CN102433269A - 一种芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的芽孢杆菌，分类命名是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1。该短小芽孢杆菌从藏猪新鲜粪便中分离，能产生纤维素酶，具有降解羧甲基纤维素钠的能力，在37℃，220rpm培养96h后羧甲基纤维素酶活性为0.92μmol/ml·min。以Bacillus pumilusSAFR-032内切酶基因bglC基因序列为参考，设计引物成功扩增出了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因，命名为bglC-BY。经NCBI blast该基因与bglC相似度为88％，而与Bacillus pumilus endoglucanase A precursor(EglA)基因相似性较高为96％，实现了pET表达系统表达并在培养温度为30℃，220rpm情况下，在菌液吸光值A595为0.7534时开始诱导，诱导后42h小时活性最高，胞外酶活测定最高为0.5434μmol/ml·min。

Description

一种芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种菌株，特别是一种从藏猪粪便微生物有益菌群中分离的芽孢杆菌，该芽孢杆菌是一种新的短小芽孢杆菌，分类命名是芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1，可用于纤维素酶的提取及应用，或者作为防治消化道疾病的药品或药用添加剂的应用等。
背景技术
1、纤维素酶应用领域和前景
纤维素酶广泛应用于畜牧业、纺织业、造纸业、饲料业、食品工业等各个领域，并在新型能源转化中起到举足轻重的作用。
近年来，人民生活水平的提高促进了畜牧生产由传统的农户散养向集约化、现代化生产转变，与之而来的是动物饲料的短缺。因此在饲料原料短缺的情况下，农作物秸秆在动物饲料的应用逐渐得到了人们的重视。
在畜牧业和饲料工业中，纤维素酶应用广泛。反刍动物饲养中，纤维素酶的主要应用是作为一种外源饲料添加剂，以促进粗纤维的分解和营养物质的利用进而提高粗纤维的消化率和缓解能量饲料的紧缺现状。此外研究表明，外源添加纤维素酶可以减少牲畜粪便营养物质损失，提高幼小牲畜的日增重，提高乳产量和乳品质等；在单胃动物中，纤维素酶的外源添加可以有效减少粪便和尿液中氨态氮的损失，因此可以减小臭气的来源，大大改善养殖场饲养环境，提高动物福利；在禽类养殖中，外源纤维素酶的添加可以有效提高日粮能量水平，蛋白利用率和日粮成分消化率以及饲料报酬，在养禽业中应用价值较高。尤其是本发明在草食单胃动物-藏猪中发现这种可充分解和消化粗纤维的菌株，对于发展节粮养殖业意义十分重大。
此外纤维素酶还可应用于生物乙醇生产，即将粗纤维分解为单糖，进而通过生物发酵产生酒精并进行提纯，生产新型清洁能源。生产和使用生物乙醇可以减少燃油消耗和温室气体的排放。在造纸业和食品工业中，都具有很广泛的用途。
2、粗纤维降解菌应用领域及前景
秸秆等混合料中加入微生物制剂进行堆积发酵，纤维降解产物为微生物生长提供糖类，有益微生物迅速繁殖，快速分解粪便和秸秆中有机质，产生生物热能，堆料温度可升至60℃～70℃，抑制或杀死病菌、虫卵等有害生物，在矿质化和腐殖质化过程中，释放出氮磷钾和微量元素等有效养分，吸收、分解恶臭和有害物质。畜禽粪便经过生物发酵腐熟后，经热风旋转烘干处理，便成为无害、无臭、无病菌和虫卵的优质有机肥，并能改善动物养殖环境。
其次，由于抗生素的大量使用，造成微生物的耐药性、毒性、致畸性、致癌性、突变性等弊端的逐渐暴露，残毒、对环境的破坏、对人类健康的威胁已成为突出问题，禁用抗生素的呼声越来越高。寻找绿色环保型抗生素替代物，减轻抗生素对畜禽生产带来的负面影响成为各国畜牧业迫切需要解决的问题。在这种背景下，微生物制剂成为一个研究热点问题。目前，微生态制剂的菌种主要有芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌等传统菌种。芽孢杆菌属在消化道内可以迅速发育、增长，具有很好的助消化、促生长作用并能产生少量抗菌物质-菌杆肽对有害微生物起抑制和杀灭的作用，其单属制剂常为助消化促进生长添加剂，也可作为防治消化道疾病的药品或药用添加剂使用，适合猪、牛、鸡等家畜、禽以及水产动物。纤维分解菌作为微生态添加中的重要组成成分，能够与添加剂中的其他菌形成稳定的微生态环境，其分解纤维素所产生的糖类可作为其他菌的生长所需营养，有效地提高了饲料的利用率，特别是粗饲料的消化率。
无论微生物作为何种生产用途，理想的微生物菌种应该是：不会使人和动物致病，不与病原微生物产生杂种；在体内外易于繁殖，体外繁殖速度快；经加工后活菌存活率高，稳定性好；最好来自动物自身肠道中。因此筛选天然存在的微生物用于解决目前生产中的难题至关重要。
发明内容
本发明目的在于，提供一种新的芽孢杆菌，其分类命名是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1(以下简称BY-1)，具有较高的纤维素酶活性，可用于养殖场粪便纤维降解，改善养殖场动物生存环境，用于微生物制剂，以防治动物肠道疾病的发生。
本发明的另一目的是提供上述BY-1的16SrRNA基因片段序列及一个新的内切纤维素酶基因序列：bglC-BY。克隆的纤维素内切酶基因经过外源表达后仍然具有较高的纤维素酶活性。
BY-1是以陕西周至县添鑫藏香猪养殖场散放饲养的藏猪新鲜粪便为材料，经分离、筛选获得，与现有技术相比，具有以下优点：
1)该菌株是从藏猪新鲜粪便中筛选出的纯天然菌种，其发酵上清液具有很高的纤维素酶活性，该纤维素酶最适宜反应温度和pH值分别为55℃和7.21，在pH 5.17-9.08之间可以保持50％，在70℃时可保持70％以上的活性。具有较广的pH和温度耐受性。可以直接用于粪肥腐熟处理、纤维素酶提取、粗纤维降解等。
2)克隆到的bglC-BY基因经pET系统表达后具有明显的酶活性，上清液可用于纤维素酶的开发与研究。
附图说明
图1是BY-1菌体革兰氏染色；
图2是BY-1孢子观察；
图3是依16SrDNA序列构建的短小芽孢杆菌BY菌株的系统进化树图；
图4是bglC-BY基因的克隆电泳图；图中的标记表示：M，Marker III；1-8，扩增产物带；
图5是菌落PCR检测电泳图；图中的标记表示：M，Marker III；1-8，扩增产物条带；
