CN102936572B - 一株耐酸耐高温的酿酒酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐酸耐高温的酿酒酵母及其应用。所述酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.6120。利用本发明所提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10制剂添加到断奶仔猪的基础日粮中，可明显提高断奶仔猪的日采食量、日增重，并降低腹泻指数。本发明所提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10在制备动物饲料添加剂或改善动物生产性能方面具有重要意义和广阔的应用前景。

Description

一株耐酸耐高温的酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明涉及一株耐酸耐高温的酿酒酵母及其应用。 

背景技术

活性酵母菌是一种益生菌类微生态制剂。酵母属于兼性厌氧菌，在进入动物胃肠道后，消耗胃肠道的氧气，造成厌氧环境，从而促进有益菌群的繁殖，改善动物消化道微生态平衡，提高动物生产性能。同时，酵母菌在发酵过程中产酸，可促进饲料的消化，并进一步抑制有害菌群的繁殖。酵母菌耐酸的特性以及具有较宽的pH值适应范围的特性是在动物体内消化道起作用的前提，因此耐酸酵母菌在饲用酵母的应用上占优势。由于饲料加工过程中往往需要高温制粒，选育耐高温酵母菌对于在饲料工业中应用活性干酵母类产品是非常有意义的。 

除此之外，酵母细胞中含有大量水分、有机物和矿物质。其中含16种氨基酸、14种或更多的矿物质、17种维生素及硒、铬、铁、锌等微量元素，其中有机质占细胞干重的90-94%，蛋白质含量占细胞干重的30-50%。糖是酵母细胞壁的组成成分，含量在35-60%之间，主要为酵母多糖，即甘露寡糖和β-葡聚糖，可对细菌、病毒引起的疾病及环境因素引起的应激反应产生非特异性免疫力。脂类物质的含量在1-5%。酵母细胞中还富含各种消化酶，能促进动物体各种营养物质的消化吸收。此外酵母细胞还含有多种色素和未知的生长因子，是养殖动物的一种很好的营养源。 

目前，在饲用酵母研究方面，对具有耐酸耐高温特性的酵母菌株的筛选和鉴定以及发酵培养条件的研究，还未见报道。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10。 

本发明所提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏登记号为CGMCC No.6120。该酿酒酵母具有耐酸耐高温特性，表现为： 

1）在40℃培养时的生物量以菌体湿重计为44.70g/L，明显高于对照YSF5的21.30g/L； 

2）在70℃热水浴处理15S时存活率为88.1%； 

3）在pH值为3.5时的生物量以菌体湿重计为35.40g/L，是对照YSF5的1.5倍。 

本发明的另一个目的是提供一种酿酒酵母制剂，所述制剂的活性成分为所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10。 

本发明还提供一种酿酒酵母制剂的制备方法，包括用所述酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）Sa-10进行液体发酵后，收集发酵液，再用所述发酵液进行固体发酵，收集所有固体发酵的产物烘干，获得所述酿酒酵母制剂。 

在上述方法中，所述用所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10进行液体发酵包括将所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10接种于种子培养基中，30℃、200转/分钟振摇培养16～18小时，获得种子液；再将所述种子液按照体积比1:10的量接种于发酵培养基A中进行第一次液体发酵培养，再加入发酵培养基B进行第二次液体发酵培养，收集发酵液； 

所述发酵培养基A和所述发酵培养基B的溶剂为水，溶质由碳源、氮源和无机盐组成； 

所述碳源为糖蜜，所述糖蜜按糖浓度计在所述发酵培养基A中的浓度为15g/L；所述糖蜜按糖浓度计在所述发酵培养基B中的浓度为240g/L； 

所述氮源为尿素和玉米浆；所述尿素和所述玉米浆在所述发酵培养基A中的浓度分别为0.56g/L和0.19mL/L；所述尿素和所述玉米浆在所述发酵培养基B中的浓度分别为12g/L和4mL/L； 

所述无机盐为硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾，所述硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾在所述发酵培养基A中的浓度分别为1g/L、0.1g/L和1g/L；所述硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾在所述发酵培养基B中的浓度分别为1g/L、0.1g/L和1g/L； 

所述发酵培养基A和所述发酵培养基B的pH值为6.5。 

在上述方法中，所述固体发酵是将所述发酵液按照每1.4升所述发酵液与1千克质量比为72:18:10的玉米芯粉、玉米粉和豆粕粉的混合物混合后进行的。 

在上述方法中，所述第一次液体发酵的时间为4—5小时，所述第二次液体发酵的时间为21—22小时； 

所述加入发酵培养基B的量为所述发酵培养基A体积的1/3—2/5,所述加入发酵培养基B的方式为连续匀速加入5小时。 

在上述方法中，所述液体发酵的发酵条件为：温度为30℃，转速为300—800转/分钟，通气量为5—30L/分钟（根据发酵罐大小不同而不同）； 

和/或，所述固体发酵的发酵条件为：温度为30℃—45℃，时间为48小时。 

在上述方法中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的浓度分别为：葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L和蛋白胨20g/L。 

本发明保护上述任一所述方法制备得到的酿酒酵母制剂。 

本发明保护所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10及所述酿酒酵母制剂的下述至少一种用途： 

1）提高动物的采食量； 

2）提高动物体重的增加量； 

3）制备降低动物腹泻指数的产品； 

4）制备提高动物生产性能的产品。 

本发明所提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10及其制剂可以作为添加剂用于动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、羊、牛、鸡等各种动物。 

实验证明，与对照相比，本发明所提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10制剂添加到断奶仔猪的基础日粮中，可明显提高断奶仔猪的日采食量、日增重，并降低腹泻指数。本发明所提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10在制备动物饲料添加剂或改善动物生产性能方面具有重要意义和广阔的应用前景。 

保藏说明

菌种名称：酿酒酵母 

拉丁名：Saccharomyces cerevisiae 

菌株编号：Sa-10 

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

保藏机构简称：CGMCC 

地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号 

保藏日期：2012年5月18日 

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6120 

附图说明

图1为菌株Sa-10和YSF5基因组DNA的PCR鉴定电泳图。其中，从左至右的泳道分别为分子量标准（从上到下的条带依次为5000、3000、2000、1500、1000、800、500、200bp）、菌株Sa-10和YSF5。 

图2为菌株Sa-10基因组DNA的ITS1-5.8S-ITS2保守区测序及比较结果。其中，Sa-10 ITS1-5.8S-ITS2代表Sa-10的基因组DNA，464282-465093.seq代表已公布的酿酒酵母的基因组DNA（Genbank号：EF457559），Consensus代表相同的序列。 

