CN104087529A - 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）JY2CGMCCNo.9150。通过从自吉尔吉斯共和国奥什赛马场一处冬小麦田(N72°50’70.01”E40°26’51.73”)土样中取样，分离、筛选、生理生化鉴定，确定该菌种本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）JY2CGMCCNo.9150对抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌中获得良好的应用效果,并在饲用微生态制剂中应用得到显著的技术效果，在饲料添加剂产业方面具有广泛的应用前景。

Description

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)JY2及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌种及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种短小芽孢杆菌及其应用的技术领域落。

背景技术

作物秸秆是农作物生产系统中一项重要的生物资源，也是当今世界上仅次于煤炭、石油和天然气的第四大能源。据不完全估计，全世界每年可产生近20～30×10⁸t秸秆，而我国农作物秸秆年产量达5.560×10⁸t，居世界之首，并以玉米、小麦和稻谷秸秆为主，占总秸秆产量的80％。由于含有植物光合作用所积累的一半以上的能量，秸秆富含粗糖、粗蛋白质等有利于家畜家禽所需的成分，作为非竞争性的饲料资源，只要能够进行合理的加工调制，提高其消化能的摄人量，用来饲喂畜禽，特别是用来饲喂牛、羊等反刍家畜，将成为优质的饲料资源。但目前用作饲料的秸秆不足10％，绝大部分仍直接还田或作燃料用，不但造成了资源的浪费，也使大量烟尘散发于空气之中，严重污染空气环境。同时，我国又是一个饲料，尤其是蛋白质饲料严重短缺的大国，每年需进口大量的鱼粉以弥补蛋白质饲料的不足。能否将秸秆纤维转化为动物可利用且营养价值高的蛋白质饲料，以解决饲料需求的严重不足，就显得尤为重要。

微生物目前已广泛应用于饲料的生产中，通过微生物发酵，可增加饲料中蛋白质的含量，降解霉菌毒素，提高营养物质的消化吸收率；有益微生物在动物肠道内定植，又能维持动物肠道的微生态平衡、提高其免疫力。有益微生物在饲料生产及养殖业中具有广泛的应用前景。

在饲料生产的原料中，往往含有一定量的木质素、纤维素、半纤维素、淀粉、蛋白质、脂肪等大分子物质，这些物质进入动物消化道后，必须经过一系列酶的分解作用，才可被机体吸收利用。虽然动物的消化系统能够分泌淀粉酶、胃蛋白酶、胰脂酶、蔗糖酶、乳糖酶、麦芽糖酶等，但是仅依靠这些内源性酶，动物对饲料的利用能力是有限的。特别是对于幼龄畜禽，内源消化酶分泌不足，直接阻滞其正常的生长发育。而微生物酶作为外源酶可对动物消化道酶的不足或缺失给予合理补充，由此促进动物对养分的消化、吸收，提高饲料的利用率。绝大多数饲料用酶可由某些细菌、曲霉菌和其它酵母菌分泌产生，因而许多学者建议在畜牧业中将外源性酶添加到饲料中，以扩大可利用饲料资源范围，改善养殖生态环境。

有研究表明，仔猪胃肠道的消化酶活性随着年龄增长而增长，但断奶对消化酶的活性增长趋势有倒退的影响，在第4周至断奶后1周内各种消化酶活性降低到断奶前水平的1/3。这时的肠道消化生理功能不适应高淀粉、高蛋白的饲料日粮，引起胃肠机能紊乱，易诱发腹泻发生，同时脂肪酶活性低也是诱发腹泻原因之一，如果在仔猪饲料日粮中加入外源性淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶来补充内源性酶分泌不足，可以改善消化，减轻腹泻。其中蛋白酶的作用是将组成蛋白的大分子多肽水解成寡肽或氨基酸，淀粉酶的作用是将大分子淀粉水解成寡糖、极限糊浆和葡萄糖。酯酶、脂肪酶可将天然油脂分解，最终产物为单酸苷油脂、脂肪酸。

