CN103525718B - 一种蜡状芽孢杆菌及其益生菌粉及该菌粉的制备和用途 - Google Patents

Abstract

一种蜡状芽孢杆菌及其益生菌粉及该菌粉的制备和用途，从健康仔猪粪便中分离、纯化、筛选得到的保藏编号为CGMCC No. 7433的蜡状芽孢杆菌BC158，该菌具有良好的耐酸、耐胆盐性能、粘附力高、安全性高，对常见肠道致病菌具有一定的抑制性，且该菌能产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶；蜡状芽孢杆菌益生菌粉的制备，采用逐级放大的四级培养工艺，通风搅拌深层液体发酵技术实现蜡状芽孢杆菌BC158的高密度培养，结合玉米淀粉等辅料的高温保护作用，实现了发酵液中蜡状芽孢杆菌的高密度回收；该制备方法简单，成本低廉，所制备的益生菌粉中芽孢率在95%以上，蜡状芽孢杆菌的活菌含量为3×10⁹-5×10¹⁰CFU/g，可应用于动物养殖的饲料添加剂。

Description

一种蜡状芽孢杆菌及其益生菌粉及该菌粉的制备和用途

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体的说是一种蜡状芽孢杆菌BC158及其益生菌粉及该菌粉的制备和用途。

背景技术  

从养殖场到餐桌的食品安全工程是一项非常复杂的工程，饲料安全作为食物链中的一个部分，无疑也是重要的一环，因此对于加强安全饲料添加剂的研发与应用具有广阔的前景，大有可为。现代集约化畜牧生产限制了动物接触土壤以及其周围的自然环境，这种饲养条件下不利于动物建立胃肠道的正常菌群。当外界环境条件发生变化时，容易导致动物胃肠道微生态菌群失调从而降低对病原菌的抵抗力。目前主要是通过改善饲养管理和在日粮中添加抗生素的方法来降低这种损失，但随着抗生素在饲料添加剂中的广泛使用，它的弊端正日益凸现，如导致动物胃肠道菌群失调，因为长期以来抗生素一直是预防和治疗仔猪黄白痢最主要的途径，虽然在一定程度上抑制了病原菌的生长，但同时也抑制了肠道内正常菌群发挥作用，长期的使用容易引起消化道疾病；而且耐药菌株不断增加，抗生素在畜禽体内的残留也严重威胁到人类的健康。鉴于此，反对在饲料中添加抗生素的呼声越来越高。瑞典政府于1986年就开始在动物饲料中禁用抗生素类生长促进剂，1995丹麦、德国和芬兰等国也相继规定禁止在动物饲料中使用艾维菌素、泰乐菌素、螺旋霉素等抗生素，到2006年欧盟已全面禁止食品动物使用抗生素促生长饲料添加剂，其他发达国家，如美国、日本、韩国等也相继实施了禁令。大部分抗生素在我国动物生产中也逐步被限制用于饲料。

但同时，欧盟科学程序委员会1997年提出了由于抗生素的禁用而出现的抗病力受阻问题。丹麦2001年发表了自1997年抗生素禁用后的5年时间内食源性动物、食物和人类中抗菌药物使用量、抗病力受阻问题的年度监测报告。报告指出，饲料中抗生素的使用量减少，使猪抗病力下降，禁用抗生素后用于控制动物亚临床疾病的成本显著提高，尤其是动物处于管理水平一般或比较差的农场问题更为突出。

Jongbloed（1998）指出，抗生素促生长剂导致荷兰饲料利用率下降3%-8%。有研究也证实，禁用抗生素后，尽管生长猪、育肥猪应激减少，但仔猪的生产性能下降。Hedegaard (2001)指出，饲料中不用抗生素促生长剂后丹麦用于治疗断奶仔猪疾病的抗生素用量增加。丹麦全国生猪生产委员会曾收集了62家丹麦育肥猪生产企业猪群停用抗生素后的生产情况，结果发现，11%群体持续出现生产性能显著下降等一系列问题，26%的猪群出现了暂时性日增重下降，只有63%的猪群未因停用而导致日增重下降或下痢增加的现象。自1995-2000年期间，从使用抗生素到减少使用量，再到禁用抗生素，断奶保育猪日增重下降、腹泻率增加、慢性病感染率增加、营养需求增加但饲料效益下降。

在这种情况下，寻求一种无毒、无残留、应用效果好的饲料添加剂显得尤为必要，抗生素替代物的研究开发引起各国的重视。微生态制剂是抗生素的替代物之一，其中芽孢杆菌由于能形成休眠芽孢，具有耐高温、耐酸等特性，具有更广阔的应用前景。CN102517238A曾经报道了一种产酸蜡状芽孢杆菌及菌剂制备方法，但对于饲用益生芽孢杆菌而言，同时兼具多种高水解酶活性，且具有良好安全性和高粘附能力的菌株目前还未见报道。CN102093974A曾经报道过一株蜡状芽孢杆菌及其多阶段发酵方法，但该方法采用精细原料作为发酵培养基必将导致发酵成本的增加，而且控制过程比较复杂，缺乏发酵液结束后菌体回收工艺环节使得菌体的保藏、运输及使用受到很大限制，因此该工艺也较难在饲用益生菌工业化生产过程中推广和应用。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种蜡状芽孢杆菌BC158、蜡状芽孢杆菌益菌粉及其制备方法和用途；蜡状芽孢杆菌益菌粉的制备方法简单，成本低廉，所制备出的蜡状芽孢杆菌益生菌粉，蜡状芽孢杆菌的活菌含量为3×10⁹-5×10¹⁰CFU/g，可应用于动物养殖的饲料添加剂。

