CN105219683A - 一株具有益生特征的罗伊氏乳杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株具有益生特征的罗伊氏乳杆菌菌株及其应用。本发明的罗伊氏乳杆菌，名称为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus？reuteri)LR1，于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC？No.11154。本发明提供菌株是从健康动物肠道中分离得到，安全性高，该菌株具有很好耐酸、耐胆盐能力，抗逆性强，该菌株对常见猪致病菌有较强抑制能力，其能通过黏附、竞争占位等方式抑制致病菌对肠上皮细胞黏附，减轻致病菌对肠上皮细胞的损伤；其还可促进肠上皮细胞增殖，促进动物肠道发育成熟，其还具有免疫调节功能。

Description

一株具有益生特征的罗伊氏乳杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物及其应用领域，具体涉及一株具有益生特征的罗伊氏乳杆菌菌株及其应用。

背景技术

饲料中使用抗生素在促进畜禽生长的同时，其弊端日益明显，包括：耐药菌株的产生和流行、引起机体内源感染或二重感染、导致机体免疫功能下降、药物在畜产品中残留并通过食物链影响人类健康和生态环境。2012年中国年产抗生素达21万吨，其中有近半被用于了畜牧养殖业，国内抗生素用量分别超出美国的4倍以上、部分欧盟国家10倍以上。由于大量使用抗生素导致畜禽肠道内微生物产生大量耐药基因，这些耐药基因随粪便一起被排泄到外界环境。一项最新研究发现，在施用养殖场粪肥后，中国商用养猪场周围土壤中抗生素耐药基因的种类和浓度超出森林土壤。携带耐药基因微生物可随着河流、地下水或者农产品被扩散，给人类带来潜在健康危险。2002年世界卫生组织已提出减少食用动物中抗生素使用的全球原则，欧盟已于2006年禁止在饲料中使用抗生素，美国也将于2015年禁止在饲料中使用抗生素。我国也制订了禁止和逐步淘汰绝大部分饲用抗生素政策和措施，《中国饲料工业1996～2020年发展战略》和《生产绿色食品的饲料添加剂使用准则》中也明确规定了今后我国饲料生产和发展的方向，将逐步控制或减少传统抗生素在饲料中添加的种类和数量，促进我国畜牧业健康可持续发展。随着《饲料和饲料添加剂管理条例》和《饲料原料目录》的正式实施，禁用饲用抗生素也将进入实施阶段，因此开发合适抗生素替代品成为当前最迫切任务。

目前，国内外公认的饲料中抗生素替代品包括微生态益生菌制剂、抗菌肽、酶制剂、中草药、植物提取物和酸化剂等6大类，在多种抗生素替代品中，益生菌由于在免疫功能调节、肠道炎症性疾病治疗、肠道应激综合征和腹泻防治等方面发挥重要作用日益受到重视。目前市面上在售的益生菌类产品质量良莠不齐，普遍存在菌种来源不明、宿主特异性差、功能不明确，甚至存在鱼目混珠现象。

动物肠道中寄住中大量微生物，其中乳酸杆菌是在动物消化道中为主要有益菌群，其在维持肠道健康、促进机体免疫系统的发育与成熟等方面发挥重要作用。猪肠道中乳酸杆菌有嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)、纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacilluscellobiosus)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillusfermentum)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivirius)、短乳酸杆菌(Lactobacillusbrevis)等。罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)是目前已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌，对肠黏膜上皮细胞有较强的粘附能力。L.reuteri在抗病毒方面效果非常显著。Oh等发现，哺乳仔猪饲喂L.reuteriHY25101菌株后能更有效预防PEDV感染。Seo等研究发现，L.reuteri(Probio-16)可以抑制轮状病毒对非洲绿猴上皮细胞系TF-104感染。在治疗由轮状病毒引起腹泻上L.reuteri有明显效果，尤其是儿童。L.reuteri能明显缩短由轮状病毒导致腹泻时间，而且L.reuteri添加量越多，腹泻停止时间越快。L.reuteri能产生一种被称为罗伊氏菌素(Reuterin)的广谱抗菌物质，它能广泛地抑制大肠埃希氏杆菌、鼠伤寒杆菌、白假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌、黄曲霉菌、空肠弯曲杆菌及产芽孢梭菌等病菌。Frese等比较了来自8种不同脊椎动物的L.reuteri基因组序列，发现它们之间存在根本性差异，L.reuteri为适应不同动物肠道微环境其基因组序列也发生相应改变。因此从健康动物肠道内分离抗逆性强、功效突出的乳酸杆菌是筛选饲用益生菌重要途径之一。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株从健康动物肠道筛选出的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)。该乳杆菌具有益生特征，能耐酸和耐胆盐，抗逆性强；对肠上皮细胞粘附能力强；对猪常见致病菌具有一定的抑制作用；可抑制产肠毒素大肠杆菌(ETECK88)对肠上皮细胞的损伤；可促进肠上皮细胞增殖；同时在体外肠上皮细胞模型中该乳杆菌具有较强免疫调节功能。

