CN114836335B - 一株沙福芽孢杆菌t1-5及其应用 - Google Patents

一株沙福芽孢杆菌t1-5及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于马铃薯疮痂病防治技术领域。本发明公开了一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1‑5，其保藏编号为CGMCC NO.23506。该菌株已于2021年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23506，保藏日期为：2021年9月29日，保藏单位简称为CGMCC，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1‑5，培养简单、周期短、无生态毒性、耐盐碱、可利用的碳源种类丰富，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病病原菌，在马铃薯疮痂病的生物防治中具有非常广泛的应用前景。

Description

一株沙福芽孢杆菌T1-5及其应用
技术领域
本发明属于微生物防治技术领域。
背景技术
马铃薯疮痂病，是一种危害马铃署块茎植物病害。表现为块茎表面出现近圆形至不定形木栓化疮痂状淡褐色病斑或斑块，手摸质感粗糙。一般分为两种发病症状，分别是网纹状病斑和裂口状病斑 (容易被误认为马铃薯粉痂病)。通常病斑虽然仅限于皮层，但被害薯块质量和产量仍可降低，不耐贮藏，且病薯外观不雅，商品品级大为下降，招致一定的经济损失。以前在我国境内由于发病率不高，为害面积不大，所以没有引起人们的重视。但近些年来，在内蒙古、河北、山东等地区的发病面积越来越大，引起的经济损失也非常可观。因此，迫切需要对这种病害进行科学防治。
根据人们长期对病原微生物的分离鉴定研究，已经确定引起马铃薯疮痂病的病原菌主要为疮痂链霉菌(拉丁学名：Streptomyces scabies(Thaxter)Waks.et Henvici)Streptomyces scabies、 Streptomyces acidiscabies、Streptomyces chiniscabies、S.Turgidiscabies、S.galilaeus等。并且这些致病菌属于条件致病菌，即在土壤环境偏碱性条件下容易生长和引起马铃薯病害，而在偏酸性土壤环境中则很少出现。
防治方法主要有以下几种：(1)选用无病种薯；(2)多施有机肥或绿肥，可部分抑制发病；(3)与葫芦科、豆科、百合科蔬菜进行5 年以上轮作；(4)选择保水好的菜地种植，结薯期遇干旱应及时浇水；(5)化学预防：一些化学农药可以用来防治疮痂病；(6)生物防治法：筛选对疮痂病病原菌有良好抑制效果且定植能力强的微生物，在生产种薯过程中及农田种植过程中施用，达到抑制病原菌生长的效果。
如何找到一种有效防治马铃薯疮痂病的菌种一直是本领域研究的难点和热点。
发明内容
正因为如此，本发明公开了一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5，其保藏编号为CGMCC NO.23506。该菌株已于 2021年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23506，保藏日期为：2021年9 月29日，保藏单位简称为CGMCC，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还公开了沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5在制备防治马铃薯疮痂病菌剂中的应用。
本发明另外同时公开额沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1- 5在制备微生物盐碱地改良剂中的应用。
在本发明的具体实施方式中，所述微生物盐碱地改良剂的耐盐性为NaCl浓度不高于11％。
在本发明的具体实施方式中，所述微生物盐碱地改良剂的pH为不高于9。
本发明提供的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5，培养简单、周期短、无生态毒性、耐盐碱、可利用的碳源种类丰富，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病病原菌，在马铃薯疮痂病的生物防治中具有非常广泛的应用前景。
附图说明
图1是筛选结果图。
图2是抑菌效果图。
图3是马铃薯发病统计照片图。
图4是不同pH条件下T1-5的生长情况。
图5是不同pH条件下T1-5的生长情况。
具体实施方式
实施例1
菌种的分离与鉴定
1.培养基：
马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose agar,PDA)培养基(g/L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然。
2.菌株来源：
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5于2020年11月分离自中国广西南宁市武鸣区甘蔗地。
取1g土样放入50ml离心管中，加入10ml无菌水震荡均匀，于37℃、200rpm的摇床上振荡30min，静置至澄清得土壤悬浮液。
在超净工作台中将制备好的土壤悬浮液进行梯度稀释，分别取 100μL 10-3、10-4、10-5倍稀释液在LB固体培养基上进行涂布，重复 3次，37℃培养24h。24h后在超净工作台中挑取形态不同的菌落分别划线纯化，37℃培养24h，重复纯化3次。将得到的纯的单菌落转移到试管斜面培养基中，放入4℃冰箱保存备用。
3.筛选结果：
分离得到菌株如图1所示，该菌株为杆状，以二分裂方式增殖。菌落为乳白色，椭圆形，边缘整齐，扁平，光滑，有光泽，黏稠。产芽孢。分解葡萄糖、麦芽糖和其他糖类。命名该菌株为菌株T1-5。
4.细菌菌株鉴定方法：
采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以待测菌株基因组DNA为模板，利用细菌16S rRNA基因通用引物 27F/1492R扩增目的片段，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将 PCR原液送博迈德生物工程股份有限公司测序。16srRNA基因序列分析，经过序列对比鉴定，菌株T1-5以MW836813.1(NCBI)为标准鉴定：T1-5菌株为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，测序，其具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的序列。
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株T1-5，该菌株已于 2021年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23506，保藏日期为：2021年9 月29日，保藏单位简称为CGMCC，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
菌株生理生化分析
采用梅里埃API 20NE非发酵G-杆菌鉴定试剂盒试验菌株T1-5 生理生化指标。沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5能利用丙酮酸盐，能利用葡萄糖、麦芽糖、Kohn明胶、蜜糖、阿拉伯糖等。详细结果如下表：
表1生理生化性质分析
Table1 Analysis of Physiological and Biochemical Properties
实施例3
菌株对疮痂链霉菌抑制效果
马铃薯疮痂病病原菌4.1765(从CGMCC中国普通微生物菌种保藏管理中心购买标准菌株，菌株信息地址链接： http://www.cgmcc.net/directory/detail？no＝32374&number＝4.176 5&genus＝&species＝&yiming＝&page＝1)在马铃薯培养基上28℃培养3天；用0.2ml无菌水刮取孢子和菌丝体，制成一定浓度的病原体悬液，要求100ul体积涂布平板时菌丝生长后可以铺满平板表面。