一种蜡状芽孢杆菌益生菌粉，其具体制备步骤为：

步骤一、斜面固体培养：将蜡状芽孢杆菌(Bacillus.cereus) BC158接种在固体斜面培养基上，37℃培养24h，得到斜面固体培养的菌种，备用；

所述的固体斜面培养基的组成成分为：按质量百分比，固体斜面培养基中含有牛肉膏0.3%-0.4%，蛋白胨1%-1.2%，氯化钠0.5%，琼脂粉1.5%-2%，余量为水；

步骤二、一级种子培养：取1-3接种环步骤一所制备的斜面固体培养的菌种接种于装有80-120mL 一级种子培养基的500mL 三角瓶中，然后34-37℃，220-250rpm 摇床培养10-16h，得到一级种子液，备用；

所述的一级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，一级种子培养基中含有酵母膏0.3-0.5％，蛋白胨0.5-0.7％，蔗糖0.5-1.0％，磷酸氢二钠0.3-0.6％，硫酸镁0.01-0.04％，硫酸锰0.06-0.09％，余量为水；

步骤三、二级种子培养：将上述步骤二培养好的一级种子液接种于装有1.5L二级种子培养基的5L 三角瓶中，接种量为二级种子培养基体积的4-7％，然后34-37℃，220-250rpm摇床培养12-18h，得到二级种子液，备用；

所述的二级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，二级种子培养基中含有蔗糖2.0-2.5％，玉米浆1.5-2.0％，硫酸镁0.01-0.03％，磷酸氢二钾0.5-1.2％，磷酸二氢钾0.075-0.100％，余量为水；

步骤四、三级种子培养：将上述步骤三培养好的二级种子液接种于装有60L三级种子培养基的100L 发酵罐中，接种量为三级种子培养基体积的3-5％；然后34-37℃，150-200rpm通风搅拌培养24-32h，得到三级种子培养液，备用；

所述的三级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，三级种子培养基中含有玉米粉2.5-3.5％，豆饼粉2.5-3.0％，玉米浆2.0-2.5％，余量为水；

步骤五、发酵罐培养：将上述步骤四所制备的三级种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的2-4％，然后于34-37℃，150-200rpm的通风搅拌培养24-32h，镜检芽孢率在95％以上，停止培养，放罐，得到发酵液；

所述的发酵培养基的组成成分为：按质量百分比，发酵培养基中含有玉米粉3.0-4.0％，豆饼粉2.5-3.0％，玉米浆2.0-2.5％，氯化钠0.5-1.0％，余量为水；

步骤六、将上述步骤五所得发酵液中添加玉米淀粉，添加量为发酵液质量的8-15％，搅拌均匀后将所得混合物直接进行喷雾干燥，料流量恒定100-180L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，即得到水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm的蜡状芽孢杆菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸发器将所得混合物进行蒸发浓缩，一效蒸发器的蒸发温度为85℃，二效蒸发器的蒸发温度为75℃，三效蒸发器的蒸发温度为65℃，当料液浓缩比达到1:3时停止浓缩；将经过浓缩后的料液用往复泵送入喷雾干燥塔进行喷雾干燥，料流量恒定100-180L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，最终获得水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm菌粉。

有益效果

1、相关实验证明，保藏编号为CGMCC No. 7433的蜡状芽孢杆菌BC158具有良好的耐酸、耐胆盐性能，并且对常见肠道致病菌具有一定的抑制性，而且该菌能产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶；该菌在 pH为2的环境下，存活率均在 90% 以上，表现出良好的耐酸性能； 在体外耐胆盐试验中也表现出了明显优势，在 0.7% 的胆盐浓度下，其存活率仍然维持在 80% 以上；并表现出高达49.68%的粘附能力；在抑菌实验中，表现出了较好的抑菌活性，对肠道有害菌大肠杆菌K88，肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显抑制效果。

2、本发明一种蜡状芽孢杆菌益生菌粉及其制备方法，以保藏编号为CGMCC No. 7433的蜡状芽孢杆菌BC158为菌种，该菌是从健康仔猪粪便中分离筛选得到的，并经相关动物实验验证，具有良好的安全性和益生性；以玉米粉、豆饼粉和玉米浆等低廉的工业原料为发酵培养基，成本低廉；采用逐级放大的四级培养工艺，通风搅拌深层液体发酵技术实现蜡状芽孢杆菌BC158的高密度培养，结合玉米淀粉等辅料的高温保护作用，实现了发酵液中蜡状芽孢杆菌的高密度回收，所制备的蜡状芽孢杆菌益生菌粉中芽孢率在95%以上，蜡状芽孢杆菌的活菌含量为3×10⁹-5×10¹⁰CFU/g。

3、本发明所制备的蜡状芽孢杆菌益生菌粉，有利于禽类和畜类提高对饲料的利用率，可在养殖行业的推广和应用；相关实验证明本发明所制备的蜡状芽孢杆菌益生菌粉可促进家禽、家畜的生长、减少发病率、提高成活率，这为利用现代生物技术生产“无抗”肉鸡的绿色食品提供了参考依据，对于寻找抗生素替代品有着重要意义，为控制畜产品的安全提供了重要线索。同时，为促进我国畜产品发展，提升产品质量的档次，突破畜禽产品绿色壁垒，促进畜禽产品的出口创汇都具有非常重要的意义。