图6是依bglC-BY基因构建的短小芽孢杆菌内切纤维素酶基因序列进化树；
图7是葡萄糖浓度曲线；
图8是培养时间对菌体生长以及产酶的影响曲线；
图9酶的最适pH值曲线；
图10酶反应的最适温度曲线；
图11是bglC-BY基因编码氨基酸种类及数量分析；
图12是bglC-BY基因结构域预测图及注解；
图13是bglCBY蛋白四级结构预测图；
图14是含重组质粒bglC-pET细菌的生长曲线以及上清液酶活曲线；
图15是SDS-PAGE检测分泌蛋白。
以下结合附图和具体试验及对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本发明的芽孢杆菌，分类命名是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1，申请人于2011年9月23日送中国典型微生物保藏中心保藏，经检测结果为存活，在中国典型微生物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2011329。
该短小芽孢杆菌从藏猪新鲜粪便中分离，能产生纤维素酶，具有降解羧甲基纤维素钠的能力，在37℃，220rpm培养条件下，pH值7.21和55℃测定条件下，羧甲基纤维素酶活性为0.92μmol/ml·min。
申请人以Bacillus pumilus SAFR-032内切酶基因bglC基因序列为参考，设计引物成功扩增出了Bacillus pumilus BY-1纤维素内切酶基因bglC-BY。经NCBI blast比对，该基因与bglC相似度为88％，而与Bacillus pumilus endoglucanase A precursor(EglA)基因相似性较高为96％，说明bglC-BY与已经公布的短小芽孢杆菌纤维素内切酶基因有相似性，但是却不相同。克隆出的基因bglC-BY实现了pET表达系统表达并在培养温度为30℃，220rpm情况下，在菌液吸光值A595为0.7534时开始诱导，诱导后42h小时活性最高，胞外酶活测定最高为0.5434μmol/ml·min。
该短小芽孢杆菌BY-1菌株在纤维素酶提取、粗纤维降解、研发微生物制剂，特别是在选育草食猪，以及大力发展节粮性养殖业方面具有重要意义和广泛应用前景。
以下通过申请人给出的实施例进行详细说明。
实施例1：BY-1制备方法和酶活特性
1、BY-1的分离筛选
1)藏猪粪便来源
藏猪粪便采自陕西省周至县添鑫藏猪养殖场。
2)菌株的分离筛选
取0.3g新鲜粪样接种于30ml的BHM液体培养基中，于37℃220r/min条件下震荡培养48h后，吸取上清液做梯度稀释(101、102、103、104、105、106、107)，分别将稀释液涂布在BHM固体培养基上，在37℃恒温培养48h后，刚果红溶液(1mg/mL)，染色1h；1mol/LNaCl溶液，洗涤40min。根据菌落周围透明圈直径与菌落直径的比值大小选择菌株。对比值大的菌落进一步采用划线分离，得到纯培养并于-20℃保存。
所述的BHM液体培养基的组分及配比为：(g/l)：羧甲基纤维素钠(CMC)，10.0；MgSO4·7H2O，0.2；K2HPO4，1.0；KH2PO4，1.0；NH4NO3，1.0；FeCl3·6H2O，0.05；CaCl2，0.02。(固体筛选培养基添加琼脂1.5)，120℃高压灭菌20分钟。
实施例2：BY-1的鉴定
1)形态学的特征
BY-1菌株在液体LB培养基中37℃，220rph震荡培养36h，革兰氏染色后光学显微镜下观察，菌体呈现蓝紫色，染色结果为革兰氏阳性菌(图1)，并有孢子出现(图2)。
2)BY-1分子生物学鉴定
(1)BY-1菌株16SrRNA的基因片段序列测定
将BY-1保存菌种划线接培养于固体LB培养基，37℃过夜培养，挑选单克隆于液体LB批培养基，37℃摇床培养8h，离心收集菌体，采用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒DP302提取短BY-1总基因组DNA(Tiangen，China)。通用引物27F/2492R扩增BY-1菌株16SrRNA的基因(F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG/R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。
以Bacillus pumilus基因组为模板，进行PCR扩增，PCR体系如下：
  组分(Ingredients)   体积(Volume)
  10×PCR buffer(Mg2+plus)   1.5μl
  dNTP(各2.5mM)   1.5μl
  引物F(10.0μmol/ml)   0.3μl
  引物R(10.0μmol/ml)   0.3μl
  DNA Polymerase   0.1μl
  基因组DNA   1.0μl
  ddH2O   10.3μl
扩增程序为：95℃，10min→94℃，30S，55℃，30S，72℃，50S，循环35次→72℃，10min→4℃，forever。
PCR扩增结束后，1％琼脂糖电泳检测后根据胶回收试剂盒说明，回收PCR产物，并与T载体相连，转入DH5α感受态，恢复培养1h后涂在含有氨苄霉素的固体LB培养平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，反应体系和反应程序与扩增相同。挑选鉴定正确的单菌落，提取质粒并测序。
经测序，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1的16SrRNA的基因序列长度是1513bp，其基因序列是：
tacggttaccttgttacgacttcaccccaatcatctgccccaccttcggcggctggctccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaact
ctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagt
cgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgggattggctaaaccttgcggtcttgcagccctttgttctgtccattgtagcacgtgt
gtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgct
ggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgt
ccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccg
cttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcg
gaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtt
acagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagt
ttcccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccgga
caacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgcgagcagttactctcgc
acttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccc
tactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagcc
attaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcatccttgaaccatgcggttcaaggaactatc
cggtattagctccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatccgggagcaagct
cccttctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccatgatcaaactct。
并将测序结果于NCBI上在线比对。
(2)BY-1序列分析和系统进化树的构建
将测定的16S rDNA序列，与GenBank数据库中的所有已测定的原核生物16SrDNA进行比对，很多短小芽孢杆菌和芽孢杆菌属多个未得到培养物的菌株相似性都达到99％。利用Blast搜索软件从GenBank数据库中调出与其相似性最高的前20个16SrDNA序列(相关放线菌菌株的登陆号如表1所示)，通过Clustal X 5软件进行多序列比对，并采用Neighbour-joining法进行系统进化树的构建见(图3)所示，分析表明：Bacillus pumilusBY-1菌株与各个菌株的进化距离相隔较远，表明申请人所分离到的菌株极有可能为一个新的芽孢杆菌菌株。
结合放线菌菌株的革兰氏染色特性和分子生物学鉴定结果，认为该菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。
表1：短小芽孢杆菌登陆号
Figure BDA0000100748200000061
Figure BDA0000100748200000071
实施例3：筛选菌株所产内切酶活性测定及酶学特性分析
1)筛选菌株内切酶活性测定
(1)所需试剂和缓冲液
A)NS显色液-3，5-二硝基水杨酸
3，5-二硝基水杨酸(DNS)显色液：准确称取3，5-二硝基水杨酸：6.3g，NaOH：20g，溶于适量的蒸馏水中；然后称量酒石酸钾钠182.0g，溶于300mL～500mL蒸馏水中，加热至充分溶解，将上述两溶液混合，再加5.0g重蒸酚和5.0g亚硫酸钠，搅拌溶解，定容至1000mL，贮于棕色瓶中置冰箱一周后使用，用前过滤。
B)缓冲溶液的配制
(a)磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液
母液A：1/15mol/LNa2HPO4溶液(Na2HPO4·2H2O：9.46g，用蒸馏水溶至1000ml)。
母液B：1/15mol/LKH2PO4溶液(KH2PO4：9.07g用蒸馏水溶至1000ml)。
缓冲液配制：X mLA溶液+Y mLB溶液加水稀释至200ml(表2)。
表2：磷酸盐缓冲液
  x   y   pH
  8.0   2.0   7.48
(b)柠檬酸-磷酸缓冲液
母液A：0.1mol/l柠檬酸溶液(19.21g柠檬酸溶至1000ml)。
母液B：0.2mol/l磷酸氢二钠溶液(53.65gNa2HPO4·7H2O溶至1000ml)。
缓冲液配制：X mLA溶液+Y mLB溶液加水稀释至100mL(表3)。
表3：柠檬酸-磷酸缓冲液
  x   y   pH
  39.8   10.2   3.0
  30.7   19.3   4.0
  24.3   25.7   5.0
  17.9   32.1   6.0
  6.5   43.6   7.0
(c)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液
母液A：0.2mol/l甘氨酸；母液B：0.2mol/l NaOH
缓冲剂配制：XmlA溶液+YmlB溶液加水稀释至200ml。(表4)
表4：甘氨酸-氢氧化钠缓冲液
  pH   x   y
  9.0   50   8.8
  10   50   32.0
(2)糖标准曲线的绘制
在NaOH和丙三醇存在的情况下，3，5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色。在540nm波长处有最大吸收值，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
Figure BDA0000100748200000081
取大于1g的葡萄糖置于热风干燥箱内105℃烘干至恒重，准确称取葡萄糖1.000g，用灭菌的蒸馏水溶解并定容至100ml，配成10mg/mL的葡萄糖溶液。移液管分别准确移取该溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL至5个100ml容量瓶并定容，配成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml标准液。
分别取各标准液各2.5mL于比色管中，各加2.5mL的3，5-二硝基水杨酸溶液，煮沸5min(另作1管对照，取1.0mL蒸馏水，加1.5mL的3，5-二硝基水杨酸溶液，同样煮沸5min)，冷却至室温后加水稀释至10mL。用U-3010分光光度计在540nm波长下比色，利用UVSolutions 2.0软件，以吸光值A540作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