取活化后的菌株T1-5于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备细胞悬液。
将试验马铃薯疮痂病病原菌4.1765涂布于不同平板上(PDA)，在平板上局部点接6ul菌株T1-5，28℃培养，5天以后观察。得到如图3所示的实验结果：沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5能有效抑制马铃薯疮痂病病原菌4.1765生长。抑菌圈直径达15mm。
实施例4
菌株耐盐测试试验
基础培养基为LB液体培养基，向LB固体培养基中加入NaCl 调节盐浓度为1％、3％、5％、9％、11％，调节pH为7.0，121℃高压灭菌20min。
将活化后的待测菌株T1-5分别接种于五种不同盐浓度的LB液体培养基上，以不接种菌的培养基为空白对照，放入37℃的恒温培养箱中培养24h观察菌株T1-5的生长情况。测定OD值。
如图5所示，结果如下，随着NaCl质量浓度的升高，菌株T1-5 的浓度逐渐降低，但是当浓度达到11％时，还能生长，但生长明显收到抑制。证明该菌株可以在盐碱地改良中应用，具有耐盐性，适合作为微生物盐碱地改良剂。
表2不同盐浓度下T1-5生长情况
实施例5
菌株对不同pH敏感性测定
基础培养基LB液体培养基，分别调节pH值为3、5、6、7、8、 9、11。将活化后的待测菌株T1-5接种于六种pH值的敏感性测定培养基上，放入37℃的恒温培养箱中培养24h，观察待测菌株T1-5的生长情况。若菌株T1-5能够正常生长，说明该菌株T1-5能够耐受该 pH；反之，则说明该菌株T1-5不能耐受该pH。测定其浓度OD值，
如图4所示，结果如下，当pH小于5以及大于9，菌株T1-5生长明显受到抑制，pH为9还能继续生长，但生长收到一定程度的抑制。证明该菌株能在pH为5-9的环境中存活及繁殖，即可以在盐碱地改良中应用，具有耐碱性，适合作为微生物盐碱地改良菌剂。
表3不同pH下T1-5生长情况
实施例6
菌株对马铃薯疮痂病防治盆栽试验
将马铃薯品种夏波蒂组培苗移栽至蛭石的花盆(直径17cm)中，生长10d后选取长势一致的幼苗，采用灌根法接种100mL疮痂链霉菌(4.1765)孢子悬液(1×106CFU/mL)于花盆中；再生长10d后接入100mL沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株T1-5的发酵液 (1×106CFU/mL)，对照组不加生防菌，并以未接种任何菌剂的处理为空白对照，每个处理重复3次。待马铃薯收获后，依据疮痂病病害分级标准，分别统计发病率、病情指数和防治效果。统计结果显示，只有病原菌处理的马铃薯发病率达到94.17％，而T1-5处理之后的马铃薯发病率为84.12％，病情指数为31.57％，菌株T1-5对马铃薯疮痂病的防效达到30.73％。
马铃薯疮痂病发病统计：
0级：薯皮健康，无病斑
1级：1-2个零星病斑，或发病病斑面积为0-1/8(0-12.5％)
2级：3-5个零星病斑，或发病病斑面积为1/8-1/4(12.5-25％)
3级：6-10个零星病斑，或发病病斑面积为1/4-1/2(25-50％)
4级：11-15个零星病斑，或发病病斑面积为1/2-3/4(50-75％)
统计表
发病率(％)＝发病块茎数/调查总块茎数×100
病情指数(％)＝∑(各病级块茎数×该病级数代表值)/(调查个体总和×最高病级数)×100
防效(％)＝(对照病指—处理病指)/对照病指×100
本发明提供的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5，培养简单、周期短、无生态毒性、耐盐碱、可利用的碳源种类丰富，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病病原菌，在马铃薯疮痂病的生物防治中具有非常广泛的应用前景。
序列表
<110> 施可丰化工股份有限公司
<120> 一株沙福芽孢杆菌T1-5及其应用
<130> P21044
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> 沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)
<400> 1
aaggtgggca ctgctatact gcagtcgagc ggacagaagg gagcttgctc ccggatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggagct aataccggat agttccttga accgcatggt tcaaggatga aagacggttt 180
cggctgtcac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtggggt aatggctcac 240
caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtgcga gagtaactgc tcgcaccatg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540
aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600
gtcattggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720
gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840
taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg gctttccctt cggggacaga gtgacaggtg 1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa 1140
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg gacagaacaa agggctgcaa gaccgcaagg tttagccaat cccataaatc 1260
tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat 1320
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
cacgagagtt tgcaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tatggagcca gccgccgaag 1440
gttacaaaag t 1451

Claims (5)

1.沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5，其保藏编号为CGMCC NO.23506。
2.沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5在制备防治马铃薯疮痂病菌剂中的应用。
3.沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5在制备微生物盐碱地改良剂中的应用。
4.依据权利要求3所述的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5在制备微生物盐碱地改良剂中的应用，其特征在于，所述盐碱地的NaCl浓度不高于11％。
5.依据权利要求3所述的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)T1-5在制备微生物盐碱地改良剂中的应用，其特征在于，所述盐碱地的pH为不高于9。
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