生物材料的保藏

   蜡状芽孢杆菌(Bacillus.cereus) BC158，保藏日期为2013年4月9日，保藏单位及其简称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 7433。

附图说明

图1 为测定蜡状芽孢杆菌BC158最适生长温度的OD600值图谱；

图2 为测定蜡状芽孢杆菌BC158最适生长pH值的OD600值图谱；

图3 为蜡状芽孢杆菌BC158耐酸性检测的OD600值图谱；

图4 为蜡状芽孢杆菌BC158耐胆盐能力检测的OD600值图谱；

图5为蜡状芽孢杆菌BC158产淀粉酶结果图；

图6为蜡状芽孢杆菌BC158产蛋白酶结果照图；

图7为蜡状芽孢杆菌BC158产纤维素酶结果照图。

具体实施方式

一种蜡状芽孢杆菌BC158，具有良好的耐酸、耐胆盐性能，并且对常见肠道致病菌具有一定的抑制性，而且该菌能产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶；该菌在 pH为2的环境下，存活率均在 90% 以上，表现出良好的耐酸性能； 在体外耐胆盐试验中也表现出了明显优势，在 0.7% 的胆盐浓度下，其存活率仍然维持在 80% 以上；并表现出高达49.68%的粘附能力；在抑菌实验中，表现出了较好的抑菌活性，对肠道有害菌大肠杆菌K88，肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显抑制效果。

一种蜡状芽孢杆菌益生菌粉，其具体制备步骤为：

步骤一、斜面固体培养：将蜡状芽孢杆菌(Bacillus.cereus) BC158接种在固体斜面培养基上，37℃培养24h，得到斜面固体培养的菌种，备用；

所述的固体斜面培养基的组成成分为：按质量百分比，固体斜面培养基中含有牛肉膏0.3%-0.4%，蛋白胨1%-1.2%，氯化钠0.5%，琼脂粉1.5%-2%，余量为水；

步骤二、一级种子培养：取1-3接种环步骤一所制备的斜面固体培养的菌种接种于装有80-120mL 一级种子培养基的500mL 三角瓶中，然后34-37℃，220-250rpm 摇床培养10-16h，得到一级种子液，备用；

所述的一级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，一级种子培养基中含有酵母膏0.3-0.5％，蛋白胨0.5-0.7％，蔗糖0.5-1.0％，磷酸氢二钠0.3-0.6％，硫酸镁0.01-0.04％，硫酸锰0.06-0.09％，余量为水；

步骤三、二级种子培养：将上述步骤二培养好的一级种子液接种于装有1.5L二级种子培养基的5L 三角瓶中，接种量为二级种子培养基体积的4-7％，然后34-37℃，220-250rpm摇床培养12-18h，得到二级种子液，备用；

所述的二级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，二级种子培养基中含有蔗糖2.0-2.5％，玉米浆1.5-2.0％，硫酸镁0.01-0.03％，磷酸氢二钾0.5-1.2％，磷酸二氢钾0.075-0.100％，余量为水；

步骤四、三级种子培养：将上述步骤三培养好的二级种子液接种于装有60L三级种子培养基的100L 发酵罐中，接种量为三级种子培养基体积的3-5％；然后34-37℃，150-200rpm通风搅拌培养24-32h，得到三级种子培养液，备用；

所述的三级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，三级种子培养基中含有玉米粉2.5-3.5％，豆饼粉2.5-3.0％，玉米浆2.0-2.5％，余量为水；

步骤五、发酵罐培养：将上述步骤四所制备的三级种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的2-4％，然后于34-37℃，150-200rpm的通风搅拌培养24-32h，镜检芽孢率在95％以上，停止培养，放罐，得到发酵液；

所述的发酵培养基的组成成分为：按质量百分比，发酵培养基中含有玉米粉3.0-4.0％，豆饼粉2.5-3.0％，玉米浆2.0-2.5％，氯化钠0.5-1.0％，余量为水；

步骤六、将上述步骤五所得发酵液中添加玉米淀粉，添加量为发酵液质量的8-15％，搅拌均匀后将所得混合物直接进行喷雾干燥，料流量恒定100-180L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，即得到水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm的蜡状芽孢杆菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸发器将所得混合物进行蒸发浓缩，一效蒸发器的蒸发温度为85℃，二效蒸发器的蒸发温度为75℃，三效蒸发器的蒸发温度为65℃，当料液浓缩比达到1:3时停止浓缩；将经过浓缩后的料液用往复泵送入喷雾干燥塔进行喷雾干燥，料流量恒定100-180L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，最终获得水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm菌粉。

实施例1

一种蜡状芽孢杆菌益生菌粉，其具体制备步骤为：

步骤一、斜面固体培养：将蜡状芽孢杆菌(Bacillus.cereus) BC158接种在固体斜面培养基上，37℃培养24h，得到斜面固体培养的菌种，备用；

所述的固体斜面培养基的组成成分为：按质量百分比，固体斜面培养基中含有牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂粉1.5%，余量为水；

步骤二、一级种子培养：取1接种环步骤一所制备的斜面固体培养的菌种接种于装有80 一级种子培养基的500mL 三角瓶中，然后34℃，220rpm 摇床培养10h，得到一级种子液，备用；

所述的一级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，一级种子培养基中含有酵母膏0.3％，蛋白胨0.5％，蔗糖0.5％，磷酸氢二钠0.3％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.06％，余量为水；

