CN113812422B - 一种多粘类芽孢杆菌和/或其发酵液的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)和/或其发酵液的应用。该菌对桑树茄科雷尔式菌、桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌、桑树克雷伯氏菌、桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌、桑树拟枝孢镰刀菌、番茄阴沟肠杆菌和烟草尖孢镰刀菌均具有很好的拮抗作用，经鉴定该菌为多粘类芽孢杆菌，命名为多粘类芽孢杆菌YS18‑2；利用该菌和/或其发酵液对为桑树、番茄和烟草病害的生物防治奠定了基础。

Description

一种多粘类芽孢杆菌和/或其发酵液的应用
技术领域
本发明属于植物病害防控技术领域。更具体地，涉及一种多粘类芽孢杆菌和/或其发酵液的应用。
背景技术
桑叶不仅作为寡食性昆虫家蚕的主要食物来源，作为药食两用的桑树，在我国蚕业可持续发展中有着举足轻重的地位。桑树病害一直影响着桑树产业的健康稳定的发展，其中以桑真菌病和桑细菌病占绝大部分。
桑细菌病，特别是桑细菌性枯萎病、桑青枯病、桑疫病等作为危害我国桑树产业的三类主要桑细菌性病害，近些年在各大蚕区的发生趋于严重。其中，植物青枯病是一种常见的细菌性病害，又称细菌性枯萎病，是由茄科雷尔氏菌R.solanacearum引起的一种世界范围内发生的茄科蔬菜重要根部土传毁灭性病害。茄科雷尔氏菌R.solanacearum危害茄科植物44科330多种植物，以番茄危害最重，其次是烟草、马铃薯和茄子。近些年在桑树中发生趋于严重，桑青枯病和桑细菌性枯萎病自上世纪80年代开始，在华南地区以及江浙等地多有危害发生报道，严重影响蚕丝产业和桑树在食药应用上的健康稳定发展。桑细菌性枯萎病自2006年在浙江杭州报道以来，发病快、蔓延迅速，近几年迅速漫延到整个华南蚕区，已严重影响蚕桑产业的健康稳定的发展，而目前尚无有效的化学农药及其他的防治方法。桑细菌病的病原菌具有多样化特征：朱勃最初发现引起桑细菌性枯萎病的病原为肠杆菌属(Enterobacter spp)病菌(朱勃.桑细菌性枯萎病病原的定名、分子检测及肠杆菌基因水平转移的研究[D].浙江大学,2010.)；Wang等从浙江杭州桑枯萎病病样中分离到肠杆菌属的阿氏肠杆菌(E.asburiae)和一个新种(Enterobacter sp.)(Wang G F,Xie G L,Zhu B,etal.Identification and characterization of the Enterobacter complex causingmulberry(Morus alba)wilt disease in China[J].European Journal of PlantPathology,2010,126(4):465-478.)；戴凡炜等从多份桑枯萎病病样本分离到肠杆菌属的阴沟肠杆菌(E.cloacae)和阿氏肠杆菌(E.asburiae)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp)的肺炎杆菌(K.pneumoniae)、克雷伯氏菌(K.variicola)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、以及泛菌属(Pantoea spp)的菠萝泛菌(P.ananatis)等病原菌，提出了桑枯萎病病原菌可能还有其他多个种属的致病细菌(戴凡炜,罗国庆,王振江,李磊,唐翠明,邝哲师,赵祥杰,叶明强,肖更生.华南蚕区桑枯萎病病原菌的分离与分子鉴定[J].蚕业科学,2012,38(06):981-987.)；本发明所属课题组也相继从广东、广西的桑树青枯病和枯萎病的病样中分离鉴定了阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产气肠杆菌Enterobacter roggenkampii strain KQ-01、克雷伯氏菌肺炎菌(K.pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、菠萝泛菌(P.ananatis)等，综上，桑细菌性枯萎病的病原菌应该是由多个种属的致病细菌所致，但到底是哪一种病菌是主要的致病菌或是多种病原细菌协同作用所致，还有待进一步研究。
桑真菌病，是桑树病害中种类较多的一类病害，常常危害桑树的叶部、枝干、根部等部位。典型的桑拟干枯病分布较广，主茎和枝条均可发病。一般桑拟干枯病病原菌在病枝干上越冬，来年4～5月份病原菌随风、雨及昆虫传播，不断侵入生长衰弱，幼龄的桑树及虫伤的枝条。桑芽枯病、桑拟干枯病常常混生并发为害桑树，破坏桑园群体结构，影响产量。