图3为菌株Sa-10在7L发酵罐中调控不同发酵液pH值的实验结果。其中，三角形表示自然pH值，正方形表示调控pH值为5.0，菱形表示调控pH值为5.5，圆形表示调控pH值为6.0，长方形表示调控pH值为6.5；上升的曲线表示生物量变化趋势，下降的曲线表示残糖量变化趋势。 

图4为菌株Sa-10在7L发酵罐中调控不同流加速度的实验结果。其中，曲线表示残糖变化趋势，三角形代表流加速度为150毫升/小时、正方形代表200毫升/小时、菱形代表250毫升/小时、圆形代表300毫升/小时；柱形图表示生物量变化趋势，白 框代表150毫升/小时，浅灰代表200毫升/小时、中灰代表250毫升/小时，黑柱代表300毫升/小时。 

图5为菌株Sa-10在7L发酵罐中调控流加培养基中碳氮比的实验结果。其中，曲线表示残糖变化趋势，三角形代表碳氮比10、正方形代表碳氮比15、菱形代表碳氮比20、圆形代表碳氮比25；柱形图表示生物量变化趋势，白框代表碳氮比10，浅灰代表碳氮比15、中灰代表碳氮比20，黑柱代表碳氮比25。 

图6为菌株Sa-10在7L发酵罐中调控流加培养基流加时间的实验结果。其中，曲线表示残糖变化趋势，三角形代表流加时间为5小时、正方形代表流加时间为6小时、菱形代表流加时间为7小时；柱形图表示生物量变化趋势，白框代表流加时间为5小时，中灰代表流加时间为6小时，黑柱代表流加时间为7小时。 

图7为菌株Sa-10在20L发酵罐中不同发酵方案的实验结果。其中，曲线表示残糖变化趋势，三角形代表发酵方案Ⅰ、正方形代表发酵方案Ⅱ、菱形代表发酵方案Ⅲ；柱形图表示生物量变化趋势，白框代表发酵方案Ⅰ，中灰代表发酵方案Ⅱ，黑柱代表发酵方案Ⅲ。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YSF5：在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的编号为2.1042。 

糖蜜：是制糖工业的副产品，一种粘稠、黑褐色、呈半流动的物体，其中主要含有大量可发酵糖，是很好的发酵原料。下述实施例中糖蜜购自海南环球糖蜜食品实业有限公司，含糖量为450g/L。 

玉米浆：是制玉米淀粉的副产物，即将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩制成黄褐色的液体为玉米浆。下述实施例中玉米浆购自德州福源生物淀粉有限公司。 

玉米芯粉：将玉米穗脱粒后的玉米芯加工制成的平均粒径为0.25mm的小颗粒，含水量为5.5%。 

玉米粉：是将成熟的玉米粒加工制成的平均粒径为0.18mm的小颗粒，含水量为13%。 

豆粕粉：是大豆提取豆油后得到的一种副产品。下述实施例中豆粕粉购自邦基集团。 

糖蜜液体培养基（1升）：取88.9ml含糖量为450g/L的糖蜜，加入800ml自来水，煮沸处理15分钟，自然冷却，8000r/min条件下离心10分钟，取上清液作为培养基的成分，添加玉米浆8ml，氯化钙3g和磷酸二氢钠2g，pH为5.0～7.0。 

YEPD液体培养基：溶剂为水，溶质为葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母粉10g/L。 

YEPD固体培养基：为每升上述YEPD液体培养基中添加10g琼脂获得的固体培养基。 

下述实施例中的溶氧量或溶氧为相对于如下溶氧量的百分比：即开始接种前将通气量调至10L/min，搅拌为400r/min，维持10min时的溶氧量。 

下述实施例中的残糖量或残糖中的“%”代表每100毫升发酵液中含糖的克数。 

实施例1、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的筛选分离与鉴定 

1、菌株的分离纯化 

取适量的无核白葡萄皮于YEPD液体培养基中培养，30℃、200rpm摇床培养24～48h，将培养液稀释成如下三种浓度梯度：10^-1、10^-2、10^-3后，分别涂布于YEPD固体培养基平板上，每个梯度各两至三板。30℃培养24～48h，观察生长出的菌落形态，将符合酵母菌菌落形态的单菌落挑选出接至YEPD斜面进行培养。 

在平板上可以观察到两种单菌落：大菌落和小菌落，均为表面光滑，乳白色菌落。分别从大菌落和小菌落中接菌至YEPD斜面上，30℃培养24h。显微镜观察细胞形态（16×40倍），发现从小菌落接出的菌株细胞个体较小，约为正常酵母细胞的四分之一左右，形状为圆形或椭圆形，多数为单个菌体；从大菌落接出的菌株细胞个体较大，为正常酵母细胞大小，形状为圆形或椭圆形，有明显的出芽生殖。根据上述菌落形态和细胞形态的观察结果，初步认为从大菌落接出的11株菌为酵母菌株，编号为Sa-1～Sa-11。 

2、细胞生物量测定 

将步骤1从大菌落接出的11株菌分别接种到装有5ml YEPD液体培养基的大试管中，30℃，200rpm摇床培养18～20h，再分别倒入装有50ml YEPD液体培养基的三角瓶中，30℃、200rpm摇床培养20～24h，8000r/min离心5min收集各瓶中的菌体，分别称重，计算生物量。 

3、PCR鉴定 

从步骤2中挑选一个生物量最高的菌株Sa-10，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YSF5作为对照，分别提取基因组DNA，再分别以这两株菌的基因组DNA为模板，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的序列保守区ITS1-5.8S-ITS2为靶序列用引物1和引物2进行PCR扩增，将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳（结果如图1所示），并进行测序和序列相似性分析（结果如图2所示）。 

上述PCR扩增的引物序列如下： 

引物1：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’（如序列表序列1所示）； 

引物2：ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’（如序列表序列2所示）。 

结果：菌株Sa-10和YSF5的PCR扩增产物测序结果相同，与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的ITS1-5.8S-ITS2序列相似性为99.50%。 

4、API试剂盒鉴定 

将菌株Sa-10和YSF5用API20 C AUX V3.0试剂盒（生物梅里埃中国有限公司）进行测定，结果二者均为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 

菌株Sa-10已于2012年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），分类名称为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），保藏编号为CGMCC No.6120。 

在YEPD固体平板培养基中培养菌落形态为圆形，表面光滑，较大，呈乳白色，没有假菌丝。具有一定的耐酸碱和耐高温的能力。Sa-10能利用的碳源有葡萄糖，半乳糖，甲基-α-葡萄糖甙，麦芽糖，蔗糖，海藻糖和棉子糖，不能利用的碳源有甘油，2-酮基-葡萄糖酸钙，阿拉伯糖，木糖，侧金盏花醇，木糖醇，肌醇，山梨醇，N-乙酰-葡萄糖胺，纤维二糖，乳糖和松三糖。 