步骤三、二级种子培养：将上述步骤二培养好的一级种子液接种于装有1.5L二级种子培养基的5L 三角瓶中，接种量为二级种子培养基体积的4％，然后34℃，220rpm摇床培养12h，得到二级种子液，备用；

所述的二级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，二级种子培养基中含有蔗糖2.0％，玉米浆1.5％，硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.5％，磷酸二氢钾0.075％，余量为水；

步骤四、三级种子培养：将上述步骤三培养好的二级种子液接种于装有60L三级种子培养基的100L 发酵罐中，接种量为三级种子培养基体积的3％；然后34℃，150rpm通风搅拌培养24h，得到三级种子培养液，备用；

所述的三级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，三级种子培养基中含有玉米粉2.5％，豆饼粉2.5％，玉米浆2.0％，余量为水；

步骤五、发酵罐培养：将上述步骤四所制备的三级种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的2％，然后于34℃，150rpm的通风搅拌培养24h，镜检芽孢率在95％以上，停止培养，放罐，得到发酵液；

所述的发酵培养基的组成成分为：按质量百分比，发酵培养基中含有玉米粉3.0％，豆饼粉2.5％，玉米浆2.0％，氯化钠0.5％，余量为水；

步骤六、将上述步骤五所得发酵液中添加玉米淀粉，添加量为发酵液质量的8％，搅拌均匀后将所得混合物直接进行喷雾干燥，料流量恒定100L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，即得到水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm的蜡状芽孢杆菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸发器将所得混合物进行蒸发浓缩，一效蒸发器的蒸发温度为85℃，二效蒸发器的蒸发温度为75℃，三效蒸发器的蒸发温度为65℃，当料液浓缩比达到1:3时停止浓缩；将经过浓缩后的料液用往复泵送入喷雾干燥塔进行喷雾干燥，料流量恒定100L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，最终获得水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm菌粉。

实施例2

一种蜡状芽孢杆菌益生菌粉，其具体制备步骤为：

步骤一、斜面固体培养：将蜡状芽孢杆菌(Bacillus.cereus) BC158接种在固体斜面培养基上，37℃培养24h，得到斜面固体培养的菌种，备用；

所述的固体斜面培养基的组成成分为：按质量百分比，固体斜面培养基中含有牛肉膏0.4%，蛋白胨1.2%，氯化钠0.5%，琼脂粉2%，余量为水；

步骤二、一级种子培养：取3接种环步骤一所制备的斜面固体培养的菌种接种于装有120mL 一级种子培养基的500mL 三角瓶中，然后37℃，250rpm 摇床培养16h，得到一级种子液，备用；

所述的一级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，一级种子培养基中含有酵母膏0.5％，蛋白胨0.7％，蔗糖1.0％，磷酸氢二钠0.6％，硫酸镁0.04％，硫酸锰0.09％，余量为水；

步骤三、二级种子培养：将上述步骤二培养好的一级种子液接种于装有1.5L二级种子培养基的5L 三角瓶中，接种量为二级种子培养基体积的7％，然后37℃， 250rpm摇床培养18h，得到二级种子液，备用；

所述的二级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，二级种子培养基中含有蔗糖2.5％，玉米浆2.0％，硫酸镁0.03％，磷酸氢二钾1.2％，磷酸二氢钾0.100％，余量为水；

步骤四、三级种子培养：将上述步骤三培养好的二级种子液接种于装有60L三级种子培养基的100L 发酵罐中，接种量为三级种子培养基体积的5％；然后37℃， 200rpm通风搅拌培养32h，得到三级种子培养液，备用；

所述的三级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，三级种子培养基中含有玉米粉3.5％，豆饼粉3.0％，玉米浆2.5％，余量为水；

步骤五、发酵罐培养：将上述步骤四所制备的三级种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的4％，然后于37℃， 200rpm的通风搅拌培养32h，镜检芽孢率在95％以上，停止培养，放罐，得到发酵液；

所述的发酵培养基的组成成分为：按质量百分比，发酵培养基中含有玉米粉4.0％，豆饼粉3.0％，玉米浆2.5％，氯化钠1.0％，余量为水；

步骤六、将上述步骤五所得发酵液中添加玉米淀粉，添加量为发酵液质量的15％，搅拌均匀后将所得混合物直接进行喷雾干燥，料流量恒定180L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，即得到水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm的蜡状芽孢杆菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸发器将所得混合物进行蒸发浓缩，一效蒸发器的蒸发温度为85℃，二效蒸发器的蒸发温度为75℃，三效蒸发器的蒸发温度为65℃，当料液浓缩比达到1:3时停止浓缩；将经过浓缩后的料液用往复泵送入喷雾干燥塔进行喷雾干燥，料流量恒定180L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，最终获得水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm菌粉。

实施例3

一种蜡状芽孢杆菌益生菌粉，其具体制备步骤为：

步骤一、斜面固体培养：将蜡状芽孢杆菌(Bacillus.cereus) BC158接种在固体斜面培养基上，37℃培养24h，得到斜面固体培养的菌种，备用；

所述的固体斜面培养基的组成成分为：按质量百分比，固体斜面培养基中含有牛肉膏0.35%，蛋白胨1.1%，氯化钠0.5%，琼脂粉1.8%，余量为水；

步骤二、一级种子培养：取2接种环步骤一所制备的斜面固体培养的菌种接种于装有100mL 一级种子培养基的500mL 三角瓶中，然后36℃，240rpm 摇床培养14h，得到一级种子液，备用；

