CN110317747B - 一种解淀粉芽孢杆菌jt68及其在防治茶炭疽病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌JT68及其在防治茶炭疽病的应用。本发明筛选的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JT68可以显著抑制茶炭疽病菌的菌丝生长、孢子萌发和降低病情指数，对茶炭疽病菌具有非常好的抑制效果，有望用于防治茶炭疽病，减少茶炭疽病的发生。尤其是对于广东省茶园炭疽病发病严重的情况，该菌株来源于本地，对于本地茶炭疽病的防控更具应用价值。同时，该解淀粉芽孢杆菌JT68对稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌和棉花枯萎病菌等也具有很好的抑制效果，具有开发为抑制植物病原真菌和防治茶炭疽病的菌剂的前景。本发明不仅可以减少化学农药的使用，减少茶叶的农药残留，为以生物防治逐渐替代化学防治提供了新的途径。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌JT68及其在防治茶炭疽病的应用

技术领域

本发明属于植物病害防治技术领域。更具体地，涉及一种解淀粉芽孢杆菌JT68及其在防治茶炭疽病的应用。

背景技术

据统计，每年全球因病虫害造成的粮食损失可达总量的10％(FAO数据)。化学农药是防治植物病虫害的主要措施。但是化学药剂的过量使用，导致了病虫抗性增强，农产品中农药残留严重，土壤环境遭受破坏，有益天敌数量减少等等诸多问题。就农业商品贸易而言，农产品中的农药残留直接限制着产品的销售和对外贸易。这在茶叶的出口贸易中就很常见。由于茶叶在生产过程使用大量的化学农药，制作而成的茶叶在对外贸易中往往由于农药的残留量大而不能进行国际贸易。

为了减少化学农药的过量使用，开发和推广生物制剂是目前的一个重要措施。筛选和获得有益的微生物并制成生物制剂，用于防治植物病虫害的发生，诱导植物产生抗性抵御病程的发展，从而达到防治病害的目的。从目前的研究和使用情况看，微生物制剂具有安全、可持续、广谱和绿色的特点。微生物制剂发挥作用的机理包括抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等等。利用微生物制剂除了可以达到防治病害以外，其分泌的代谢物，还可以促进植物生长，对农产品的产量也有增产作用。目前国内外的研究者分离得到多种有用的拮抗微生物，其分离的来源主要为土壤和植物根际。研究者获得的拮抗微生物除了实验室的研究以外，有很多研发的拮抗微生物已经进行生产和试验示范。不少菌剂也被登记为生物农药。据估计，全球生物农药市场预计将以17.4％的年复合增长率增长，至2022年将达到88.2亿美金。这说明微生物制剂的研发和应用不仅具有理论意义，也可以很好的应用到生产实践中。

在目前以研发的生物农药中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一个应用较广的菌。如王静等(2018)从瓜连作土壤中分离到一株解淀粉芽孢杆菌，对西瓜枯萎病的防效达88.89％。陈哲等(2018)也获得一株广谱的解淀粉芽孢杆菌CM3，对草莓根腐病菌对防治效果达到64.86％，而且还具有促进草莓根部生长的能力。杨定祥等(2018)从海洋环境中分离得到一株解淀粉芽孢杆菌SH-27，其发酵液处理后的辣椒植株根长、株高、茎粗、鲜重、干重均显著高于对照处理；灌根处理对辣椒疫病4、6和9d的防效分别为70.81％、66.55％和48.20％。由此可见，不同的解淀粉芽孢杆菌菌株对病原真菌的防效具有特异性和差异性，无论是对于抗菌谱还是抗菌效果而言，甚至是不同菌株个体的效果也具有较大差异。分离筛选合适的高效有针对性的生防菌是生物农药开发的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有茶炭疽病防治生物农药的不足，提供一种对茶炭疽病菌具有很好抑制作用的解淀粉芽孢杆菌JT68，同时该菌株还对稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌和棉花枯萎病菌等也具有很好的抑制效果，具有开发为生防菌剂的前景。

本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株JT68。

本发明另一目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株JT68，已于2019年5月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60673，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

该解淀粉芽孢杆菌菌株JT68，不仅对茶炭疽病菌具有很好抑制作用，同时还对稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌和棉花枯萎病菌等也具有很好的抑制效果。因此，以下应用均应在本发明保护范围之内：

所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68在防治植物真菌方面的应用。

所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68在制备植物杀真菌剂的应用。

所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68在防治茶炭疽病方面的应用。

所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68在制备茶炭疽病防治制剂方面的应用。

优选地，所述真菌为茶炭疽病菌、稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌或棉花枯萎病菌。

一种含有所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68和/或其发酵液的植物杀真菌剂/茶炭疽病防治制剂，也应在本发明保护范围之内。