植物病害严重影响植物的品质和产量。桑树既是寡食性昆虫家蚕的主要食物来源，也是我们人类药食两用的重要资源，在我国蚕业可持续发展和乡村振兴中有着举足轻重的地位。但桑树病害，特别是桑桑细菌病和真菌病一直困扰并影响着桑树产业的健康稳定的发展，生产上多采用多种杀菌剂或与杀虫剂混配等方法进行桑树病害的防控，尽管化学农药具有见效快、成本低的优势，但农药残留已严重影响蚕桑安全生产和桑树资源的开发利用，且长期大规模使用化学农药易使土壤环境恶化，土壤微生物种群的丰富度下降，导致各种病原菌的耐药性增强而造成病菌再猖獗，不能从根本上解决疾病流行发生的问题。本发明人在前期的研究工作中，发现了一种防治桑树病害的铜绿假单胞杆菌菌株(保藏号为GDMCC No：60613)，该菌株对桑枯萎病和桑青枯病病原有不同程度的拮抗和防控作用，且安全有效，为桑树病害的生物防治奠定了基础(CN201910282354.2)。因此，寻找更多、更有效、长久、安全的防治桑树病害的生防菌具有重要意义。越来越显示出益生菌的生物防治在植物细菌病和真菌病防治上的巨大潜力，可望为植物青枯病，特别是桑树、烟草、番茄等经济作物的病害防治的一种有效措施。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有桑树病害防治方法的缺陷和不足，提供一种多粘类芽孢杆菌和/或其发酵液的应用。
本发明的第一个目的是提供一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)和/或其发酵液的应用。
本发明的第二个目的是提供一种生防制剂。
本发明的第三个目的是提供所述制剂的应用。
本发明的第四个目的是提供一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明从桑树叶片组织中分离得到一株对桑树青枯病、桑树枯萎病、桑拟干枯病、番茄枯萎病或烟草根腐病的多种病原(桑树茄科雷尔式菌、桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌、桑树克雷伯氏菌、桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌、桑树拟枝孢镰刀菌、番茄阴沟肠杆菌或烟草尖孢镰刀菌)有不同程度拮抗作用的内生菌，并结合形态特征、生理生化特征及基因组全长序列分析对其进行鉴定，确定其为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)和/或其发酵液在以下中的任意一项或几种中的应用：
防控桑树青枯病、桑树枯萎病、桑树拟干枯病、番茄枯萎病和/或烟草根腐病中的任意一种或几种；
制备防控桑树青枯病、桑树枯萎病、桑树拟干枯病、番茄枯萎病和/或烟草根腐病中的任意一种或几种的制剂；
抑制茄科雷尔式菌、阴沟肠杆菌、菠萝泛菌、克雷伯氏菌、尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、禾谷镰刀菌和/或拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种；
制备抑制抑制茄科雷尔式菌、阴沟肠杆菌、菠萝泛菌、克雷伯氏菌、尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、禾谷镰刀菌和/或拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种的制剂；
抑制由桑树茄科雷尔式菌引起的桑树青枯病；
桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和/或桑树克雷伯氏菌中的任意一种或几种引起的桑树枯萎病；
桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和/或桑树拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种引起的桑树拟干枯病；
番茄阴沟肠杆菌引起的番茄枯萎病；
烟草尖孢镰刀菌引起的烟草根腐病；
制备抑制由桑树茄科雷尔式菌引起的桑树青枯病；
桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和/或桑树克雷伯氏菌中的任意一种或几种引起的桑树枯萎病；
桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和/或桑树拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种引起的桑树拟干枯病；
番茄阴沟肠杆菌引起的番茄枯萎病；
烟草尖孢镰刀菌引起的烟草根腐病的制剂。
优选地，所述桑树克雷伯氏菌为桑树肺炎克雷伯氏菌和/或桑树产酸克雷伯氏菌。
优选地，所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)为保藏号GDMCCNo：61095的菌株，所述菌株已于2020年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
一种生防制剂，所述制剂包含所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)和/或其发酵液。