所述的一级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，一级种子培养基中含有酵母膏0.4％，蛋白胨0.6％，蔗糖0.8％，磷酸氢二钠0.5％，硫酸镁0.03％，硫酸锰0.08％，余量为水；

步骤三、二级种子培养：将上述步骤二培养好的一级种子液接种于装有1.5L二级种子培养基的5L 三角瓶中，接种量为二级种子培养基体积的6％，然后36℃，230rpm摇床培养17h，得到二级种子液，备用；

所述的二级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，二级种子培养基中含有蔗糖2.2％，玉米浆1.7％，硫酸镁0.02％，磷酸氢二钾0.8％，磷酸二氢钾0.08％，余量为水；

步骤四、三级种子培养：将上述步骤三培养好的二级种子液接种于装有60L三级种子培养基的100L 发酵罐中，接种量为三级种子培养基体积的4％；然后35℃，180rpm通风搅拌培养28h，得到三级种子培养液，备用；

所述的三级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，三级种子培养基中含有玉米粉2.9％，豆饼粉2.8％，玉米浆2.3％，余量为水；

步骤五、发酵罐培养：将上述步骤四所制备的三级种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％，然后于36℃，180rpm的通风搅拌培养28h，镜检芽孢率在95％以上，停止培养，放罐，得到发酵液；

所述的发酵培养基的组成成分为：按质量百分比，发酵培养基中含有玉米粉3.5％，豆饼粉2.8％，玉米浆2.8％，氯化钠0.9％，余量为水；

步骤六、将上述步骤五所得发酵液中添加玉米淀粉，添加量为发酵液质量的10％，搅拌均匀后将所得混合物直接进行喷雾干燥，料流量恒定160L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，即得到水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm的蜡状芽孢杆菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸发器将所得混合物进行蒸发浓缩，一效蒸发器的蒸发温度为85℃，二效蒸发器的蒸发温度为75℃，三效蒸发器的蒸发温度为65℃，当料液浓缩比达到1:3时停止浓缩；将经过浓缩后的料液用往复泵送入喷雾干燥塔进行喷雾干燥，料流量恒定170L/h，压力2MPa，喷雾干燥塔热风进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥时间为25s，最终获得水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径约为0.06mm菌粉。

相关实验：

一、菌株的分离、筛选与鉴定

1、菌株的分离、筛选

在河南省洛阳市裴村一养猪场选择2周龄健康仔猪，称取其粪便1.5g，置于装有30ml无菌蒸馏水的三角瓶中，然后80℃水浴加热20min后，从中吸取2ml放入装有30ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，接着37℃、180rpm，培养24h后得到种子液。然后吸取1ml种子液于装有9ml蒸馏水的试管中，混匀，再从中吸取1ml于另支装有9ml蒸馏水的试管中，依次稀释，得到稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10-⁵的菌液，然后从稀释度为10^-5的菌液 中吸取0.1ml涂装有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板，37℃，培养24h。培养结束后，把单菌落划线纯化，然后斜面保藏，将其命名为BC158。

2、菌株的鉴定

（1）、菌株的生理生化鉴定

对所得纯化的菌种进行生理生化鉴定，同时与蜡状芽孢杆菌的进行对比；观察纯化的菌落外观形态，进行革兰氏染色和芽孢染色，确认细菌染色形态。并进行与硝酸还原实验、过氧化氢酶、吲哚试验、明胶液化实验、甲基红实验、V.P实验、葡萄糖产酸实验、葡萄糖产气实验、硫化氢实验、卵磷脂酶实验、5%氯化钠是否生长实验；结果如表1所示，对比表1中，+表示阳性；-表示阴性；结果表明，其为革兰氏阳性菌，会产生芽孢、菌落直径为5-7mm，菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，稍有光泽的白色； 各理化指标和蜡状芽孢杆菌相同；

表1：鉴定菌株与蜡状芽孢杆菌的生化性状

                                                 

 （2）、菌株的分子生物学鉴定

设计细菌16srDNA的通用引物，其引物序列为：正向引物：27F ：5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'；反向引物：1492 R ：5'-GGTTA CCTTG TTACG ACTT-3'； 用CTAB法提取细菌基因组DNA，然后以此为模板，以通用引物为引物，进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，在1500kb处有单一亮带，然后用DNA胶回收试剂盒进行胶回收，送生物工程上海股份有限公司进行测序。测序条件为先92℃2分钟后，然后92°30秒、55°15秒、70°15秒共30个循环，最后4°保存；反应结束后于各微量离心管分别加入3ul stop solution，置于92°加热3分钟，测序产物以5.5%Kbplus gel(LI-COR,Inc,Lincoln,Nebraska,U.S.A)及LI-COR测序系统（LI-COR,Inc,Lincoln,Nebraska,U.S.A）进行分析。利用Base imageIR( LI-COR,Inc,Lincoln,Nebraska,U.S.A)软件撷取电泳的序列，将数据输入GeneBase（Applied Maths,Belgium）进行排列，构筑得到BC158菌株完整的16srDNA序列，该16srDNA序列如序列表中序列1的所示；将BC158菌株完整的16srDNA序列进行NCBI blast分析，比对结果与蜡状芽孢杆菌有100%的相似性。

综上，序列比对的结果结合形态和生理生化特征，表明菌株BC158属于蜡状芽孢杆菌。

二、蜡状芽孢杆BC158最适生长环境的测定

1、蜡状芽孢杆菌BC158最适生长温度的测定

将获得的蜡状芽孢杆菌BC158分别接种于6个装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，接种量为普通的牛肉膏蛋白胨液体培养基体积的1%，然后将其分别在温度为30℃、33℃、37℃、39℃、42℃、45℃条件下180r/min摇床震荡培养24h，分别取菌液测定OD600值，确定菌种的最适生长温度。