作为一种可选择的方案，所述发酵液的制备方法为：菌株活化后取单菌落在LB液体培养基中，30℃培养为种子液；然后按照1％体积比的接种量接种到LB液体培养基中，30℃180r/m转速培养24h即得发酵液。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，可以显著抑制茶炭疽病菌的菌丝生长、孢子萌发和降低病情指数，对茶炭疽病菌具有非常好的抑制效果。尤其是对于广东省茶园炭疽病发病严重的情况，该菌株来源于本地，对于本地茶炭疽病的防控更具应用价值。

同时，该解淀粉芽孢杆菌对稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌和棉花枯萎病菌等也具有很好的抑制效果，具有开发为抑制植物病原真菌和防治茶炭疽病的菌剂的前景。

本发明不仅可以减少化学农药的使用，减少茶叶的农药残留，为以生物防治逐渐替代化学防治提供了新的途径。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌JT68的菌落图和电镜扫描图；左图为JT68菌落图；右图为JT68菌株电镜图。

图2为解淀粉芽孢杆菌JT68的遗传进化树；上图为JT68菌株16S rDNA基因进化树；下图为JT68菌株gyrB基因进化树。

图3为解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病菌的抑制效果图；左图为茶炭疽病菌对照；右图为JT68菌株和茶炭疽病菌对峙培养。

图4为解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病菌菌丝生长的抑制效果图；左图为正常生长的茶炭疽病菌对照；右图为经JT68菌株处理的茶炭疽病菌。

图5为解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病菌萌发的抑制效果；左图为正常萌发的茶炭疽病菌孢子；右图为经JT68菌株处理后的茶炭疽病菌孢子。

图6为解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病的离体防治效果；A为清水对照组，B为生防菌液稀释100倍，C为生防菌液稀释10倍，D为生防菌液原液。

图7为解淀粉芽孢杆菌JT68对稻瘟病菌的抑制效果图；左图为稻瘟病菌对照；右图为JT68菌株和稻瘟病菌对峙培养。

图8为解淀粉芽孢杆菌JT68对菜心炭疽病菌的抑制效果图；左图为菜心炭疽病菌对照；右图为。JT68菌株和菜心炭疽病菌对峙培养。

图9为解淀粉芽孢杆菌JT68对香蕉枯萎病菌的抑制效果图；左图为香蕉枯萎病菌对照；右图为JT68菌株和香蕉枯萎病菌对峙培养。

图10为解淀粉芽孢杆菌JT68对棉花枯萎病菌的抑制效果图；左图为棉花枯萎病菌对照；右图为JT68菌株和棉花枯萎病菌对峙培养。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1解淀粉芽孢杆菌JT68的分离与筛选

1、样品采集：

土壤样品采集自华南农业大学校农场的稻田土(地点为广东省广州市天河区华南农业大学跃进北区农场)。用50mL灭菌的离心管装稻田土带回实验室分离。

2、生防菌的分离：

将每份土壤样品分别混匀，并分装整理编号，分别用10mL离心管取1/3管土样，加入灭菌水至10mL，剧烈震荡使制成悬浮液，所得悬浮液浓度记为1×10^-1。接着以80℃水浴15min。吸取1mL 1×10^-1的土样悬浮液至装有9mL无菌水的新离心管中，稀释成1×10^-2、1×10^-3的系列浓度土壤溶液。吸取0.1L的1×10^-2、1×10^-3溶液至固体LB平板(yeast extract5g，tryptone 10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.2，琼脂粉15g，121℃灭菌15min)上，以涂布棒涂布涂匀，晾干后置于30℃培养箱培养1～2d。

3、生防菌的初筛：

本实验用平板对峙法进行生防细菌的筛选。用6mm打孔器打取菌块，接种在PDA平板中央。将细菌接种在距病原菌菌块2.5cm处，每皿4株不同细菌，不接细菌为对照，在28℃下进行培养，至对照组病原菌菌落长满培养皿，观察细菌周围是否出现抑菌带。另存产生抑菌带的菌株，并记录其编号。进一步初筛用6mm打孔器打取菌块，接种在PDA平板右侧，然后将上述能产生抑菌带的菌株接种在距离病原菌块3cm处，每皿1株细菌，以不接菌为对照。在28℃下进行培养，至对照组病原菌菌落长满培养皿，观察细菌周围是否出现明显的抑菌带。另存产生明显抑菌带的菌株，并记录其编号。

