CN103320337B

CN103320337B - 戊糖乳杆菌

Info

Publication number: CN103320337B
Application number: CN201210406321.2A
Authority: CN
Inventors: 任洪冰; 沈锐; 赖泳红; 李治滢
Original assignee: YUNNAN HONGBIN GREEN FOOD CO Ltd
Current assignee: Honghe Hongbin Food Co.,Ltd.
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2032-10-23
Also published as: CN103320337A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有较强降解亚硝酸盐能力的微生物菌株。本发明所述的戊糖乳杆菌（Lactobacilluspentosus）命名为戊糖乳杆菌YIM110937 LactobacilluspentosusYIM110937，现在保藏单位保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2012372。本发明所述的菌株YIM110937戊糖乳杆菌为食品用乳酸菌，亚硝酸盐降解效率远大于以往报道的菌株，可以在改良MRS液体培养基中快速降解亚硝酸盐，在改良MRS液体培养基中培养36h后，培养基上清液亚硝酸盐浓度由3567.97mg/L，降至137.59mg/L，降解率达到96.14%；在单纯的好氧条件下即可大量降减亚硝酸盐，无需复杂繁琐的好氧/厌氧序批式工艺；具有良好的耐高盐性，在3-10%盐浓度培养基中连续培养生长良好，降解盐硝酸盐效果明显。

Description

戊糖乳杆菌

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有较强降解亚硝酸盐能力的微生物菌株。

背景技术

乳酸菌是一类能发酵利用糖类物质而产生大量乳酸的细菌，它是一类对人体有益的菌群。乳酸菌发酵能产生大量的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢物，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌等生理功效。乳酸菌的应用历史非常悠久，但真正科学的研究和利用是始于19世纪中叶。如今，人们已经认识到乳酸菌的生理功能，乳酸菌发酵在食品加工中得到了广泛的应用。乳酸菌的种类从形态上分类主要有球状和杆状两大类。按照生化分类法，乳酸菌可分为乳秆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和汁球菌属5个属，每个属又有很多种，某些种还包括数个亚种。

腌菜、泡菜等腌渍食品是全世界人民广泛喜爱的一种佐餐佳品, 其口味独特, 营养易于吸收, 并有开胃理气, 降低胆固醇等功效,其发酵原理是乳酸菌利用蔬菜中的糖类等营养物质发酵产酸, 形成特殊口味,早期的蔬菜腌渍多为家庭和作坊式制作, 其发酵周期长, 并易污染杂菌, 破坏了蔬菜的纤维结构, 使蔬菜变软、发粘, 影响口感。自然发酵的腌菜酸味浓郁、口味醇厚，但发酵周期长，发酵条件不易控制，易腐烂、变味；而接种发酵腌菜尽管发酵快, 不易腐烂，但由于蔬菜腌制品有很强的地域性，不同蔬菜或者相同蔬菜的腌制品，不同地方其加工工艺不同，特色风味就会不一样，生产中应采用与之相适应的菌种。此外，由于蔬菜种植过程中化肥使用量的增加, 硝酸盐污染问题日益突出, 加之蔬菜在腌制中一些还原菌的作用, 致使硝酸盐被还原生成亚硝酸盐, 易导致形成高铁血红蛋白血症和强力致癌物亚硝胺，在该领域中如何降解腌菜亚硝酸盐是亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从云南风味腌菜中分离得到的具有高效降解亚硝酸盐的乳酸菌———戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus ）。

本发明所述的戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus ）系从云南风味腌菜中分离得到。现在保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072。保藏日期为2012年9月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 2012372。

本发明所述的戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus ）命名为戊糖乳杆菌YIM110937 Lactobacillus pentosus YIM110937，现在保藏单位保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2012372。

本发明所述的YIM110937菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌株的16S rDNA序列由1460个碱基组成。用BLAST程序对YIM110937的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果与已报道的戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus (登录号D79211)的16S rDNA序列同源性达到100％，鉴定其为戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus。构建了YIM110937菌株的系统发育进化树。