结果如图1所示，37℃时OD600值最大， 表明蜡状芽孢杆菌(Bacillus.cereus)最适生长温度为37℃。

2、蜡状芽孢杆菌BC158最适生长pH值的测定

将获得的蜡状芽孢杆菌BC158分别接种于6个装有pH值为6.4、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6，牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，37℃，180r/min摇床震荡培养24h，分别取菌液测定OD600值，确定菌种的最适生长pH值。

结果如图2所示，pH值为7.0-7.2时OD600值最大，蜡状芽孢杆菌BC158

增殖效果最好，表明蜡状芽孢杆菌BC158的最适生长pH值为7.0-7.2。

三、蜡状芽孢杆菌BC158的益生性检测

1、蜡状芽孢杆菌BC158的耐酸性检测

将获得的蜡状芽孢杆菌BC158接种于装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，37℃，180r/min摇床震荡培养24h后，接种于pH值分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.5的生理盐水中，接种量为生理盐水体积的4%，2h后，测OD600值，结果如图3所示；以pH6.5为对照，各pH的OD600值除以pH的OD600值为该菌的存活率，该菌株在pH的存活率仍在90%以上，说明该菌具有良好的耐酸性能。

2、蜡状芽孢杆菌BC158的耐胆盐能力检测

将获得的蜡状芽孢杆菌BC158接种于装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，37℃，180r/min摇床震荡培养24h后，接种于胆盐质量浓度分别为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的生理盐水中，2h后，测OD600值，结果如图4所示，各胆盐浓度的OD600值除以对照的OD600值为该菌的存活率，表明，该菌株能耐受0.5%的胆盐浓度。

3、蜡状芽孢杆菌BC158的抑菌能力检测

采用琼脂平板扩散法，普通的琼脂培养基倒牛肉膏蛋白胨培养基平板，厚度约为4mm，平板上涂布0.1ml的大肠杆菌（K88）、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌菌液，然后打孔器在平板上打孔（孔径5mm左右），将各菌株37℃培养24h后，取蜡状芽孢杆菌BC158菌株的发酵液加满于孔中，37°培养24h后测量抑菌圈的直径，结果如表2所示。表明，该菌能有效抑制肠道常见病原微生物：大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长。

表2:抑菌能力检测结果

4、蜡状芽孢杆菌BC158产酶能力检测

将蜡状芽孢杆菌BC158点种于淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶选择性培养基的平板中，37℃，培养24h，培养结束后，淀粉酶选择性培养基平板上滴加碘液，会出现明显透明圈；蛋白酶的选择性培养基平板上会出现透明圈；纤维素酶选择性培养基平板上先滴加1mg/ml的刚果红溶液，染色30min后，再滴加1mol/L的氯化钠溶液，会出现透明圈，结果如图5、6、7所示，表明，该菌具有良好的产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶的能力。

5、蜡状芽孢杆菌BC158粘附能力检测

将蜡状芽孢杆菌BC158接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，培养24h，培养结束后，对菌液进行以6000rpm离心10min收集菌体，然后用无菌PBS缓冲液洗涤两次，然后加入少量PBS缓冲液重悬菌体，并调制菌液的浓度为10⁸-10⁹CFU/ml，备用；

接着，分别刮取猪前肠，中肠，后肠粘液，以2000rpm，10min离心收集上清，标定蛋白含量至0.5mg/ml；取300ul标定好的肠粘液于96孔培养板内，4℃过夜，用等量的质量百分比为0.2%的牛血清白蛋白代替肠粘液作为阴性对照；多余的肠粘液用无菌PBS缓冲液冲洗两次；加入计数后的备用的菌悬液，37℃孵育2h；用300ul的无菌PBS缓冲液冲洗2次以去除未粘附的细菌；然后每孔加入300ul的质量百分比为的1%SDS和0.1mol/L NaOH的混合物，60℃温育1.5h，以使粘附于肠粘液上的细菌溶解。然后用血球计数板来进行计数。通过粘附前后细菌个数，来计算粘附率。每个实验三次重复，结果见表3。从表可以看出，BC158对肠粘液的粘液能力很强，对前肠粘液的粘附率高达49.68%。

表3：粘附能力检测结果

四、蜡状芽孢杆菌BC158菌粉活菌数检测

  1、样品制备：取7份蜡状芽孢杆菌BC158菌粉，将其分别编号为1、2、3、4、5；从每份蜡状芽孢杆菌BC158菌粉中称取50g蜡状芽孢杆菌BC158菌粉于烧杯中，置于450ml无菌蒸馏水中，混匀，制成1：10样品稀释液；然后从1:10稀释液中吸取10ml加入到含90ml无菌蒸馏水的烧杯中，充分混匀，制成1:100样品稀释液，一次类推，稀释至10^-10；

 2、平板计数：取各稀释样品0.1ml接种到MYP培养基平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，每组3个平行，将平板置于37℃培养24h。蜡状芽孢杆菌BC158在MYP培养基平板上生成的菌落为粉红色，且菌落周围产生卵磷脂酶透明圈，培养结束后，从平板上计数蜡状芽孢杆菌的典型菌落。计数后，从每个平板上至少选取5个已经计数的菌落分别接种于牛肉膏蛋白胨平板上，于37℃培养24h，进行证实实验。然后根据证实实验确定为蜡状芽孢杆菌的菌落数，按比例计算出该平板中的蜡状芽孢杆菌菌落数，然后再乘以稀释倍数再乘以10，即得每克样品中所含的蜡状芽孢杆菌个数，结果如表4所示；