优选地，所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)为保藏号GDMCC No：61095的菌株，所述菌株已于2020年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
所述制剂在防控桑树青枯病、桑树枯萎病、桑树拟干枯病、番茄枯萎病和烟草根腐病中的应用。
所述制剂在抑制茄科雷尔式菌、阴沟肠杆菌、菠萝泛菌、克雷伯氏菌、尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、禾谷镰刀菌和拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种中的应用。
所述制剂在抑制桑树茄科雷尔式菌、桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌、桑树克雷伯氏菌、桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌、桑树拟枝孢镰刀菌、番茄阴沟肠杆菌和烟草尖孢镰刀菌中的任意一种或几种中的应用。
所述制剂在防控由桑树茄科雷尔式菌引起的桑树青枯病；桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌、桑树克雷伯氏菌中的任意一种或几种引起的桑树枯萎病；桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和桑树拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种引起的桑树拟干枯病；番茄阴沟肠杆菌引起的番茄枯萎病；烟草尖孢镰刀菌引起的烟草根腐病中的应用。
优选地，所述桑树克雷伯氏菌为桑树肺炎克雷伯氏菌和/或桑树产酸克雷伯氏菌。
一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)，所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)的保藏号为GDMCC No：61095，已于2020年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
本发明具有以下有益效果：
本发明得到了一株对桑树茄科雷尔式菌、桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌、桑树克雷伯氏菌、桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌、桑树拟枝孢镰刀菌、番茄枯萎病和烟草尖孢镰刀菌均具有很好的拮抗作用，及对其侵染植物引起的植物病害(桑树青枯病、桑树枯萎病、桑树拟干枯病、番茄枯萎病和烟草根腐病)均具有很好的防控效果的生防菌，经鉴定为多粘类芽孢杆菌，命名为多粘类芽孢杆菌YS18-2；利用该多粘类芽孢杆菌和/或其发酵液对桑树青枯病、桑树枯萎病、桑树拟干枯病、番茄枯萎病和烟草根腐病进行生物防控，安全有效，能够避免化学农药带来的土壤环境恶化、病原的耐药性增强等各种问题，为桑树、番茄和烟草病害的生物防治奠定了基础。因此，该多粘类芽孢杆菌和/或其发酵液在防控植物病害或制备防控植物病害的制剂中有很好的应用前景。
附图说明
图1是多粘类芽孢杆菌YS18-2对枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、成团泛菌和寡养单胞菌的拮抗活性结果，其中，1：枯草芽孢杆菌；2：巨大芽孢杆菌；3：成团泛菌；4：水；5：内生拮抗菌YS18-2；6：寡养单胞菌。
图2是多粘类芽孢杆菌YS18-2在LB培养基上的生长状况。
图3是多粘类芽孢杆菌YS18-2的革兰氏染色结果。
图4是多粘类芽孢杆菌YS18-2的扫描电镜(15000×)结果。
图5是多粘类芽孢杆菌YS18-2的染色体基因组碱基测序结果。
图6是多粘类芽孢杆菌YS18-2的质粒基因组碱基测序结果。
图7是多粘类芽孢杆菌YS18-2的rDNA序列全长构建系统发育进化树。
图8是多粘类芽孢杆菌YS18-2对桑树茄科雷尔式菌的拮抗活性结果；其中，a：100mg/L硫酸链霉素；b：内生拮抗菌菌株发酵液上清；c：内生拮抗菌菌株发酵液上清；d：无菌生理盐水。
图9是多粘类芽孢杆菌YS18-2对桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和桑树产酸克雷伯氏菌的拮抗活性结果；其中，a：100mg/L硫酸链霉素；b：内生拮抗菌菌株发酵液上清；c：内生拮抗菌菌株发酵液上清；d：无菌生理盐水。
图10是多粘类芽孢杆菌YS18-2对番茄阴沟肠杆菌的拮抗活性结果；其中，a：100mg/L硫酸链霉素；b：内生拮抗菌菌株发酵液上清；c：内生拮抗菌菌株发酵液上清；d：无菌生理盐水。
图11是多粘类芽孢杆菌YS18-2对桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和桑树拟枝孢镰刀菌拮抗活性结果。