本发明的另一目的在于提供所述的罗伊氏乳杆菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，名称为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1，于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11154。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1的培养条件：培养基采用MRS肉汤培养基，pH5.5，培养温度37±1℃，50～70rpm震荡培养24～48h。

所述的MRS肉汤培养基的组成成分为：酪蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、酵母提取物5g/L、磷酸氢二钾2g/L、枸橼酸钠2g/L、七水硫酸镁0.58g/L、四水硫酸锰0.25g/L、醋酸钠5g/L、吐温-801mL/L；pH为5.5，121℃高压灭菌15min，放于4℃冰箱中备用；MRS固体培养基(pH5.5)只需要在灭菌前加入15g/L琼脂即可。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1的菌落形态：LR1菌株在平板上菌落呈现灰白色或乳白色，不透明、表面光滑、凸起、边缘整齐，直径1～1.5mm。(如图1所示)

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1具备抑制常见肠道致病菌能力。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1具备抑制肠毒素大肠杆菌ETECK88对肠上皮细胞的损伤的功能。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1具备免疫调节功能。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1具备促进肠上皮细胞增殖上的功能。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1在制备用于治疗肠道疾病的制剂中的应用。

所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1在促进肠上皮细胞增殖上的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明提供菌株是从健康动物肠道中分离得到，安全性高，该菌株具有很好耐酸、耐胆盐能力，抗逆性强，该菌株对常见猪致病菌有较强抑制能力，其能通过黏附、竞争占位等方式抑制致病菌对肠上皮细胞黏附，其还可促进肠上皮细胞增殖，促进动物肠道发育成熟，其还具有免疫调节功能。

附图说明

图1是罗伊氏乳杆菌LR1在MRS平板上菌落形态图。

图2是罗伊氏乳杆菌LR1黏附猪小肠上皮细胞系IPEC-1的结果图。

图3是罗伊氏乳杆菌LR1抑制产肠毒素大肠杆菌K88黏附猪小肠上皮细胞系IPEC-1的结果图。

图4是罗伊氏乳杆菌LR1促进猪小肠上皮细胞系IPEC-1增殖的结果图。

图5是罗伊氏乳杆菌LR1调控IPEC-1细胞免疫细胞因子基因mRNA表达的结果图。

图6是罗伊氏乳杆菌LR1调控IPEC-1细胞免疫细胞因子蛋白表达的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件。

PBS溶液的制备方法如下：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O3.628g，溶于800mL蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000mL，备用。

实施例1罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1的分离、鉴定

1、分离

选取5头健康断奶仔猪(杜洛克×长白×大洛克，广东省农科院动物科学研究所动物试验场饲养)，屠宰后收集回肠、结肠和直肠内容物，装于无菌采样袋中，冷藏保存后快速送至无菌室进行处理。用无菌的PBS溶液重悬肠道内容物，并漩涡震荡40s，之后梯度稀释至10^-6。取稀释后的肠道内容物样品0.2mL均匀涂到MRS固体培养基(pH.5.5)平板上，采用烛缸法37℃培养48h。从平皿中挑选共106个乳白色的单一菌落重新在MRS固体培养基(pH.5.5)平板上划线分离，再采用烛缸法37℃培养48h，按上述步骤纯化两次后做纯培养，而后置于4℃冰箱保存备用。

取少量菌液涂布载玻片上，固定后革兰氏染色，镜检，选取无芽孢革兰氏阳性杆菌共90株。

2、菌株初步筛选

(1)耐酸性筛选

制备MRS肉汤培养基(pH2.5)，其组分为：酪蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、葡萄糖20g、酵母提取物5g、磷酸氢二钾2g、枸橼酸钠2g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、醋酸钠5g、吐温-801mL；将上述成分混溶于1000mL的水中，用浓盐酸调节pH为2.5，121℃高压灭菌15min，放于4℃冰箱中备用；