非淀粉多糖在目前常用的原料中是比重非常大的组分，并且其木聚糖、阿拉伯聚糖、葡聚糖、乳糖和甘露聚糖半纤维组分是非淀粉多糖具有很多抗营养作用的主要原因。纤维素酶能破除植物细胞壁，使细胞内容物充分释放出来，从而被单胃动物肠道吸收。木聚糖酶能水解水溶性木聚糖，可有效降低动物肠道中食糜粘度，有利于内源消化液充分和食糜混合，充分消化，利于营养物的吸收提高饲料的利用率及能量，降低料重比。甘露聚糖酶能有效地分解饲料中的甘露聚糖生成甘露寡糖等物质，虽然甘露寡糖不能直接被动物机体吸收，但可参与机体的神经内分泌，影响代谢。因此非淀粉多糖酶的添加不仅能提高饲料的能量利用率，还可有效阻断细菌和寄生虫对肠道的侵袭，提高动物健康水平，从而增加养殖业的经济效益。

由于饲料成分复杂，饲用微生物酶制剂的研制首先要注意选用的微生物应不产生毒素、激素或其它有害物质，还要注意添加复合酶效果比单一酶好，即尽量采用集多种酶于一身的微生物进行生产。目前，我国秸秆利用率还很低，开发研究潜力很大，随着微生物在饲料工业中得到越来越广泛的重视和应用，微生物发酵秸秆技术将对进一步提高畜牧业的生产水平，推动绿色食品生产技术的发展具有重要意义。

发明内容

针对目前国内外现有技术中短小芽孢杆菌作为饲用微生态制剂和酶制剂的应用现状，本发明旨在提供一种新的短小芽孢杆菌及其作为饲用微生态制剂和酶制剂的应用，所述的短小芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙门氏菌都有一定的抑制作用，将其接种到玉米秸秆饲料中进行发酵，可显著增加饲料中蛋白和粗脂肪含量，降低其中粗纤维含量，通过代谢表达，表明所提供的短小芽孢杆菌在蛋白酶、纤维素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶生产领域具有广泛的应用前景，这些特性明显区别于已公开报道的其他短小芽孢杆菌有效种，具有广泛的应用价值。

本发明采用的主要技术方案：

本发明从吉尔吉斯共和国奥什赛马场一处冬小麦田中取样(N 72°50’70.01”E 40°26’51.73”)，分离筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出一株编号为JY2的菌株，参照《伯杰氏细菌分类鉴定手册》(7th edition)和东秀株编著的《常见细菌分类鉴定手册》中的方法进行温度和pH值、发酵类型、代谢底物、营养依赖型等方面对JY2菌株进行形态学，生理生化鉴定，进一步依据分子生物学分类规则，将这种新型的JY2菌株命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。该菌株于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101, 保藏日期是2014年05月13日，保藏号是CGMCC No.9150；该菌株革兰氏阳性，杆状、不运动、兼性好氧且产棒状孢子，拥有比较宽的酸碱耐受范围（pH4.0－11.0），生长温度范围为10-50℃，最适温度是37℃，生长不需NaCl，对盐耐受最高可达10%，凝胶液化试验、柠檬酸盐利用试验，接触酶和氧化酶试验均呈现阳性，可利用L-阿拉伯糖、D－甘露醇、D－木糖，水解淀粉试验、VP试验、吲哚产生试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、甲基红试验均呈阴性，不发生硝酸和亚硝酸还原，不降解D-葡萄糖。

本发明通过总DNA的提取、16S rRNA基因的PCR扩增和测序，根据测序结果，用Blast搜索软件从本领域常见GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关芽孢杆菌菌株的16S rRNA基因序列，用CLUSTAL X 进行多序列比对，并采用 Saitou和Nei 的邻接法（Neighbor Joining）用MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建和同源性比较。经测定，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150 的16s rRNA基因序列为1485bp，其序列与本领域常见的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）存在差异。

通过对上述菌种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2生理生化分析及16SrRNA同源分析、系统发育分析结果，将纯化的菌株JY2进行系统进化树的构建及多样性分析，与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）同源性最高，将菌种编号为JY2的菌株鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

本发明进而提供短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150的分离和培养方法。

1. 分离培养基采用LB培养基:蛋白胨 10g ，酵母膏/粉 5g ，NaCl 10g ，琼脂 17g，蒸馏水1000mL pH自然。

2. 分离和筛选条件：

(1)样品采集：土壤样品采自吉尔吉斯共和国奥什赛马场一处冬小麦田(N 72°50’70.01”E 40°26’51.73”)，随机选取多处深度为3 cm-20cm的土壤样品，混匀后装入无菌容器内，车载冰箱运至实验室，4°C保存备用。