根据测定结果，用Excel软件制作散点图得到标准曲线如(图7)所示，并得出标准曲线方程为Y＝0.0611X+0.0033，标准曲线散点图相关性系数R＝0.9994，线性良好。
(3)筛选菌株Bacillus pumilusBY-1菌株酶活力的测定
纤维素酶活力的计算参照中华人民共和国农业部发布的纤维素酶活力测定方法(NY/T912-2004)进行，计算公式如下：
X＝V·D·[(AE-AB)×K+C0]×1000/(M×T)
式中：
X：样品稀释液的纤维素酶活力，单位为(μmol/ml·min)；
V：反应体积；
D：稀释倍数；
AE：酶反应液的吸光度；
AB：空白对照的吸光度；
K：标准曲线的斜率；
C0：标准曲线的截距；
M：葡萄糖的摩尔质量，即M＝180.2g/mol；
T：酶与底物反应时间，单位为分钟；
1000：转化因子，即1mmol＝1000umol
将筛选得到的菌株通过接种到30ml摇瓶培养基中，于37℃220r/min摇瓶培养。取培养液于5000rpm，4℃下离心10min，取上清液即是细胞胞外酶液用于不同培养时间酶活力的测定。
10ml比色管中加入1.5ml的1.0％羧甲基纤维素钠溶液(CMCase)，水浴55℃预热10min后加入1.0ml稀释的粗酶液，55℃下水浴酶解10min，加入2.5ml3，5-二硝基水杨酸溶液(DNS)，煮沸5min。(另取一试管作为空白对照，即在10ml试管中加入1.5ml的1.0％羧甲基纤维素钠溶液(CMC)、1.0ml稀释煮沸灭活的粗酶液、2.5ml的3，5-二硝基水杨酸溶液(DNS)，迅速混匀后沸水浴5min。)冷却至室温后，用空白管做空白对照，在540nm下用分光光度计测定其吸光值，计算酶活力。
根据菌体生长及不同发酵时间酶活力测定的结果(图8)表明：该菌在培养12h后开始明显表现纤维素酶酶活力，培养至96h达到高峰，最高值为0.92μmol/ml·min。培养24h左右进入菌株的对数生长期，表现为细菌迅速繁殖，OD595值迅速升高；到60h左右达到一个生长的平台期；96h时达到最大生长量，此时的OD595值为3.52，96h后细菌生长开始衰退，与纤维素酶的产生过程基本吻合。
2)筛选菌酶学特性的研究
(1)酶反应的最适pH
将筛选出的菌株发酵培养液离心，收集上清即为粗酶液，将粗酶液、底物CMC分别与不同pH的缓冲液(3-10)1∶1混合，测定最终的pH值，分别在pH值为3.17、4.10、5.17、6.17、7.21、8.26、9.08、10.21的条件下反应测定酶活力。
酶的反应的最适PH测定结果(图9)表明：该酶的最适pH为7.21左右，为中性偏碱性环境。
(2)酶反应的最适温度
在10ml试管中加入1.5ml 1.0％羧甲基纤维素钠溶液(CMC)与1.0ml适当稀释的粗酶液，均匀混合后分别于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下分别反应10min来测定其酶活力(PH＝7.21)。结果显示(图10)该酶最适宜温度为55℃左右。
实施例4：短小芽孢杆菌BY-1纤维素内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆与分析
1)芽孢杆菌BY-1纤维素内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆
(1)PCR扩增
提取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1基因组，以NCBI上所发布的短小芽孢杆菌SAFR-032纤维素酶基因bglC基因为依据，利用Vector NTIAdvance10设计引物，添加适当的酶切位点，扩增目的基因片段，引物序列和酶切位点见表5。
表5：引物序列和酶切位点
Figure BDA0000100748200000101
以Bacillus pumilus基因组为模板，进行PCR扩增，PCR体系和反应程序如下表：
  组分(Ingredients)   体积Volume
  10×PCR buffer(Mg2+plus)   1.5μl
  dNTP(各2.5mM)   1.5μl
  引物F(10.0μmol/ml)   0.3μl
  引物R(10.0μmol/ml)   0.3μl
  DNA Polymerase   0.1μl
  基因组DNA   1.0μl
  ddH2O   10.3μl
PTC-1148PCR仪扩增，反应程序如下：
Figure BDA0000100748200000111
PCR扩增结束后，1％琼脂糖电泳检测(见图4)。
(2)PCR产物回收
利用Bio-Flux胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。详细步骤如下：
A：用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5ml干净离心管中；
B：按1∶3的比例(凝胶质量毫克数∶溶胶液体积微升数)加入Extraction Buffer，于50℃水浴中孵育，直至凝胶融化。
C：将混合液全部转移到Spin column内，6,000g离心一分钟，并弃去接液管内的液体。
D：向Spin column内加入500μl Extraction Buffer，于12,000g离心30S～60S，并弃去接液管内液体。
E：向Spin column中加入750μl的Wash Buffer，室温放置2～5min，于12,000g离心30S～60S，弃去接液管内液体。
F：再次于12,000rpm离心1min，然后将Spin column转移到1.5ml离心管内。向Spin column中加入50μl的ddH2O，并室温放置1min。
G：12,000g离心1min，微量离心管内含有DNA目的片段，于-20℃保存。
(3)连接转化
将PCR回收产物与pMD 19-T vector连接于16℃连接30min，连接体系如下表：
  组分(Ingredients)   体积(Volume)
  PCR扩增产物   1.0μl
  pMD 19-T vector   1.0μl
  ddH2O   3.0μl
  Solution I   5.0μl
  Total volume   10.0μl
将连接产物转入DH5αCompetent cells中，具体转化步骤如下：