4、生防细菌的复筛：

病原菌：茶炭疽病菌、稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌和棉花枯萎病菌。

病原菌接种方法与初筛相同，生防细菌接种每皿4株相同细菌，不接细菌为对照，在28℃下进行培养，至对照组病原菌菌落长满培养皿，测量病原菌菌落直径和对照组病原菌菌落直径，记录，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照组菌丝直径-处理组菌丝直径)/对照组菌丝直径×100％

以上述方法获得菌株编号为JT68的细菌对多种病原真菌具有较高防效。

实施例2解淀粉芽孢杆菌JT68的鉴定

1、形态鉴定

对实施例1筛选得到的菌株JT68在LB培养基上培养，观察形态特征：单菌落为规则圆形，白色，乳状，菌落较大，表面光滑。电镜下显示菌体为杆状，双胞，直径范围2.0*5.8um(如图1)。

生理生化鉴定结果发现，菌株JT68为革兰氏阳性菌，能利用蔗糖、果糖、甘露醇和麦芽糖，接触酶反应、运动性测定、淀粉水解、V-P试验、硝酸盐还原、明胶液化等生理生化试验呈阳性，不能利用葡萄糖和乳糖，需氧，氧化酶反应、甲基红试验、硫化氢试验等呈阴性。

结合JT68菌株的形态与生理生化特征，鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)。

2、分子鉴定

提取菌株JT68的总DNA，将所提取的样品基因组DNA作为模板进行PCR扩增，采用细菌16S rDNA通用引物对由北京擎科新业生物技术有限公司合成：正向引物序列27F 5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物序列1492R 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。gyrB基因通用引物引物序列:正向引物序列5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'，反向引物序列5’-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’，Y表示C或T，N表示A、T、C或G R表示A或G。反应体系与程序与16S r DNA相同。

PCR反应体系为25μL，反应体系组成为：2×PCR Mix 12.5μL，27F(10μmol/L)1.0μL,1492R(10μmol/L)1μL，DNA模板1μL，最后去离子水补至25μL。反应液分装于PCR管中,混匀后进行PCR反应。PCR扩增的反应程序为：98℃预变性2min，98℃10s，56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃最终延伸10min。

经PCR反应扩增得到的片段经回收纯化后由北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，测得序列提交到NCBI进行序列比对。根据解淀粉芽孢杆菌JT68的16S rDNA序列和gyrB基因序列与数据库中已有的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的序列进行比对，构建系统进化树，结果可以看出，菌株JT68与解淀粉芽孢杆菌聚为一支(图2)。

结合形态和分子鉴定，菌株JT68鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，于2019年5月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号GDMCCNO：60673，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例3解淀粉芽孢杆菌JT68发酵液的制备

本实施例提供一种制备解淀粉芽孢杆菌JT68发酵液的方案选择。

首先，从-80℃冰箱将保存的菌株活化。用接种环挑取活化后的菌落在LB液体培养基(yeast extract 5g，tryptone 10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.2，121℃灭菌15min)中于30℃培养，此为种子液。

然后，取1mL种子液加到100mL LB液体培养基中，于30℃，以180r/m转速培养24h即得发酵液。

实施例4解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病菌的抑制作用

1、解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病菌的抑菌实验

采用平板对峙法测试，应用实施例3所得的解淀粉芽孢杆菌JT68发酵液，对茶炭疽病菌进行抑菌实验。用6mm打孔器打取菌块，接种在PDA平板中央，将解淀粉芽孢杆菌JT68接种在距病原菌菌块2.5cm处，不接细菌为对照，在28℃下进行培养，至对照组病原菌菌落长满培养皿，测量病原菌菌落直径和对照组病原菌菌落直径，记录，计算抑菌率。结果如图3和表1。

表1解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病菌的抑菌率：

病菌	抑菌率(％)
		茶炭疽病菌	80.94±1.23

2、解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病菌菌丝形态的影响

将未活化的JT68菌株转接到LB平板上，适温下培养2d后再转接到LB液体培养基中振荡培养36h，即得发酵液。在PDA平板上均匀涂布JT68菌株发酵液，待半干时覆盖一层玻璃纸，排除气泡使之平整，取4℃保存的茶炭疽菌菌株，用接种环挑取一环点接于PDA平板上，28℃恒温培养5～7d，观察菌体长势。用打孔器打直径为6mm的茶炭疽菌菌块，接于培养基中央，以无菌培养液处理为对照，放置于28℃恒温箱中培养5d。观察时撕下玻璃纸，剪取少量最外缘菌丝于显微镜下观察。通过与正常菌丝的形态比较判断JT68菌株是否对茶树炭疽菌丝的生长有影响。