 (2)菌种筛选，纯化及生理生化特性

依据梯度稀释法，称取10g土壤样品于90mL无菌生理盐水中，37°C活化30min后进行梯度稀释，选取10^-2、10^-3、10^-4稀释液分别涂布于LB培养基，每个处理3个重复，置37°C培养;待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落。

经培养筛选确定的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150存在不透明型和半透明型两种不同的菌落形态，不透明菌落呈浅黄色，扁平，边缘整齐无褶皱，在传代过程中可产生少许的半透明菌落，且在后续转接过程中半透明型菌落可消失。该菌株革兰氏阳性，杆状、不运动、兼性好氧且产棒状孢子，拥有比较宽的酸碱pH耐受范围（pH4.0－11.0），生长温度范围为10-50℃，最适温度是37℃，生长不需NaCl，对盐耐受最高可达10%，凝胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、卵磷脂酶试验、接触酶和氧化酶试验均呈现阳性，可利用L-阿拉伯糖、D－甘露醇、D－木糖，水解淀粉试验、VP试验、吲哚产生试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、甲基红试验均呈阴性，不发生硝酸和亚硝酸还原，不降解D-葡萄糖。

通过体外抑菌性能检测，所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150对致病性大肠杆菌和沙门氏菌都有明显的抑制作用。表明本发明提供的的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150在对抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌中获得良好的应用效果。

将短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150接种到玉米秸秆饲料中进行发酵，结果表明饲料中蛋白和粗脂肪含量显著增加，粗纤维含量显著降低。表明本发明的提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150在饲用微生态制剂中应用得到显著的技术效果。

同时，本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150在蛋白酶、纤维素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶方面具有良好的代谢表达，可广泛用于蛋白酶、纤维素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶生产领域，该菌种生长迅速、发酵周期短的特点，在饲料添加剂产业方面具有广泛的应用前景。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：

本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150对致病性大肠杆菌和沙门氏菌都有一定的抑制作用；将其接种到玉米秸秆饲料中进行发酵，可显著增加饲料中蛋白和粗脂肪含量，降低其中粗纤维含量；具有蛋白酶、纤维素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶阳性，木聚糖酶、α-淀粉酶阴性，可广泛用于蛋白酶、纤维素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶生产领域，可见，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150在饲料添加剂领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1所示为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150在LB培养基上的菌落形态图。

图2所示为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150系统发育树状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，当然，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。

本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：

培养基选用：蛋白胨 10g ，酵母膏/粉 5g ，NaCl 10g ，琼脂 17g，蒸馏水1000mL pH自然。

主要仪器与试剂：MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-1F B型单人双面净化工作台，E360K离心机，恒温摇床HWY-100。PCR仪 Eppendorf No:5345，电泳仪Bio-Rad Mode 200/2.0，凝胶成像仪United-Bio,GK-330C plus，PCR预混液(TaKaRa Biotechnology)，其余试剂均为分析纯。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150的分离、筛选

1. 分离：本发明所述的短小芽孢杆菌JY2分离于吉尔吉斯斯坦共和国奥什赛马场一处冬小麦田(N 72°50’70.01”E 40°26’51.73”)，随机选取农田中多处深度为3cm-20cm的土壤样品，混匀后装入无菌容器内，车载冰箱运至实验室，采用平板稀释涂布法，分离获得一株短小芽孢杆菌，编号为JY2。

分离步骤：依据梯度稀释法，称取10g土壤样品于90mL无菌生理盐水中，30°C活化30min后进行梯度稀释，选取10^-2、10^-3、10^-4稀释液涂布于LB琼脂培养基平板，每个处理3个重复，置37°C培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于新的分离培养基直至无杂菌落。将纯化后的菌株一部分采用冻干物安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4°C直接用于后续研究。 

2. 培养条件：培养基：LB琼脂培养基采用为，蛋白胨 10g ，酵母膏/粉 5g ，NaCl 10g ，琼脂 17g，蒸馏水1000mL pH自然，121°C 灭菌20分钟。

3．繁殖;用接种针取少量菌丝于LB琼脂培养基，37℃培养18h后形成中等大小菌落，JY2菌种存在不透明型和半透明型两种不同的菌落形态，不透明菌落呈浅黄色，扁平，边缘整齐无褶皱，在传代过程中可产生少许的半透明菌落，且在后续转接过程中半透明型菌落可消失。

4.菌种生理生化表型:本发明所述的该菌株革兰氏阳性，杆状、不运动、兼性好氧且产棒状孢子，拥有比较宽的酸碱耐受范围（pH4.0－11.0），生长温度范围为10-50℃，最适温度是37℃，生长不需NaCl，对盐耐受最高可达10%，凝胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、卵磷脂酶试验、接触酶和氧化酶试验均呈现阳性，可利用L-阿拉伯糖、D－甘露醇、D－木糖，水解淀粉试验、VP试验、吲哚产生试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、甲基红试验均呈阴性，不发生硝酸和亚硝酸还原，不降解D-葡萄糖。短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No. 9150与菌株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）KT 1012的生理生化特性比较结果见表1.

