 g、甘油 5mL、NaNO3 0.2 g、蛋白胨1.5g、MgSO4·7H2O 0.05g、KH2PO4 0.15g、加水至100 mL。
优化的，上述的一种高产洛伐他汀的生产方法，包括下述步骤：
a、 菌种诱变：以生理盐水从初始菌株Monascus purpureus紫色红曲菌生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液，收集单孢子悬液然备用；
在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时，最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应；
吸取1 mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射。照射时间为10min，激光波长：632.8nm 照射功率密度为17.6 mw/cm2；
将诱变处理后的菌液稀释涂布PDA固体平板，30℃培养3 d；
将长出的单菌落转接到固体PDA平板的一侧，30℃培养4 d后，在平板另一侧转接构巢曲霉，30℃下进行对峙培养8 d；
b、 选取构巢曲霉菌落直径为3.0-5.0cm的红曲霉菌株，从平板上刮取红曲霉孢子转接到种子培养基上，30℃培养3d，按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基中，30℃摇床150r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20d。
上述的一种高产洛伐他汀的生产方法中，所述初始菌株紫色红曲菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.6807，保藏单位地址为：北京市朝阳区大屯路。
本发明的紫色红曲霉(Monascus purpureus)具有以下形态特征：
于400倍显微镜观察紫色红曲霉的菌丝体形态，菌株形态特征为：菌丝体分枝甚繁、有隔，直径3.0μm-7.0μm，幼时有内含物，分生孢子球形或洋梨形、无色，子囊果球形、无色、短柄，椭圆形(5.0-7.0)μm×(4.5-5.0) μm。
本发明的紫色红曲霉MPB3具有以下培养特征：
紫色红曲霉在PDA琼脂培养基中30℃培养 7d，菌落较大，稍凸起，疏松，呈绒毡状，蔓延性一般，正面中间浅粉色，背部深红色，菌落大小(3.0-4.0)cm×(4.5-5.5)cm，生长速度较快；
紫色红曲霉MPB3在察氏琼脂培养基中30℃培养7d，菌落小，凸起最高，呈绒毡状，疏松，蔓延性差，正面浅红色，背部红色，菌落大小(2.5-3.0)cm×(3.5-4.5)cm，生长速度较慢。
本发明的紫色红曲霉的生物学特性如下：
生长温度为20℃-38℃，最适生长温度为35℃-32℃，在pH2.0-7.0的范围内均能生长。在察氏培养基和PDA琼脂培养基30℃培养7d，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。
本发明的有益效果是：
本发明的诱变菌株及其生产洛伐他汀的方法，与常规红曲霉生产菌株及生产方法相比，其洛伐他汀产量可达到1650mg/L以上，洛伐他汀生产能力更高，提高了洛伐他汀的质量。
附图说明
图1为本发明紫色红曲霉在PDA培养基平板上生长时菌落形态；
图2为本发明紫色红曲霉在在查氏培养基平板上生长时菌落形态。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
高产洛伐他汀红曲霉菌株的诱变及初筛
以生理盐水从初始菌株Monascus purpureus紫色红曲菌生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h左右，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液，收集单孢子悬液备用。
在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时，最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应。
吸取1 mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射。照射时间为10 min。激光波长：632.8 nm 照射功率密度为17.6 mw/cm2。
将经过诱变处理后的菌液稀释至适当浓度后涂布PDA固体平板，30℃培养3 d。将长出的单菌落利用打孔器转接到固体PDA平板的一侧，30℃培养4 d后，利用打孔器在平板另一侧转接构巢曲霉，30℃下进行对峙培养8 d后，通过比较构巢曲霉菌落直径来筛选洛伐他汀高产的红曲霉菌株。
实施例2
红曲霉液态发酵生产洛伐他汀
发酵菌株：Monascus purpureus紫色红曲菌
种子培养基：
米粉 3 g，葡萄糖 2 g，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.15 g，加水至100 mL。
发酵培养基：
米粉 7 g，甘油 5 mL，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.15 g，加水至100 mL。
培养条件：
从平板上刮取红曲霉孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30℃培养3 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20d.
样品的处理与检测：
将发酵液10000 g离心10 min后，取上清250 μL，加入750 μL的无水乙醇，超声萃取20 min，使用 0.45 μm的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC）检测。HPLC检测条件为：色谱柱为255 mm×4.6 mm的C18柱，柱温25℃，紫外检测器，检测波长为238 nm，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14（体积比），流速1 mL/min，进样量20 μL。
经检测得，红曲霉产生的洛伐他汀产量为801 mg/L。
实施例3
本发明诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀
发酵菌株：紫色红曲霉
种子培养基：
米粉 3 g，葡萄糖 2 g，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.15 g，加水至100 mL。
发酵培养基：
米粉 7 g，甘油 5 mL，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.15 g，加水至100 mL。
培养条件：
从平板上刮取红曲霉MPB3孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30℃培养3 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20 d.
样品的处理与检测：
将发酵液10000 g离心10 min后，取上清250 μL，加入750 μL的无水乙醇，超声萃取20 min，使用 0.45 μm的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC）检测。HPLC检测条件为：色谱柱为255 mm×4.6 mm的C18柱，柱温20-25℃，紫外检测器，检测波长为238 nm，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14（体积比），流速1 mL/min，进样量20 μL。
经检测得，红曲霉MPB3产生的洛伐他汀产量为1660 mg/L。
实施例4
本发明诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀
发酵菌株：紫色红曲霉
种子培养基：
米粉 3 g，乳糖 2 g，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.15 g，加水至100 mL。
发酵培养基：
米粉 7 g，葡萄糖 5 g，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.15 g，加水至100 mL。
培养条件：
从平板上刮取红曲霉MPB3孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30℃培养3 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20 d.