结果显示(图4)：对照的茶炭疽病菌菌丝生长正常，单根菌丝生长旺盛，菌丝沿直线生长。而经过JT68发酵液处理的茶炭疽病菌菌丝直径相对较小，菌丝生长的尖端弯曲，且产生厚垣孢子。表明解淀粉芽孢杆菌JT68具有明显的抑制茶炭疽病菌菌丝生长的作用。

3、解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病菌孢子萌发的抑制作用

挑取3块茶炭疽菌饼于PDA液体培养基中，置于28℃200rpm摇床中培养5～7d，用一层擦镜纸过滤备用。取5ml孢子悬液和5ml68号菌液于离心管中，充分震荡混匀，设3组重复。空白组用无菌水代替生防菌液，放置于22℃恒温箱中黑暗处理24h，稀释至血球计数板每格大约5个孢子，即孢子浓度为1×10⁶个/ml时显微镜下计数，统计出孢子总数和萌发孢子数，以孢子萌发的芽管超过孢子长度一半为萌发标准，按以下公式计算分生孢子平均萌发率和菌液对孢子萌发的抑制率：

萌发率/％＝(已萌发的分生孢子数/分生孢子总数)×100

抑制率/％＝[(对照萌发率-药剂处理萌发率)/对照萌发率]×100

结果显示(图5)：对照的茶炭疽病菌孢子萌发率为61.1％，而经JT68菌株处理后茶炭疽病菌的孢子均不能萌发，萌发率为0。说明JT68菌株及其代谢物可以完全抑制茶炭疽病菌的萌发。

实施例5解淀粉芽孢杆菌JT68对茶炭疽病的离体防治效果

1、选取茶树(实验品种为台湾黄叶)芽尖下第4叶，保证长势一致无病害，叶片清洗干净，并晾干。用75％的酒精浸泡约5s，浸泡时间不可过长以免灼伤叶片，再用无菌水清洗3次，放至通风处惊干。生防菌发酵原液分别稀释10、100倍，每组15张叶片，共3个处理组1空白对照组。每组菌液分别加入1/1000的50％曲拉通表面活性剂，有助于生防菌在叶片上的定殖。用无菌棉蘸取菌液均匀涂抹在叶片正反面，放入人工气候箱中培养一晚，培养条件：湿度95％，温度26℃。每片叶片叶脉左右两侧各对称接种2次，用接种针轻轻扎伤叶片(不刺破)，1个接种空白培养基作为对照，1个接种炭疽菌饼，用湿润无菌棉覆盖保湿。接种叶片平摊放入人工气候箱中培养，培养条件：湿度95％，温度26℃，12h光暗交替，模拟炭疽菌最适宜的侵染环境。每天观察叶片症状，记录20d生长情况，测量病斑直径，利用PhotoShop软件计算面积，统计各处理组的相对抑制率。

相对抑制率＝处理组病斑面积/对照组病斑面积×100％

2、结果如图6和表2所示，结果显示，菌株JT68的发酵液对茶炭疽病的相对抑制率达到83.20％，10倍稀释液的相对抑制率达到79.70％，100倍稀释液的相对抑制率达到72.66％。

表2茶树炭疽活体接种抑菌率(％)

注：同行不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

实施例6解淀粉芽孢杆菌JT68对多种病菌的作用

1、同实施例4中抑菌实验的方法，对稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌和棉花枯萎病菌进行抑菌实验。

2、结果如表3和图7～10所示，解淀粉芽孢杆菌JT68对稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌和棉花枯萎病菌都具有很好的抑制效果。

表3解淀粉芽孢杆菌JT68对多种病菌的抑菌率

病菌	抑菌率(％)
		稻瘟病菌	70.0±0.84
香蕉枯萎病菌	70.3±1.57
		辣椒炭疽病菌	79.7±1.38
菜心炭疽病菌	93.2±0.28
		棉花枯萎病菌	58.1±0.77

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株JT68，其特征在于，于2019年5月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60673，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68在防治植物真菌方面的应用，其特征在于，所述真菌为茶炭疽病菌、稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌或棉花枯萎病菌中的一种或多种。

3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68在制备植物杀真菌剂的应用，其特征在于，所述真菌为茶炭疽病菌、稻瘟病菌、菜心炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌或棉花枯萎病菌中的一种或多种。

4.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68在防治茶炭疽病方面的应用。

5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68在制备茶炭疽病防治制剂方面的应用。

6.一种植物杀真菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株JT68和/或其发酵液。

7.根据权利要求6所述植物杀真菌剂，其特征在于，所述植物杀真菌剂为茶炭疽病防治制剂。

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