表1：短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2的生理生化表型

特性	Bacillus pumilus JY2	Bacillus pumilus  KT 1012	特性	Bacillus pumilus XJU-13	Bacillus pumilus KT 1012
						G+	＋	＋	苯丙氨酸脱氨酶	－	－
细胞直径﹥1.0μm	－	－	卵黄卵磷脂酶	＋	+
						芽孢圆形	－	－	木聚糖酶	－	ND
孢囊膨大	－	－	酯酶	＋	+
						伴胞晶体	－	－	硝酸盐还原	－	-
接触酶	＋	＋	形成吲哚	－	-
						氧化酶	＋	－	需要NaCl和KCl	－	-
厌氧生长	－	－	pH	pH4.0-11.0	pH4.0-11.0
						V-P测定	－	－	生长NaCl:
产酸：D－葡萄糖	－	－	5%	＋	+
						L-阿拉伯糖	＋	＋	7%	＋	+
D－木糖	＋	＋	10%	＋	ND
						D-甘露醇	＋	＋	生长温度：
葡萄糖产气	－	－	5℃	-	-
						水解：明胶	＋	＋	10℃	＋	+
淀粉	－	－	50℃	＋	ND
						柠檬酸盐利用	＋	＋	55℃	-	-

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2CGMCC No. 9150菌落形态图参见附图1。

实施例二：短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No. 9150的序列测定及系统发育分析

1. DNA提取：采用CTAB/NaCl法提取JY2基因组DNA。 将菌株接种于LB培养基（蛋白胨 10g ，酵母膏/粉 5g ，NaCl 10g ，琼脂 17g，蒸馏水1000mL pH自然，121°C 灭菌20分钟。），37℃震荡培养过夜。取1.5ml培养物12000rpm离心2min。沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。

加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直至DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇。TE溶解得到DNA。

2. 16S rRNA基因扩增及测序

用细菌16S rRNA基因通用引物进行扩增：

正向引物27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', 

反向引物1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 

PCR 扩增反应体系为50 μL，反应条件为：95°C，5 min；95°C，45 S，57°C， 30 S，72°C，90S，30Cycles； 72°C，7min。扩增产物(约 1500 bp)，PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物进行测序，将菌株JY2进行16S rRNA序列测定，经测定，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus） JY2  CGMCC No. 9150的16s rRNA基因序列为1485bp，参见附后提供的基因序列表：SEQUENCE LISTING。

3. 16S rRNA 序列比对及系统发育分析

本发明通过总DNA的提取、16S rRNA基因的PCR扩增和测序。根据测序结果，用Blast搜索软件从GenBank、EMBL等数据库中调出相似性较高的相关芽孢杆菌菌株的16S rRNA基因序列，用CLUSTAL X 进行多序列比对，其序列与本领域常见的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）存在明显差异，采用 Saitou和Nei 的邻接法（Neighbor Joining）用MEGA 5.0软件进行系统进化树的构建。结果参见附图2所示，从树状图附图2中可以看出，该菌株与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）在同一分支，表明二者的亲缘关系最近，比对结果表明JY2与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）ML477、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）MVIT06同源性最高，但是两者之间存在明显的分支和差异，依据微生物分类方法，将菌种编号为JY2菌株初步鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

实施例三：短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No. 9150的抑菌性能检测

将猪大肠杆菌1565、金黄色葡萄球菌作为指示菌进行体外抑菌性能检测。各取0.5ｍＬ大肠杆菌、沙门氏菌及短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2菌液，同时接种于５ｍＬ普通肉汤培养基中，并分别取0.5ｍＬ大肠杆菌和沙门氏菌菌液接种于同样的普通肉汤培养基作为对照组培养。37℃振荡培养18h后采用梯度稀释进行CFU法计数。结果表明，JY2与大肠杆菌共培养后，活菌数比单一接种大肠杆菌减少16.00%；JY2与沙门氏菌共培养后，活菌数比单一接种沙门氏菌减少11.91%。因此，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2对致病性大肠杆菌和沙门氏菌都有明显的抑制作用，可见本发明提供的的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150在对抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌中具有良好的应用效果。