菌株YIM110937的菌落形态特征：

菌株YIM110937菌落突起，边缘光滑细腻，呈乳白色，直径0.4mm～2.2mm，有酸味。

菌株YIM110937的显微形态特征：

菌体形态为杆状，为无芽孢的革兰氏阳性菌，兼性厌氧。

生理生化特征：

YIM110937生理生化特征

测定指标	标准菌株	YIM110937实验结果
			革兰氏	+	+
H2O2 试验	－	－
			明胶液化试验	－	－
吲哚试验	－	－
			硝酸盐还原试验	－	－
H2S 产生试验	－	－
			甲基红	+	+
运动试验	－	－
			pH4. 5	+	+
45 ℃	+	W
			葡萄糖产气	－	－
葡萄糖产酸	+	+
			阿拉伯糖	+	+
果糖	+	+
			半乳糖	+	+
葡萄糖	+	+
			葡萄糖酸盐	+	+
乳糖	+	+
			麦芽糖	+	－
甘露醇	+	－
			甘露糖	+	+
松三糖	+	+
			蜜二糖	+	W
鼠李糖	－	－
			山梨糖	+	+
蔗糖	+	+
			木糖	+	+
淀粉水解	－	－

备注：“+”表示阳性反应，“－”阴性反应，“W”表示反应较弱。

分子生物学特征：

①16SrDNA基因序列测定

对菌株YIM110937进行DNA提取，对菌株的16SrDNA片段进行PCR并测序，在NCBI上进行比对，确定各菌株种类。

PCR体系具体如以下两表：

表1：PCR体系

总体积	50.0ul
		Template DNA	1.5ul
Forward primer	1.0 ul
		Reverse primer	1.0 ul
10×Easytaq Buffer	5.0 ul
		dNTPs(2.5mM)	4.0 ul
Easytaq DNA Polymerase	0.5 ul
		ddH2O	37.0 ul

注：Forward primer（PA）序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

Reverse primer（PB）序列为：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。

表2：PCR扩增条件

菌株YIM110937液体发酵培养特征：

①乳酸细菌培养基（MRS）培养基，摇瓶培养2～5天，培养温度28℃。

②发酵培养特征：

培养第1天，培养基略微变浑浊；培养第2天，培养基进一步变浑浊；培养第3天，发酵液呈褐色，有少量菌体粘附在三角瓶壁上；培养第4天，发酵液稍粘稠，培养第5天，菌体生长稳定，发酵液呈棕褐色，三角瓶壁上粘附较多的菌体产生。

YIM110937戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus ）菌株采用液态发酵。

其发酵流程：

菌种→试管斜面→种子培养→发酵培养→培养液离心→上清液→亚硝酸钠测定。此步骤中，发酵原料为改良的MRS液体培养基。

发酵条件参数如下：

（1）发酵方式：液态发酵。

（2）菌种斜面：试管斜面菌种培养采用MRS培养基。

（3）种子培养：种子培养为MRS液体培养基

MRS培养基制备：

葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵[（NH₄）₂HC₆H₅O₇] 2g（柠檬酸钠5g），磷酸氢二钾（K₂HPO₄·3H₂O）2g，乙酸钠CH₃COONa·3H₂O）5g，七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.58g，硫酸锰（MnSO₄·4H₂O）0.25g（或0.05g），吐温80 1.0 ml，蒸馏水1000ml，，调节至pH 6.2-6.4，121℃高压灭菌30min。

改良乳酸菌MRS培养基制备：

在上述培养基中加入磷酸氢二钾（K₂HPO₄）2g，碳酸钙（CaCO₃，分别灭菌后加入）20g。

改良乳酸菌MRS固体培养基制备：

上述MRS培养基中加入琼脂15g，即为固体MRS培养基。

（4）发酵培养：MRS培养基，pH6.2-6.4。

（5）培养时间：试管斜面菌种活化培养3～5天，种子摇床培养时间1～2天，发酵培养时间2～5天。

（6）培养温度：试管斜面菌种培养温度28℃±1℃，种子摇床培养温度28℃±1℃，发酵培养温度为28℃±1℃。

（7）亚硝酸盐的测定：发酵完毕，收集发酵液，经离心，得到上清液。根据亚硝酸盐的测定方法，采用改良的分光光度法（GB/T5009.33-2003）来测定培养上清液中亚硝酸盐的含量。

YIM110937菌株降解亚硝酸盐测定结果

发酵液	OD₅₃₈	稀释后亚硝酸钠浓度（mg/L）	稀释倍数	亚硝酸浓度（mg/L）
					改良MRS+NaNO₂培养液	0.637	44.599	80	3567.966
YIM110937培养36hr后	0.110	6.879	20	137.591