实施例2、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10 CGMCC No.6120的生物学特性 

1、耐高温特性 

1）不同培养温度下的生物量 

分别将菌株Sa-10和YSF5接种到装有5ml YEPD液体培养基的大试管中，30℃、200rpm摇床培养18～20h；无菌条件下分别转接入装有50ml糖蜜液体培养基的250ml三角瓶中，分别在30℃、35℃和40℃下、200rpm摇床培养24h，每个温度做三瓶平行样，测生物量（每升培养液中的菌体湿重，g/L），结果如表1所示。结果表明，与普通的酿酒酵母YSF5相比，该菌株Sa-10在40℃培养时仍然保持较高的生物量。 

表1.菌株Sa-10和YSF5在不同培养温度下的生物量（菌体湿重，g/L） 

培养温度(℃)	Sa-10	YSF5
			30	50.47	42.06
35	49.12	27.88
			40	44.70	21.30

2）酵母菌的温度耐受分析 

取菌株YSF5和Sa-10分别接种到5ml YEPD液体培养基中，30℃、200rpm摇床培养18～20h。分别吸取0.5ml YSF5的培养液至5个装有4.5ml无菌水的大试管中，在70℃热水浴处理0s，15s，20s，25s和30s后（注意在水浴时要震荡，使培养基受热 均匀），然后将处理液进行稀释涂布，0s处理液涂布10^-5、10^-6、10^-7三个浓度，15s处理液涂布10^-2、10^-3、10^-4、10^-5四个浓度，其它处理涂布10^-2、10^-3、10^-4三个浓度，30℃培养24～48h。Sa-10的培养液用上述同样的方法进行处理，每个处理三次重复。分别统计各处理菌落数的平均值，并计算存活率：存活率=（处理组菌落数×稀释浓度×100）/（0s时的菌落数×稀释浓度），结果如表2所示。 

表2.菌株Sa-10和YSF5的温度耐受性分析结果 

表2的结果表明：与对照菌株YSF5相比，Sa-10的温度耐受性比较好。菌株Sa-10在70℃热水浴处理15S时存活率为88.1%，处理20S的存活率为0.5%；而YSF5在70℃热水浴处理15S存活率仅为0.001889%，明显低于Sa-10。 

2、耐酸特性 

将菌株YSF5和Sa-10分别在pH3.5、4.5、5.5、6.5和7.5的糖蜜液体培养基中30℃、200rpm培养24小时，每个处理3次重复，测定生物量（即每升培养液中的菌体湿重，g/L），结果如表3所示。 

表3.Sa-10与YSF5菌株在pH3.5-7.5培养条件下的生物量（菌体湿重，g/L） 

培养基pH值	Sa-10	YSF5
			3.5	35.40	23.78
4.5	35.89	27.00
			5.5	42.42	34.11
6.5	49.81	42.66
			7.5	49.05	30.22

结果表明，菌株Sa-10生物量在pH3.5到6.5之间逐渐增加，在pH5.5～7.5范围内生物量较高。同一pH值下，菌株Sa-10的生物量均明显高于YSF5的生物量，当pH值为3.5时，菌株Sa-10的生物量为35.40g/L，是YSF5的1.5倍。 

实施例3、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10CGMCC No.6120的液体发酵培养优化 

本实施中所用的种子培养基：溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的浓度为：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L和蛋白胨20g/L。 

一、发酵培养基中氮源的筛选 

1、无菌条件下取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10 CGMCC No.6120至含种子培养基的三角瓶中，30℃、200转/分钟，培养16～18小时；获得种子液； 

2、按照体积比为10%的接种量取步骤1的种子液，分别接种于含不同氮源的发酵培养基（编号分别为A、B、C、D）的三角瓶中，30℃、200转/分钟，发酵培养30小时，获得发酵液，每种发酵培养基同时做三个重复。 

发酵培养基：溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的浓度为糖蜜（去除不溶于水的杂质后发酵培养基中按糖浓度计为40g/L，硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氮源，pH为6.5；（注：去除不溶于水的杂质的方法：按照所述发酵培养基中糖浓度为40g/L，取适量的糖蜜加适量的自来水，煮沸处理15分钟，冷却，8000r/min，离心10分钟，取上清液作为发酵培养基的成分。） 

四种不同发酵培养基中的氮源及其在培养基中的浓度分别为： 

发酵培养基A：硫酸铵2g/L； 

发酵培养基B：尿素2g/L； 

发酵培养基C：硫酸铵1.5g/L，玉米浆0.5mL/L； 

发酵培养基D：尿素1.5g/L，玉米浆0.5mL/L。 

3、生物量测定 

用离心法测定步骤2不同发酵培养基获得的发酵液中酵母菌的生物量，结果如表4所示。结果表明，发酵培养基中的氮源为尿素1.5g/L和玉米浆0.5mL/L时所获得的 发酵液中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10的生物量较高，各重复间的平行性好，较稳定。 

 上述离心法测定生物量的具体方法如下（与步骤二、三和四中方法相同）： 

取发酵液在离心机上8000r/min、离心5min，倒掉上清液，称取残留在离心管底部的菌体重量，记录数据，计算生物量：生物量（干重，g/L）=[装有菌体的离心管重（g）-离心管重（g）]×1000×0.23/菌体液体积（mL），其中的0.23为菌体干湿比。 

表4.不同氮源发酵的生物量测定结果(干重，g/L) 

二、7升发酵罐发酵工艺参数优化 

1、流加培养基起始加入时间的确定（测定1.5%糖浓度生长曲线） 

1）无菌条件下取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10 CGMCC No.6120至含种子培养基的三角瓶中，30℃、200转/分钟，培养16～18小时；获得种子液； 

2）按照体积比为10%的接种量取步骤1）的种子液接种于含如下发酵培养基的7升发酵罐中进行发酵培养,每隔2小时监测发酵液的pH、溶氧、残糖量和细胞生物量，共发酵8小时，实验设三次重复，结果用平均值表示。 

发酵培养基：溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的浓度为糖蜜（去除不溶于水的杂质后发酵培养基中糖浓度为15g/L），硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氮源（尿素1.5g/L和玉米浆0.5mL/L），pH为6.5。 

发酵罐设定：30℃、转速300～800转/分钟，初期转速为400转/分钟，待溶氧下降至15%以下，增加转速，使溶氧量迅速达到15%以上，通气量5L—10L/min。 

3）实验结果：如表5所示。发酵过程中镜检观察细胞形态，细胞个体较大，呈现圆形或椭圆形，多数为双球状，可明显看到出芽生殖。结果表明，发酵至4小时，发酵液中的残糖量已降至0.16%，即此时可流加培养液。 