实施例四：短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No. 9150用于改善饲料品质的特性检测

1.短小芽孢杆菌 CGMCC No.4756接种于 LB 液体培养基 37℃好氧培养 12h，调整其菌体浓度达到 1×10⁸，将上述菌液按照 5％的接种量接种于粉碎后的未经灭菌的玉米秸秆中进行发酵12天，以接种量相同的无菌水接种到发酵饲料中作为空白对照。取一定量样品烘干，用无菌水溶解，进行稀释平板菌落计数分析。结果表明，短小芽孢杆菌CGMCC No.4756活菌数达到4.0×10¹⁰cfu/g，且发酵饲料瓶中散发出酸香的气味。

2.将步骤 1中发酵12天的饲料烘干进行粗蛋白、粗纤维素含量检测，粗蛋白检测方法依据 GB/T 6432-1994，粗脂肪检测方法依据GB/T6433-2006，粗纤维检测方法依据 GB/T 6434-2006，还原糖检测方法依据GB/T5009.7-2003。结果表明，与对照相比，蛋白含量由原来的 3.15％增加到 5.24％，粗脂肪含量由原来的 1.01％增加到1.43％，粗纤维含量由 32.21％降至 25.56％，还原糖含量由原来的1.83%升至2.15%，接种短小芽孢杆菌的发酵饲料中蛋白、粗脂肪含量显著增加，粗纤维含量显著下降。因此，短小芽孢杆菌CGMCC No.4756具有改善饲料品质的优良性能,表明本发明的提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150在饲用微生态制剂中应用得到显著的技术效果。

实施例五：短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No. 9150酶活筛选

采用平板透明圈法筛选产酶菌株，共筛选7种酶活：α-淀粉酶、短链脂肪酶或酯酶、长链脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶，将测试菌株点接于筛选平板上，每株菌在1板上重复4次，37℃ 培养3d 后观察结果。

筛选培养基采用α-淀粉酶筛选培养基、酯酶（短链脂肪酶）筛选培养基、长链脂肪酶筛选培养基、蛋白酶筛选培养基、纤维素酶筛选培养基、木聚糖酶筛选培养基和甘露聚糖酶筛选培养基共7种，这7种筛选培养基都是在基础培养基基础上调整设定。

1.α-淀粉酶筛选培养基：基础培养基加可溶性淀粉（国产分析纯）10g，定容至1L灭菌，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。

2.酯酶（短链脂肪酶）筛选培养基：基础培养基加75ml三丁酸甘油酯（日本，T0364）乳化液，定容至1L灭菌，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。

3. 长链脂肪酶筛选培养基：基础培养基加80ml橄榄油（国产分析纯）乳化液，定容至1L，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。灭菌完毕，待温度降至60℃，加入600ul过滤灭菌的0.05%罗丹明B（BBI）溶液。

4.蛋白酶筛选培养基：基础培养基加120g脱脂奶粉，定容至1L灭菌，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。

5. 纤维素酶筛选培养基：基础培养基加羧甲基纤维素钠（国产分析纯）2g，定容至1L，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。

6.木聚糖酶筛选培养基：基础培养基加山毛榉木聚糖（sigma X4252-10G）10g，定容至1L，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。

7. 甘露聚糖酶筛选培养基：基础培养基加刺槐豆胶（阿拉丁）5g，定容至1L，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。

基础培养基为LB琼脂培养基：蛋白胨 10g ，酵母膏/粉 5g ，NaCl 10g ，琼脂 17g，蒸馏水1000mL pH自然，121°C 灭菌20分钟；对出现透明圈的菌点测量透明圈和菌落直径，计算每个透明圈的平均值和标准误差；各酶活检测方法如下：

1.α-淀粉酶筛选：培养基为基础培养基加可溶性淀粉（国产分析纯）10g，定容至1L灭菌，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。倒平板，接菌，37℃培养48h，碘液染色观察透明圈；如果是阳性，菌落周围会出现透明圈，反之菌落周围仍为深蓝色。