根据上述公式可以算出未培养液中NaNO₂和培养后NaNO₂的浓度，计算菌株YIM110937 NaNO₂的降解率：

NaNO₂的降解率=（1—）×100%

NaNO₂的降解率=（1— ）×100%=96.14%

本发明是采用云南特色腌菜乳酸菌作为发酵菌株，来测定菌株的亚硝酸盐降解效果。它是以改良的MRS液体培养基（MRS+3% NaCl）为原料，通过液态发酵方式，采用组合化学手段，测定NaNO₂的降解率。该菌株对NaNO₂的降解效果明显优于报道的菌株，是重要的蔬菜腌制品应用微生物。

本发明所述的菌株戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）为食品用乳酸菌，亚硝酸盐降解效率远大于以往报道的菌株，可以在改良MRS液体培养基中快速降解亚硝酸盐，在改良MRS液体培养基中培养36h后，培养基上清液亚硝酸盐浓度由3567.97mg/L，降至137.59mg/L，降解率达到96.14%；在单纯的好氧条件下即可大量降减亚硝酸盐，无需复杂繁琐的好氧/厌氧序批式工艺；具有良好的耐高盐性，在3-10%盐浓度培养基中连续培养生长良好，降解盐硝酸盐效果明显。

附图说明

图1为本发明所述的YIM110937在MRS培养基上培养特征（正面）。

图2为本发明所述的YIM110937在MRS培养基上培养特征（反面）。

图3为本发明所述的YIM110937菌体特征（扫描电镜12000倍）。

图4为本发明所述的YIM110937亚硝酸盐降解标准曲线图。

图5为本发明所述的YIM110937菌株的系统发育进化树。

图中：分支节点上的数字表示经过1000次bootstrap分析所支持的结果。线段标尺0.05表示5%的序列差异的分支长度。

具体实施方式

实施例：

取编号YIM110937菌种，在无菌条件下（无菌室或超净工作台），用灭菌竹签挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体MRS培养基试管（15×150mm）中，置培养箱内28℃活化培养5天。

取出活化5天的菌种，在无菌条件下，以同样方式接入活化好的菌种到已灭菌的种子MRS液体培养基中，在28℃下摇床培养1～2天，即为YIM110937菌株发酵种子。

发酵采用250ml玻璃三角瓶，装入改良的MRS液体培养基100ml，121℃灭菌30min后，取出冷却后放置28℃培养箱过夜，无杂菌污染即可确认灭菌彻底，可用于后续发酵培养。在无菌条件下，取YIM110937种子液，接种于装有100ml改良MRS液体培养基的250ml玻璃三角瓶中，接种量为5～10%（v/w），置28℃通气培养2～5天。在发酵期间，注意发酵室温度变化，检查有无染菌现象。

发酵完毕，收集发酵上清液。把发酵液加入到5ml 离心管中，12000rpm，离心3min，把上清液转移到干净的离心管中，测定上清液中亚硝酸盐含量。

亚硝酸盐的测定：根据亚硝酸盐的测定方法，采用改良的分光光度法（GB/ T5009.33-2003）来测定培养上清液中亚硝酸盐的含量。

主要试剂及配制：

1.0 mol/L硫酸锌溶液：称取75g ZnSO₄.7H₂O溶于250mL水中。

200g/L盐酸溶液：取68.5mL12mol/L的盐酸于150mL容量瓶中,加水稀释至刻度并摇匀。

4g/L对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸溶于200g/L盐酸中配成100mL溶液,避光保存。

2g/L盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g 盐酸萘乙二胺溶于100 mL水中,避光保存。

NaNO₂标准溶液：准确称取0.1000g干燥24h的分析纯NaNO₂，用水溶解后定量转入500mL容量瓶中，加水稀释至刻度并摇匀。临用时准确移取上述贮备液(0.2g/L)5.0mL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为操作液(10ug/mL)。

标准曲线的绘制：

①挑取适量(一环)乳酸菌于10mlMRS培养基中，培养12h，吸取4ml培养液接种于含0.15mg/ml亚硝酸钠的40ml MRS培养基中（另取50ml MRS培养基接种，进行对照试验），在28C培养：分别在12h,24h,36h,48h,72h取样，测定亚硝酸钠的含量。