图12是多粘类芽孢杆菌YS18-2对烟草尖孢镰刀菌拮抗活性结果。
图13是多粘类芽孢杆菌YS18-2的盆栽防控实验结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例所用的细菌DNA提取试剂盒、PCR试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂、牛肉汁蛋白胨琼脂培养基、生理生化培养基、LB肉汤均购于广东环凯微生物科技有限公司。
实施例1内生拮抗菌菌株的分离纯化
1、样本采集：于广东省丝绸集团英德蚕种场采集健康抗青283桑树幼苗，低温保存带回实验室，4℃保存备用。
2、内生拮抗菌菌株的分离纯化
取新采集的桑树叶片组织用自来水冲洗干净后，剪成约1×3cm2的长条状置于带有开关的漏斗(漏口有滤网)内，然后在超净工作台上往漏斗内加入75％酒精，浸泡约15s后排干酒精，同样方法用升汞处理5min，再用无菌水冲洗3次，将根段取出置于工作台上风干后，用无菌镊子将叶片轻压于LB培养基上，24h若无杂菌长出，可将其表层叶片的表皮撕下，置于新的LB培养基之上，密封24h后，用接种环分生成菌落划线培养。待平板上长出菌落纯化后，将单菌落移至斜面上培养，备用。
3、内生拮抗菌菌株发酵液的制备
挑取已纯化的单菌落在LB液体培养基中30℃、180rads/min摇床振荡培养2d，备用。
4、内生拮抗菌菌株的筛选
采用点样法测定内生菌的拮抗活性：使用打孔器均匀的在已涂布供试菌株的培养皿中打上小孔，用微量移液枪取10μL枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、成团泛菌、内生拮抗菌和寡养单胞菌发酵液上清，依次加入加到已打好的小孔1、2、3、5和6中，在第4个小孔加入水。比较了实验室分离鉴定拮抗细菌如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、成团泛菌、寡养单胞菌和本专利申请的内生拮抗菌的拮抗效果。每个平板各做3个重复。培养皿放置在30℃的恒温培养，48h后观察抑菌圈大小。
通过内生拮抗菌菌株的筛选，本发明发现了一株内生拮抗菌的拮抗效果最明显的菌株(见图1)。
实施例2内生拮抗菌菌株的鉴定
菌落平板的培养特征、革兰氏染色以及各项生理生化指标测试是确定细菌菌株分类地位的重要依据。rRNA基因序列因其具有高度保守性，可作为进化分析的重要参考标准。
1、实验方法
将实施例1分离纯化得到的菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基(LB培养基)，30℃培养48h，观察记录菌落形态、生长状况等。革兰氏染色、形态观察(扫描电镜)及接触酶、好氧性等相关理化参数的测定参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》。
对该内生拮抗菌菌株进行全基因组测序，将得到的rRNA全长与从NCBI上下载目标物种近缘物种的rRNA全序列采用MUSCLE v.3.8.31(http://www.drive5.com/muscle/)软件进行多序列比对，再用比对后的序列通过Mega6软件，最大似然法(ML法：MaximumLikelihood method)构建系统发育树，Bootstrap值设置为1000。
2、实验结果
(1)内生拮抗菌菌株在LB培养基上的生长状况如图2所示，可以看出，内生拮抗菌菌株在LB培养基上呈透明色，菌落平均直径1～2mm，质感比较粗糙，黏性较大。
(2)内生拮抗菌菌株的革兰氏染色结果如图3所示，可以看出，内生拮抗菌菌株呈革兰氏阳性，杆状，有芽孢。
(3)内生拮抗菌菌株的扫描电镜(15000×)结果如图4所示，可以看出，内生拮抗菌菌株为杆状菌，两端钝圆，无鞭毛，表面光滑。
(4)内生拮抗菌菌株的生理生化特征结果如表1所示，可以看出，内生拮抗菌菌株均可利用普通还原性糖，不具有运动型。
表1内生拮抗菌菌株的生理生化特征结果
Figure BDA0003251247840000081
注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。
(5)内生拮抗菌菌株的染色体基因组碱基测序结果如图5所示，内生拮抗菌菌株的染色体基因组碱基含量统计结果如表2所示，内生拮抗菌菌株的染色体基因注释统计结果如表3所示。内生拮抗菌菌株的质粒基因组碱基测序结果如图6所示，内生拮抗菌菌株的质粒基因组碱基含量统计结果如表4所示，内生拮抗菌菌株的质粒基因注释统计结果如表5所示。
表2内生拮抗菌菌株的染色体组碱基
Figure BDA0003251247840000082
表3内生拮抗菌菌株的染色体基因注释统计结果
Figure BDA0003251247840000083
Figure BDA0003251247840000091
表4内生拮抗菌菌株的质粒基因组碱基含量统计结果
Figure BDA0003251247840000092
