EA028359B1 - Штамм bacillus для добавки к корму животных, способ его получения и применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к штамму Bacillus, используемуму в качестве добавки к корму для животных, выбранному из: (а) штамма Bacillus mojavensis CHCC 15510 DSM 25839; (b) штаммов Bacillus amyloliquefaciens CHCC 15516 DSM 25840, CHCC 15536 DSM 27032 и CHCC 15539 DSM 27033; (с) штамма Bacillus subtilis CHCC 15541 DSM 25841 и (d) мутанта любого из штаммов (а), (b) или (с), где в мутантном штамме менее 1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом (а), (b) или (с), причем любой из штаммов (а), (b), (с) или (d) характеризуется: (i) чувствительностью к ампициллину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, стрептомицину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу; (ii) ингибирующей активностью против Е. coli и Clostridium perfringens; и (iii) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации. Кроме того, предложены способ получения заявленного штамма, композиция на его основе и способ ее получения, способ получения корма для животных, а также способ кормления животного, предусматривающие использование предложенной композиции.

Description

Свиньи, особенно поросята, страдают от поноса, то есть диареи, которая может быть вызвана бактериями, такими как ЕксйейсЫа сой (Е. сой) и С1окйтФит ретйтпдепк типов А и С (С. ретГйпдепк). Диарея может быть причиной смерти и тяжелых потерь продуктивности, включая в себя потерю массы, в случае отсутствия лечения.

Е. сой является первичной причиной диареи у поросят, и 50-75% антибиотиков, используемых в фермерских хозяйствах, используют против диареи отъема, первично вызываемой Е. сой. Диарея является самой большой проблемой в отлучаемом от матки и выращиваемом далее молодняке (вплоть до 40 кг), и Е. сой является наиболее важным патогеном, вызывающим диарею (К1оке е! а1., 2010).

Кишечные клостридиальные инфекции у свиней встречаются преимущественно в периоде отъема, но также связаны с геморрагическим синдромом кишечника, поражающим свиней в заключительном периоде откорма. Хотя иммунизация к С. ретГйпдепк типа С в сильной степени уменьшала смертность перед отъемом, в настоящее время нет коммерческих вакцин к С. ретГйпдепк типа А. Инфекции С. регГппдепк типа А теперь определяют с увеличивающейся частотой у свиней перед отъемом от матки, и подходы к диагностике и профилактике являются как различными, так и более сложными, чем подходы для инфекций типа С.

Несколько инфекций и заболеваний в домашних птицах вызываются патогенными бактериями, включающими Е. сой и С1окйтйшт ретГйпдепк. Инфекции и заболевания, вызываемые патогенами, приводят к увеличенной смертности, уменьшенной производительности и увеличенным издержкам производства. Кроме того, многие из этих патогенов могут переноситься к людям. Птичий колибактериоз является системной инфекцией, вызываемой Е. сой, и встречается наиболее часто у молодых бройлеров и цыплят.

Пробиотики используются в применениях для здоровья животного для поддержания здоровой микрофлоры кишок, в том числе для уменьшения вредных бактерий, таких как С1окйтФа и Е. сой, и увеличения в полезных бактериях, таких как Ьас1оЬасШик крр. и В1ййоЬас1ейит. Пробиотики хорошо пригодны для поддержания здорового баланса между патогенными и полезными бактериями, так как в отличие от антибиотиков они не разрушают бактерии без разбора и не приводят к устойчивым к антибиотику штаммам патогенных бактерий. Существует много механизмов, посредством которых пробиотики поддерживают здоровую микрофлору кишечника: конкурентное исключение патогенных бактерий, уменьшение патогенных бактерий через продуцирование антимикробных веществ, увеличение роста и жизнеспособности полезной микрофлоры кишечника и стимуляция иммунной реакции в этом животном.

Ввиду вышеизложенного желательным было бы наличие одного или нескольких штаммов ВасШик для лечения или профилактики заболеваний, вызываемых инфекциями Е. сой и/или С1окйтйшт у свиней и домашних птиц.

Сио е! а1., 2006, описывает скрининг штаммов ВасШик в качестве потенциальных пробиотиков и тест ВасШик киЬййк МА139 у свиней. 124 пробы собирали у бройлера, свиней, из почв, ферментированных кормов и китайских трав. Из этих проб выделили 750 аэробных спорообразующих штаммов. Ингибирующую активность против Е. сой К88 и К99, 8а1топе11а и §1арйу1ососсик аигеик тестировали с использованием диффузионного анализа с диск-пластиной, 6 бацилл с наилучшей активностью тестировали на их выживаемость в имитирующих С1Т-условиях (рН 2 и 0,3% желчная кислота). В. киЬййк МА139 был наилучшим кандидатом, и его тестировали ш νί\Ό у поросят в 28-дневном испытании по откорму с 90 поросятами. АЭС (средний суточный прирост массы) и потребление корма улучшались. Количества молочно-кислых бактерий увеличивались, количества Е. сой в фекалиях уменьшались. Однако антимикробную активность против С1окйтйшт ретГйпдепк и чувствительность к антибиотикам не тестировали.

- 1 028359

ВагЬока с1 а1., 2005, описывает выделение 237 ВаеШик из фекалий у органически (в контакте с почвой) выращенных бройлеров. Были охарактеризованы изоляты в количестве 31. Среди них были В. киЬ(Шк и В. ПсНсп|Гогт15. Несколько штаммов В. киЫШк кВатк обнаружили ингибирование в отношении С. рсгГппдспк и 8. аигсик. В. ПсйсшГогпик также обнаруживал действие против С. рсгГппдспк. Однако ни один из выделенных изолятов ВасШик не проявлял антимикробной активности против Е. сой, как определено в данной заявке. Один отобранный изолят ВасШик показывает уменьшение в интенсивности роста, но не завершает ингибирование против штамма Е. сой О78:К80 и не действует против другого тестируемого штамма Е. сой (см. табл. 5). Данные по проценту споруляции после 2 дней инкубирования или по чувствительности относительно ванкомицина, канамицина, стрептомицина и клиндамицина не представлены.

Сйа1уатеап е1 а1., 2010, описывают штамм ВасШик кр. Т3-1, который является чувствительным к антибиотикам, широко используемым в медицинском лечении, и который проявляет антимикробную активность к С. рсгГппдспк АТСС 15191. Этот штамм не имеет антимикробной активности против Е. сой 0157. Данные по проценту споруляции после 2 дней инкубирования не представлены.

ВспПс/ с1 а1., 2011, недавно сообщили, что присутствие интактной или инактивированной Е. сой увеличивало синтез антимикробных пептидов штаммом ВасШик ату1ойдисГасюпк ЬВМ 5006.

и8 7754469 относится к микроорганизмам и способам для лечения домашней птицы, а И8 8021654 относится к способам лечения свиней штаммами ВасШик.

Однако ни в одной из этих статей и ни в одном из этих патентов нет какого-либо описания или предположения для отбора штаммов ВасШик, которые являются чувствительными в отношении антибиотиков, которые обычно используются для людей, имеют антимикробную активность как к С1окйгШит рсгГппдспк,- так и к Е. сой, и имеют высокий процент споруляции для получения штамма, применимого для эффективной споруляции, и, следовательно, производства пробиотика ВасШик.

Ни один из документов предшествующего уровня техники, например, ВагЬока с1 а1., 2005, Сйа1уа\\ап с1 а1., 2010 и Оио с1 а1., 2006, не раскрывает штаммов, имеющих чувствительность в отношении антибиотиков, которые обычно используют для людей, антимикробную активность в смысле ингибирования роста как против С1окйгбшт рсгГппдспк, так и против Е. сой, и высокий процент споруляции.

В целом, в предшествующем уровне техники, относящемся к скринингу штаммов ВасШик, не представлены три выдающихся признака настоящего изобретения, т. е. чувствительность в отношении антибиотиков, которые обычно используют для людей, антимикробную активность против Е. сой и С1окйгбшт рсгГппдспк и высокий процент споруляции. Предшествующий уровень техники также не обеспечивает штаммы ВасШик, удовлетворяющие этим трем критериям.

Сущность изобретения

Задачей, которая должна быть решена данным изобретением, является представление штамма Васй1ик, который отличается чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола; антимикробной активностью против Е. сой и С1окйгШит рсгГппдспк и процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2.

Это решение основано на способе отбора, разработанного авторами этого изобретения для идентификации улучшенных штаммов ВасШик, имеющих эти улучшенные свойства.

Одной основной стадией этого способа отбора является специфический скрининг на штаммы Васй1ик, которые являются чувствительными в отношении антибиотиков, которые обычно используют для людей. Более конкретно эти штаммы подвергают скринингу на чувствительность в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола.

Дополнительно эти штаммы подвергают скринингу на антимикробную активность против Е. сой и С1окйгШит рсгГппдспк и на наличие процента споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2.

Из 261 изолята из почвы и фекалий и источников корма, исследуемых авторами этого изобретения, 161 изолят был устойчивым к антибиотикам в предварительном тесте скрининга, описанном в примерах. Из этих 100 изолятов, которые были чувствительны к антибиотикам, 56 имели антимикробное действие против С1окйгШит рсгГппдспк и только 22 имели действие как против Е. сой, так и против С1окйгШит рсгГппдспк. Из них 12 изолятов были из вида В. атуйНсщсГааспк. Другие репрезентативные штаммы были из видов В. киЬййк и В. то|ауспк1к. Табл. 2 и 3 суммируют результаты изготовленных штаммов Сйг. Напксп (22 из 32 штаммов, отобранных для вторичного скрининга).

Процесс отбора был сосредоточен на ί) безопасности, ίί) действии и ίίί) высокой споруляции в средах, подходящих для продуцирования. Аспект безопасности основан в основном на отсутствии устойчивости к антибиотикам, которое является важным вследствие увеличивающихся случаев устойчивых бактерий в человеке. Эти бактерии приводили к хорошо известным заболеваниям, которые уже не могут быть обработаны антибиотиками, когда эти патогенные бактерии стали устойчивыми.

Хорошо известно, что ВасШик может продуцировать вещества, которые могут иметь антимикробную активность, такие как бактериоцины, бактериолитические ферменты или суфрактины. Этот второй критерий отбора, действие против Е. сой и С1окйгШит рсгГппдспк. является важным, когда оба патогена

- 2 028359 являются главными причинами диареи у свиней и домашних птиц. Этот эффект тестируют против трех штаммов Е. сой и против С1окйтФит регГппдепк типа А, но предполагается, что эти результаты являются показателями для общего действия против Е. сой и для действия против других типов ОоМпсйа. таких как С1окйтФит регГппдепк типа С.

Третий критерий отбора является важным для производства пробиотика. Процесс производства пробиотика имеет место в ферментерах, выращивающих ВасШик, и в конце этого процесса необходима высокая скорость споруляции для высокой эффективности производства. Процесс споруляции ВасШик исследовался в течение многих лет, но все еще имеется масса вопросов. Таким образом, среди специалистов в данной области, работающих с производством и процессом развития ВасШик, хорошо известно, что некоторые штаммы ВасШик имеют очень низкую скорость споруляции. Предполагалось, что ВасШик дифференцируется в субпопуляции специализированных клеток, т. е. в сообщества, которые продуцируют ферменты для деградации комплексных нутриентов и сообществ, которые умирают (Ьоре/ апй КоЙег, 2010). Предполагается, что эта дифференцировка регулируется внеклеточными сигналами, большинство из которых продуцируется самим ВасШик. Таким образом, существовала гипотеза, что высокое продуцирование ферментов или антимикробных веществ может приводить к низкой эффективности споруляции. Таким образом, для специалиста в данной области является неожиданным и удивительным, что штамм ВасШик может иметь как антимикробную активность, так и высокий процент споруляции.

