CN105820989A - 一种直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法：（1）菌种的活化：所用乳酸菌菌株为JSX‑A1。菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h。然后，从平板上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24‑48h；（2）乳酸菌JSX‑A1的高密度培养：在MRS液体培养基中添加5‑10g/L的果糖及5‑10%的牛蒡根提取物JSX‑PE1，调节pH 6.6‑6.8，高压灭菌20min，接种3%活化的JSX‑A1菌液，在37℃、200r/min条件下培养12h，然后添加灭菌的10g/L的葡萄糖和5g/L果糖及5‑10%的NaHCO3再继续培养10‑12h。最终乳酸菌密度可达1012cfu/ml。

Description

一种直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法
技术领域
本发明涉及一种直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，属于微生物发酵工程技术领域。
背景技术
乳酸菌，如嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)及嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)是一大类有益菌群（益生菌），被视为人体重要的“生理器官”，与免疫、营养、代谢等许多生理功能紧密相关，有促于恢复人体自然平衡及提高人体免疫能力等。优质商业化发酵剂是实现乳生菌生产工业化、标准化的必要条件。直投式发酵剂无需进行活化、放大培养等预处理，可省去菌种车间，简化生产工艺，使生产规范化，在乳生菌生产中具有广泛的应用前景。目前我国尚缺乏能满足不同特征产品生产所需的乳酸菌商业化发酵剂，多数发酵乳制品企业主要靠进口国外冷冻干燥乳酸菌发酵剂。发酵剂制备主要包括优质菌种筛选、菌种的高密度培养与放大培养、及活菌的冷冻干燥与保护剂选择等关键技术。优质乳酸菌菌种非常缺乏，乳酸菌产品中活菌数少、活性低，尤其，食用后经过极强酸性环境的消化系统器官胃（pH3.0以下）后，存活的乳酸菌更是很少，食用后很难达到乳酸菌的预期功能。在菌种培养方面，过去主要着重于基础培养基和培养工艺中单一因素的优化研究，因乳酸菌在生长繁殖过程中不断产生乳酸，培养液的pH值不断下降，当pH值降至4左右时，乳酸菌的生长繁殖受到抑制，最终培养液中乳酸菌密度一般仅达到1010cfu/ml级别。最近我们利用化学诱变的方法开发了较大规模的乳酸菌突变群体作为新的乳酸菌遗传种质资源库，从中高通量选育出了一些生长速度快、特征明显的菌株。为了生产出低成本、高活性的优质直投式乳酸菌发酵剂，选育优质菌种，并采用改变培养方式如分批流加培养、筛选生长刺激因子及进行代谢调控等综合措施，实现菌种的高密度培养，容易达到1011-1012cfu/ml级别。另外，在细胞和分子水平上研究冷冻干燥过程中保护剂对微生物细胞的保护机制，设计高效保护剂，提高直投式发酵剂菌种存活率，保护其发酵性能等也是一条有效途径。
本发明主要通过改变乳酸菌的培养方式及采取一些简单但实用的代谢调控手段等综合措施来实现我们从突变群体当中筛选出的一株优质耐强酸乳酸菌的高密度培养，以期生产低成本、高密度的直投式优质益生乳酸菌发酵剂。
发明内容
目的：为解决现有技术的不足，本发明提供了一种直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，通过改变乳酸菌的培养方式及采取一些简单但实用的代谢调控手段等综合措施来实现从突变群体当中筛选出的一株优质耐强酸乳酸菌JSX-A1的高密度培养，使培养液中乳酸菌的密度达到1012cfu/ml，以期生产低成本、高密度的直投式优质益生乳酸菌发酵剂。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其步骤为：
1、一种直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其步骤为：
（1）基础培养基制备
MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁，0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容，高压（1×105Pa）灭菌20min。
MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压灭菌20min。
（2）菌种的活化
所用乳酸菌菌株为生长速度快、耐酸的突变株JSX-A1；菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h；然后，从MRS平板培养基上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，再按3%的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃连续培养12-24h。
（3）乳酸菌密度的检测
每隔一定时间从MRS培养菌液中抽取少量菌液，然后用蒸馏水稀释，在显微镜下用细胞计算器计数，换算成cfu/ml表示乳酸菌密度。
（4）菌种培养基的优化
在MRS液体培养基的基础上，主要优化了碳源，表明添加一定量的果糖（5-10g/L）可以显著促进JSX-A1的生长繁殖。
（5）培养工艺的优化
用上述优化的培养基对JSX-A1进行液体培养，发现培养12h后添加一定量的中和剂NaHCO3（约5-10%）可有促于维持JSX-A1的高速生长；
（6）生长刺激因子的筛选
我们制备了一系列的植物中药抽提物，从中筛选到了一种牛蒡根提取物JSX-PE1可显著促进JSX-A1的生长与繁殖。JSX-PE1制备步骤如下：
鲜牛蒡根洗干净后切片，迅速置于沸水中3-5分钟，捞出，沥干，烘干。称取一定量干牛蒡根切片，用70-90℃水提取4小时，料水比为1：4，过滤，滤液保存，滤渣同样条件下重复提取2次，每次3小时；合并滤液，浓缩得浓缩液，添加无水乙醇，并不断搅拌，与浓缩液充分混合，然后4℃静置过夜，分离出沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀3次，得JSX-PE1。