制备MRS固体培养基(pH5.5)，其组分为：酪蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、葡萄糖20g、酵母提取物5g、磷酸氢二钾2g、枸橼酸钠2g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、醋酸钠5g、吐温-801mL、琼脂15g；将上述成分混溶于1000mL的水中，用浓盐酸调节pH为5.5，121℃高压灭菌15min，放于4℃冰箱中备用；MRS肉汤培养基(pH5.5)不含琼脂。

分别将90株分离菌株接种至pH2.5的MRS肉汤培养基中，37℃下50rpm培养24小时，之后8000rpm离心10min，用无菌PBS溶液洗涤菌体三次，然后用无菌PBS溶液调整菌浓度为5×10⁸cfu/mL，按照体积比4％的接种量接种到pH2.5的MRS肉汤培养基中，培养3h用取出1mL进行梯度稀释后，取10^-4和10^-5浓度的稀释液各0.1mL在MRS固体培养基(pH5.5)上均匀涂布，平皿放置在37℃的培养箱中，每个稀释度涂三个平板，每个菌株进行三个重复。菌株培养48小时后，观察各个菌株在平皿上的生长情况，筛选能够耐受酸性环境菌株，计算存活率，进而进行耐胆盐试验。

(2)耐胆盐性筛选

MRS肉汤培养基(pH5.5，含0.3％猪胆盐)配制：酪蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、葡萄糖20g、酵母提取物5g、磷酸氢二钾2g、枸橼酸钠2g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、醋酸钠5g、吐温-801mL、猪胆盐3g；将上述成分混溶于1000mL的水中，用冰醋酸调节pH为5.5，121℃高压灭菌15min，放于4℃冰箱中备用。

将耐酸菌株活化24h，8000rpm离心10min，用无菌PBS溶液洗涤菌体三次，然后用无菌PBS溶液调整菌浓度为5×10⁸cfu/mL后，按照体积比4％的接种量接种到MRS肉汤培养基(pH5.5，含0.3％猪胆盐)中，接种后第3h用取出1mL进行梯度稀释，取10^-4和10^-5浓度的稀释液各0.1mL在MRS固体培养基(pH5.5)平板上均匀涂布，平皿放置在37℃的培养箱中，每个稀释度涂三个平板，每个菌株进行三个重复。菌株培养48小时后，观察各个菌株在平皿上的生长情况，筛选能够耐受胆盐环境菌株。

经耐酸、耐胆盐筛选，共获得16株具有强耐酸耐胆盐菌株。

3、体外抑菌能力筛选

LB琼脂培养基的配制：胰蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，琼脂粉14g；将上述成分混溶到1000mL去离子水中，用5mol/L氢氧化钠调节pH至7.4，121℃高压20min。LB液体培养基不含琼脂。

链球菌培养基的配制(依据《微生物培养基的制造与应用》陈天寿)：胰蛋白胨10g、葡萄糖2g、酵母提取粉5g、氯化钠10g、无水磷酸氢二钠2.5g，水1000mL；将上述成分混合，加热溶解。调pH至7.2，121℃高压15min，4℃保存，使用该培养基时须在无菌环境下加入2％(v/v)灭活的小牛血清。链球菌琼脂培养基需要在灭菌前加入15g/L的琼脂。

将16株保存菌株接种至MRS肉汤培养基(pH是5.5)中，37℃恒温培养24h，10000rpm离心10min，收集上清液，置4℃冰箱保存。

产肠毒素大肠杆菌(ETECK88)、猪链球菌2型(Streptococcussuistype2，SS2)和猪链球菌(Streptococcussuis)D型：购自中国兽医药品监察所；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；肠沙门氏菌(Salmonellaentericasubsp，ATCC13312)购自广东省微生物研究所。将ETECK88、沙门氏菌和S.aureus接种至LB液体培养基。猪链球菌2型、猪链球菌D型接种至链球菌培养基，分别37℃、震荡培养18h，调整各自细胞浓度至1×10⁶cfu/mL菌悬液。另将LB琼脂培养基和链球菌琼脂培养基冷却到45℃左右时，分别取0.2mL与18mL各自对应培养基混匀后倾注培养皿中，待其凝固后，将牛津杯(直径7mm)轻轻的放到培养基上，向牛津杯中分别加入16株候选菌株上清液200μL，放于培养箱中37℃培养18h观察结果，测定抑菌圈大小。每个试验进行三个重复试验，同时设同体积的未接种上清液为阴性对照。