A：于-80℃冰箱中取感受态细胞并于冰浴中融化。
B：加入101.0μl连接产物，并冰上放置30min。
C：于42℃水浴中热激60～90S。
D：从冰浴中取出连接产物，冰中放置2～3min。
E：加入900μl液体无抗性的LB培养基，并于37℃，150rpm恢复培养45min。
F：将转化产物4000rpm离心2min，弃去适量上层清夜，适量涂于氨苄抗性的LB培养平板中，37℃过夜培养。
(4)插入片段的PCR检测
挑取培养平板上的单克隆，分别以BMD2609F/R和BMDF/R为引物进行扩增，扩增体系如下表：
  组分(Ingredient)   体积(Volume)
  10×PCR Buffer   2.0μl
  Forward/Reverse   0.3μl
  dNTP(各2.5mM)   2.0μl
  ddH2O   14.3μl
  菌液   1.0μl
  DNA Polymerase   0.1μl
  总体积(Total volume)   20.0μl
PCR扩增条件与目的基因扩增条件相同。取8μl的PCR产物于1％琼脂糖电泳检测(见图5)，将检测正确的质粒命名为pbglC，保存菌液并测序。
测序表明，该短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1克隆的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因序列如下：
ATGGCATCTTATAACTATGTAGAGGTTCTCCAAAAATCCATGCTGTTTTATGAAGCGCAGCGGTCAGGCCGGCTTCCGGA
AAACAATCGTCTTAACTGGCGGGGAGATTCTGGACTAGAGGACGGGAAGGATGTTGGGCATGACTTAACTGGCGGCTGGT
ATGATGCGGGAGATCATGTGAAATTTGGACTTCCGATGGCTTATTCAGCAGCCGTGCTTGCATGGACAGTATATGAATAC
CGGGAAGCTTATGAAGAAGCAGAATTGCTTGATGAGATCTTAGATCAAATCAAGTGGGCAACGGATTATTTTTTGAAAGC
ACATACAGGACCGAATGAATTTTGGGCACAAGTAGGTGATGGAAACGCCGATCACGCTTGGTGGGGACCAGCAGAAGTGA
TGCCGATGAACCGGCCAGCTTTTAAAATTGATGAACATTGTCCTGGCACAGAAGTAGCTGCACAAACTGCGGCGGCTTCA
GCAGCAGGTTCTATCATTTTTAAAGAAACAGATGCGCCCTATGCAGCAAAGCTTTTGACGCACGCCAAACAGCTATATGC
ATTTGCTGACACGTATCGCGGCAAATATACAGATTGTGTCACCAATGCGCAGCCATTTTACAACTCCTGGAGCGGCTATG
TTGACGAACTTATTTGGGGCGGAATCTGGCTGTACTTGGCGACAAATGAAGAAACCTATTTAAACCAAGCATTAAAAGCG
GTAGAGGAATGGCCGAAGGATTGAGATTATACGTTTACCATGTCATGGGACAATACTTTTTTTGCTTCACAAATCTTACT
AGCAAGAATCACGAAAGAAAACAGATTTATAGAATCGACAGAGCGCAATCTTGATTACTGGACCACAGGTCTTGTTCAAA
ATGGAAAAGTAGAAAGAATCACCTATACGCCTGGCGGTTGGGCATGGCTGGATCAATGGGGTTCACTTCGTTATGCCGCC
AATGCAGCATTTTTAGCCTTTGTCTATGCTGATTGGGTATCTGATCAAGAAAAGAAAAATCGATACCAATCGTTTGCGAT
TAAGCAAACTCACTATATGCTGGGTGATAATCCGCTGAATAGAAGCTACGTCGTTGGGTTTGGTCAGAATCCGCCGAAGC
ACCCGCACCACCGTACTGCACATGGCTCGTGGTCGAACCAGCTGACAAATCCTCCAGTTCATCGGCACACACTTTATGGA
GCACTTGTTGGGGGCCCTAATGCACAGGATCAATATGATGATgACATCTCTGATTATATATCAAACGAGGTGGCGACCGA
TTATAATGCCGCTTTTACTGGAAATATCGCCAAAATGGTGCAGCTGTTTGGTCAAGGGCAATCAAAGCTGCCAAATTTCC
CGCCTAAAGAACAGGTGGAGGATGAGTTTTTTGTAGAGGCAGCTGTGATGCATAACGATACAACATCTACTCAAGTGAAA
GCAGTGCTGTACAACAGGTCCGGCTGGCCGGCAAGAAGCAGTCAAACACTATCCTTTAGATATTACGTCAATCTGAGTGA
GGTCTTTGCAAAGGGATTCACTGAAAAGGATATTCAAGTGACAGCAGCCTACAATGAAGGCGCTTCCTTATCACCTTTAA
AAGTATATGACGCATCAAGCCGCGTCTATTTTGCAGAAATCGATTTTACGGGCGTAGCTATTTCTCCTAGAGGAGAATCT
GAGCATAAGAGGGAAATACAATTTCGATTATCTGCTCCAAATGGATCGAATATATGGGATGCCTCAAATGATTATTCCTA
TCAAGGATTAACATCCAATATGCAAAAAACAACAAAGATTCCTGTCTTTGACGATGGTGTTTTAGTATTTGGCACACTTC
CAGACAAATAA。
2)bglC-BY基因构建的短小芽孢杆菌内切纤维素酶基因序列进化树
测定的短小芽孢杆菌纤维素内切酶基因序列包含一个完整的CDS区，开始于ATG，结束于TAA，与GenBank数据库中的所有已公布的短小芽孢杆菌内切酶基因序列进行比对，其与Bacillus pumilus endoglucanase A precursor(EglA)相似性最高，为96％，而与作为模板的Bacillus pumilus SAFR-032相似性为88％。
利用Blast搜索软件从GenBank数据库中调出9个纤维素内切酶基因序列(相关放线菌菌株的登陆号如表3所示)，通过Clustal X 5软件进行多序列比对，并采用Neighbour-joining法构建系统进化树(图6)。