②测定：取1mL 样液定量转移至50 mL 容量瓶中加5mL 硫酸锌溶液, 混匀。置60℃水浴中加热10 min, 取出后冷却至室温, 然后分别加入2 mL 对氨基苯磺酸溶液,摇匀。静置3 min 后,再分别加入1mL盐酸萘乙二胺溶液,以水定容,摇匀。放置15min ,用2 cm 吸收池,以水为参比,空白另测，测定其试样在538nm吸收峰处的吸光度。根据测得的吸光度, 同一样品平行测定3 次,取其算术平均值。根据吸光度值大小确定降解能力。

③标准曲线绘制:准确移取NaNO₂操作液(10μg/mL)0～5.0mL分别置于50mL的容量瓶中,各加水30mL,分别配成不同浓度的NaNO₂溶液,然后分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液,摇匀。静置3 min后,再分别加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液,加水稀释至刻度,摇匀。放置15min,用2cm吸收池,用0mg/L亚硝酸钠标准系列显色液作参比，调吸收值到零，由低浓度到高浓度测标准系列显色液的吸收值。测定OD538在方格纸上以OD值作纵坐标，以加入亚硝酸钠mg/L数为横坐标绘制标准曲线（见图4）。

计算公式：

NaNO₂ mg/L＝显色液NaNO₂mg/L数×分取倍数

显色液NaNO₂mg/L含量：从标准曲线查得显色液的NaNO₂mg/L含量

显色液体积：50ml

分取倍数＝

YIM110937菌株Meg4.0建树：

对所测菌株YIM110937的16S rDNA序列图谱校正，提交GenBank，并在GenBank，EMBL，DDBJ等国际核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLASTsearch)，比较测试菌株与模式菌株对应序列的相似程度，并结合形态学及生理学特征分析对其做出鉴定。菌株间的序列比较用Clustal.x软件完成。用Neighbor—Joining方法进行分子系统学分析，并进行1000次bootstrap统计学检验，用TreeView软件显示系统树（见图5）。

核苷酸序列

菌株YIM110937的核苷酸碱基序列：

ATGCAAGTCG AACGAACTCT GGTATTGATT GGTGCTTGCA TCATGATTTA CATTTGAGTG AGTGGCGAAC TGGTGAGTAA CACGTGGGAA ACCTGCCCAG AAGCGGGGGA TAACACCTGG AAACAGATGC TAATACCGCA TAACAACTTG GACCGCATGG TCCGAGTTTG AAAGATGGCT TCGGCTATCA CTTTTGGATG GTCCCGCGGC GTATTAGCTA GATGGTGGGG TAACGGCTCA CCATGGCAAT GATACGTAGC CGACCTGAGA GGGTAATCGG CCACATTGGG ACTGAGACAC GGCCCAAACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAG GGAATCTTCC ACAATGGACG AAAGTCTGAT GGAGCAACGC CGCGTGAGTG AAGAAGGGTT TCGGCTCGTA AAACTCTGTT GTTAAAGAAG AACATATCTG AGAGTAACTG TTCAGGTATT GACGGTATTT AACCAGAAAG CCACGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTGTCCGGAT TTATTGGGCG TAAAGCGAGC GCAGGCGGTT TTTTAAGTCT GATGTGAAAG CCTTCGGCTC AACCGAAGAA GTGCATCGGA AACTGGGAAA CTTGAGTGCA GAAGAGGACA GTGGAACTCC ATGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGATATATG GAAGAACACC AGTGGCGAAG GCGGCTGTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG GCTCGAAAGT ATGGGTAGCA AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCATAC CGTAAACGAT GAATGCTAAG TGTTGGAGGG TTTCCGCCCT TCAGTGCTGC AGCTAACGCA TTAAGCATTC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGCTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGAAGCTA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT CTTGACATAC TATGCAAATC TAAGAGATTA GACGTTCCCT TCGGGGACAT GGATACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTATT ATCAGTTGCC AGCATTAAGT TGGGCACTCT GGTGAGACTG CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGATGGTACA ACGAGTTGCG AACTCGCGAG AGTAAGCTAA TCTCTTAAAG CCATTCTCAG TTCGGATTGT AGGCTGCAAC TCGCCTACAT GAAGTCGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCATGAGAGT TTGTAACACC CAAAGTCGGT GGGGTAACCT TTTAGGAACC AGCCGCCTAA GGTGGGACAG ATGATTAGGG。

Claims

1.一种戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus），其特征在于命名为戊糖乳杆菌YIM110937 Lactobacillus pentosus YIM110937，现在保藏单位保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2012372。