表5.Sa-10在1.5%糖浓度发酵培养基中的实验结果 

发酵时间（小时）	0	2	4	6	8
						pH	6.10	5.55	5.53	6.10	5.58

 

溶氧（%）	92.8	87.9	83.4	58.2	34.8
						残糖量（%）	1.41	1.09	0.16	0.09	0.11
生物量(干重，g/L）	0.76	2.21	4.48	5.41	7.40

2、发酵过程中pH值确定 

1）与步骤1中的1）相同。 

2）按照体积比为10%的接种量取步骤1）的种子液接种于含3.81L底糖培养基的7升发酵罐中进行发酵培养；发酵4小时后，采用380毫升/小时匀速流加流加培养基；调控每罐发酵液的pH分别为自然pH（发酵培养基初始pH调至6.5，然后在发酵过程中不加入任何酸碱来调控pH）、pH5.0、pH5.5、pH6.0和pH6.5共5种处理；在发酵过程中，每隔2小时监测发酵液的pH，溶氧，残糖量和细胞生物量，每种处理3次重复，结果用平均值表示。 

底糖培养基：溶剂为水，溶质及其在底糖培养基中的浓度为糖蜜（去除不溶于水的杂质后发酵培养基中糖浓度为15g/L），硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氮源（尿素1.5g/L和玉米浆0.5mL/L），pH为6.5； 

流加培养基：溶剂为水，溶质及其在流加培养基中的浓度为糖蜜（去除不溶于水的杂质后发酵培养基中糖浓度为120g/L），硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氮源（尿素1.5g/L和玉米浆0.5mL/L），pH为6.5，发酵罐中的添加体积为1.19L/罐。 

发酵罐设定：与步骤1中2）的相同。 

3）实验结果：如表6—10和图3所示，结果表明，在发酵过程中调控发酵pH不能加快酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10糖耗的速度和提高生物量，采用自然pH即可。 

表6.自然pH条件下的实验结果 

发酵时间（小时）	0	2	4	6	8	10
							pH	6.53	6.06	5.82	5.51	5.3	6.39
溶氧（%）	100	39	40	30	28.9	21.1
							转速（转/min）	200	200	200	200	200	609
残糖量（%）	1.78	1.53	0.92	1.39	0.48	0.30
							生物量（干重，g/L）	1.12	1.13	3.63	4.92	8.65	9.20
发酵时间（小时）	12	14	16	18	20	22
							pH	7.16	7.27	7.19	6.31	5.88	6.84
溶氧（%）	20.8	20.7	19.8	20.5	20.9	20.8

 

转速（转/min）	640	703	660	681	695	200
							残糖（%）	0.39	0.44	0.42	0.42	0.37
生物量(干重，g/L）	9.20	9.58	10.63	12.03	13.23	13.31

表7.pH恒定5.0条件下的实验结果 

发酵时间（小时）	0	2	4	6	8	10
							pH	5	5.04	4.99	5.03	5.18	5.04
溶氧（%）	100	42	38.2	29	28.5	18.3
							转速（转/min）	200	200	200	200	200	613
残糖（%）	1.67	1.54	0.91	1.46	0.47	0.46
							生物量（干重，g/L）	1.05	0.54	1.92	4.49	8.22	9.01
发酵时间（小时）	12	14	16	18	20	22
							pH	5.06	5.14	4.99	4.95	4.83	4.92
溶氧（%）	20.4	20.2	21	21.3	16.2	22.1
							转速（转/min）	672	648	722	727	300	200
残糖（%）	0.43	0.42	0.41	0.38	0.40
							生物量（干重，g/L）	8.93	9.56	11.38	13.02	13.35	13.34

表8.pH恒定5.5条件下的实验结果 

发酵时间（小时）	0	2	4	6	8	10
							pH	5.53	5.48	5.56	5.42	5.48	5.56
溶氧（%）	100	20	23.7	19.8	20.1	19.2
							转速（转/min）	200	200	311	474	373	671
残糖（%）	1.10	0.95	0.47	0.90	0.31	0.31
							生物量（干重，g/L）	0.14	0.81	2.36	4.43	6.63	7.71
发酵时间（小时）	12	14	16	18	20
							pH	5.49	5.51	5.48	5.5	5.48
溶氧（%）	21.2	20.3	20.3	20.5	19.8
							转速（转/min）	713	724	613	502	251
残糖（%）	0.28	0.16	0.14	0.11	0.10
							生物量（干重，g/L）	8.35	9.81	11.64	11.67	11.68

表9.pH恒定6.0条件下的实验结果 

发酵时间（小时）	0	2	4	6	8	10
							pH	5.87	5.93	5.95	5.86	5.93	5.93

 

溶氧（%）	100	20	18.4	21.8	20.3	18
							转速（转/min）	200	200	274	429	514	617
残糖（%）	0.96	0.93	0.48	0.94	0.32	0.32
							生物量（干重，g/L）	0.26	1.21	1.57	5.54	7.26	8.05
发酵时间（小时）	12	14	16	18	20
							pH	5.96	5.99	5.98	6.02	5.9
溶氧（%）	19	20.9	20.4	20.3	12.5
							转速（转/min）	671	730	625	519	225
残糖（%）	0.29	0.15	0.12	0.13	0.10
							生物量（干重，g/L）	8.68	9.98	12.94	13.03	13.01

表10.pH恒定6.5条件下的实验结果 

发酵时间（小时）	0	2	4	6	8	10
							pH	6.43	6.25	6.53	6.57	6.56	6.53
溶氧（%）	100	21.8	14.8	20.8	20.9	19.2
							转速（转/min）	200	330	361	587	674	776
残糖（%）	1.04	0.89	0.47	0.85	0.74	0.31
							生物量（干重，g/L）	0.09	1.11	2.47	4.96	7.20	7.22
发酵时间（小时）	12	14	16	18	20
							pH	6.47	6.5	6.53	6.52	6.44
溶氧（%）	17.2	14.8	14.6	17.4	19.8
							转速（转/min）	822	800	800	800	800
残糖（%）	0.32	0.14	0.13	0.11	0.10
							生物量（干重，g/L）	6.59	7.82	7.91	7.13	7.81

3、流加培养基流加速度的确定 

1）同步骤1中的1）； 

2）按照体积比为10%的接种量取步骤1）的种子液接种于含3L底糖培养基的7升发酵罐中进行发酵培养；每个罐均在发酵4小时后开始流加流加培养基，每个罐中的流加速度不同，流加时间不同，流加体积均为2.1L，流加速度为匀速，分别为150毫升/小时、200毫升/小时、250毫升/小时和300毫升/小时，流加时间相应为14小时、10.5小时、8.4小时和7小时。控制发酵液pH为自然pH（发酵培养基初始调pH至6.5，然后在发酵过程中不加入任何酸碱来控制pH）；在发酵过程中，每隔2小时监测发酵液的pH，溶氧，残糖量和细胞生物量。 