分析表明：通过NCBI blast比对发现，该基因与Bacillus pumilus endoglucanase A precursor(EglA)基因相似性最高，为96％，而与作为模板的Bacillus pumilus SAFR-032相似性为88％。说明短小芽孢杆菌内切纤维素酶基因具有保守型，所克隆的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因为一个新基因，并命名为bglC-BY。
表6：短小芽孢杆菌纤维素内切酶基因登陆号
Figure BDA0000100748200000141
2)bglC-BY的生物信息学分析
bioedti软件统计发现该蛋白由20种氨基酸构成(如图11所示)将bglC蛋白序列在SwissModel(http://swissmodel.expasy.org/)预测结果显示该氨基酸序列有两种明显的催化结构域和结合结构域(图12)：在5-439aa处，形成一个糖苷水解酶家族9的催化结构域，并在477-609aa或者463-548或者457-614aa处形成纤维素结合结构域；另一种可能性是在2-443aa形成含有6个发夹结构的葡萄糖甘酶活性的催化结构域，在460-613aa形成结合碳水化合物结构域。四级结构预测(图13)显示，该蛋白是由异源二聚体形式存在，与氨基酸序列结构域预测结果相同。这种结构是典型的细菌的纤维素内切酶基因结构。
3)短小芽孢杆菌纤维素内切酶基因的表达
(1)原核表达载体的构建
将保存的含重组质粒pbglC的重组菌和BL21(DE3)菌分别于氨苄抗性和卡那霉素抗性的的LB平板上画线，用灭菌的牙签挑取单克隆摇菌，分别提取质粒，将提取的质粒均用采用EcoR I和Xho I于37℃水浴中进行酶切，酶切体系如下表：
  组分Ingredient   体积Volume
  质粒Plasmid   10.0μl
  10×PCR Buffer(Mg2+plus)   5.0μl
  ddH2O   33.0μl
  EcoRI/XhoI   1.0μl
  总体积Total volume   50.0μl
将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定正确后将剩余的PCR产物用相同浓度的琼脂糖回收目的基因片段bglC-BY和线性化的pET28a(a+)片段并将回收的目的基因片段bglC-BY与pET28a(a+)片段相连，连接体系如下表：
  组分(Ingredients)   体积(Volume)
  10×Ligase Buffer   1.0μl
  目的基因片段(bglC)   1.0μl
  pET28a(a+)大片段   6.0μl
  ddH2O   1.0μl
  连接酶Ligase   1.0μl
  总体积(Total volume)   10.0ul
将连接产物于16℃过夜连接后转入DH5α内，采用菌落PCR方法挑选并鉴定阳性克隆。提取重组表达载体质粒并命名为TbglC。
将表达载体质粒分别转入BL21(DE3)感受态内，转化产物4000rpm离心2min，并取适量转化产物涂到卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆，以目的基因克隆时的引物为引物进行PCR鉴定并保存阳性克隆。
(2)原核基因的表达
将含重组质粒TbglC的BL21细菌于卡那霉素抗性的LB平板上划线过夜培养后挑取单菌落，接种至到含卡那霉素的LB培养基中，30℃，200rpm培养12h后，以1∶100稀释到含相应抗生素的摇瓶发酵培养基中，37℃下继续培养2h后，在OD595为0.8左右时加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达，按一定的时间梯度(2h、4h、6h、8h)取样测定菌液的OD595值和酶活力。结果如图16所示，菌体生长曲线与纤维素酶活曲线有很大的相似性，但与菌体生长相比，胞外纤维素酶活增长相对滞后：在诱导后8h菌体开始大量繁殖，并于14h达到平台期，而其分泌到胞外的纤维素酶活于10h开始迅速上升，并于诱导后42h达到最大值0.5434，而后缓慢降低。基因开纤维素酶表明随着细菌的大量生长，胞外分泌的纤维素酶量也在逐渐累积，随着菌体生长进入平台期，纤维素酶量逐渐上升并进入平台期并随着菌体量的减少而下降。
(3)原核表达产物的检测
A：将含pET-28a(+)质粒的BL21菌作为对照菌，检测含有TbglC质粒的BL21重组菌在卡那霉素抗性(30μg/ml)的LB平板中37℃画线培养，挑取单克隆于1ml卡那霉素抗性液体LB中，37℃过夜振荡培养。
B：1ml过夜培养物以1∶100比例接种于30mll卡那霉素抗性液体LB中37℃振荡培养2h以上直至对数中期(A550＝0.5～1.0)；
C：在培养物中加入IPTG至终浓度为1mmol/l，32℃，220rpm继续振荡培养。
D：诱导后取1mL菌液，室温高速离心12000rpm离心1min收集菌体。
E：沉淀悬于灭菌PBS缓冲液中，重悬，12000rpm离心1min收集菌体，重复两次。
F：加入100μl×SDS凝胶加样缓冲液中(用前加入DTT)，100℃加热10min，室温高速离心10min，冰上放置，直至全部样品处理完毕后上样。
G：样品加热至室温，点样。
H：8V/cm～15V/cm电泳，直至溴酚蓝迁移到分离胶底部。
I：电泳完毕后，固定，染色，脱色，观察表达产物条带。
结果如图15所示，bglC-BY基因表达蛋白大小预测结果为69.29KDa，电泳结果显示，在大于60Kda-80KDa处，与对照相比，出现了一条明显的蛋白条带，证明外源基因成功表达。
tacggttaccttgttacgacttcaccccaatcatctgccccaccttcggcggctggctccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgggattggctaaaccttgcggtcttgcagccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagtttcccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgcgagcagttactctcgcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccattaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcatccttgaaccatgcggttcaaggaactatccggtattagctccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatccgggagcaagctcccttctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccatgatcaaactct
ATGGCATCTTATAACTATGTAGAGGTTCTCCAAAAATCCATGCTGTTTTATGAAGCGCAGCGGTCAGGCCGGCTTCCGGAAAACAATCGTCTTAACTGGCGGGGAGATTCTGGACTAGAGGACGGGAAGGATGTTGGGCATGACTTAACTGGCGGCTGGTATGATGCGGGAGATCATGTGAAATTTGGACTTCCGATGGCTTATTCAGCAGCCGTGCTTGCATGGACAGTATATGAATACCGGGAAGCTTATGAAGAAGCAGAATTGCTTGATGAGATCTTAGATCAAATCAAGTGGGCAACGGATTATTTTTTGAAAGCACATACAGGACCGAATGAATTTTGGGCACAAGTAGGTGATGGAAACGCCGATCACGCTTGGTGGGGACCAGCAGAAGTGATGCCGATGAACCGGCCAGCTTTTAAAATTGATGAACATTGTCCTGGCACAGAAGTAGCTGCACAAACTGCGGCGGCTTCAGCAGCAGGTTCTATCATTTTTAAAGAAACAGATGCGCCCTATGCAGCAAAGCTTTTGACGCACGCCAAACAGCTATATGCATTTGCTGACACGTATCGCGGCAAATATACAGATTGTGTCACCAATGCGCAGCCATTTTACAACTCCTGGAGCGGCTATGTTGACGAACTTATTTGGGGCGGAATCTGGCTGTACTTGGCGACAAATGAAGAAACCTATTTAAACCAAGCATTAAAAGCGGTAGAGGAATGGCCGAAGGATTGAGATTATACGTTTACCATGTCATGGGACAATACTTTTTTTGCTTCACAAATCTTACTAGCAAGAATCACGAAAGAAAACAGATTTATAGAATCGACAGAGCGCAATCTTGATTACTGGACCACAGGTCTTGTTCAAAATGGAAAAGTAGAAAGAATCACCTATACGCCTGGCGGTTGGGCATGGCTGGATCAATGGGGTTCACTTCGTTATGCCGCCAATGCAGCATTTTTAGCCTTTGTCTATGCTGATTGGGTATCTGATCAAGAAAAGAAAAATCGATACCAATCGTTTGCGATTAAGCAAACTCACTATATGCTGGGTGATAATCCGCTGAATAGAAGCTACGTCGTTGGGTTTGGTCAGAATCCGCCGAAGCACCCGCACCACCGTACTGCACATGGCTCGTGGTCGAACCAGCTGACAAATCCTCCAGTTCATCGGCACACACTTTATGGAGCACTTGTTGGGGGCCCTAATGCACAGGATCAATATGATGATgACATCTCTGATTATATATCAAACGAGGTGGCGACCGATTATAATGCCGCTTTTACTGGAAATATCGCCAAAATGGTGCAGCTGTTTGGTCAAGGGCAATCAAAGCTGCCAAATTTCCCGCCTAAAGAACAGGTGGAGGATGAGTTTTTTGTAGAGGCAGCTGTGATGCATAACGATACAACATCTACTCAAGTGAAAGCAGTGCTGTACAACAGGTCCGGCTGGCCGGCAAGAAGCAGTCAAACACTATCCTTTAGATATTACGTCAATCTGAGTGAGGTCTTTGCAAAGGGATTCACTGAAAAGGATATTCAAGTGACAGCAGCCTACAATGAAGGCGCTTCCTTATCACCTTTAAAAGTATATGACGCATCAAGCCGCGTCTATTTTGCAGAAATCGATTTTACGGGCGTAGCTATTTCTCCTAGAGGAGAATCTGAGCATAAGAGGGAAATACAATTTCGATTATCTGCTCCAAATGGATCGAATATATGGGATGCCTCAAATGATTATTCCTATCAAGGATTAACATCCAATATGCAAAAAACAACAAAGATTCCTGTCTTTGACGATGGTGTTTTAGTATTTGGCACACTTCCAGACAAATAA
 

Claims (4)

1.一种芽孢杆菌，其特征在于，该芽孢杆菌的分类命名是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1，保藏号为：CCTCC M 2011329。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1的16SrRNA的基因序列是：
tacggttaccttgttacgacttcaccccaatcatctgccccaccttcggcggctggctccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaact
ctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagt
cgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgggattggctaaaccttgcggtcttgcagccctttgttctgtccattgtagcacgtgt
gtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgct
ggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgt
ccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccg
cttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcg
gaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtt
acagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagt
ttcccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccgga
caacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgcgagcagttactctcgc
acttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccc
tactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagcc
attaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcatccttgaaccatgcggttcaaggaactatc
cggtattagctccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatccgggagcaagct
cccttctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccatgatcaaactct。
3.如权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，用所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-1所克隆的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因，命名为bglC-BY，其基因序列如下：
ATGGCATCTTATAACTATGTAGAGGTTCTCCAAAAATCCATGCTGTTTTATGAAGCGCAGCGGTCAGGCCGGCTTCCGGA
AAACAATCGTCTTAACTGGCGGGGAGATTCTGGACTAGAGGACGGGAAGGATGTTGGGCATGACTTAACTGGCGGCTGGT
ATGATGCGGGAGATCATGTGAAATTTGGACTTCCGATGGCTTATTCAGCAGCCGTGCTTGCATGGACAGTATATGAATAC
CGGGAAGCTTATGAAGAAGCAGAATTGCTTGATGAGATCTTAGATCAAATCAAGTGGGCAACGGATTATTTTTTGAAAGC
ACATACAGGACCGAATGAATTTTGGGCACAAGTAGGTGATGGAAACGCCGATCACGCTTGGTGGGGACCAGCAGAAGTGA
TGCCGATGAACCGGCCAGCTTTTAAAATTGATGAACATTGTCCTGGCACAGAAGTAGCTGCACAAACTGCGGCGGCTTCA
GCAGCAGGTTCTATCATTTTTAAAGAAACAGATGCGCCCTATGCAGCAAAGCTTTTGACGCACGCCAAACAGCTATATGC
ATTTGCTGACACGTATCGCGGCAAATATACAGATTGTGTCACCAATGCGCAGCCATTTTACAACTCCTGGAGCGGCTATG
TTGACGAACTTATTTGGGGCGGAATCTGGCTGTACTTGGCGACAAATGAAGAAACCTATTTAAACCAAGCATTAAAAGCG
GTAGAGGAATGGCCGAAGGATTGAGATTATACGTTTACCATGTCATGGGACAATACTTTTTTTGCTTCACAAATCTTACT
AGCAAGAATCACGAAAGAAAACAGATTTATAGAATCGACAGAGCGCAATCTTGATTACTGGACCACAGGTCTTGTTCAAA
ATGGAAAAGTAGAAAGAATCACCTATACGCCTGGCGGTTGGGCATGGCTGGATCAATGGGGTTCACTTCGTTATGCCGCC
AATGCAGCATTTTTAGCCTTTGTCTATGCTGATTGGGTATCTGATCAAGAAAAGAAAAATCGATACCAATCGTTTGCGAT
TAAGCAAACTCACTATATGCTGGGTGATAATCCGCTGAATAGAAGCTACGTCGTTGGGTTTGGTCAGAATCCGCCGAAGC
ACCCGCACCACCGTACTGCACATGGCTCGTGGTCGAACCAGCTGACAAATCCTCCAGTTCATCGGCACACACTTTATGGA
GCACTTGTTGGGGGCCCTAATGCACAGGATCAATATGATGATGACATCTCTGATTATATATCAAACGAGGTGGCGACCGA
TTATAATGCCGCTTTTACTGGAAATATCGCCAAAATGGTGCAGCTGTTTGGTCAAGGGCAATCAAAGCTGCCAAATTTCC
CGCCTAAAGAACAGGTGGAGGATGAGTTTTTTGTAGAGGCAGCTGTGATGCATAACGATACAACATCTACTCAAGTGAAA
GCAGTGCTGTACAACAGGTCCGGCTGGCCGGCAAGAAGCAGTCAAACACTATCCTTTAGATATTACGTCAATCTGAGTGA
GGTCTTTGCAAAGGGATTCACTGAAAAGGATATTCAAGTGACAGCAGCCTACAATGAAGGCGCTTCCTTATCACCTTTAA
AAGTATATGACGCATCAAGCCGCGTCTATTTTGCAGAAATCGATTTTACGGGCGTAGCTATTTCTCCTAGAGGAGAATCT
GAGCATAAGAGGGAAATACAATTTCGATTATCTGCTCCAAATGGATCGAATATATGGGATGCCTCAAATGATTATTCCTA
TCAAGGATTAACATCCAATATGCAAAAAACAACAAAGATTCCTGTCTTTGACGATGGTGTTTTAGTATTTGGCACACTTC
CAGACAAATAA。
4.权利要求1或2所述的芽孢杆菌用于纤维素酶提取、粗纤维降解、微生物制剂的应用。
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