Описание чертежа

Чертеж показывает схематически антимикробную активность 261 штамма ВасШик. Удивительно, что многие штаммы ВасШик ату1о1к|иеГас1епк имеют антимикробное действие.

Подробное описание этого изобретения

Постепенное сокращение антибиотических стимуляторов роста в Европейском союзе в 2006 году привело к увеличенной потребности в кормовых добавках с экономическим показателем затратыэффективность с высокой эффективностью и, следовательно, к потребности в новых пробиотиках.

Пробиотические кормовые добавки на основе ВасШик известны из-за их высоких положительных действий на здоровье и продуцирование у свиней и домашних птиц. Эти продукты являются релевантными для кормовой промышленности, так как споры являются теплостойкими и могут выживать в процессе гранулирования при температуре вплоть до 90-95°С.

Пробиотики для свиней должны быть безопасными для животных, людей и окружающей среды и должны увеличивать рост и коэффициент утилизации корма животного. Целью данного изобретения был скрининг в трех стадиях широкого диапазона аэробных эндоспорообразующих бактерий (АЕВ) из разных источников на их пробиотическое действие у свиней. АЕВ выделяли из ферментированного корма (КаШопд и первичные стартеры Сегдоикй), фекалий свиней, почвы и различных коллекций культур. 261 изолят АЕВ идентифицировали секвенированием генов 168 рДНК и исследовали на соответствующую устойчивость к антибиотикам определением минимальной ингибирующей концентрации (М1С) нескольких релевантных антибиотиков.

Дополнительные анализы включали в себя толерантность к желчи и кислотам, ингибирование патогенами, рост в различных средах, споруляцию, а также взаимодействие с клеточными линиями животного для оценивания сходства положительных действий на плотные контакты в кишечной системе. Результаты показывают высокое различие как между видами, так и между штаммами. Этими выделенными штаммами были сначала род ВасШик, включающий в себя В. атуЦйциеГааепк, В. кийййк и В. каГепык из кормовых источников, В. кийййк, В. ритйик, В. атуШИциеГашепк, В. йсйешГогтщ, В. теда!егшт из фекалий и В. йсйешГогтщ и В. кипр1е\ из почвы.

Многие из этих изолятов обнаруживали нежелательную устойчивость к антибиотикам выше критического уровня, определенного с использованием ЕР8А, и были отброшены по соображениям безопасности. Хороший рост наблюдали для большинства этих штаммов при выращивании в течение ночи в телячьем инфузионном бульоне, тогда как 16% имели неудовлетворительный рост в среде, подходящей для ферментации. В стадии 2 этого процесса скрининга 32 выбранных штамма без устойчивости к антибиотикам идентифицировали секвенированием гена дугВ и с использованием РРСЕ-фингерпринтинга. Кроме того, их антимикробное действие на выбранные патогены тестировали и наблюдали значительную вариацию между изолятами. Несколько из этих изолятов обнаруживали ингибирование С1окйтФит регГгтдепк, тогда как только малое число изолятов ингибировали Е. сой. Таким образом, эти результаты данного изобретения подтверждают, что ингибирование роста как С1окйтФит регГппдепк, так и Е. сой объединены только редко. Стадия 3 этого процесса скрининга включала в себя 10 штаммов с высоким ингибированием патогенов и включала в себя определение термостойкости спор, секвенирование генома и дополнительные стадии ш νίΐΐΌ, показывающие их действие на плотные контакты.

Данное изобретение обеспечивает штаммы ВасШик, отличающиеся ί) чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритомицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола.

Под термином чувствительность в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритомицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола имеется в виду, что штамм, рассматриваемый в качестве чувствительного к конкретному антибиотику, должен расти при

- 3 028359 критическом уровне, приведенном ΕΕδΑ (ΕΕδΑ, 2008), изображенном в табл. 1.

Величины М1С, изображенные в табл. 1, основаны на руководствах, изданных ΕΕδΑ (Техническое руководство, приготовленное с использованием панели добавок и продуктов или веществ, используемых в корме для животных (ΕΕΕΌΑΡ) в коррекции критериев, используемых в оценивании бактериальной устойчивости к антибиотикам, важным для человека и важным в ветеринарии, журнал ΕΕδΑ (2008) 732, 1-15 обеспечивает перечень антибиотиков и приемлемых пороговых величин для рода ВасШиз. Критический уровень, даваемый ΕΕδΑ для ампицилина в отношении ВасШиз, не существует, однако критический уровень существует для нескольких других бактерий, т. е. Еас1оЬасШиз зрр. Таким образом, эта чувствительность штаммов ВасШиз против ампициллина была выбрана в качестве критического уровня для данного изобретения.

Таблица 1

Критические уровни ΕΕδΑ для различных антибиотиков, обычно используемых для людей

Тип антибиотика	Антибиотик	Критический уровень ЕГ5А мг/л
В-лактам	Ампициллин	4
Гликопептид Аминогликозиды Макролид	Ванкомицин Гентамицин Канамицин Стрептомицин Эритромицин	4 4 8 8 4
Линкосамид	Клинд амицин	4
Тетрациклин	Тетрациклин	8
Хлорамфеникол	Хлорамфеникол	8

Чтобы находиться в объеме данного изобретения, этот штамм должен быть чувствительным в отношении всех вышеупомянутых антибиотиков. На практике это означает, что не наблюдается рост этого штамма при критическом уровне при тестировании способом микроразведения (минимальной ингибирующей концентрации (М1С)).

Согласно данному изобретению М1С измеряют способом микроразведения бульона, как изображено посредством стандарта СЙ81 (Сйшса1 апб йаЬога1огу 81апбагбз 1пзйШе Μ07-Α8 апб Μ45-Α2), выполняемым следующим образом.

Суспензию ночного роста подлежащего тестированию штамма инокулируют в бульоне ΙδΟδΕΝδΙΤΕδΤ (Οχοΐ6 СМ0473) в микротитрационных планшетах при приблизительной концентрации 10⁵ КОЕ/мл (колониеобразующие ед/мл) в двухкратных серийных разведениях подлежащего тестированию антибиотика (общий объем 100 мкл на лунку) и инкубируют аэробно в течение 20-24 ч при 37°С. Могут быть использованы предварительно сфабрикованные панели Уе1М1С йасМ и йас1-2, содержащие антибиотики ампициллин, ванкомицин, гентамицин, канамицин, стрептомицин, эритомицин, клиндамицин, тетрациклин и хлорамфеникол. Эти результаты регистрируют после 24 ч при самой низкой концентрации антибиотика для ингибирования видимого роста.

Первая часть аспекта и) этого изобретения относится к штамму ВасШиз, который проявляет антимикробную активность против Е. сой. Согласно данному изобретению ее измеряют посредством капельного теста Е. сой на агаре, выполняемого следующим образом:

мл телячьего инфузионного бульона (У1В) инокулируют с подлежащей тестированию культурой ВасШиз и инкубируют при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Одновременно 9 мл сердечно-мозговой вытяжки (ВН1) инокулируют со штаммом Е. сой, отобранным из Е. сой 0149 (0149:к91, к88а), Е. сой 0147 (0147:К89 Е4) и Е. сой 0101 (0101, Е5), и инкубируют в течение ночи при 37°С.

Ночные культуры Е. сой добавляют в объеме 2 мл, каждая в 200 мл жидкого агара при 50°С, и выливают в каждую чашку для биоанализа. Чашки сушат в стерильном ламинарном шкафу. Эту ночную культуру ВасШиз, подлежащую тестированию, наносят в виде пятен на поверхность агара У1В, смешанного с Е. сой, и инкубируют при 37°С в течение 2 дней. Радиусы зон ингибирования вокруг пятен и диаметры пятен регистрируют.

Считается, что штамм ВасШиз проявляет антимикробную активность в отношении Е. сой, если зона ингибирования равна по меньшей мере 1,5 мм. Предпочтительно зона ингибирования равна по меньшей мере 2,0 мм, например 2,5 мм, более предпочтительно по меньшей мере 3 мм, наиболее предпочтительно 3,5 мм и даже более предпочтительно по меньшей мере 4 мм. Эта зона ингибирования может быть различной для различных штаммов Е. сой. Чтобы штамм мог считаться штаммом, проявляющим антимикробную активность против Е. сой, по данному изобретению он должен проявлять зону ингибирования по меньшей мере 1,5 мм для всех из тестируемых штаммов Е. сой. Предпочтительно эта зона ингибирова- 4 028359 ния двух или даже более предпочтительно зона ингибирования всех трех штаммов Е. сой равна по меньшей мере 2 мм. Один штамм ВасШик этого изобретения характеризуется ингибированием роста Е. сой, в частности ингибированием роста этих тестируемых видов. Как показано предыдущим уровнем техники и подтверждено авторами этого изобретения, отсутствие ингибирования роста одного вида Е. сой часто объединено с отсутствием ингибирования роста другого вида Е. сой (табл. 5, ВагЬока с1 а1., 2005) и \зсе уегка, т. е. ингибирующая активность одного вида Е. сой часто объединена с ингибирующей активностью другого вида Е. сой (табл. 1, Оио е1 а1., 2006).

Вторая часть аспекта и) этого изобретения относится к штамму ВасШик, который проявляет антимикробную активность против С1окйтйшт регГгшдеик. Согласно данному изобретению ее измеряют посредством капельного теста пятен С1окйтФит рейпидеик на агаре, выполняемого следующим образом:

мл У1В инокулируют с культурой ВасШик, подлежащей тестированию, и инкубируют при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Одновременно 9 мл бульона ВН1 инокулируют С. регГгшдеик типа Α, ΌδΜ 756, и инкубируют в течение ночи при 37°С в анаэробном сосуде.

Культуры ВасШик наносят в виде пятен на поверхность агара У1В в чашках Петри и инкубируют при 37°С в течение ночи. Ночную культуру С. регГгшдеик в объеме 2 мл смешивают с 200 мл жидкого агара ВН1 и выливают на агар У1В с растущими пятнами ВасШик. Эти чашки инкубируют анаэробно при 37°С в течение 1 дня. Радиусы осветленных зон вокруг этих пятен измеряют.

Считается, что штамм ВасШик проявляет антимикробную активность в отношении СйэкйтФит регГгшдепк. если зона ингибирования равна по меньшей мере 5 мм. Предпочтительно эта зона ингибирования равна по меньшей мере 6 мм, более предпочтительно по меньшей мере 7 мм. Штамм ВасШик этого изобретения характеризуется ингибированием роста С1окйтФит рейпидеик, в частности ингибированием роста тестируемых видов. Как известно квалифицированному в данной области специалисту, отсутствие ингибирования одного вида часто объединяется с отсутствием ингибирования роста другого вида С1окйтФит рейпидеик и \зсе уегка, т. е. ингибирование роста одного вида С1окйтФит регГгшдеик часто объединено с ингибированием роста другого вида С1окйтФит рейпидеик.