 表4：蜡状芽孢杆菌菌落数统计结果

五、蜡状芽孢杆菌BC158在仔猪养殖中的应用

试验选择24日龄左右的断奶仔猪120头，根据体重、窝别、性别分为5个组，每个组设3个重复，每重复6头，具体设计方案如表5所示；抗生素对照组为基础日粮添加杆菌肽锌和硫酸抗敌素。其他3个处理组为基础日粮添加蜡状芽孢杆菌益生菌粉，分别为低剂量组（1g蜡状芽孢杆菌益生菌粉/kg饲料），中剂量组（5g蜡状芽孢杆菌益生菌粉/kg饲料），高剂量组（15g蜡状芽孢杆菌益生菌粉/kg饲料）。其中，仔猪的基础日粮组成成分为：膨化玉米30%、玉米19%，豆粕6.5%，鱼粉2.5%，乳清粉9%，膨化大豆9.5%，脂肪粉2.35%，血浆蛋白4%，血球粉1%，代乳粉10%，葡萄糖2%，石粉1.13%，碳酸氢钙1.12%，防霉剂0.2%，氧化锌0.3%，酸化剂0.15%和嘉禾S614型乳猪预混料1%。                     

表5：试验设计方案

试验开始后，按组分别饲喂仔猪，观察其采食、饮水、活动等情况，记录患病腹泻等情况，详细记录每组的饲喂量。在试验开始0d，30d清晨对每窝猪进行空腹称重，统计每组猪耗料量，结果如表6；

表6：蜡状芽孢杆菌的添加对仔猪生长的影响

注：日增重=（试验末平均体重-起始平均体重）/试验天数；平均日采食量=总耗料量/总饲养日；耗料增重比=总耗料/总增重

表7：蜡状芽孢杆菌益生菌粉的添加对仔猪腹泻率的影响

 注：腹泻率=腹泻头数/总饲养日×100%

以上结果表明，蜡状芽孢杆菌益生菌粉可提高仔猪生长速度，减少仔猪腹泻率。

六、蜡状芽孢杆菌BC158在鸡养殖中的应用

将500只雏鸡，随机分为4个组，每组125只，1组为对照组，2组、3组、4组为试验组。试验组日粮和对照组日粮的基本组份相同，唯一不同的是试验组日粮中加有蜡状芽孢杆菌菌粉。试验组饮水和环境中依周龄不同，分别添加不同浓度的嗜酸乳酸杆菌菌粉。从试验开始到结束，试验组和对照组人员之间要严格隔开，禁止人员之间窜组。对照组的管理按照以往的管理方式，日常所有药物及抗生素按照出口肉鸡的标准进行执行，所用消毒试剂也和以往相同。而试验组必须按照试验的标准、要求进行，不使用一切抗生素药物。饲料方面要求育雏前1周（1-7日龄）采用原育雏料，即和对照组一样的饲料，第2周开始饲料中开始添加蜡状芽孢杆菌菌粉，各期蜡状芽孢杆菌菌粉的添加浓度见表8。

表8：采食数据及饲料中添加的蜡状芽孢杆菌菌粉的量；

鸡舍内温、湿度控制温度每周上下浮动不超过5℃，每天上下浮动不超过2℃；湿度的控制由于后期通风量的增大，单凭喷雾不能保证正常的湿度，可采用人工适当增加湿度。具体要求见表9。

表9：鸡舍内温湿度控制及每天每羽饮水耗量；

兽医防疫及环境保护工作①雏鸡所有兽医防疫及饲养管理措施全部按照原农场方案执行；②饲料中（包括预混料）取消一切抗生素，临床上不使用抗生素；③所有兽医防疫系统按原农场方案执行（指疫苗接种、隔离制度、环境卫生等）；④鸡舍内外环境不使用任何化学消毒剂，改用定期施撒生石灰粉。

蜡状芽孢杆菌菌粉对雏鸡成活率、评价出栏重、料肉比及出栏数等的影响见表10，由表可知试验组成活率、出栏平均体重、料肉比之间差异显著，其中成活率极显著高于对照组。

表10 ：成活率、评价出栏重、料肉比及出栏数据

 所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基配方为：每1000ml培养基，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，余量为水，pH7.0-7.2；

所述的牛肉膏蛋白胨固体培养基配方为：每1000ml培养基，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉1.5g,余量为水，pH7.0-7.2；

所述的MYP培养基配方为：每1000ml培养基，蛋白胨10g,甘露醇10g，牛肉膏1g，氯化钠10g，酚红0.025g，琼脂15g，pH7.2。

所述PBS缓冲液的配方为：每1000ml缓冲液中，氯化钠8g，磷酸氢二钠1.44 g，磷酸二氢钾0.24g，氯化钾0.2g，余量为水。

       SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南科技大学

 

<120>  一种蜡样芽孢杆菌益生菌粉及其制备方法

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1459

<212>  DNA

<213>  蜡样芽孢杆菌(Bacillus.cereus)

 

<400>  1

cagtcggtcg gccgactata catgcaagtc gagcgaatgg attaagagct tgctcttatg     60

 

aagttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccataagac tgggataact    120