在MRS培养基中添加5-10%的JSX-PE1即可显著促进JSX-A1的生长，8.5%的JSX-PE1促进效果最好。
（7）分批流加培养
主要是分批流加碳源葡萄糖和果糖，在培养12h时，流加10g/L葡萄糖和5g/L果糖及5%的NaHCO3，乳酸菌能继续高速生长。
（8）高密度培养的完整工艺
MRS液体培养基中添加5-10g/L的果糖及5-10%的牛蒡根提取物JSX-PE1，接种3%的JSX-A1菌液在37℃、200r/min培养12h，然后添加10g/L的葡萄糖和5g/L果糖及5-10%的NaHCO3再继续培养10-12h；乳酸菌密度可达1012cfu/ml。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做具体说明：
实施例 1
（1）基础培养基制备
MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁及0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容；高压（1×105Pa）灭菌20min。
MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压灭菌20min。
（2）菌种的活化
所用乳酸菌菌株为我们从开发的化学诱变乳酸菌突变群体筛选到的一株生长速度快、耐酸的突变株JSX-A1。菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h。然后，从平板上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h， 再按3%的接种量接种于MRS 液体培养基中，于37℃连续培养12-24h。
（3）乳酸菌密度的检测
每隔一定时间从MRS培养菌液中抽取少量菌液，然后用灭菌水稀释，在显微镜下用细胞计算器计数，换算成cfu/ml表示乳酸菌密度。
（4）基础培养基添加果糖
在基础培养基MRS的基础上，添加一定量的果糖（5-10g/L）培养JSX-A1，培养24h后检测乳酸菌密度，表明果糖可以显著促进JSX-A1的生长繁殖。
实施例 2
（1）基础培养基制备
MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁及0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容；高压（1×105Pa）灭菌20min。
MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压灭菌20min。
（2）菌种的活化
所用乳酸菌菌株为我们从开发的化学诱变乳酸菌突变群体筛选到的一株生长速度快、耐酸的突变株JSX-A1。菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h。然后，从平板上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，再按3%的接种量接种于MRS 液体培养基中，于37℃连续培养12-24h。
（3）乳酸菌密度的检测
每隔一定时间从MRS培养菌液中抽取少量菌液，然后用灭菌水稀释，在显微镜下用细胞计算器计数，换算成cfu/ml表示乳酸菌密度。
（4）添加中和剂NaHCO3
用上述添加5g/L 果糖的基础培养基对JSX-A1进行液体培养，在培养12h后添加一定量的中和剂NaHCO3（约10%）再继续培养。培养24h后检测乳酸菌密度。表明NaHCO3可有促于维持JSX-A1的高速生长。
实施例 3
（1）基础培养基制备
MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁及0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容；高压（1×105Pa）灭菌20min。
MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压灭菌20min。
（2）菌种的活化
所用乳酸菌菌株为我们从开发的化学诱变乳酸菌突变群体筛选到的一株生长速度快、耐酸的突变株JSX-A1。菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h。然后，从平板上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，再按3%的接种量接种于MRS 液体培养基中，于37℃连续培养12-24h。
（3）乳酸菌密度的检测
每隔一定时间从MRS培养菌液中抽取少量菌液，然后用灭菌水稀释，在显微镜下用细胞计算器计数，换算成cfu/ml表示乳酸菌密度。
（4）添加生长刺激因子JSX-PE1
在MRS培养基中添加5-10%的JSX-PE1培养JSX-A1。培养24h后检测乳酸菌密度。表明JSX-PE1可显著促进JSX-A1的生长。
实施例 4
（1）基础培养基制备
MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁及0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容；高压（1×105Pa）灭菌20min。
MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压灭菌20min。
（2）菌种的活化
所用乳酸菌菌株为我们从开发的化学诱变乳酸菌突变群体筛选到的一株生长速度快、耐酸的突变株JSX-A1。菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h。然后，从平板上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，再按3%的接种量接种于MRS 液体培养基中，于37℃连续培养12-24h。
（3）乳酸菌密度的检测
每隔一定时间从MRS培养菌液中抽取少量菌液，然后用灭菌水稀释，在显微镜下用细胞计算器计数，换算成cfu/ml表示乳酸菌密度。
（4）实施分批流加培养
主要是分批流加碳源葡萄糖和果糖，在培养12h时，流加10g/L葡萄糖和5g/L果糖及5%的NaHCO3，再继续培养。培养24h后检测乳酸菌密度。表明分批流加培养能继续维持乳酸菌的高速生长。
实施例 5
（1）基础培养基制备
MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁及0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容；高压（1×105Pa）灭菌20min。
MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压灭菌20min。
（2）菌种的活化
所用乳酸菌菌株为我们从开发的化学诱变乳酸菌突变群体筛选到的一株生长速度快、耐酸的突变株JSX-A1。菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h。然后，从平板上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，再按5%的接种量接种于MRS 液体培养基中，于37℃连续培养12-24h。
（3）乳酸菌密度的检测
每隔一定时间从MRS培养菌液中抽取少量菌液，然后用灭菌水稀释，在显微镜下用细胞计算器计数，换算成cfu/ml表示乳酸菌密度。
（4）基础培养基同时添加果糖和生长刺激因子JSX-PE1
起始MRS培养基中添加5-10g/L的果糖及5-10%的牛蒡根提取物JSX-PE1，接种3%的JSX-A1菌液在37℃、200r/min培养24h，检测乳酸菌密度。表明果糖和生长刺激因子JSX-PE1可以叠加促进乳酸菌JSX-A1的生长。
实施例 6
（1）基础培养基制备
MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁及0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容；高压（1×105Pa）灭菌20min。
MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压灭菌20min。
（2）菌种的活化
所用乳酸菌菌株为我们从开发的化学诱变乳酸菌突变群体筛选到的一株生长速度快、耐酸的突变株JSX-A1。菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h。然后，从平板上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，再按3%的接种量接种于MRS 液体培养基中，于37℃连续培养12-24h。
（3）乳酸菌密度的检测
每隔一定时间从MRS培养菌液中抽取少量菌液，然后用灭菌水稀释，在显微镜下用细胞计算器计数，换算成cfu/ml表示乳酸菌密度。
（4）乳酸菌JSX-A1的高密度培养
在MRS液体培养基中添加5-10g/L的果糖及5-10%的牛蒡根提取物JSX-PE1，调节pH 6.6-6.8，高压（1×105Pa）灭菌20min，接种3%的JSX-A1菌液，在37℃、200r/min条件下培养12h，然后添加灭菌的10g/L的葡萄糖和5g/L果糖及5-10%的NaHCO3再继续培养10-12h。检测乳酸菌密度。最终乳酸菌密度可达1012cfu/ml。
以上已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其步骤为：
（1）菌种的活化：所用乳酸菌菌株为嗜酸乳杆菌株JSX-A1；菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中培养24h；
然后，从MRS平板培养基上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，得到活化的JSX-A1菌液；
（2）乳酸菌JSX-A1的高密度培养：在MRS液体培养基中添加5-10g/L的果糖及5-10%的牛蒡根提取物JSX-PE1，调节pH 6.6-6.8，高压1×105Pa灭菌20min，接种3%上述活化的JSX-A1菌液，在37℃、200r/min条件下培养12h，然后添加灭菌的10g/L的葡萄糖和5g/L果糖及5-10%的NaHCO3再继续培养10-12h，即可。
2.根据权利要求1所述的直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其特征在于：所述MRS平板培养基的制备方法：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁及0.25g/L硫酸锰及20.0g/L琼脂，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，然后定容，高压1×105Pa灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其特征在于：所述MRS液体培养基的制备方法：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁及0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，然后定容，高压1×105Pa灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其特征在于：所述牛蒡根提取物JSX-PE1制备方法如下：
鲜牛蒡根洗干净后切片，迅速置于沸水中3-5分钟，捞出，沥干，烘干；称取一定量干牛蒡根切片，用70-90℃水提取4小时，过滤，滤液保存，滤渣同样条件下重复提取2次，每次3小时；合并滤液，浓缩得浓缩液，添加无水乙醇，并不断搅拌，与浓缩液充分混合，然后4℃静置过夜，分离出沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀3次，得JSX-PE1。
5.根据权利要求4所述的直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其特征在于：干牛蒡根切片用70-90℃水提取的料水比为1：4。
6.根据权利要求1所述的直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其特征在于：乳酸菌JSX-A1的高密度培养中，在MRS液体培养基中添加8.5%的牛蒡根提取物JSX-PE1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的直投式发酵剂益生乳酸菌的高密度培养方法，其特征在于：乳酸菌液体培养24h后乳酸菌密度可达1012cfu/ml。
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