Клетки ВасШик существуют в виде споровых клеток ВасШик и вегетативных клеток ВасШик. При ссылке на клетки ВасШик эта ссылка относится к обеим.

Термин спора ВасШик в отношении споровой клетки ВасШик относится к споре, которая в соответствии с данной областью может быть охарактеризована как покоящаяся, прочная, нерепродуктивная структура, продуцируемая бактериями ВасШик. Первичной функцией спор является обычно обеспечение выживания бактерии на протяжении периодов внешнего стрессового воздействия. Таким образом, они являются резистентными к ультрафиолету и гамма-излучению, высушиванию, лизоциму, температуре, голоданию и химическим дезинфицирующим средствам. Споры обычно обнаруживаются в почве и воде, где они могут выживать в течение продолжительных периодов времени. Оболочка споры является непроницаемой для многих токсичных молекул и может также содержать ферменты, которые участвуют в прорастании. Это ядро имеет нормальные клеточные структуры, такие как ДНК и рибосомы, но является метаболически неактивным. Когда бактерия детектирует, что внешние условия становятся неблагоприятными, она начинает процесс споруляции, который занимает приблизительно 8 ч.

Термин вегетативная клетка ВасШик относится к функциональным вегетативным клеткам ВасШик, которые могут делиться для продуцирования большего количества вегетативных клеток.

В аспекте ίίί) это изобретение относится к штамму ВасШик, которые проявляет процент споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2. Согласно данному изобретению процент споруляции анализируют следующим образом:

штамм ВасШик, подлежащий тестированию, добавляют в объеме 50 мкл в 700 мкл УТВ в планшете с глубокими лунками (ΌΑ) и инкубируют при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Эту ночную культуру ВасШик в объеме 50 мкл переносят в 700 мкл среды споруляции, содержащей (м/м) 95% воды; 1,5% источник азота (т. е. дрожжи); 3% сахарозы; 0,06% микроминералов; дикалийгидрофосфат 0,1% в планшетах ΌΑ. Этот планшет инкубируют при 37°С и 175 об/мин в течение 3 дней.

Споруляцию наблюдают микроскопически и процент спор (количество спор в сравнении с общим количеством клеток ВасШик) определяют визуальным оцениванием после 1 дня (24 ч), 2 дней (48 ч) и 3 дней (72 ч) инкубации.

Под термином имеющие процент споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2 имеется в виду, что по меньшей мере 80% этих клеток спорулировались после 2 дней инкубации. Процент споруляции может быть предпочтительно более высоким, таким как по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%. Одной важной целью данного изобретения является отбор на штаммы ВасШик, имеющие клетки с высоким процентом споруляции, чтобы сделать этот штамм применимым для производства корма для животных. Высокий процент споруляции, который может быть назван высокой скоростью споруляции, является необходимым для высокой эффективности производства, как описано выше.

Как описано выше, известный уровень техники описал способы для отбора штаммов ВасШик, но способы скрининга известного уровня техники не фокусировались на проценте споруляции. Таким образом, маловероятно, что отобранные с известным уровнем техники штаммы ВасШик спорулируются в до- 5 028359 статочной степени для требуемого процента споруляции, как описано здесь.

Три штамма, имеющих объединенную способность свойств высокого роста и споруляции, не имеющих устойчивости к антибиотикам и высокой антимикробной активности, выбирали и депонировали. Но также другие штаммы, в частности штаммы видов ВаеШик ату1о1к|исГас1СП5 (см. штаммы Ό-ΐ в табл. 2 и 3) удовлетворяют критериям, описанным в формуле этого изобретения и, следовательно, включены в объем данного изобретения.

Как видно из фиг. 1, в частности, многие штаммы вида ВасШик ату1о1к|исГас1СП5 находятся в объеме данного изобретения. Удивительно, что многие штаммы ВасШик ату1о1к|исГас1СП5 имеют антимикробное действие, так как до сих пор предполагалось, что антимикробное действие рода ВасШик является штаммспецифическим и не относящимся к видам.

На основе этих подробных описаний анализов квалифицированный в данной области специалист способен повторять эти анализы для определения, согласуется ли конкретный штамм ВасШик с чувствительностью пункта (ί), антимикробной активностью пункта (ίί) и процентом споруляции пункта (ίίί) различных аспектов этого изобретения. Таким образом, специалист с обычной квалификацией в данной области будет способен стойко продуцировать штаммы с указанными свойствами. Предпочтительно этот способ отбора будет также включать в себя (ίν) анализ на чувствительность этих вегетативных клеток при рН 4 и (ν) анализ на устойчивость к желчи для гарантии, что эти штаммы способны выживать до достаточной степени в желудочно-кишечном тракте. Очевидно, что эти анализы могут выполняться в любом порядке, и некоторые штаммы могут исключаться во время этого процесса, если они не удовлетворяют этим критериям.

Из литературы известно, что желчь имеет некоторые отрицательные влияния на выживание и прорастание и вырост споровых клеток ВасШик в вегетативные клетки в ΟΙΤ (желудочно-кишечном тракте) животных.

Таким образом, пробиотические бактерии будут обычно способны выживать и пролиферировать в кишечнике животных, будучи способными выдерживать низкий рН и будучи резистентными к желчным солям для того, чтобы быть применимыми в качестве пробиотических композиций ВасШик для добавления к корму животных. В этом смысле эти примеры обеспечивают полезные тесты ίη νίΐτο. Тест на чувствительность к низкому рН (воспроизводящий условия в желудке) фокусируется на устойчивости вегетативных клеток к рН 4. Хорошо известно, что споры являются устойчивыми при величинах рН 2-3, и что вегетативные клетки будут умирать при рН 2. Однако рН желудка может иметь величины рН до 4, особенно в условиях кормления. Это может приводить к прорастанию спор, и, следовательно, уместным является тестирование чувствительности вегетативных клеток при рН 4. Отобранные штаммы должны быть предпочтительно устойчивыми к рН 4. Результаты, относящиеся к отобранным штаммам, представлены в табл. 2.

Штаммом этого изобретения является род ВасШик, предпочтительно один из видов ВасШик ату1оПсцюГааспк. такой как ВасШик атуЫкщсГасюпк киЬкр. атуКПсщсГасюпк или ВасШик атуЫкщсГасюпк киЬкр. р1ап1агит, ВасШик ытр1ех, ВасШик 1юкеш£огт1к, ВасШик тедаЮпит, ВасШик то.)ауепк1к, ВасШик рипШих ВасШик каГепкЕ, ВасШик к1тр1ех, ВасШик киЫШк, ВасШик айоркаеик, ВасШик теШуЩгорЫсик, ВасШик Ьатепкк, ВасШик уаШктогПк или ВасШик 1едиНепк1к.

Исходный способ идентификации 261 штамма был основан на 168. Этот способ не может различать между некоторыми близкородственными видами ВасШик. Таким образом, некий штамм может быть идентифицирован как родственный относительно группы, состоящей из видов ВасШик а1у1о1ц|иеГааепк/а1торЬаеик/теШу1о1торЬюик/к1атепк1к/ уаШктоШк, или группы, состоящей из видов ВасШик то|ауепк1к/киЬ1Шк/1ес.1ш1епк1к. Обе группы содержат много штаммов, которые удовлетворяют критериям этого изобретения, и, следовательно, эти группы представляют важные варианты этого изобретения.

После признания подходящими эти штаммы дополнительно идентифицируют более детальным способом (дуг В)). Эти данные, показанные в табл. 2 и 3, первично основывались на ВасШик ату1окдиеГааепк (идентифцированной по дуг В). Отобранные изоляты ВасШик атуЫцщеГабепк дополнительно идентифицировали анализом последовательности гена бета-субъединицы РНК-полимеразы (дуг В) и подвидов, идентифицированных и представленных в табл. 4, 5 и 6.

Желательным является проявление теплостойкости этим штаммом. Результаты для отобранных штаммов представлены в табл. 4. Теплостойкость при 99,5°С измеряют в КОЕ как уменьшение после 2,5 и 10 мин относительно времени 0 (1од/1од). Уменьшение ниже 2 достигается обычными коммерческими препаратами спор ВасШик. Для штаммов в объеме данного изобретения уменьшение должно быть предпочтительно 0,5 или менее после 2 мин, более предпочтительно 0,25 или менее, наиболее предпочтительно 0,05 или менее. В предпочтительных вариантах осуществления уменьшение после 5 мин должно быть предпочтительно 2,5 или менее, наиболее предпочтительно 0,5 или менее и после 10 мин уменьшение должно быть также предпочтительно 2,5 или менее, более предпочтительно 1 или менее, наиболее предпочтительно 0,5 или менее. Все эти штаммы в этой таблице проявляют подходящую теплостойкость. Как видно из этой таблицы, штаммы В, Ό и Р имеют очень высокую теплостойкость даже после 10 мин. Заслуживает внимания то, что как В, так и Р являются штаммами ВасШик ату1окдиеГас1епк киЬкр. ату1оидиеГастепк, что делает этот подвид предпочтительным вариантом данного изобретения.

- 6 028359

Продуцирование ферментов исследовали в примере 4. Полученные данные показывают для всех исследованных штаммов целлюлазную активность 50 мЕ/мл или более. Предполагается, что такая активность будет выгодным свойством для штамма ВаеШик этого изобретения. Для определенного варианта может быть предпочтительным, что этот штамм имеет даже более высокую целлюлазную активность, такую как 100 мЕ/мл или более, как обнаружено для штаммов В. атукИдиеГааепк киЪкр. р1аи1агит, что делает этот подвид предпочтительным вариантом данного изобретения. Для штаммов в объеме данного изобретения целлюлазная активность должна быть предпочтительно 50 мЕ/мл или более, более предпочтительно 100 мЕ/мл или более, наиболее предпочтительно 250 мЕ/мл или более, даже более предпочтительно 400 мЕ/мл или более.

Некоторые штаммы обнаруживают высокую ксиланазную активность 70 мЕ/мл или более. Табл. 5 показывает, что высокая целлюлазная активность исследованных штаммов необязательно объединена с высокой ксиланазной активностью или высокой протеазной активностью, определенных как 40000 ΚΕυ/ΘΌ или более. Штаммы С, I и 1, которые все являются штаммами В. ату1о1к.]иеГаскпк киЪкр. р1аи1агит, являются примерами штаммов, демонстрирующих высокую активность для всех трех ферментов.

В одном предпочтительном варианте осуществления штаммом ВаеШик является ВаеШик киЬОПк. ВаеШик то]ауепкк или ВаеШик ату1о1к.]иеГаскпк. Наиболее предпочтительно этот штамм выбран из группы, состоящей из штамма а) ВаеШик то|ауепк1к с номером доступа Ό8Μ 25839; Ъ) штаммов ВаеШик ату1о1и.]иеГаскпк с номерами доступа Ό8Μ 25840, Ό8Μ 27032 или Ό8Μ 27033 и (с) штамма ВаеШик киЪОПк с номером доступа Ό8Μ 25841; и их мутантных штаммов.