表5内生拮抗菌菌株的质粒基因注释统计结果
Type Number Length(bp) GC(％)
tRNA 0 0 0
rRNA 0 0 0
CDS 47 31380 42.90
Total 47 31380 42.90
基于内生拮抗菌rDNA序列全长构建系统发育进化树，发现其与分离自江西省南昌的番茄根部的多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa(HY96-2)(GenBank:CP025957.1)归于一支(图7)，置信度接近100％。但Paenibacillus polymyxa(HY96-2)的碱基总数为5745779bp，编码5180个蛋白基因，而本研究发现的菌株的碱基总数为5840603，编码4834个蛋白基因，两者显然是属于不同的菌株。因此将其鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa。
综上所述，鉴定该内生拮抗菌菌株属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，命名为：多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa YS18-2，并于2020年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：61095，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
实施例3 YS18-2对桑树青枯病病原菌的拮抗实验
1、实验方法
桑树茄科雷尔式菌由本实验室分离保存，采用滤纸片法测定实施例1分离纯化并经过实施例2鉴定的YS18-2菌株发酵液对桑树青枯病病原菌的桑树茄科雷尔式菌的拮抗活性：
采用4个直径为5mm的滤纸片等距离放置在已均匀涂布供试桑树茄科雷尔式菌的培养皿中，用微量移液枪取10μL YS18-2菌株的发酵液上清(浓度为108cfu/mL)加到滤纸片上，用100mg/L的硫酸链霉素作阳性对照，生理盐水做空白对照。每个平板各做3个重复。培养皿放置在30℃的恒温培养，48h后观抑察菌圈大小。
2、实验结果
平板抑菌实验结果表明，YS18-2菌株的发酵液对桑树青枯病病原菌的桑树茄科雷尔式菌有较好的抑菌效果，拮抗效果明显，同100mg/L的硫酸链霉素相当，因此YS18-2菌株及其发酵液可适用于桑树青枯病的防治。
根据图8中YS18-2对桑树茄科雷尔式菌的拮抗活性情况，得到表6所示数据。滤纸片法实验表明，YS18-2菌株的发酵液对桑树茄科雷尔式菌的抑菌率达到77.27％。
表6 YS18-2菌株发酵液对桑树茄科雷尔式菌的拮抗活性
Figure BDA0003251247840000101
实施例4桑树枯萎病病原菌的拮抗实验
采用实施例3相同的实验方法，测定实施例1分离纯化并经过实施例2鉴定的YS18-2菌株发酵液对桑树枯萎病病原菌的桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和桑树产酸克雷伯氏菌的拮抗活性，桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和桑树产酸克雷伯氏菌由本实验室分离保存：
平板抑菌实验结果表明，YS18-2菌株发酵液对桑树枯萎病病原菌的桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和桑树产酸克雷伯氏菌有较好的抑菌效果，因此YS18-2菌株及其发酵液可适用于桑树青枯病的防治。
根据图9中YS18-2菌株发酵液对桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和桑树产酸克雷伯氏菌的拮抗活性情况，得到表7所示数据。滤纸片法实验表明，YS18-2菌株发酵液对桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和桑树产酸克雷伯氏菌的抑菌率分别达到50.00％、58.33％和54.54％。
表7 YS18-2菌株发酵液对桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和桑树产酸克雷伯氏菌的拮抗活性
Figure BDA0003251247840000111
实施例5桑树拟干枯病病原菌的拮抗实验
1、实验方法
桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和桑树拟枝孢镰刀菌由本实验室分离保存，采用平板对峙法测定实施例1分离纯化并经过实施例2鉴定的YS18-2菌株发酵液，对桑树拟干枯病病原真菌的桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和桑树拟枝孢镰刀菌的拮抗活性：