样品的处理与检测：
将发酵液10000 g离心10 min后，取上清250 μL，加入750 μL的无水乙醇，超声萃取30 min，使用 0.45 μm的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC）检测。HPLC检测条件为：色谱柱为255 mm×4.6 mm的C18柱，柱温25℃，紫外检测器，检测波长为238 nm，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14（体积比），流速1 mL/min，进样量20 μL。
经检测得，红曲霉MPB3产生的洛伐他汀产量为1680 mg/L。
实施例5
诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀
发酵菌株：紫色红曲霉
种子培养基：
米粉 3 g，木糖 2 g，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.15 g，加水至100 mL。
发酵培养基：
米粉 7 g，甘油 5 mL，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g， MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO4 0.15 g，加水至100 mL。
培养条件：
从平板上刮取红曲霉MPB3孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30℃培养2 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30℃摇床150 r/m培养2d后，26℃摇床150 r/m培养20d.
样品的处理与检测：
将发酵液10000 g离心10 min后，取上清250 μL，加入750 μL的无水乙醇，超声萃取15 min，使用 0.45 μm的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC）检测。HPLC检测条件为：色谱柱为255 mm×4.6 mm的C18柱，柱温25℃，紫外检测器，检测波长为238 nm，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14（体积比），流速1 mL/min，进样量20 μL。
经检测得，红曲霉MPB3产生的洛伐他汀产量为1730 mg/L。
注：此处构巢曲霉直径指与对峙培养的红曲霉相对方向上的构巢曲霉菌落的直径。
我们利用高效液相色谱（HPLC）分析诱变菌株发酵产生的洛伐他汀产量，并与构巢曲霉对峙培养实验得到的结果相比对，证实红曲霉菌株产生洛伐他汀的能力与其同平板对峙培养的构巢曲霉菌落直径的大小成反比。由此可证明利用构巢曲霉对峙培养筛选红曲霉高产洛伐他汀菌株的可行性。
Claims (9)
1.一种高产洛伐他汀的生产方法，包括下述步骤：
菌种诱变：以生理盐水从初始菌株紫色红曲菌生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液，收集单孢子悬液然备用；
在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时，最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应；
吸取1 mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射；
照射时间为8-12min，激光波长：630-640 nm 照射功率密度为15-18 mw/cm2；
将诱变处理后的菌液稀释后涂布PDA固体平板，26-32℃培养3-4 d；
将长出的单菌落转接到固体PDA平板的一侧，26-32℃培养4-5 d后，在平板另一侧转接构巢曲霉，26-32℃下进行对峙培养7-8 d；
选取构巢曲霉菌落直径为3.0-5.0cm的红曲霉菌株，从平板上刮取红曲霉孢子转接到种子培养基上，26-32℃培养2-5 d，按照12-16%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基中，26-32℃摇床120-180 r/m培养2-5 d后，20-25℃摇床120-180 r/m培养18-25d。
2.根据权利要求1所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述种子培养基包括米粉2-5g、碳源1-3g、氮源 0.1-0.5g、蛋白胨1.0-2.0g、MgSO4·7H2O 0.02-0.08g、KH2PO4 0.10-0.20g，加水至100 mL。
3.根据权利要求2所述的一种高产洛伐他汀的生产方法， 其特征在于：所述碳源为葡萄糖、乳糖或木糖，所述氮源为NaNO3。
4.根据权利要求3所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述种子培养基包括米粉3g、葡萄糖2g、NaNO3 0.2g、蛋白胨1.5g、MgSO4·7H2O 0.05g、KH2PO4 0.15g，加水至100 mL。
5.根据权利要求1所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基包括米粉5-10 g、碳源 1-5 mL、氮源 0.1-0.5 g、蛋白胨1.0-2.0g、MgSO4·7H2O 0.02-0.08g、KH2PO4 0.10-0.20g、加水至100 mL。
6.根据权利要求5所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述碳源为甘油或葡萄糖，所述氮源为NaNO3。
7.根据权利要求6所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基包括米粉7 g、甘油 5mL、NaNO3 0.2 g、蛋白胨1.5g、MgSO4·7H2O 0.05g、KH2PO4 0.15g、加水至100 mL。
8.根据权利要求1所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，包括下述步骤：
菌种诱变：以生理盐水从初始菌株Monascus purpureus紫色红曲菌生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液，收集单孢子悬液然备用；
在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时，最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应；
吸取1 mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射；
照射时间为10min，激光波长：632.8nm 照射功率密度为17.6 mw/cm2；
将诱变处理后的菌液稀释后涂布PDA固体平板，30℃培养3 d；
将长出的单菌落转接到固体PDA平板的一侧，30℃培养4 d后，在平板另一侧转接构巢曲霉，30℃下进行对峙培养8 d；
选取构巢曲霉菌落直径为3.0-5.0cm的红曲霉菌株，从平板上刮取红曲霉孢子转接到种子培养基上，30℃培养3d，按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基中，30℃摇床150r/m培养3 d后，24℃摇床150 r/m培养20d。
9.根据权利要求1或8所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述初始菌株紫色红曲菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.6807。
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