Другой аспект этого изобретения относится к способу получения мутантного штамма:

(a) штамма ВаеШик то]ауепкк с номером доступа Ό8Μ 25839;

(b) штаммов ВаеШик ату1о1и.]иеГаскпк с номерами доступа Ό8Μ 25840, Ό8Μ 27032 или Ό8Μ 27033 или (c) мутантного штамма ВаеШик киЪййк с номером доступа Ό8Μ 25841;

причем этот способ предусматривает необязательно подвергание этого штамма мутагенизационной обработке и отбору на мутантные штаммы, имеющие следующие свойства:

(ί) чувствительность в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стрептомицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола;

(н) антимикробную активность против Е. сой и СккйгФит регйгпдепк и (ίίί) процент споруляции по меньшей мере 80 при измерении в день 2.

Этот штамм может быть подвергнут мутагенизационной обработке, как описано более подробно ниже, для получения мутантных штаммов, и после этого выполняют процесс отбора. Альтернативно, отбор выполняют в отношении спонтанно встречающихся мутантов.

Этот способ получения мутантного штамма может также включать в себя (ίν) анализ на чувствительность вегетативных клеток при рН 4 и (ν) анализ на устойчивость к желчи для гарантии, что эти штаммы способны выживать до достаточной степени в желудочно-кишечном тракте. Очевидно, что эти анализы могут выполняться в любом порядке, и некоторые штаммы могут исключаться во время этого процесса, если они не удовлетворяют этим критериям.

Термин бактериальный штамм относится в данном контексте к бактерии, которая остается генетически неизмененной при росте или размножении. Множество идентичных бактерий включены в этот термин.

Термин штамм дикого типа относится к немутированной форме бактерии, обнаруживаемой в природе.

Термин мутантная бактерия или мутантный штамм относятся к природной (спонтанной, природно существующей) мутантной бактерии или индуцированной мутантной бактерии, содержащей одну или несколько мутаций в ее геноме (ДНК), которые отсутствуют в ДНК дикого типа. Одним индуцированным мутантом является бактерия, в которой эта мутация была индуцирована обработкой человеком, такой как любая обычно используемая мутагенизационная обработка, включающая в себя обработку химическими мутагенами, такими как химический мутаген, выбранный из (ί) мутагена, который ассоциируется с ДНК или становится включенным в ДНК, такой как аналог основания, например 2-аминопурин или интерхелатирующий агент, такой как 1СК-191, (ίί) мутагена, который реагирует с ДНК, включающий алкилирующие агенты, такие как нитрозогуанидин или гидроксиламин, или этанметилсульфонат (ΕΜ8) или №метил-№-нитро-№нитрогуанидин (ΝΤΟ), υν- или гамма-излучение и т. д. В отличие от этого спонтанный мутант или природно-встречающийся мутант не был мутагенизирован человеком.

Мутант может быть подвергнут действию нескольких мутагенизационных обработок (единственную обработку следует понимать как одну стадию мутагенизации с последующим стадией скрининга/отбора), но в настоящее время предпочитается выполнение не более 20, или не более 10, или не более 5 обработок (или стадий скрининга/отбора). В предпочтительном в настоящее время мутанте менее 1, менее 0,1, менее 0,01, менее 0,001 или даже менее 0,0001% нуклеотидов в бактериальном геноме были заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении с материнским штаммом.

Мутантные бактерии, описанные выше, являются не-ΟΜΟ, т. е. не модифицированы технологией рекомбинантных ДНК. В качестве альтернативы предпочтительного описанного выше способа обеспе- 7 028359 чения этого мутанта случайным мутагенезом можно обеспечивать такой мутант сайт-направленным (сайт-специфическим) мутагенезом, например, с использованием подходящим образом сконструированных ПЦР-способов или с использованием мобильного генетического (подвижного) элемента, который является интегрируемым в бактериальных репликонах.

При обеспечении этого мутанта в виде спонтанно встречающегося мутанта штамм дикого типа, описанный выше, подвергают стадии отбора без предшествующей обработки мутагенизацией.

Несколько видов ВасШик имеют статус ОКА8, т. е. они обычно признаются как безопасные. Все штаммы В. киЫШк являются ОКЛ8 (общепризнано безопасными). Описанные здесь штаммы ВасШик являются аэробными и факультативными спорообразующими штаммами. Штаммы ВасШик являются образующими только одну спору штаммами, которые считаются ОКЛ8 (общепризнано безопасными). Кормление скота микроорганизмами, которые имеют статус ОКЛ8, является признанной практикой среди поставщиков, ветеринаров и других производителей в животноводстве на промышленной основе.

Таким образом, дополнительный аспект этого изобретения относится к композиции ВасШик, содержащей клетки штамма ВасШик этого изобретения. Эта композиция может содержать клетки по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех или даже больше штаммов ВасШик, выбранных по меньшей мере из одного из штаммов этого изобретения. Предпочтительно эти клетки композиции ВасШик являются споровыми клетками.

Релевантные штаммы ВасШик этой композиции могут присутствовать в коммерчески релевантной форме, известной квалифицированному в данной области специалисту.

Соответственн, в одном варианте штаммы ВасШик этой композиции присутствуют в виде высушенных (например, высушенных распылительной сушкой) клеток или в виде замороженных клеток. Эта композиция может быть обеспечена в любой подходящей форме, такой как форма жидкости, густой суспензии, порошка или кормовой гранулы.

В одном предпочтительном варианте осуществления композиция ВасШик содержит от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г, более предпочтительно от 10⁶ до 10¹² КОЕ/г и наиболее предпочтительно от 10⁷ до 10¹² КОЕ/г.

Термин КОЕ/г относится к массе в граммах этой композиции, как таковой, включающей в себя подходящие релевантные добавки, присутствующие в этой композиции. Как известно специалисту с квалификацией в данной области, коммерчески релевантная бактериальная композиция обычно содержит другие релевантные добавки, такие как, например, один носитель/ингредиент из группы, принадлежащей сыворотке, пермеату сыворотки, карбонату кальция/известняку и предотвращающим слеживание (спекание) агентам, таким как силикаты алюминия и кизельгур (диатомовая земля). Эта композиция не включает в себя массу подходящего контейнера, используемого для упаковки композиции ВасШик. Один вариант относится к композиции, упакованной в подходящий контейнер.

Композиции данного изобретения могут включать в себя штамм ВасШик этого изобретения, включающий в себя мутанты, и носители, которые делают эти композиции подходящими для кормления животных в качестве кормовой добавки или в качестве добавки для питьевой воды. Альтернативно, штамм ВасШик этого изобретения, включающий в себя мутанты, может быть приготовлен с ингредиентами корма животных, включающими в себя кормовой белок и/или кормовые углеводы. Такие комбинации могут находиться в форме кормовых гранул, которые экструдируют посредством стандартных процессов гранулирования.

Эта описанная здесь композиция ВасШик может быть использована в качестве пробиотической добавки к корму животных. Это изобретение обеспечивает также способ получения корма животных или премикса, предусматривающий добавление композиции ВасШик этого изобретения к корму животных.

В данном контексте термин премикс относится к штамму ВасШик, добавляемому к носителю для получения премикса, который затем добавляют к корму при желаемой скорости включения и скармливают животному.

Другой аспект этого изобретения относится к способу кормления животного, предусматривающему введение композиции ВасШик этого изобретения, или корма, или премикса для животного, приготовленного в соответствии с этим изобретением, животному.

Пример 5 описывает испытания кормления со штаммами В и С и показывает, что пробиотические продукты обоих штаммов ВасШик, добавленные к рационам питомника, численно улучшали продуктивность в сравнении с группой отрицательного контроля. Во время этого испытания можно было наблюдать значительное действие на параметры продуктивности. Процент смертности уменьшался как в группах ВасШик, так и в обоих испытаниях.

В одном из этих участков количество животных, обрабатываемых на загон энрофлуксацином для преодоления тяжелой диареи, было значимо более высоким (Р>0,05) в животных, вскармливаемых контрольным рационом, чем животных, вскармливаемых ВасШик.

Таким образом, этот пример демонстрирует, что введение композиции ВасШик этого изобретения может быть использовано для лечения и предотвращения заболеваний, например ингибированием патогенов, таких как Е. сой и С1окйтФит, в этом животном. Эта композиция ВасШик может скармливаться непосредственно в виде микробов или в виде кормовой добавки к корму для животных. Композиции данного изобретения вводят или скармливают животному в количестве, эффективном для уменьшения

- 8 028359 роста патогенных бактерий, таких как С1ок1пШа и ЕксЬепсЫа сой в кишечнике этого животного.

Это животное может быть выбрано из группы, состоящей из домашней птицы, жвачных животных, телят, свиней, кроликов, лошадей, рыбы и домашних животных. В одном предпочтительном варианте осуществления этим животным является сельскохозяйственное животное, которое выращивается для потребления, такое как свиньи, или как продуценты пищи, такие как бройлеры и продуцирующие яйца курицы.

Обеспечены также способы введения одного или нескольких штаммов ВасШик этого изобретения поросенку. Такие способы могут включать в себя скармливание одного или нескольких штаммов ВасШик этого изобретения матке поросенка. Этот штамм (эти штаммы) можно скармливать во время беременности, лактации или в обоих случаях. Один или несколько штаммов ВасШик могут также скармливаться поросятам, находящимся в питомнике для поросят, и поросятам в заключительной стадии откорма.

Применения терминов а и ап и Ше и подобных символов в контексте описания этого изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения) должны пониматься как включающие в себя как единственное, так и множественное число, если здесь нет другого указания или это не противоречит явно контексту. Термины содержащий, имеющий, включающий в себя и вмещающий должны пониматься как термины с открытым концом (т. е. означающие включающие в себя, но не ограничивающиеся ими). Перечисление диапазонов величин предназначено здесь только в качестве стенографического способа для ссылки индивидуально на каждую отдельную величину, попадающую в этот диапазон, если здесь нет других указаний, и каждая отдельная величина включена в это описание, как если бы она была индивидуально перечислена здесь. Все способы, описанные здесь, могут выполняться в любом подходящем порядке, если здесь нет другого указания или если они иным образом явно противоречат контексту. Применение любого или всех примеров или языка примера (например, такой как), обеспеченного здесь, предназначено просто для освещения этого изобретения и не для предложения ограничения в объеме этого изобретения, если нет другого заявления. Никакая фраза в этом описании не должна пониматься как указание любого незаявленного элемента в качестве существенного для применения к практике этого изобретения.

Депонированные штаммы.