底糖培养基：与步骤2中2）的相同； 

流加培养基：溶剂为水，溶质及其在流加培养基中的浓度为糖蜜（去除不溶于水的杂质后流加培养基中糖浓度为240g/L），硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氮源（尿素1.5g/L和玉米浆0.5mL/L），pH为6.5。 

发酵罐设定：与步骤1中2）的相同。 

3）实验结果：如表11—14和图4所示，结果表明，在发酵过程中流加培养基的流加速度为200毫升/小时比较适合酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10的生长速度。 

表11.流加速度为150毫升/小时的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10
							pH	5.79	5.44	5.35	5.23	5．41	5.52
溶氧（%）	100	62.2	28.6	14.8	12，5	15.2
							转速（转/min）	400	400	400	508	573	629
残糖（%）	1.17	0.73	0.13	0.39	0.54	0.81
							生物量(干重，g/L)	0	0.44	2.09	5.62	9.71	14.27
发酵时间(小时)	12	14	16	18	20	22
							pH	5.53	5.50	5.51	5.65	5.83	6.47
溶氧（%）	11.8	9.3	6.9	3.2	2.2	15.0
							转速（转/min）	768	799	800	800	800	525
残糖（%）	0.85	0.95	1.04	1.25	1.12	1.13
							生物量(干重，g/L)	18.34	21.73	23.39	24.71	25.01	25.17

表12.流加速度为200毫升/小时的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10
							pH	5.69	5.35	5.26	5.25	5.27	5.54
溶氧（%）	100	77.0	19.2	15.9	13.9	15.2
							转速（转/min）	400	400	400	473	486	575
残糖（%）	1.16	0.77	0.14	0.84	1.11	1.6
							生物量(干重，g/L)	0.34	0.99	2.93	6.55	10.54	15.47
发酵时间(小时)	12	14	16	18	20	22
							pH	5.59	5.56	6.02	6.22	6.14	6.69
溶氧（%）	16.4	4.4	2.6	1.8	1.3	15.5

转速（转/min）	753	800	800	800	800	523
							残糖（%）	1.25	1.31	1.12	1.05	1.04	1.04
生物量(干重，g/L)	17.61	21.08	22.03	24.23	24.40	25.27

表13.流加速度为250毫升/小时的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10
							pH	5.82	5.66	5.60	5.49	5.20	5.03
溶氧（%）	100	90.8	45.8	16.2	15.7	15.0
							转速（转/min）	400	400	400	400	400	673
残糖（%）	1.16	0.76	0.15	1.09	1.33	1.67
							生物量(干重，g/L)	0	0.63	3.30	5.37	9.75	12.46
发酵时间(小时)	12	14	16	18	20	22
							pH	5.06	5.37	6.81	6.45	6.23	6.27
溶氧（%）	14.8	5.8	4.5	3.6	3.2	2.9
							转速（转/min）	800	800	800	800	800	800
残糖（%）	1.54	1.01	0.95	0.82	0.88	0.91
							生物量(干重，g/L)	14.24	14.91	15.21	19.26	18.94	18.78

表14.流加速度为300毫升/小时的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10
							pH	5.76	5.61	5.54	5.58	5.25	5.15
溶氧（%）	100	66.2	24.5	15.0	14.3	14.5
							转速（转/min）	400	400	400	400	400	674
残糖（%）	1.20	0.80	0.14	1.48	1.52	1.70
							生物量(干重，g/L)	0.64	1.47	4.14	5.52	10.93	12.90
发酵时间(小时)	12	14	16	18	20	22
							pH	5.24	5.50	6.61	6.43	6.39	6.52
溶氧（%）	13.5	6.0	4.9	3.7	3.3	2
							转速（转/min）	800	800	800	800	800	800
残糖（%）	1.35	1.04	0.88	0.95	0.93	0.95
							生物量(干重，g/L)	13.65	13.74	17.03	17.06	18.11	18.45

4、流加培养基碳氮比的确定 

1）同步骤1中的1）； 

2）按照体积比为10%的接种量取步骤1）的种子液接种于含底糖培养基的7升发酵罐中进行发酵培养；每个罐均在发酵4小时后开始流加流加培养基，不同发酵罐中的流加培养基的碳氮比不同，分别设置10、15、20、25四种处理，即流加培养基中的氮源组成分别为尿素18g/L和玉米浆6mL/L,尿素12g/L和玉米浆4mL/L，尿素9g/L和玉米浆3mL/L，尿素7.2g/L和玉米浆2.4mL/L；流加速度为匀速，200毫升/小时，流加10.5小时，控制发酵液pH为自然pH（发酵培养基初始调pH至6.5，然后在发酵过程中不加入任何酸碱来控制pH）；在发酵过程中，每隔2小时监测发酵液的pH，溶氧，残糖量和细胞生物量，每种处理三次重复，结果用平均值表示。 

底糖培养基：溶剂为水，溶质及其在底糖培养基中的浓度为糖蜜（去除不溶于水的杂质后发酵培养基中糖浓度为15g/L），硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氮源（尿素0.56g/L和玉米浆0.19mL/L），pH为6.5，发酵罐中的添加体积为3L/罐； 

流加培养基：溶剂为水，溶质及其在流加培养基中的浓度为糖蜜（去除不溶于水的杂质后发酵培养基中糖浓度为240g/L），硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氮源，pH为6.5，发酵罐中的添加体积为2.1L/罐。 

发酵罐设定：同步骤1中的2）。 

3）实验结果：如表15—18和图5所示，结果表明，在发酵过程中流加培养基中液碳氮比为15（即氮源组成为尿素12g/L和玉米浆4mL/L）时比较适合酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10生长。 

表15.流加培养基中碳氮比为10的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12
								pH	5.81	5.44	5.33	5.21	5.55	5.82	5.92
溶氧（%）	100	60.3	20.5	15.0	14.8	14.4	15.0
								转速（转/min）	400	400	400	453	505	702	780
残糖（%）	1.11	0.69	1.37	1.56	0.87	0.82	1.20
								生物量(干重，g/L)	0	0.84	2.98	6.28	11.17	12.16	14.99
发酵时间(小时)	14	16	18	20	22	24	26
								pH	5.96	6.09	6.86	6.95	7.16	--	7.16
溶氧（%）	9.1	5.5	3.6	3.0	2.5	2.5	14.5
								转速（转/min）	800	800	800	800	800	800	500
残糖（%）	1.41	1.42	1.43	1.33	1.11	1.09	1.01