表1分离菌株对四种致病菌的抑菌情况

注：抑菌圈用“平均值±标准差n＝3”表示。

综合耐酸、耐胆盐及抑菌圈大小结果筛选得到1株LR1候选菌株。

4、分子鉴定

该L.reuteriLR1菌株经16SrDNA序列分子鉴定，其序列结构如其16SrDNA序列经测序采用BLAST工具与在线数据库比对，该菌株与其它多株罗伊氏乳杆菌的16SrDNA序列有99％的相似性。确认该菌株为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，将其命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1。

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年7月23日，保藏编号为CGMCCNo.11154。

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1菌株的16SrDNA序列：(1472bp)如SEQIDNo.1所示：

GCTGGCGGGTGCTATACATGCAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCATTATGGAGGAGCCGCTAAGTCGATAGT。

实施例2罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1益生特征

(1)罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1耐酸耐胆盐能力

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1接种到MRS肉汤培养基(pH5.5)中，37℃厌氧培养24h，8000rpm离心10min，去除上清，用无菌PBS溶液洗涤菌体3次，菌体PBS溶液稀释，使其浓度为5×10⁸cfu/mL，按接种量4％接种到pH2.5的MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养6h。分别在接种后第0h、3h和6h分别用1mL培养液进行梯度稀释至10^-5后，取10^-4和10^-5两个浓度的稀释液各0.1mL在MRS固体培养基(pH5.5)上均匀涂布，平皿放置在37℃的培养箱中培养48h，进行平板菌落计数并计算耐酸存活率。

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1接种到MRS肉汤培养基(pH5.5)中，37℃厌氧培养24h，8000rpm离心10min，去除上清，用无菌PBS溶液洗涤菌体3次，菌体PBS溶液稀释，使其浓度为5×10⁸cfu/mL，按体积比4％的接种量接种到MRS肉汤培养基(pH5.5、含0.3％猪胆盐)中，37℃厌氧培养6h。分别在接种后第0h、3h和6h分别用1mL培养液进行梯度稀释至10^-5后，取10^-4和10^-5两个浓度的稀释液各0.1mL在MRS固体培养基(pH5.5)上均匀涂布，平皿放置在37℃的培养箱中培养48h，进行平板菌落计数并计算耐胆盐存活率。

表2罗伊氏乳杆菌LR1耐酸耐胆盐能力

注：存活率用“平均数±标准差n＝3”的表示。

(2)罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1粘附肠上皮细胞

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1接种至MRS肉汤培养基(pH5.5)中，37℃厌氧培养24小时，4℃下10000rpm离心10min，弃上清用无菌PBS溶液洗涤2次，用PBS溶液调整浓度为1×10⁸cfu/mL，取1mL菌液4℃下10000rpm离心10min，弃上清后再加入1mL的DMEM培养基(无抗生素)(购自美国Life公司)重悬菌液，备用。

将分离自乳猪空肠的猪小肠上皮细胞系IPEC-1(美国德州农工大学伍国耀教授惠赠，L-GlutamineorL-alanyl-L-glutaminepreventsoxidant-orendotoxin-induceddeathofneonatalenterocytes,AminoAcids，May2009,Volume37,Issue1,pp131-142)，复苏后进行传代培养。取对数生长期细胞，进行胰酶消化，收集细胞悬液，离心取沉淀，用DMEM培养基调整细胞浓度至约1×10⁵个/mL。将细胞接种到6孔板，每孔接种3mL，37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养过夜，待细胞贴壁铺满后(每孔约1.2×10⁶个细胞)，弃去培养基，每孔加入3mLPBS溶液清洗液洗涤一次。然后取将上述1mL用DMEM重悬的LR1菌液加入到各孔中，同时再加入2mLDMEM培养基(无抗生素)，盖上6孔板盖轻轻摇匀。放于37℃下5％(v/v)CO₂培养箱中继续培养2h。取出6孔板弃去培养基，用灭菌PBS溶液洗涤三次后，再向孔中加入2mL灭菌的PBS溶液液体。接着用细胞刮刀轻轻的刮掉贴壁的肠上皮细胞，收集细胞加入1mLMRS肉汤培养基(pH5.5)，震荡混匀。进行梯度稀释至10^-4后，分别取10^-1～10^-4四个梯度的稀释液各100μL进行均匀涂布MRS固体培养基(pH5.5)平板，每个稀释度涂三个平板，每个试验进行三个重复，同时设同体积未接种细胞的菌液为阴性对照，37℃下培养48h，进行平板菌落计数并计算粘附率。