Штамм ВасШик то|агепк1к СНСС 15510 был депонирован в Ό8ΜΖ (ОеШксЬе 8атт1ип§ νοη М1кгоогдатктеп ипб Ζе11киЬи^еη ОтЬН, 1пЬойепк1гакке 7В, Ό-38124 ВгаипксЬ\\ещ) под номером доступа Ό8Μ 25839 с датой депонирования 3 апреля 2012 года СЬг. Напкеп А/8, Оептагк. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Штамм ВасШик атуЫкщеГаОепк СНСС 15516 был депонирован в Ό8ΜΖ (Эеи1ксЬе 8атт1ипд уоп МПаоогдашктеп ипб Ζе11киЬи^еη ОтЬН, 1пЬоГГепк1гакке 7В, 0-38124 ВгаипксШуещ) под номером доступа Ό8Μ 25840 с датой депонирования 3 апреля 2012 года СЬг. Напкеп А/8, Оептагк. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Штамм ВасШик атуЫцщеГаОепк СНСС 15536 был депонирован в Ό8ΜΖ (ОеШксЬе 8атт1ипд уоп Μ^к^οο^§аШктеη ипб Ζе11киЬи^еη ОтЬН, 1пЬо£Гепк1гакке 7В, Ό-38124 ВгаипксШуещ) под номером доступа Ό8Μ 27032 с датой депонирования 21 марта 2013 года СЬг. Напкеп А/8, Оептагк. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Штамм ВасШик атуЫцщеГаОепк СНСС 15539 был депонирован в Ό8ΜΖ (ОеШксЬе 8атт1ипд уоп Μ^к^οο^§аШктеη ипб Ζе11киЬи^еη ОтЬН, 1пЬо£Гепк1гакке 7В, Ό-38124 ВгаипксШуещ) под номером доступа Ό8Μ 27033 с датой депонирования 21 марта 2012 года СЬг. Напкеп А/8, Оептагк. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Штамм ВасШик киМШк СНСС 15541 был депонирован в Ό8ΜΖ (ОеШксЬе 8атт1ипд уоп Μ^к^οο^даη1ктеп ипб Ζе11киЬи^еη ОтЬН, 1пЬо£Гепк1гакке 7В, Ό-38124 ВгаипксЬ\уещ) под номером доступа Ό8Μ 25841 с датой депонирования 3 апреля 2012 года СЬг. Напкеп А/8, Оептагк. Это депонирование было выполнено при условиях Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Для всех идентифицированных выше депонированных микроорганизмов применимы следующие дополнительные указания:

что касается соответствующих патентных ведомств соответствующих указанных государств, заявители требуют, чтобы пробы депонированных микроорганизмов, заявленных выше, становятся доступными только эксперту, назначенному заявителем, до даты, до которой этот патент предоставлен, или до даты, при которой эта заявка была отклонена, или отозвана, или предположительно является отозванной.

Варианты данного изобретения описаны ниже с использованием неограничивающих примеров. Примеры

Материалы.

Телячий инфузионный бульон (У!В) (ШГсо. 234420).

- 9 028359

Агар с телячьим инфузионным бульоном (У1В) (У1В+1,5% агар бактериологический (агар № 1), Охо1б ЙРОО11).

Чашки с агаром Т3 (на 1л: 3 г триптона, 2 г триптозы, 1,5 г дрожжевого экстракта, 0,05М натрийдигидрофосфат и 0,005 МпС1₂ (рН 6,8) и 15 г агара).

Бульон Ьаига-Вейат (ЬВ) (г/л: бактотриптон 10 (ИгГсо 0123), дрожжевой экстракт 5 (Охо1б Ь21), №ιθ 10 (Мегск № 106404)).

Бульон сердечно-мозговой вытяжки (ВН1) (Охо1б СМ225).

Агар с сердечно-мозговой вытяжкой (ВН1) (Охо1б СМ375).

Соли желчных кислот (желчный экстракт, свиной; §1§ша В 8631).

Чашки для проб для анализа (Νικία 240845).

Чашки Петри (Ргосибап 140096, чашки Петри с рубчиками).

Среда споруляции: % (м/м) 95% воды; 1,5% источника азота (т.е. дрожжи); 3% сахарида; 0,06% микроминералов; дикалий-гидрофосфат 0,1%.

Физиологический солевой раствор с пептоном (0,9% хлорид натрия, 1% пептон) РКР Уе1М1С Ьас1-1 и Ьас1-2 (δνΑ, Иррза1а, 5>\\сбеп).

Бульон КОББ^ПТБТ (Охо1б СМ0473).

Культуры.

Штаммы ВасШиз выделяли из фекалий, почвы, кормовых источников и собирали из коллекций банков и поддерживали в νΐΕ с 20%-ным глицерином в основных чашках МТР при -80°С.

Антибиотики.

Ампициллин (δίβΐηιι. Α9518-5Ο).

Ванкомицин (δί§ιη;·Γ V1764-250ΜΟ).

Гентамицин (δί§ιη;·Γ О1264-50МО).

Канамицин (Бщта, К137 7-10).

Стрептомицин (δί§ιη;·Γ δ6501-50).

Эритромицин (δίβΐηη Ε-5389).

Клиндамицин (δί§ιη;·Γ С2569-10М0).

Тетрациклин (Бфта Τ-7660).

Хлорамфеникол (Бщта, С0378-50).

Патогены.

Е. сой 0101 Р5 (§1а1е 5>егит 1пзй1и1е, Сореийадеи, Эептагк).

Ε. сой 0147:К89 Р4 (§1а1е 5>егит 1и8Й1и1е, Сорепйадеп, Эептагк).

Ε. сой 0149:к91, к88а ЩСТС 10650) №Шопа1 Сойесйоп оГ Туре СиЙигез.

Штаммы Е. сой поддерживали в ЬВ с 20%-ным глицерином в основных чашках МТР при -80°С.

С1оз1йбшт регГйидеиз Туре Α, Э8М 756, поддерживали в ВН1 с 20%-ным глицерином при -80°С.

Пример 1. Предварительный скрининг.

261 изолят из почвы, фекалий и кормовых источников подвергали предварительному скринингу на чувствительность к антибиотикам, ингибирование патогенов и чувствительность к низкому рН.

1.1. Чувствительность к антибиотикам.

Штаммы ВасШиз добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек МТР в 700 мкл νΐΕ в планшеты Ό\ν (с глубокими лунками) и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Пробы КО-теста, дополненные антибиотиками, перечисленные в табл. 1, при 2 концентрациях и 15>О-контроли без антибиотиков добавляли в чашки МТР в объеме 180 мкл. Ночные культуры ВасШиз разводили в 100 раз и переносили в аликвоты 20 мкл в пробы 15>О-тсста и контроли. Чашки МТР инкубировали при 37°С. Оптическую плотность (ОО) при 620 нм измеряли в инокуляте и в тест-чашках МТР после 24 и 48 ч инкубирования. Чувствительность к антибиотикам бактерий оценивали в виде процента ОО в пробах 18Отеста относительно ОО в 15>О-контроля.\.

1.2. Скрининг штаммов ВасШиз на ингибирование патогенов.

Штаммы ВасШиз добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек чашек МТР в 700 мкл νΐΕ в планшеты Όν (с глубокими лунками) и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи.

Перед этим анализом штаммы Е. сой выращивали в ЬВ в течение ночи при 30°С. С. регГйидеиз СНСС14372 выращивали в ВН1 в течение ночи в анаэробном сосуде при 37°С.

1.2.1. Ингибирование Е. сой посредством агарового капельного теста.

мл ночной культуры Е. сой перемешивали с 200 мл жидкого агара νΐΕ при 50°С и выливали в каждую чашку биоанализа. Эти чашки сушили в стерильном боксе. Ночные культуры ВасШиз, 2 мкл каждая, наносили в виде пятен на поверхность УТВ-агара, смешанного с Е. сой, и инкубировали при 37°С в течение 2 дней. Радиусы осветвленных зон ингибирования вокруг этих пятен измеряли и регистрировали как высокий - радиус больший чем 2 мм, средний - радиус между 0,5-2 мм и низкий - радиус, меньший чем 0,5 мм.

1.2.2. Ингибирование С. регГппдепз посредством агарового капельного теста.

νΐΕ-агар наливали в чашки для биоанализа (200 мл на чашку) и основательно сушили в стерильном боксе. Ночные культуры ВасШиз, 2 мкл каждая, наносили в виде пятен на поверхность чашек с У1В- 10 028359 агаром и инкубировали при 37°С в течение ночи. С. регГппдепк типа А СНСС14372 добавляли в объеме 2 мл к 200 мл жидкого агара ВН1, перемешивали и наносили осторожно в чашки для биоанализа с пятнами ВасШик. Эти чашки инкубировали анаэробно при 37°С в течение 1 дня.

Радиусы осветвленных зон ингибирования вокруг этих пятен измеряли и регистрировали как высокий - больший чем 2 мм, средний - между 1 и 2 мм и низкий - меньший чем 1 мм.

1.2.3. Ингибирование С. регГппдепк посредством диффузионного луночного теста.

мл ночной культуры Е. сой перемешивали с 200 мл жидкого агара ВН1 и выливали в каждую чашку биоанализа. После отверждения делали лунки 10 мм в агаре ВН1 стерильным сверлом и 80 мкл ночной культуры ВасШик переносили в каждую лунку. Чашки инкубировали анаэробно при 37°С в течение 1 дня. Радиусы осветвленных зон ингибирования вокруг этих лунок измеряли и регистрировали как высокий - больший чем 2 мм, средний - между 1-2 мм и низкий - меньший чем 1 мм.

1.3. Анализ резистентности к желчи.

Штаммы ВасШик добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек МТР в 700 мкл У1В в планшеты Ω\ν (с глубокими лунками) и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Ночные культуры ВасШик в объеме 50 мкл переносили в 800 мкл У1В, дополненный 0,3% желчными солями (тест-пробы) и У1В без желчи (контроли) в Όν-планшетах (с глубокими лунками). Планшеты инкубировали при 37°С и 175 об/мин. Оптическую плотность при 620 нм (ΘΌ₆₂₀) измеряли при времени 0,6 и 24 ч в У1В с желчью и вычитали из соответствующих величин ΘΌ₆₂₀ в У1В-контролях. Культуры ранжировали в соответствии с различиями в величинах ΟΌ₆₂₀ в группы А (ΘΌ<0,1), В (ΘΌ=0,1-0,4) и С (ΘΌ>0,4). Штаммы в группе А рассматривали как наиболее резистентные к желчным солям. Отобранные штаммы должны находиться в группе А или В. Результаты для отобранных штаммов представлены в табл. 2.

1.4. Чувствительность к низкому рН (моделирующему условия в желудке).

Аликвоты У1В 800 мкл, установленные на рН 4 1,0М хлористо-водородной кислотой, и У1Вконтроли (рН 7) распределяли в Όν-планшетах. Штаммы ВасШик добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек МТР в Όν-планшеты и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение 24 ч. Оптическую плотность (ΟΌ₆₂₀) измеряли в 200 мкл клеточных суспензий при времени 0 и после 24 ч инкубирования. Бактериальный рост при рН 4 определяли вычитанием величин ΟΌ₆₂₀ перед инкубированием из соответствующих величин после инкубирования. Культуры, показывающие увеличение в ΟΌ₆₂₀, большее чем 0,1, рассматривали как резистентные к рН 4 (указанные как К в табл. 2), тогда как культуры с величинами ΟΌ₆₂₀, меньшими чем 0,1 (отсутствие роста или отрицательные величины), рассматривали как чувствительные к рН 4 (указанные как δ в табл. 2).

1.5. Результаты предварительного скрининга.

На основе этого теста предварительного скрининга были отобраны 32 штамма для вторичного скрининга. Отобранные штаммы должны быть чувствительными в отношении описанных антибиотиков и проявлять антимикробное действие как против Е. сой, так и против С1окйтйшт регГппдепк, и выступать приемлемо в других выполняемых тестах.

Из количества 261 этих изолятов из почвы и фекалий и кормовых источников изоляты в количестве 161 были устойчивыми к антибиотикам в тесте предварительного скрининга. Из 100 изолятов, которые были чувствительными к антибиотикам, 56 имели антимикробное действие против С1окйтйшт ретГйпдепк и только 22 имели действие как против Е. сой, так и против С1окйтйшт регГппдепк. Из них 12 изолятов были из вида В. ату1оПс|иеГас1епк. Другие репрезентативные штаммы были из видов В. киЬййк и В. то_)ауепк1к. Табл. 2 и 3 суммируют эти результаты патентованных Сйт. Напкеп штаммов (22 из 32 штаммов, отобранных для вторичного скрининга).