 

生物量(干重，g/L)

17.42

20.91

21.64

22.21

21.83

23.31

23.36

表16.流加培养基中碳氮比为15的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12
								pH	5.80	5.46	5.22	5.17	5.48	5.71	5.69
溶氧（%）	100	57.7	18.3	14.4	14.9	14.9	10.4
								转速（转/min）	400	400	400	482	529	731	800
残糖（%）	1.13	0.69	1.29	1.58	0.89	0.91	1.03
								生物量(干重，g/L)	0.21	0.56	3.61	6.59	11.18	13.02	17.24
发酵时间(小时)	14	16	18	20	22	24	26
								pH	5.68	5.76	6.24	6.33	--	--	6.50
溶氧（%）	6.3	5.3	4.2	3.9	10	16	39.3
								转速（转/min）	800	800	800	800	800	800	400
残糖（%）	1.22	1.27	1.25	1.26	1.19	1.16	1.13
								生物量(干重，g/L)	20.05	25.86	22.98	25.09	24.86	24.39	24.12

表17.流加培养基中碳氮比为20的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12
								pH	5.82	5.74	5.73	5.35	5.78	5.93	6.05
溶氧（%）	100	64.6	27.7	24.6	15.3	12.9	9.8
								转速（转/min）	400	400	400	400	467	621	800
残糖（%）	1.13	0.78	1.32	1.13	1.41	1.14	1.18
								生物量(干重，g/L)	0.13	0.50	2.41	4.19	5.91	9.25	10.95
发酵时间(小时)	14	16	18	20	22	24	26
								pH	6.10	6.08	6.55	6.56	6.83	6.94	6.99
溶氧（%）	6.4	5.2	3.5	4.2	3.5	11.44	16.9
								转速（转/min）	800	800	800	800	800	576	421
残糖（%）	1.20	1.23	1.26	1.16	1.14	1.15	1.15
								生物量(干重，g/L)	13.94	16.70	19.66	20.84	22.70	23.13	23.05

表18.流加培养基中碳氮比为25的实验结果 

发酵时间(小时)

0

2

4

6

8

10

12

pH	5.99	5.74	5.73	5.81	5.77	6.03	6.19
								溶氧（%）	100	67.3	26.6	24.4	19.2	16.4	7.9
转速（转/min）	400	400	400	400	400	400	800
								残糖（%）	1.12	0.79	1.42	1.31	1.56	1.17	1.22
生物量(干重，g/L)	0.28	0.68	3.01	6.08	8.67	9.86	10.83
								发酵时间(小时)	14	16	18	20	22	24	26
pH	6.01	6.50	6.74	6.81	6.75	6.84	6.75
								溶氧（%）	6.5	4.2	2.1	3.9	6.2	13.5	32.2
转速（转/min）	800	800	800	800	800	600	600
								残糖（%）	1.25	1.18	1.24	1.15	1.09	1.08	1.08
生物量(干重，g/L)	12.22	15.46	18.21	19.06	19.89	19.97	19.90

5、流加培养基流加时间的确定 

1）同步骤1中的1）； 

2）按照体积比为10%的接种量取步骤1）的种子液接种于含底糖培养基的7升发酵罐中进行发酵培养；每个罐均在发酵4小时后开始流加流加培养基，不同发酵罐流加培养基的流加时间分别设置为5小时、6小时和7小时三种处理；流加速度为匀速，200毫升/小时，流加10.5小时，控制发酵液pH为自然pH（发酵培养基初始调pH至6.5，然后在发酵过程中不加入任何酸碱来控制pH）；在发酵过程中，每隔2小时监测发酵液的pH，溶氧，残糖量和细胞生物量，每种处理设三次重复，结果取平均值。 

底糖培养基：同步骤4中的2），pH为6.5，发酵罐中的添加体积为3L/罐； 

流加培养基：溶剂为水，溶质及其在流加培养基中的浓度为糖蜜（去除不溶于水的杂质后发酵培养基中糖浓度为240g/L），硫酸镁1g/L，氯化钙0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，氮源（碳氮比为15，组成为尿素12g/L和玉米浆4mL/L），pH为6.5。 

发酵罐设定：同步骤1中的2）。 

3）实验结果：如表19—22和图6所示，结果表明，在发酵过程中流加时间为6小时较适合酵母生长比较适合酿酒酵母（Saccharomyces oerevisiae）Sa-10生长。 

表19.流加时间为5小时的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12
								pH	5.95	5.52	5.65	5.51	5.56	6.24	6.98
溶氧（%）	100	49.4	35.4	15.2	14.2	14.6	14.9
								转速（转/min）	400	400	400	433	553	762	772
残糖（%）	1.18	0.69	1.35	1.43	1.56	0.87	0.97

生物量(干重，g/L)	0.27	1.99	4.47	9.31	12.55	13.32	13.86
								发酵时间(小时)	14	16	18	20	22	24
pH	7.02	6.91	6.44	7.2	7.41	7.52
								溶氧（%）	8.5	14.6	9	44.4	65.2	69.3
转速（转/min）	800	784	800	400	400	400
								残糖（%）	0.98	0.95	0.80	0.64	0.62	0.51
生物量(干重，g/L)	13.97	15.12	16.66	17.78	19.87	19.87

表20.流加时间为6小时的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12
								pH	5.84	5.51	5.38	5.59	5.5	5.51	5.9
溶氧（%）	100	93.8	58.1	13.4	15	14.3	16.3
								转速（转/min）	400	400	400	501	496	590	744
残糖（%）	1.31	0.90	0.50	0.80	1.59	1.48	1.32
								生物量(干重，g/L)	0.19	1.29	3.05	6.75	8.51	12.43	15.09
发酵时间(小时)	14	16	18	20	22	24	26
								pH	6.84	7.13	6.82	6.78	7.82	7.98	8.09
溶氧（%）	8.1	5.2	3.3	4.6	45.3	44	58.6
								转速（转/min）	800	800	800	800	400	400	400
残糖（%）	1.18	1.10	0.85	0.80	0.83	0.82	0.82
								生物量(干重，g/L)	17.84	19.34	19.99	23.69	22.32	22.55	22.38

表21.流加时间为7小时的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12
								pH	5.87	5.68	5.54	5.8	5.74	5.5	5.58
溶氧（%）	100	93.9	50.9	14.3	15.1	14.6	15.6
								转速（转/min）	400	400	400	436	473	558	592
残糖（%）	1.28	0.85	0.54	0.78	1.56	1.36	1.17
								生物量(干重，g/L)	0.41	1.12	2.90	2.27	7.97	11.78	13.20
发酵时间(小时)	14	16	18	20	22	24	26
								pH	6.14	6.4	6.66	6.71	6.74	6.61	7.22
溶氧（%）	10	5.4	4.2	2.5	4.4	4.2	12.4
								转速（转/min）	800	800	800	800	800	800	404
残糖（%）	1.20	1.08	1.06	0.93	0.86	0.84	0.83