另取对数生长期小肠上皮细胞IPEC-1进行胰酶消化，收集细胞悬液，离心取沉淀，用DMEM培养基调整细胞浓度至约1×10⁵个/mL。在6孔板放入盖玻片，将细胞接种到6孔板中，每孔接种3mL，37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养过夜，待细胞爬片贴壁后，弃去培养基，PBS溶液清洗2次。然后将上述1mL用DMEM重悬的LR1菌液加入到各孔中，同时再加入2mLDMEM培养基(无抗生素)，盖上6孔板盖轻轻摇匀，放于37℃下5％(v/v)CO₂培养箱中继续培养2h，取出6孔板弃去培养基，用灭菌PBS溶液洗涤5次后，去除未粘附的细菌。然后用甲醇固定，革兰氏染色，镜检，在油镜下罗伊氏乳杆菌LR1与细胞粘附情况。

表3罗伊氏乳杆菌LR1黏附猪小肠上皮细胞系IPEC-1的结果

菌株编号	粘附率(％)
		L.reuteri LR1	1.93

根据DelRe等(Lettersinappliedmicrobiology,2000，31：438-442)报道评判标准，罗伊氏乳杆菌LR1具有很强黏附肠上皮细胞能力。

罗伊氏乳杆菌LR1黏附猪小肠上皮细胞系IPEC-1结果如图2所示。图2的结果显示：IPEC-1细胞表面及其周边黏附了较多罗伊氏乳杆菌LR1，证明乳杆菌LR1可黏附于猪小肠上皮细胞系IPEC-1。

(3)罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1抑制产肠毒素大肠杆菌K88(ETECK88)对肠上皮细胞黏附

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1接种至MRS肉汤培养基(pH5.5)中，37℃厌氧培养24小时，4℃下10000rpm离心10min，PBS溶液洗涤两次，用PBS溶液调整浓度为1×10⁹cfu/mL和2×10⁹cfu/mL，取1mL菌液4℃下10000rpm离心10min，弃上清后再加入1mL的DMEM培养基(无抗生素)重悬菌液，备用。

将产肠毒素大肠杆菌K88(ETECK88)接种至LB液体培养基，于37℃、200rpm震荡培养16h，4℃下10000rpm离心10min，PBS溶液洗涤两次，用PBS溶液调整浓度为1×10⁹cfu/mL，取1mL菌液4℃下10000rpm离心10min，弃上清后再加入1mL的DMEM培养基(无抗生素)重悬菌液，备用。

试验A：罗伊氏乳杆菌LR1和ETECK88同时与IPEC-1作用。在12孔板中每孔接种10⁶个细胞IPEC-1，37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养过夜，弃去培养基，每孔加入1mLPBS溶液清洗液洗涤1次，再加入1mLDMEM培养基(无抗生素)，之后分别加入0.1mL不同浓度罗伊氏乳杆菌LR1和ETECK88菌悬液(含菌量的比值：伊氏乳杆菌LR1：ETECK88＝1:1或2:1)，同时设置只接种ETECK88菌悬液作为对照，对照组用DMEM(无抗生素)补平至相同体积，试验组共孵育2h，弃去培养基，每孔加入1mLPBS溶液清洗液洗涤3次，胰酶消化收集细胞，再加入1mLPBS溶液震荡混匀，之后进行梯度稀释至10^-5后，分别取10^-4～10^-5四个梯度的稀释液各100μL进行均匀涂布LB平板。37℃下培养24h，进行平板菌落计数并计算粘附率。每个稀释度涂三个平板，每个试验进行三个重复，结果如图3-A所示。