Пример 2. Вторичный скрининг.

На основе результатов первичного скрининга 40 отобранных изолятов и ссылочных штаммов тестировали на ингибирование патогенов повторением агаровых капельных тестов и на споруляцию. 32 штамма тестировали также на чувствительность к антибиотикам с использованием М1С-теста.

2.1. Скрининг штаммов ВасШик на ингибирование патогенов.

Перед анализом 9 мл У1В инокулировали культурами ВасШик и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Одновременно 9 мл бульона ВН1 инокулировали штаммами Е. сой и инкубировали в течение ночи при 37°С. С1окйтйшт регГппдепк выращивали при тех же самых условиях в анаэробном сосуде.

2.1.1. Ингибирование Е. сой с использованием агарового капельного теста.

Ночные культуры патогенов добавляли в объеме 2 мл, каждой, в 200 мл жидкого У1В-агара при 50°С и выливали в каждую чашку биоанализа. Чашки сушили в стерильном боксе.

Ночные культуры ВасШик наносили в виде пятен на поверхность У1В-агара, смешанного с патогенами, и инкубировали 37°С в течение 2 дней. Радиусы зон ингибирования вокруг пятен и диаметры пятен регистрировали.

2.1.2. Ингибирование С. регГппдепк с использованием агарового капельного теста.

Культуры ВасШик наносили в виде пятен на поверхность У1В-агара в чашках Петри и инкубировали при 37°С в течение ночи. Ночную культуру С. регГппдепк в объеме 2 мл смешивали с 200 мл жидкого ВН1-агара и выливали в У1В-агар с выросшими пятнами ВасШик. Эти чашки инкубировали анаэробно

- 11 028359 при 37°С в течение 1 дня. Измеряли радиусы осветвленных зон ингибирования вокруг этих пятен.

2.2. Рост в У1В и в среде спору ляции.

Штаммы ВасШик добавляли в объеме 50 мкл основных планшетов МТР в 700 мкл У1В или среды споруляции в ϋ^-планшетах (с глубокими лунками) и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение 24 ч. Бактериальный рост определяли по оптической плотности при 620 нм (Οϋ₆₂₀) в 200 мкл суспензий. Вследствие высокой мутности среды споруляции и ее варьирования между лунками величины Οϋ₆₂₀ перед инкубированием вычитали из величин Οϋ₆₂₀ в соответствующих лунках после инкубирования. Культуры, показывающие Οϋ₆₂₀, большее чем 0,4, ранжировали в группу А (высокий рост), и Οϋ₆₂₀, меньшее чем 0,4, в группу В (низкий рост).

2.3. Споруляция в среде споруляции.

Штаммы ВасШик добавляли в объеме 50 мкл из основных чашек МТР в 700 мкл У1В в 1Жпланшетах и инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение ночи. Ночные культуры ВасШик в объеме 50 мкл переносили в 700 мкл среды споруляции (5М) в ГЖ-планшетах.

Планшеты инкубировали при 37°С и 175 об/мин в течение 3 дней. Споруляцию наблюдали микроскопически, и процент спор (количество спор относительно общих клеток) определяли визуальным оцениванием после 1 дня (24 ч), 2 дней (48 ч) и 3 дней (72 ч) инкубирования.

2.4. Чувствительность к антибиотикам, измеренная с использованием М1С.

Эти штаммы анализировали на чувствительность к антибиотикам измерением минимальной ингибирующей концентрации (М1С) для ряда антибиотиков. Используемым способом был способ микроразведения бульона, описанный стандартом СБ51 (Институт клинических и лабораторных стандартов М07А8 и М45-А2).

Суспензию ночного роста, подлежащую тестированию, инокулируют в бульон ΙδΟ-δΕΝδΙΤΕδΤ (Οχοΐά СМ0473) в микротитрационных планшетах при приблизительной концентрации 10⁵ КОЕ/мл (колониеобразующих ед/мл) в двукратных серийных разведениях тестируемого антибиотика (общий объем 100 мкл/лунка) и инкубировали аэробно в течение 20-24 ч при 37°С. Могут быть использованы предварительно сфабрикованные панели Уе1М1С Бас1-1 и Бас1-2, содержащие антибиотики амипициллин, ванкомицин, гентамицин, канамицин, стрептомицин, эритромицин, клиндамицин, тетрациклин и хлорамфеникол. Эти результаты регистрируют после 24 ч в виде самой низкой концентрации антибиотика для ингибирования видимого роста. Этот тест выполняли дважды в виде независимых биологических повторностей.

2.5. Результаты.

Результаты из 32 отобранных штаммов показали, что ВасШик ату1ойцие1ас1епк имела наилучшие объединенные свойства чувствительности к антибиотикам, антимикробного действия и споруляции (ср. табл. 2). Включены только данные патентованных Сйг. Напкеп штаммов (22 из 32 штаммов).

Таблица 2

Базовые данные для отобранных штаммов ВасШик.

Источник, вид по дуг В, рост в У1В и среде споруляции, а также процент споруляции.

Штамм А=15510; штамм В=15516; штамм С=15541; штамм Н=15536; штамм 1=15539.

Штаммы Источник	Вид	Устойчивость к антибиотикам	Рост νίΒ	5 М	Споруляция,	% День 3
День 1	День 2
А	Фекалии	В.то]'ауеп515	Чувствительный	А	В	5	95	90
В	Фекалии	В. ату1о11яие£ас1еп5	Чувствительный	А	А	10	99	99
С	Фекалии	Β.δΐιΜΐΙΐδ	Чувствительный	В	А	0	80	95
ϋ	Фекалии	В. ату1о11яиеГааеп5	Чувствительный	В	А	40	99	99
Е	Фекалии	В. ату1о1|циеГас1еп5	Чувствительный	В	А	20	99	99
Е	Фекалии	В. ату1оНциеГааеп5	Чувствительный	В	А	50	99	99
С	Фекалии	В. ату1о11яиеГааеп5	Чувствительный	В	А	95	95	95
н	Фекалии	В. ату1о1|циеГас1еп5	Чувствительный	А	А	99	99	99
I	Фекалии	В. ату1о1|циеГас1еп5	Чувствительный	В	А	80	99	99
ΰ	Фекалии	В. ату1оНциеГааеп5	Чувствительный	В	А	50	99	99
к	1_МС	В. ату1о11яиеГааеп5	Чувствительный	А	А	2	99	99
I.	Фекалии	В. Ιίεήεηίίοπτιίδ	Чувствительный	В	А	90	99	ΝΑ
м	Почва	В. ΙίεήεπίίοΓΓηίδ	Устойчивый	В	А	0	1	80
N	Почва	В. тедаГепит	Устойчивый	В	А	0	0	0
0	Фекалии	В.зиЬДНз	Чувствительный	А	В	0	60	10
Р	Фекалии	В. ритПи5	Устойчивый	А	А	0	10	99
Ω	Фекалии	В. ||спеп|Гогт15	Устойчивый	А	А	0	1	5
к	Фекалии	В. ΙίοήεπίίοΓΓπίδ	Устойчивый	А	А	0	немного	40
5	Фекалии	В. ритПи5	Чувствительный	А	А	0	10	95
т	Почва	В. тедаГепит	Устойчивый	В	А	0	0	0
и	Почва	В. ΙίεήεπίΐοΓΓηίδ	Устойчивый	А	А	0	немного	70
V	Фекалии	Β.δΙίΜΐΙΐδ	Устойчивый	А	В	95	99	90

- 12 028359

Таблица 3

Ингибирование Е. сой и С1ок1пШит регГппдепк (мм), а также устойчивость против желчи и кислоты отобранных штаммов ВасШик.

Штамм А А=СНСС15510; штамм В=15516; штамм С=15541; штамм Н=15536; штамм 1=15539; 0149, 0147 и 0101 являются тремя свиными патогенами Е. сой, упоминаемыми как патогены

Штаммы	Вид	6 ч	Желчь 24 ч	Е.соН, ингибирование, СК регМпдепв,
мм	мм	Мт
Кислота 0149	0147	0101
А	В. то)ауеп515 В. ату1оНяиеГаа-	С	А	5	1.5	1.7	2.3		7
В	епз	А	А	5	2.5	2.3	3.5		8
С	В. зиЬВПз В. ату1оНдие1аа-	А	В	К	1.8	1.5	2.7		7
ϋ	епз В. ату1оНяиеГаа-	А	А	К	2	1.7	2.5		6
Е	епз В. ату1оПяиеГаа-	В	А	5	3	3	3.5		6
Е	епз В. ату1оНяиеГаа-	В	А	5	2.5	2.5	3.3		7
С	епз В. ату1оНяиеГас1-	В	В	К	2	1.7	2		7
н	епз В. ату1оНяиеГаа-	А	А	К	3.5	3	4.5		7
I	епз В. ату1оНяиеГаа-	В	А	К	2	2	2		8
1	епз	В	А	5	2	2.5	2.5		8

К	В. ату1оПяиеГааепз	В	А	5	0.3	<1	1	4
ί	В. ||спеп|(огт15	А	В	5	< 1	<1	1.3	8
М	В. ПсИеп|Гогт15	В	А	5	0	0	0	4
N	В. теда1епит	В	А	5	0	0	0	0
0	В. зиЬВНз	В	А	5	1	<1	1.3	7
Р	В. ритПиз	А	А	К	1	0	1.7	8
Ω	В. Пспеп|(огт15	В	В	5	0	0	0	2
к	В. Пспеп|1огт15	В	В	5	0	0	0	2
5	В. ритНиз	А	А	К	<1	0	<1	6
Т	В. теда1епит	А	А	5	0	0	0	0
и	В. ПсИеп|Гогт15	В	В	5	0	0	0	3
V	В. зиЬВНз	С	А	5	2.5	1	2.5	10

Пример 3. Теплостойкость.

3.1. Способ для теста теплостойкости.

Штаммы ВасШик выращивали в течение ночи в У1В при 37°С и 220 об/мин. Ночные культуры распределяли на чашках с агаром Т3 (100 мкл 105-106 разведений) и инкубировали при 37°С в течение 1-2 дней, пока не завершалась споруляция. Споры выскребали из этих чашек, суспендировали в растворе РКР и инкубировали при 80°С в течение 15 мин для инактивации вегетативных клеток.

Суспензии спор помещали на лед сразу же после нагревания. Препараты спор промывали дважды в РКР, ресуспендировали в РКР с 20% глицерином и хранили при 80°С перед применением. Теплостойкость бактериальных спор оценивали удерживанием пробирок Эппендорфа с 500 мкл в ГКР (при концентрации приблизительно 1x106 КОЕ на мл) при 99,5°С в течение 2, 5 и 10 мин. Количества КОЕ определяли в разведениях нагретых суспензий, посеянных на У1В-агар, после инкубирования при 37°С в течение ночи.

3.2. Результаты теста на теплостойкость.

Данные теплостойкости показаны в табл. 4.

Таблица 4

Теплостойкость при 99,5°С отобранных штаммов ВасШик, измеренная в КОЕ в виде уменьшения после 2, 5 и 10 мин относительно времени 0 (1од/1од).