碘液配置方法：2g KI溶于10ml水中，加1g I2充分混匀，加水至300ml，避光。用时稀释2倍。

2. 酯酶（短链脂肪酶）筛选：基础培养基加75ml三丁酸甘油酯（日本，T0364）乳化液，定容至1L灭菌，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。倒平板，接菌，37℃培养48h，直接观察透明圈。如果是阳性，菌落周围会出现透明圈，反之菌落周围无透明圈。

三丁酸甘油酯乳化液制备方法：15ml三丁酸甘油酯，加60ml  2%聚乙烯醇（国产），加热，超声（60HZ，10min，间隔2 sec）。

3. 长链脂肪酶筛选：基础培养基加80ml橄榄油（国产分析纯）乳化液，定容至1L，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。灭菌完毕，待温度降至60℃，加入600ul过滤灭菌的0.05%罗丹明B（BBI）溶液。倒平板，接菌，37℃培养48h，紫外下观察荧光圈。如果是阳性，菌落在紫外下发荧光，反之菌落不发荧光。

橄榄油乳化液制备方法：20ml橄榄油，60ml  2%聚乙烯醇，加热，超声（60HZ，10min，间隔2 sec）。

4. 蛋白酶筛选：基础培养基加120g脱脂奶粉，定容至1L灭菌，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。接菌，37℃培养48h，直接观察透明圈。有透明圈为阳性，反之则为阴性。

5. 纤维素酶筛选：基础培养基加羧甲基纤维素钠（国产分析纯）2g，定容至1L，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。倒平板，接菌，37℃培养48h，刚果红染色观察透明圈，有透明圈为阳性，反之则为阴性。

刚果红染色方法：0.5%刚果红染色1h，1M NaCl脱色3h，冲洗后观察透明圈。

6. 木聚糖酶筛选：基础培养基加山毛榉木聚糖（sigma X4252-10G）10g，定容至1L，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。倒平板，接菌，37℃培养48h，刚果红染色观察透明圈，有透明圈为阳性，反之则为阴性。

7. 甘露聚糖酶筛选：基础培养基加刺槐豆胶（阿拉丁）5g，定容至1L，pH 7.0-7.2，121°C 灭菌20分钟。倒平板，接菌，37℃培养48h，刚果红染色观察透明圈，有透明圈为阳性，反之则为阴性。酶活筛选其结果见表2：

表2：酶活筛选结果为：

通过上述结果可知，本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No. 9150具有在蛋白酶、纤维素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、α-淀粉酶方面具有应用前景，从而可证明了本发明提供的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No. 9150可预期广泛用于蛋白酶、纤维素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶生产领域。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  新疆农业科学院微生物应用于研究所

<120>  一种短小芽孢杆菌JY2及其应用

<130>  1

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1485

<212>  DNA

<213>  短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）

 

<400>  1

ccccattagc agcgcgctat acatgcaagt cgagcggaca gaagggagct tgctcccgga      60

 

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc      120

 

cgggaaaccg gagctaatac cggatagttc cttgaaccgc atggttcaag gatgaaagac      180

 

ggtttcggct gtcacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt ggggtaatgg       240

 

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag     300

 

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc     360

 

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg        420

 

gaagaacaag tgcgagagta actgctcgca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg      480

 

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg        540

 

ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg       600

 

ggagggtcat tggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt       660

 

agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg       720

 

taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc       780

 

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa         840

 

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg        900

 

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc      960

 

aggtcttgac atcctctgac aaccctagag atagggcttt cccttcggga cagagtgaca       1020

 

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag       1080

 

cgcacccttg atcttagttg ccagcattca gtgggcactc taagtgactg cggtgacaaa       1140

 

ccgaaggagg tgggatgacg tcaatcatca tgcccttatg acttggctac acatcgtgct       1200

 

acatgacgaa caaggctgca gacgcaagta gcatgtaact gttcagttcg aatcgcactt       1260

 

cctcgactgg cgtgtagaag cgtggatctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta       1320

 

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt       1380

 

cacaccacga gagtttgcaa cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg agccagccgc       1440

 

cgaaggtggg gcagatgatt ggggtgaagt cgaaacaaga atcat                    1485

 

Claims (4)

1.一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 ，其特征在于，所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2保藏编号为CGMCC No.9150。

2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150

在饲用微生态制剂中应用。

3.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150

在对抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌中的应用。

4.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2 CGMCC No.9150在蛋白酶、纤维素酶、酯酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、α-淀粉酶方面中的应用。