 

ccgggaaacc ggggctaata ccggataaca ttttgaaccg catggttcga aattgaaagg    180

 

cggcttcggc tgtcacttat ggatggaccc gcgtcgcatt agctagttgg tgaggtaacg    240

 

gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga    300

 

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt    360

 

ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact ctgttgttag    420

 

ggaagaacaa gtgctagttg aataagctgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac    480

 

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggaattat    540

 

tgggcgtaaa gcgcgcgcag gtggtttctt aagtctgatg tgaaagccca cggctcaacc    600

 

gtggagggtc attggaaact gggagacttg agtgcagaag aggaaagtgg aattccatgt    660

 

gtagcggtga aatgcgtaga gatatggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctttctggtc    720

 

tgtaactgac actgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt    780

 

ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agagggtttc cgccctttag tgctgaagtt    840

 

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca aaggaattga    900

 

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta    960

 

ccaggtcttg acatcctctg aaaaccctag agatagggct tctccttcgg gagcagagtg   1020

 

acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac   1080

 

gagcgcaacc cttgatctta gttgccatca ttaagttggg cactctaagg tgactgccgg   1140

 

tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct   1200

 

acacacgtgc tacaatggac ggtacaaaga gctgcaagac cgcgaggtgg agctaatctc   1260

 

ataaaaccgt tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc   1320

 

tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc   1380

 

gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taaccttttt ggagccagcc   1440

 

gcctaatgtg acaggagtg                                                1459

 

Claims (6)

1.一种蜡状芽孢杆菌，其特征在于：分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus.cereus) BC158，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7433。

2.利用权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌BC158生产蜡状芽孢杆菌益生菌粉的方法，其特征在于：其具体制备步骤为：

步骤一、斜面固体培养：将所述的蜡状芽孢杆菌BC158接种在固体斜面培养基上，37℃培养24h，得到斜面固体培养的菌种，备用；

所述的固体斜面培养基的组成成分为：按质量百分比，固体斜面培养基中含有牛肉膏0.3%-0.4%，蛋白胨1%-1.2%，氯化钠0.5%，琼脂粉1.5%-2%，余量为水；

步骤二、一级种子培养：取1-3接种环步骤一所制备的斜面固体培养的菌种接种于装有80-120mL 一级种子培养基的500mL 三角瓶中，然后34-37℃，220-250rpm 摇床培养10-16h，得到一级种子液，备用；

所述的一级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，一级种子培养基中含有酵母膏0.3-0.5％，蛋白胨0.5-0.7％，蔗糖0.5-1.0％，磷酸氢二钠0.3-0.6％，硫酸镁0.01-0.04％，硫酸锰0.06-0.09％，余量为水；

步骤三、二级种子培养：将上述步骤二培养好的一级种子液接种于装有1.5L二级种子培养基的5L 三角瓶中，接种量为二级种子培养基体积的4-7％，然后34-37℃，220-250rpm摇床培养12-18h，得到二级种子液，备用；

所述的二级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，二级种子培养基中含有蔗糖2.0-2.5％，玉米浆1.5-2.0％，硫酸镁0.01-0.03％，磷酸氢二钾0.5-1.2％，磷酸二氢钾0.075-0.100％，余量为水；

步骤四、三级种子培养：将上述步骤三培养好的二级种子液接种于装有60L三级种子培养基的100L 发酵罐中，接种量为三级种子培养基体积的3-5％；然后34-37℃，150-200rpm通风搅拌培养24-32h，得到三级种子培养液，备用；

所述的三级种子培养基的组成成分为：按质量百分比，三级种子培养基中含有玉米粉2.5-3.5％，豆饼粉2.5-3.0％，玉米浆2.0-2.5％，余量为水；

步骤五、发酵罐培养：将上述步骤四所制备的三级种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基体积的2-4％，然后于34-37℃，150-200rpm的通风搅拌培养24-32h，镜检芽孢率在95％以上，停止培养，放罐，得到发酵液；

所述的发酵培养基的组成成分为：按质量百分比，发酵培养基中含有玉米粉3.0-4.0％，豆饼粉2.5-3.0％，玉米浆2.0-2.5％，氯化钠0.5-1.0％，余量为水；

步骤六、将上述步骤五所得发酵液中添加玉米淀粉，添加量为发酵液质量的8-15％，搅拌均匀后将所得混合物进行喷雾干燥，即得到蜡状芽孢杆菌益生菌粉。

3.如权利要求2所述的生产蜡状芽孢杆菌益生菌粉的方法，其特征在于：步骤六将所得混合物浓缩后进行喷雾干燥，浓缩的具体操作方法为，采用三效降膜式蒸发器将所得混合物进行蒸发浓缩，一效蒸发器的蒸发温度为85℃，二效蒸发器的蒸发温度为75℃，三效蒸发器的蒸发温度为65℃，当料液浓缩比达到1:3时停止浓缩。

4.如权利要求2所述的生产蜡状芽孢杆菌益生菌粉的方法制成的蜡状芽孢杆菌益生菌粉，其特征在于：蜡状芽孢杆菌益生菌粉的组成成分包括玉米淀粉和蜡状芽孢杆菌。

5.如权利要求4所述的蜡状芽孢杆菌益生菌粉，其特征在于：蜡状芽孢杆菌的活菌含量为3×10⁹-5×10¹⁰CFU/g，水分的质量百分比为5%，菌粉颗粒直径为0.06mm。

6.如权利要求2所述的生产蜡状芽孢杆菌益生菌粉的方法制成的蜡状芽孢杆菌益生菌粉在动物养殖的饲料添加剂中的应用。