Штамм В=15516; штамм С=15541, штамм Н=15536

Штаммы	Виды	Уменьшение после	в КОЕ
		2 мин	5 мин	10 мин
В	В. ату1оИдие£ас1епз зиЬзр ату1оИдие£ас1епз	0, 05	0	0
С	В. зиЬГШз	0,25	2,5	3, 8
ϋ	В. ату1о11дие£ас1епз/з1атепз1з родственный	0	0	0, 05
Е	В. ату1оИдие£ас1епз зиЬзр. р1ап£агит	0,34	3, 8	5, 3
Е	В. ату1оИдие£ас1епз зиЬзр. ату1оИдие£ас1епз	0	0	0
Н	В. ату1оИдие£ас1епз зиЬзр. р1ап£агит	0, 19	2,5	5

Обычно уменьшение меньшее чем 2 (1од/1од) КОЕ после 2 мин относительно времени 0 является подходящим для спор, подлежащих включению в корм для гранулирования, и результаты ниже 2 достигаются с обычными коммерческими препаратами спор ВасШик. Таким образом, все штаммы, тестирован- 13 028359 ные и показанные в табл. 4, имеют хорошую теплостойкость. Некоторые штаммы также показали хорошую теплостойкость после 5 и 10 мин, а именно штамм В и штамм Р, оба В. ату1о1к|иеГас1епк киЬкр. ату1оНдиеГас1епк, которые не обнаруживали уменьшения КОЕ.

Пример 4. Получение ферментов.

4.1. Способ для анализа целлюлазы.

Штаммы ВасШик выращивали в карбоксиметилцеллюлозной среде (СМС) (АЬои-Та1еЬ е1 а1., 2009) (на л: 10,0 г карбоксиметилцеллюлозы (С9481), 2,0 г Бакто Триптона (кат. 211705, Вес1оп Оюкткоп А/8, Оептагк), 4 г КН₂РО₄, 4,0 г Ыа₂НРО₄, 0,2 г М§8О₄-7Н₂О, 0,001 г СаС1₂-2Н₂О, 0,04 г Ре8О₄-7Н₂О, рН 7) при 37°С и сильном магнитном перемешивании в течение 24 ч. Продуцирование целлюлазы определяли с использованием набора Еп/СНек Се11и1аке 8иЬк1га1 (кат. Е33953, ЫГе Тесйпо1од1ек) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце супернатанты культур собирали центрифугированием и распределяли в МТР (200 мкл на лунку) в серийных разведениях. Стандартные кривые конструировали с использованием целлюлазы из АкрегдШик тдег, начиная от 2 Е/л. Раствор субстрата Еп/СНек добавляли к культуральным супернатантам в 96-луночных планшетах Миис В1аск Р1иогоМипс (кат. 237105, ТЬегто РЬНег 8с1епЬйс, ΝυΝΕ 1пс.). Флуоресценцию регистрировали при возбуждении 360 нм/испускании 420 нм после 30-минутной инкубации (Епкрпе 2300 Ми1ШаЬе1 РеаЬег, Регкш Е1тег 1пс.). Активность целлюлазы рассчитывали из стандартных кривых в двух независимых экспериментах и выражали как средние величины (Е/мл).

4.2. Способ для анализа ксиланазы.

Культуры ВасШик выращивали в среде, содержащей ксилан древесины бука (СогЬепо е1 а1., 2002) (на л: 5,0 г ксилана (Х4252), 2,0 г дрожжевого экстракта (кат. 288620, Вес1оп Пккшкоп А/8, Оептагк), 5,0 г Бакто Пептона (кат. 211677, Вес1оп Пккшкоп А/8, Оептагк), 0,5 г №С1, 0,5 г М§8О₄-7Н₂О, 0,15 г СаС1₂-2Н₂О, рН 7,5) при 37°С и сильном магнитном перемешивании в течение 24 ч. Анализ ксиланазы выполняли с использованием набора Еп/СНек ИНга Ху1апаке Аккау (кат. Е33650, ЬгГе ТесНпоШфек) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце супернатанты культур собирали центрифугированием и распределяли в МТР (200 мкл на лунку) в серийных разведениях и добавляли рабочий раствор субстрата ксиланазы. Флуоресценцию в культуральных супернатантах измеряли при возбуждении 360 нм/испускании 420 нм после инкубирования в течение 30 мин (Епкрпе 2300 Ми1ШаЬе1 РеаЬег, Регкш Е1тег 1пс.) - ТЬегтотусек 1ашдшок1к (Х2753) использовали в качестве стандартного фермента и загружали в МТР в серийных разведениях, начиная от 25 мЕ на мл. Активность ксиланазы рассчитывали из стандартных кривых и выражали в виде средних величин (мЕ/мл) двух независимых анализов.

4.3. Способ для анализа протеазы.

Ночные культуры ВасШик (росшие в У1В при 37°С) переносили в реакционную смесь с флуоресцеинизотиоцианатом (Р1ТС-С) в виде субстрата (8щта С3777) и инкубировали при 37°С 3 ч. После преципитации количество растворимых пептидов измеряли посредством флуоресценции при возбуждении 497 нм, испускании 515 нм. Этот анализ детектирует широкий диапазон протеаз (серина, аспарагиновой кислоты, цистеина и металлопротеаз).

4.4. Методы для получения биопленки.

Штаммы ВасШик добавляли в У1В (приблизительно 10⁷ КОЕ/мл), распределяли в полипропилен (РР) МТР (9б-луночные Сотса1 В1т РР РЬ №11ига1; NυNС 1пс., Эептагк) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч без встряхивания. Рост контролировали измерениями оптической плотности (ΌΌ) при 620 нм. Образование биопленки оценивали с использованием окрашивания кристаллическим фиолетовым красителем, как описано ранее (Аидег е1 а1., 2009). Вкратце после промывания этих лунок дистиллированной водой раствор кристаллического фиолетового красителя 0,1% (м/о) добавляли к РР-МТР, и эти планшеты инкубировали в течение 30 мин. Затем процедуру промывания повторяли и в эти планшеты добавляли этанол 96% (о/о). Поглощение при 570 нм измеряли после 15 мин ингибирования (Аа11ас УЬ1ог2спектромер, Регкш Е1тег 1пс.). Штаммы ВасШик крр. классифицировали либо как высокие (АЭ8_{570 нм}>2,0), средние (АЭ8_{570 нм}=1,0-2,0) или низкие (АЭ8_{570 нм}<1,0) продуценты биопленки. Этот анализ выполняли в двух повторностях.

4.5. Результаты для анализов ферментов.

- 14 028359

Таблица 5

Получение ферментов и биопленки (КЕи=относительная единица флуоресценции). Штамм А=15510; штамм В=15516; штамм С=15541; штамм Н=15536; штамм 1=15539

	Целлюлаза	Ксиланаза	Протеаза	Биопленка
Штаммы Виды	мЕ/мл	мЕ/мл	кги/сю
А	В.то]ауеп515	1734	50	142117	+
В С	В.ату1о11чие(ас1еп5 зиЬзр. ату1оПдие(аС1еп5 Β.δΐιόίίΙίδ	67 1037	47 24	599919 445091	+ +
ϋ	В. ату1оНяиеГааеп5/51атеп515 родственные	2196	70	291908	+ + +
Е	В. ату1оНяиеГас1еп5 ειιόερ. р1ап(агит	612	28	381459	+ + +
Е	В. ату1оНяиеГааеп5 зиЬзр. ату1о1|диеГааеп5	54	57	400456	+ + +
С	В. ату1оНдиеГааеп5 зиЬзр. р1ап1агит	371	71	453158	+ + +
н	В. ату1оНяие1ааеп5 зиЬзр. р1ап(агит	631	30	252377	++
I	В. ату1оНдие1ас1еп5 еиЬер. р1ап!агит	466	121	411206	+ + +
	В. ату1оНрие(ааеп5 зиЬзр. р1ап(агит	469	72	421338	+ + +

Эта таблица показывает, что штаммы Е, О, Н, I и I, которые все являются В. ату1о1^^иеГас^еηк киЬкр. р1ап1агит, имеют высокую целлюлазную активность, тогда как штаммы В и Е, которые являются В. ату1о1^^иеГас^еηк киЬкр. ату^ИдисГашспк, имеют низкую целлюлазную активность.

Пример 5. Испытания на поросятах.

Два отобранных штамма ВасШик (штамм В или С) добавляли к рациону питомника для оценивания их действия на показатели роста и смертность поросят после отъема. Поскольку Е. сой является одним из главных патогенов в период пребывания в питомнике с большим воздействием на параметры продуктивности и смертность, эти испытания могут дать информацию о действии на ингибирование Е. сой в этих животных. Эти испытания выполняли в 2 различных участках; участком 1 было экспериментальное хозяйство, а участком 2 был университет. Схема испытания была одинаковой в обоих участках.

Таблица 6

Беглый обзор участков, используемых в испытаниях с поросятами

	Общее количество свиней	Количество повторностей	Взвешивание	Дни в испытании
Участок 1	576	96	28, 35, 42, 63	35
Участок 2	720	24	28, 35, 49, 63	35

5.1.1. Экспериментальная схема на участке 1.

В день отъема 576 поросят (28-дневных) из двух последовательных партий (288 поросят в каждой), происходящих из экспериментальной фермы, использовали в этом эксперименте. Поросятами были поросята кроссбреда (первого поколения от скрещивания неродственных особей) (АСМСхШсГгаш). Отобранные поросята были здоровыми, с хорошим общим видом и не получали никакой вакцинации в фазе питомника. Эта экспериментальная ферма была положительной в отношении свиного репродуктивного и респираторного синдрома (РКК8), но была под контролем и имела некоторые проблемы колибактериоза в фазе после отъема. Этих поросят сортировали по массе тела и затем распределяли в 48 загонах в обеих партиях отъема (96 загонов в целом), так что каждый блок загонов содержал 6 поросят, 3 некастрированных самцов и 3 самок, со сходной массой тела в обеих обработках. Эти обработки распределяли в загоны легких и тяжелых поросят по блоку, так что каждую обработку применяли к 24 загонам из 6 поросят (6 загонов на обработку и помещение; 12 загонов на обработку и партию отъема). Продукты ВасШик добавляли к корму при 400 г на тонну корма или 1,28 х10⁷ КОЕ на г корма.

Свиней индивидуально взвешивали в дни 28 (день 0; день отъема), 35, 42 и 63 возраста для расчета среднего ежедневного прироста массы (АПШО). Среднее ежедневное потребление корма (ΑΌΕΙ) и затрату корма на единицу продукции (ЕСК) измеряли на загон в одних и тех же фазах (28-35; 35-42; 42-63) и для основных периодов (престартер: возраст 28-42 дней; стартер: возраст 42-63 дня и общий период питомника). Смертность и случаи патологий контролировали один раз в день, в том числе регистрацию индивидуальных применяемых обработок антибиотиками.