试验B：IPEC-1先与罗伊氏乳杆菌LR1作用再与ETECK88作用。在12孔板中每孔接种10⁶个细胞IPEC-1，37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养过夜，弃去培养基，每孔加入1mLPBS溶液清洗液洗涤1次，再加入1mLDMEM培养基(无抗生素)，之后先加入0.1mL不同浓度罗伊氏乳杆菌LR1，共孵育2h，然后再加入0.1mlETECK88菌悬液(含菌量的比值：伊氏乳杆菌LR1：ETECK88＝1:1或2:1)，再共孵育2h，同时设置只接种ETECK88菌悬液作为对照，对照组用DMEM(无抗生素)补平至相同体积。相互作用后弃去培养基，每孔加入1mLPBS溶液清洗液洗涤3次，胰酶消化收集细胞，再加入1mLPBS溶液震荡混匀，之后进行梯度稀释至10^-5后，分别取10^-4～10^-5四个梯度的稀释液各100μL进行均匀涂布LB平板。37℃下培养24h，进行平板菌落计数并计算粘附率。每个稀释度涂三个平板，每个试验进行三个重复。结果如图3-B所示。

图3的结果显示：罗伊氏乳杆菌LR1能明显抑制产肠毒素大肠杆菌(ETECK88)对肠上皮细胞上黏附，且乳杆菌LR1浓度和作用先后次序对抑制ETECK88的粘附有很大影响。由此可见，罗伊氏乳杆菌可通过竞争占位方式抑制产肠毒素大肠杆菌对肠上皮细胞黏附。

(4)罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1抑制ETECK88对上皮细胞IPEC-1损伤

将L.reuteriLR1接种至MRS肉汤培养基(pH5.5)中，37℃培养18小时，4℃下10000r/min离心10min，弃上清用灭菌PBS洗涤两次，用PBS调整浓度为5×10⁷cfu/mL，取一定体积菌液4℃下10000r/min离心10min，弃上清后再加入相同体积的DMEM(无抗生素)培养基重悬(5×10⁷cfu/mL)，备用。将ETECK88接种至LB培养基中，37℃培养震荡16小时，4℃下10000r/min离心10min，弃上清用灭菌PBS洗涤两次，采用上述方法分别用无抗DMEM培养基调整菌悬液浓度为：1×10⁷cfu/mL、5×10⁷cfu/mL和1×10⁸cfu/mL，备用。

用DMEM培养基调整IPEC-1细胞浓度至约1×10⁵个/mL，按相同体积接种至6孔板中，孵育过夜，之后试验将细胞分为3组：第1组为对照组(不加菌)；第2组为不同浓度ETECK88组；第3组为不同浓度的ETECK88+L.reuteriLR1(5×10⁷cfu/mL)组。然后分别孵育3h和6h，达到孵育时间后，移去细胞培养液，往6孔板中加入500μL胰蛋白酶，培养箱孵育10min，再加入DMEM培养基，轻轻吹打，将孔内贴壁细胞转变为悬浮细胞，收集悬浮细胞并采用苔盼蓝染色，使用细胞计数板计数单位体积内所含有的活细胞数和死细胞数，计算细胞存活率。

结果如表4所示：不同浓度ETECK88对IPEC-1细胞有损伤作用，且损伤程度与细胞浓度以及作用时间有关。同时，我们也可以看出L.reuteriLR1可以抑制ETECK88对IPEC-1细胞侵害。

表4IPEC-1与L.reuteriLR1和ETECK88共作用后细胞存活率

(5)罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1促进肠上皮细胞增殖

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1接种至MRS肉汤培养基(pH5.5)中，37℃厌氧培养24小时，4℃下10000rpm离心10min，PBS溶液洗涤两次，用PBS溶液调整浓度为1×10⁹cfu/mL，取部分菌悬液于95℃水浴中灭活10min，再分别取1mL活的或灭活的菌液4℃下10000rpm离心10min，弃上清后各自加入1mL的DMEM培养基(不添加无抗生素和血清)(购自美国Life公司)重悬菌体，备用。

在96孔板中每孔接种10⁴个细胞IPEC-1，37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养过夜，弃去培养基，每孔用PBS溶液洗涤3次，再加入0.15mL活的和灭活的罗伊氏乳杆菌LR1悬液，DMEM培养基(不添加抗生素和血清)，之后分别加入同时设置添加DMEM培养基(不添加抗生素和血清)作为对照，37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养24h，弃去培养基，每孔用PBS溶液洗涤3次，之后采用MTT法测定570nm吸光度。结果如图4所示。图4的结果显示：活的罗伊氏乳杆菌能明显促进肠上皮细胞增殖，而灭活细菌则对IPEC-1细胞无影响。