生物量(干重，g/L)

15.16

17.04

17.25

19.84

21.20

23.31

23.53

表22.三种不同流加时间的糖的消耗和菌体的转化率统计结果 

注：此处的数值发酵26小时的测定结果。 

本实施例步骤二的上述结果表明，在7L发酵罐中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10的最优发酵条件为发酵过程中自然pH，流加培养基的流加速度为200毫升/小时，流加培养基的碳氮比为15，流加培养基的流加时间为6小时。 

三、20升发酵罐发酵工艺参数优化 

在步骤二7升的最优发酵条件基础上，在使用20升发酵罐发酵酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10扩大培养时共设置三种方案，每个方案中在流加培养基起始加入时间、流加速度和流加时间三个参数值上不相同（如表23所示），其它具体操作步骤如下： 

1）同步骤二中1中的1）； 

2）按照体积比为10%的接种量取步骤1）的种子液接种于含底糖培养基9升的20升发酵罐中进行发酵培养； 

底糖培养基：同步骤二中4中的2）； 

流加培养基：同步骤二中5中的2）； 

发酵罐设定：30℃，转速200～600rpm，初期转速为300rpm，待溶氧下降至15%以下，增加转速，使溶氧量迅速达到15～20%，通气量15～20L/min； 

在发酵过程中，每隔2小时监测发酵液的pH，溶氧，残糖量和细胞生物量。 

结果如表24-26和图7所示（各方案均设三次重复，结果取平均值）。结果表明：方案Ⅱ的比较适宜酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10的发酵。 

表23.20升发酵罐的不同发酵方案的参数组合 

	流加培养基起始加入时间	流加速度	流加时间	流加培养基体积
					方案Ⅰ	发酵后3小时	600毫升/小时	6小时	3.6升/罐
方案Ⅱ	发酵后5小时	600毫升/小时	5小时	3.0升/罐
					方案Ⅲ	发酵后4小时	550毫升/小时	5小时	2.75升/罐

 表24.发酵方案Ⅰ的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12
								pH	6.64	6.18	5.85	5.54	5.23	5.51	6.73
溶氧（%）	100	15	21.4	13.9	14.1	11.1	13.8
								转速（转/min）	300	328	410	482	534	538	597
通气量（L/min）	5	5	5	5	5	5	10
								残糖（%）	1.41	1.04	1.79	2.06	1.45	1.15	1.15
生物量(干重，g/L)	0.00	1.73	4.25	8.56	11.65	13.39	13.39
								发酵时间(小时)	14	16	18	20	22	24	26
pH	6.79	6.99	6.87	6.57	6.48	6.39	7.51
								溶氧（%）	10.3	3.9	3.1	2.8	2.7	2.7	15
转速（转/min）	600	600	600	600	600	600	392
								通气量（L/min）	10	15	15	15	15	15	5.2
残糖（%）	1.18	1.14	1.13	1.01	0.83	0.78
								生物量(干重，g/L)	16.45	16.59	17.87	18.72	20.37	21.05	22.97

表25.发酵方案Ⅱ的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12	14
									pH	6.38	5.87	5.95	5.49	5.27	5.63	6.89	7.46
溶氧（%）	96	15.8	13.9	14.2	13.5	14	12.5	12.4
									转速（转/min）	300	300	396	462	493	540	600	600
通气量（L/min）	10.2	10.2	10.2	10.2	10.2	10.2	12	16.9
									残糖（%）	1.29	0.68	0.15	0.79	1.19	1.51	1.59	1.30
生物量(干重，g/L)	1.33	2.60	4.50	6.29	10.29	13.31	14.43	17.07
									发酵时间(小时)	16	18	20	22	24	26	28
pH	7.34	6.85	7.72	8.25	8.4	8.2	8.6
									溶氧（%）	5.6	5.6	15	15	15.9	15	15.1
转速（转/min）	600	600	400	395	384	370	370
									通气量（L/min）	17	20	10.2	10.2	10.2	10.2	10.2
残糖（%）	1.17	1.14	0.97	0.81	0.72	0.61
									生物量(干重，g/L)	18.53	19.87	20.27	20.79	21.98	23.05	27.60

表26.发酵方案Ⅲ的实验结果 

发酵时间(小时)	0	2	4	6	8	10	12	14
									pH	6.12	5.58	5.9	5.52	5.46	6.04	6.68	7.15
溶氧（%）	100	15	14	13.8	13.2	10	7.9	7.2
									转速（转/min）	300	300	326	424	483	500	500	500
通气量（L/min）	10	10.1	16.9	18	18.8	17.9	17.8	17.4
									残糖（%）	1.15	0.51	0.15	0.95	1.09	0.99	0.98	0.97
生物量(干重，g/L)	1.44	3.79	4.84	8.35	14.26	16.83	17.89	17.90
									发酵时间(小时)	16	18	20	22	24	26	28
pH	7.22	7.33	7.38	7.59	7.63	8.31	8.29
									溶氧（%）	7.2	6.8	6.6	6.5	6.6	15.5	15.4
转速（转/min）	500	500	500	500	500	419	331
									通气量（L/min）	17.2	20	20	20	20	17.9	16.4
残糖（%）	0.99	0.89	0.70	0.59	0.63	0.64
									生物量(干重，g/L)	17.72	19.77	20.28	20.31	19.94	20.73	20.56

表27.三种方案的结果比较 

注：表中的数值是发酵26小时的测定结果。 

四、40升发酵罐发酵工艺参数优化 

发酵方法与步骤三中的方案Ⅱ相同，具体如下： 

1）同步骤二中1中的1）； 

2）按照体积比为10%的接种量取步骤1）的种子液接种于含底糖培养基18升/罐的40升发酵罐中进行发酵培养； 

底糖培养基：同步骤二中4中的2）； 

流加培养基：同步骤二中5中的2）； 

发酵罐设定：30℃，转速200～600rpm，初期转速为300rpm，待溶氧下降至15%以下，增加转速，使溶氧量迅速达到15～20%，通气量15～30L/min； 

流加培养基的流加速度为1200毫升/小时，在发酵4小时后开始流加，流加5小时，流加培养基的流加体积为6升/罐； 

在发酵过程中，每隔2小时监测发酵液的pH，溶氧，残糖量和细胞生物量。结果如表27所示。结果表明：Sa-10在40L发酵罐的实验条件能够重复其在20L发酵罐的实验结果。 