Таблица 7

Параметры продуктивности на участке 1. Р-величины в сравнении с контролем (А:Р<0,1; а<0,05). Штамм В=15516; штамм С=15541, 8Е - стандартная ошибка

	Масса тела, кг	Возраст 28 дней - 42 дня (14 дней в испытании)	Возраст 42-6С	! дня	Общая масса (28-63 дня)
	286	636	Αϋ6	ΑϋΕΙ	ЕСК	ΑϋΟ	ΑϋΕΙ	ЕСК	АОС	ΑϋΕΙ	ЕСК
Контроль	7,7	20,7	179	254	1,43	493	697	1,42	371	522	1,40
Штамм В	7,7	21,1	19бА	264	1,37а	513	723а	1,41	383	535	1,40
Штамм С	7,8	21,0	199а	267А	1,37а	501	710	1,42	380	532	1,40
ЗЕ (станд. ошибка)	0,150	0,254	0,007	0,006	0,024	ο,οιο	0,010	0,008	0,007	0,007	0,009

5.1.2. Результаты.

Пробиотические продукты обоих штаммов ВасШик, добавленные к рационам питомника, улучшали

- 15 028359 продуктивность в сравнении с группой отрицательного контроля, без проявления различий между ними. Существенные действия как на АЭС, так и на Ри можно было наблюдать в фазе престартера (возраста 28-42 дней). Процент смертности уменьшался в обеих группах ВаеШик (% смертности: контроль (3,47), штамм В (1,39%), штамм С (2,08)).

5.2.1. Экспериментальная серия в участке 2.

Сразу же после отъема всех поросят содержали в отъемном отделении из 24 загонов с 30 животными на один загон. Это отделение оборудовано центральным обогреванием и принудительной вентиляцией с системой охлаждения и полностью покрытыми шифером полами. Каждый загон оборудован коммерческой двухсторонней кормушкой для полужидких-сухих кормов для гарантии кормления ад НЪЧит и свободного доступа воды с возможностью одновременного кормления трех животных. Корм распределяли ад НЪйит на протяжении всей экспериментальной фазы.

В целом использовали 720 коммерческих скрещенных поросят-отъемышей (Р1е1га1пх(ЬапдгаеехЬагде Шййе)). Этих животных получали от свиноматок одной и той же фермы в день отъема и перемещали в экспериментальные установки (без транспортирования). Использовали самцов и самок 26дневных поросят 7,0 кг, 8Ώ=1,64 ВШ (по массе). Использовали идентификационную пластиковую ушную бирку с номером животного. Этих животных распределяли в три блока по начальной массе тела. Таким образом, каждый блок состоял из 8 загонов 30 животных, в которые случайным образом назначали экспериментальные рационы.

Испытание начинали при отъеме в возрасте 28 дней. Животных по отдельности взвешивали в дни 0 и 7, и группу взвешивали в дни 21 и 35 в испытании. Исчезновение корма из каждого бункера измеряли на протяжении этого эксперимента. Таким образом, рассчитывали среднее суточное потребление корма (ΑΏΡΙ), средний суточный прирост (АЭС) и затрату корма на прирост продукции (РСК) в соответствии с общим потреблением корма. Состояние здоровья поросят оценивали регулярно и регистрировали любые аномальные признаки или лекарственное лечение. Рассчитывали показатель смертности и процент выбраковки.

Таблица 8

Показатели продуктивности в участке 2.

Средние величины наименьших квадратов, Р-величины в сравнении с контролем (А:Р<0,1).

Штамм В=15516; штамм С=15541

	Возраст 28-35 дней	Возраст 49 дней - 63 дня	Всего (28 дней - 63 дня)
	ΑϋΟ	ΑϋΡΙ	РСК	ΑϋΟ	ΑϋΡΙ	РСК	ΑϋΟ	ΑϋΡΙ	РСК
Контроль	73.8	157	2.26	345	602	1.76	227	388	1.72
Штамм В	80.9	174	2.26	375а	584	1.58А	235	383	1.64
Штамм С	87.1	166	1.96	379	586	1.60	232	389	1.69
ЗЕ (станд. ошибка)	0.010	0.008	0.0002	0.019	0.025	0.0001	0.0091	0.0066	0.00065

5.2.2. Результаты.

Оба штамма ВаеШик, добавленные к рационам питомника, численно улучшали продуктивность в сравнении с группой отрицательного контроля без обнаруживания различий между ними. Существенное действие как на АЭС, так и на Ри можно было наблюдать в периодах испытания.

Количество животных, обработанных на один загон энрофлуксацином для преодоления тяжелой диареи, было значимо более высоким (Р>0,05) у животных, которых кормили с ВаеШик во время первой недели после отъема. Такие же результаты (Р<0,05) наблюдали в течение всего экспериментального периода ((0-35 дней после отъема). Процент смертности уменьшался в обеих группах ВаеШик (% смертности: контроль (4,17), штамм В (0,04%), штамм С (2,65)).

- 16 028359

Ссылки

ВагЬоза еЬ а1. , 2005, Зсгееп1пд £ог ВасШиз 1зо1аЬез ίη

ЬЬе ВгоПег базЬго1пЬезЫпа1 ТгасЬ, АррИеЬ апЬ Епч1гоптепВа1 Мз_сгоЪз_о1оду, 968-978

ВепЬЬег еЬ а1., 2011, АпЫт1сгоЫа1 АсЫчНзу о£ ВасШиз ату1оИдие£ас1епз ЪВМ 5006 13 епЬапсеЬ ίη ЬЬе Ргезепсе о£

ЕзсЬегЬсЫа соП, Сигг М1сгоЫо1 62, 1017-1022 бЬаЬуамап еЬ а1., 2010, СЬагасЬегЬгаЫоп апЬ ргоЫоЫс ргорегЫез о£ ВасШиз зЬгаЬпз 15о1аЬес1 Ьгот ЬгоНег, ТЬе ТЬаЬ Доигпа1 о£ УеЬегЬпагу МеЫсЬпе, 40, 2, 207-214 биЬЫпд, 5. М. 2011. ВасШиз ргоЫоЫсз. Εοοά М1сгоЫо1оду 28 (2):214-20.

ЕЕЗА 2008. ТесЬп1са1 биЬЬапсе. ЮрЬаЬе о£ апЫЫоЫс гезЬзЬапсе сгЬЬегЬа. ТЬе ЕЕЗА Ьоигпа1 732, 9-15 био еЬ а1, 2006, ЗсгеепЬпд о£ ВасШиз зЬга1пз аз роЬепЫа1 ргоЫоЫсз апЬ зиЬзедиепЬ сопЫгтаЫоп о£ ЬЬе ίη νίνο еЬЬесЬЫепезз о£ ВасШиз зиЬЬШз МА139 ίη р1дз, Αηίοηίθ ν3η ЬееимепЬоек 90:139-146

К1озе еЬ а1. , 2010. Ιη νίίτο апЬадопЬзЫс 3θίίνίίίθ3 о£ ап1та1 1пЬезЫпа1 зЬгаЬпз адаЬпзЬ змЬпе-аззосЬаЬеЬ раЬЬодепз. λ/еЬ. М1сгоЫо1оду 144:515-521.

Ьорег, ϋ., апЬ К. Ко1Ьег. 2010. ЕхЬгасе11и1аг з1дпа1з ЬЬаЬ ЬеЫпе ЫзЫпсЬ апЬ соехЬзЫпд се11 ЬаЬез ίη ЬасШиз зиЬЬШз. ЕЕМЗ М1сгоЫо1 . Ηθν. 34(2):134-149.

ЗрЬеЬз, М. СТ., б. б. ЗЬигзоп, апЬ Ь. Ь. ЬоЬпзЬоп. 2008. ЕЬЬесЬз о£ Ьмо ЫгесЬ-ЬеЬ т1сгоЫа1 оп ЬЬе аЬШЬу о£ р1дз Ьо гезЬзЬ ап ЬпЬесЫоп мЬЬЬ за1топе11а епЬегЬса зегс^аг ЬурЫтигЬит. Ьоигпа1 о£ Зм1пе Неа1ЬЬ апЬ РгоЬисЫоп. 16(1) :27-

Claims (17)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Штамм ВасШиз, используемый в качестве добавки к корму для животных, выбранный из:

   a) штамма ВасШиз шо]ауепз1з СНСС 15510 Ό8Μ 25839;

   b) штаммов ВасШиз ашу1ойдиеГас1епз СНСС 15516 Ό8Μ 25840, СНСС 15536 Ό8Μ 27032 и СНСС 15539 Ό8Μ 27033;

   c) штамма ВасШиз зиЫШз СНСС 15541 Ό8Μ 25841;

   б) мутанта любого из штаммов а), Ь) или с), где в мутантном штамме менее 1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), Ь) или с), причем любой из штаммов а), Ь), с) или б) характеризуется:

   ι) чувствительностью к ампициллину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, стрептомицину, эритромицину, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу;

   ίί) ингибирующей активностью против Е. сой и С1оз1пбшш регГппдепз; и

   Ш) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации.
2. 2. Штамм ВасШиз по п.1, где в мутантном штамме менее 0,1% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), Ь) или с).
3. 3. Штамм ВасШиз по п.1, где в мутантном штамме менее 0,01% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), Ь) или с).
4. 4. Штамм ВасШиз по п.1, где в мутантном штамме менее 0,001% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), Ь) или с).
5. 5. Штамм ВасШиз по п.1, где в мутантном штамме менее 0,0001% нуклеотидов бактериального генома заменены другим нуклеотидом или делетированы в сравнении со штаммом а), Ь) или с).
6. 6. Способ получения мутантного штамма, выбранного из:

   a) штамма ВасШиз шо]ауепз1з СНСС 15510 Ό8Μ 25839;

   b) штаммов ВасШиз ашуШИциеГашепз СНСС 15516 Ό8Μ 25840, СНСС 15536 Ό8Μ 27032 или СНСС 15539 Ό8Μ 27033; или

   c) штамма ВасШиз зиЫШз СНСС 15541 Ό8Μ 25841;

   где способ предусматривает мутагенез штамма а), Ь) или с), при котором происходит замена или делеция менее 1% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), Ь) или с), и отбор мутантного штамма, характеризующегося:

   ι) чувствительностью в отношении ампициллина, ванкомицина, гентамицина, канамицина, стреп- 17 028359 томицина, эритромицина, клиндамицина, тетрациклина и хлорамфеникола; и) ингибирующей активностью против Е. соН и С1ок1гЫшш регГппдепк; ΐΐΐ) процентом споруляции по меньшей мере 80 при измерении через 2 дня после инкубации.
7. 7. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,1% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), Ь) или с).
8. 8. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,01% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), Ь) или с).
9. 9. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,001% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), Ь) или с).
10. 10. Способ по п.6, где происходит замена или делеция менее 0,0001% нуклеотидов бактериального генома в сравнении со штаммом а), Ь) или с).
11. 11. Композиция для добавления к корму животных, содержащая по меньшей мере один штамм ВасШик по любому из пп.1-5.
12. 12. Композиция по п.11, содержащая по меньшей мере два штамма ВасШик по любому из пп.1-5.
13. 13. Композиция по п.11 или 12, содержащая по меньшей мере три штамма ВасШик по любому из пп.1-5.
14. 14. Композиция по любому из пп.11-13, где клетки указанных штаммов ВасШик находятся в форме спор.
15. 15. Способ получения корма для животных с пробиотической добавкой, предусматривающий добавление композиции по любому из пп.11-14 в качестве премикса к корму для животных.
16. 16. Способ кормления животного, отличающийся тем, что для кормления используют композицию по любому из пп.11-14.
17. 17. Способ кормления животного по п.16, где указанное животное, выбрано из домашней птицы, жвачных животных, телят, свиней, кроликов, лошадей, рыб и домашних животных.