(6)罗伊氏乳杆菌的免疫调节作用

将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1接种至MRS肉汤培养基(pH5.5)中，37℃厌氧培养24小时，4℃下10000rpm离心10min，PBS溶液洗涤两次，用PBS溶液调整浓度为2×10⁹cfu/mL，取部分菌悬液于95℃水浴中灭活10min，再分别取1mL活的或灭活的菌液4℃下10000rpm离心10min，弃上清后各自加入1mL的DMEM培养基(不添加无抗生素和血清)(购自美国Life公司)重悬菌体，备用。

将产肠毒素大肠杆菌(ETECK88)K88接种至LB液体培养基，于37℃、200rpm震荡培养16h，4℃下10000rpm离心10min，PBS溶液洗涤两次，用PBS溶液调整浓度为2×10⁹cfu/mL，取1mL菌液4℃下10000rpm离心10min，弃上清后再加入1mL的DMEM培养基(无抗生素)重悬菌液，备用。

在6孔板中每孔接种1×10⁶个细胞IPEC-1，37℃、5％(v/v)CO₂的培养箱中培养过夜，弃去培养基，每孔用PBS溶液洗涤3次，之后将细胞分4组，每组3个重复，分别加入2mLDMEM培养基(无抗生素)。各组按如下方式处理：第一组为对照组，在对应的IPEC-1细胞中添加0.2mLDMEM培养基(无抗生素)；第二组为ETECK88组，在对应IPEC-1细胞中分别加入0.1mL的ETECK88菌悬液和DMEM培养基(无抗生素)；第三组为LactobacillusreuteriLR1组，在对应IPEC-1细胞中分别加入0.1mLLactobacillusreuteriLR1菌悬液和DMEM培养基(无抗生素)；第4组为ETECK88+LactobacillusreuteriLR1共培养组，在对应IPEC-1细胞中分别加入0.1mL的LactobacillusreuteriLR1菌悬液和ETECK88菌悬液。各试验组共孵育1.5h，然后收集培养基上清液采用ELISA法测定促炎因子IL-6和抑炎因子IL-10的含量；结果见图6。另外，每孔加入1mLPBS溶液清洗液洗涤细胞3次，胰酶消化收集细胞，采用Trizol试剂盒(TAKARA公司)提取总RNA，反转录cDNA后，采用荧光定量PCR方法分析细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10基因mRNA表达变化，β-Actin作为内参；结果见图5。引物如表5所示。

表5用于荧光定量PCR的细胞因子的引物序列

引物名称	序列
		IL-6F	5′-TACATCCTCGGCAAAATC-3′
IL-6R	5′-TCTCATCAAGCAGGTCTCC-3′
		TNF-α-F	5′-CAGCCTCTTCTCCTTCCT-3′
TNF-α-R	5′-CGATGATCTGAGTCCTTGG-3′
		IL-8F	5′-AGCAACAACAACAGCAGTAACA-3′
IL-8R	5′-AGCACAGGAATGAGGCATAGAT-3′
		IL-10F	5′-GGTTGCCAAGCCTTGTCAG-3′
IL-10R	5′-AGGCACTCTTCACCTCCTC-3′
		β-Actin-F	5′-AAGGACCTCTACGCCAACAC-3′
β-Actin-R	5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′

从细胞因子mRNA表达水平来看(图5)，LactobacillusreuteriLR1能下调由ETECK88引起促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α基因表达，且LactobacillusreuteriLR1能显著上调抑炎因子IL-10基因表达(P＜0.05)。从蛋白表达水平来看(图6)，LactobacillusreuteriLR1能降低由ETECK88诱导的促炎因子IL-6表达，且能显著促进抑炎因子IL-10基因表达(P＜0.05)。上述结果表明LactobacillusreuteriLR1具有较强免疫调节作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一株罗伊氏乳杆菌，其特征在于：名称为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1，于2015年7月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11154。

2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LR1的培养条件：培养基采用MRS肉汤培养基，pH5.5，培养温度37±1℃，50～70rpm震荡培养24～48h。

3.根据权利要求2所述的罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述的MRS肉汤培养基的组成成分为：酪蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、酵母提取物5g/L、磷酸氢二钾2g/L、枸橼酸钠2g/L、七水硫酸镁0.58g/L、四水硫酸锰0.25g/L、醋酸钠5g/L、吐温-801mL/L。

4.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在制备用于治疗肠道疾病的制剂中的应用。

5.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在促进肠上皮细胞增殖上的应用。