表27.40升发酵罐发酵的实验结果 

实施例4、固体发酵制备酿酒酵母制剂 

1、固体发酵制备酿酒酵母制剂 

按照每1千克玉米芯粉混合物（玉米芯粉、玉米粉和豆粕粉的质量比为72:18:10）添加1.4升实施例3中步骤四的发酵液，将二者混合后密封，30～45℃下发酵48小时，收集所有发酵产物进行烘干处理，得到含水量为8%的酿酒酵母制剂。 

2、活菌数测定 

取步骤1获得的酿酒酵母制剂，常温下放置24小时后，采用稀释涂布法测定活菌数，以市场上同类产品（万饲特—活性酵母培养物，购自美国西方酵母股份有限公司， 生产日期为2012年05月12日）为对照，结果如表28所示。 

上述稀释涂布法测定活菌数的具体步骤如下： 

取待测样品0.5g，与5毫升无菌水混合后，取上清液0.1mL进行10倍的逐级稀释，分别取浓度为10^-6、10^-7和10^-8的稀释液0.1mL，均匀涂布于YEPD固体培养基上，30℃黑暗条件下培养48小时，统计菌落数，计算每克样品中的活菌数。 

表28.酿酒酵母制剂活菌数 

待测样品	亿/g
		步骤1获得的酿酒酵母制剂	5
对照	2

实施例5、本发明酿酒酵母制剂对断奶仔猪生长的影响 

1、实验方法 

试验选用健康且体型大小相近的断奶仔猪120头，随机分成4组，每组三个重复，每个重复10头，公母各半，单栏饲养每个重复仔猪。 

对4组仔猪分别饲喂如下四种不同的日粮： 

负对照组：基础日粮； 

正对照组：基础日粮中添加抗敌素20mg/kg和吉他霉素20mg/kg； 

试验1组：基础日粮中添加重量比为0.2%的实施例4制备得到的酿酒酵母制剂； 

试验2组：基础日粮中添加重量比为0.5%的实施例4中的对照； 

上述基础日粮的配置如表29-1~3所示； 

实验期19天，试验期间自由采食和饮水，按猪场常规程序进行消毒、驱虫和免疫。统计各重复平均每头仔猪的初始体重（kg）、结束体重（kg）、增重（kg）、日增重（g/头）、日采食量（g/头）、料肉比及腹泻指数；其中，腹泻指数=（腹泻仔猪累计腹泻天数÷全组仔猪累计饲养天数）×100%。 

表29-1.基础日粮的配置 

表29-2.基础日粮中的维生素水平 

VA	13160IL/kg	B1	2.8mg/kg	烟酰胺	34mg/kg
						VD	2800IU/kg	B2	7.0mg/kg	泛酸钙	14mg/kg
VE	28IU/kg	B6	2.8mg/kg	叶酸	1.4mg/kg
						VK	2.8mg/kg	B12	0.03mg/kg	生物素	0.14mg/kg
VC	98mg/kg

表29-3.基础日粮中的微量元素水平(mg/kg) 

Fe	90	I	0.4
				Cu	72	Se	0.3
Zn	67.5	Cr	0.2
				Mn	25

表30.不同日粮对仔猪生长的影响 

组别	负对照组	正对照组	试验1组	试验2组
					初始体重(kg)	10.39	9.85	9.75	10.04
结束体重(kg)	17.76	17.57	17.79	17.78
					增重(kg)	7.37	7.72	8.04	7.73
日增重(g/头)	388	406	423	407
					日采食量(g/头)	648	711	726	698
料肉比	1.67	1.75	1.71	1.72
					腹泻指数	2.71	4.79	1.88	3.75

2、实验结果 

如表30所示。结果表明，试验1组(即饲喂添加了实施例4制备得到的酿洒酵母制剂的基础日粮)仔猪的日增重分别比负对照组、正对照组和试验2组提高9.02％、 4.19%、3.95%，日采食量分别比负对照组、正对照组、试验2组提高12.04%、2.11%、4.01%，腹泻指数明显低于其它各组，料肉比与其它各组没有显著差异。 

Claims (10)

1.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.6120。 

2.一种酿酒酵母制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分为权利要求1所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10。 

3.一种酿酒酵母制剂的制备方法，包括用权利要求1所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10进行液体发酵后，收集发酵液，再用所述发酵液进行固体发酵，收集所有固体发酵的产物烘干，获得所述酿酒酵母制剂。 

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述用权利要求1所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10进行液体发酵包括将权利要求1所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10接种于种子培养基中，30℃、200转/分钟振摇培养16～18小时，获得种子液；再将所述种子液按照体积比1:10的量接种于发酵培养基A中进行第一次液体发酵，再加入发酵培养基B进行第二次液体发酵，收集发酵液； 

所述发酵培养基A和所述发酵培养基B的溶剂为水，溶质由碳源、氮源和无机盐组成； 

所述碳源为糖蜜，所述糖蜜按糖浓度计在所述发酵培养基A中的浓度为15g/L；所述糖蜜按糖浓度计在所述发酵培养基B中的浓度为240g/L； 

所述氮源为尿素和玉米浆；所述尿素和所述玉米浆在所述发酵培养基A中的浓度分别为0.56g/L和0.19mL/L；所述尿素和所述玉米浆在所述发酵培养基B中的浓度分别为12g/L和4mL/L； 

所述无机盐为硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾，所述硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾在所述发酵培养基A中的浓度分别为1g/L、0.1g/L和1g/L；所述硫酸镁、氯化钙和磷酸二氢钾在所述发酵培养基B中的浓度分别为1g/L、0.1g/L和1g/L； 

所述发酵培养基A和所述发酵培养基B的pH值为6.5。 

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述固体发酵是将所述发酵液按照每1.4升所述发酵液与1千克质量比为72:18:10的玉米芯粉、玉米粉和豆粕粉的混合物混合后进行的。 

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述第一次液体发酵的时间为4—5小时，所述第二次液体发酵的时间为21—22小时； 

所述加入发酵培养基B的体积为所述发酵培养基A体积的1/3—2/5,所述加入发酵培养基B的方式为连续匀速加入5—6小时。 

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述液体发酵的发酵条件为：温 度为30℃，转速为300—800转/分钟，通气量为5—30升/分钟； 

和所述固体发酵的发酵条件为：温度为30～45℃，时间为48小时。 

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的浓度分别为：葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L和蛋白胨20g/L。 

9.权利要求3-8中任一所述方法制备得到的酿酒酵母制剂。 

10.权利要求1所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sa-10、权利要求2或9所述制剂的下述至少一种用途： 

1）提高动物的采食量； 

2）提高动物体重的增加量； 

3）制备降低动物腹泻指数的产品； 

4）制备提高动物生产性能的产品； 

所述动物为猪。 

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