于生长良好的病原真菌培养基取下菌饼置于新的PDA培养基上，采用4个直径为5mm的滤纸片等距离放置在菌柄的四周，用微量移液枪取10μL YS18-2菌株的发酵液上清(浓度为108cfu/mL)加到滤纸片上，以未处理的菌柄做空白对照。每个平板各做3个重复。培养皿放置在28℃的恒温培养，72h后观察抑菌圈大小。
根据图10中YS18-2菌株的发酵液对桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和桑树拟枝孢镰刀菌拮抗活性情况，得到表8所示数据。平板对峙实验表明，YS18-2菌株的发酵液对桑树真菌性病原桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和桑树拟枝孢镰刀菌的抑菌率分别达到65.71％、57.15％、68.33％、40.00％。因此YS18-2菌株及其发酵液可适用于桑树拟干枯病的防治。
表8 YS18-2菌株发酵液对桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和桑树拟枝孢镰刀菌拮抗活性
Figure BDA0003251247840000112
Figure BDA0003251247840000121
实施例6番茄枯萎病病原菌的拮抗实验
番茄阴沟肠杆菌由本实验室分离保存，采用实施例3相同的实验方法，测定实施例1分离纯化并经过实施例2鉴定的YS18-2菌株的发酵液对番茄枯萎病病原菌的番茄阴沟肠杆菌的拮抗活性：
平板对峙法实验结果表明，YS18-2菌株的发酵液对番茄枯萎病病原菌的番茄阴沟肠杆菌有较好的抑菌效果，因此YS18-2菌株及其发酵液可适用于番茄枯萎病的防治。
根据图11中YS18-2发酵液对番茄阴沟肠杆菌的拮抗活性情况，得到表9所示数据。滤纸片法实验表明，YS18-2对番茄阴沟肠杆菌的抑菌率达到33.34％。
表9 YS18-2菌株发酵液对番茄阴沟肠杆菌的拮抗活性
Figure BDA0003251247840000122
实施例7和烟草根腐病病原菌的拮抗实验
烟草尖孢镰刀菌由本实验室分离保存，采用实施例5相同的实验方法，测定实施例1分离纯化并经过实施例2鉴定的YS18-2发酵液对烟草根腐病病原菌的烟草尖孢镰刀菌拮抗活性：
平板抑菌实验结果表明，YS18-2发酵液对烟草根腐病病原菌的烟草尖孢镰刀菌有较好的抑菌效果，因此YS18-2菌株及其发酵液可适用于烟草根腐病的防治。
根据图2中YS18-2发酵液对烟草尖孢镰刀菌的拮抗活性情况，得到表10所示数据。平板抑菌实验表明，YS18-2发酵液对烟草尖孢镰刀菌的抑菌率达到62.5％。
表10 YS18-2菌株发酵液对烟草尖孢镰刀菌拮抗活性
Figure BDA0003251247840000131
实施例8菌株发酵液对患青枯病的桑盆栽防控实验
1、实验方法
根据实施例3和4的平板抑菌实验结果和实施例2的菌株鉴定结果，检测该多粘类芽孢杆菌YS18-2菌株发酵液上清对桑树青枯病病原菌的茄科雷尔氏菌、桑树枯萎病病原菌的产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯菌的防控作用。针对不同病原菌，各取6株长势相同的桑树幼苗(90d)平均分为A、B两组，伤根处理后，均施加10mL浓度为108CFU/mL的相应病原菌菌液进行回接实验，人工气候箱培养3d后，A组施加清水作为空白对照组，B组施加多粘类芽孢杆菌YS18-2的发酵液上清作为处理组。继续培养7d后，统计患病情况，实验重复3次，最终结果取其平均值。
2、实验结果
盆栽防控实验结果如图13所示，A组的6株桑树均出现明显的枯萎现象(100％)，而B组桑树均长势正常，初步说明本发明分离得到的多粘类芽孢杆菌YS18-2对桑树茄科雷尔式菌导致的桑青枯病具有防控作用。
而多粘类芽孢杆菌YS18-2发酵液对桑树枯萎病病原菌的产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯菌的盆栽防控情况见表11。初步说明本发明分离得到的多粘类芽孢杆菌YS18-2菌株及其发酵液对桑树克雷伯氏菌导致的桑枯萎病具有防控作用。
表11多粘类芽孢杆菌YS18-2发酵液对桑树枯萎病病原菌的产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯菌的盆栽防控情况
Figure BDA0003251247840000132
Figure BDA0003251247840000141
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的保藏号为GDMCC No：61095，已于2020年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
2.一种生防制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1中所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)和/或其发酵液。
3.根据权利要求2所述的生防制剂在防控桑树青枯病、桑树枯萎病、桑树拟干枯病、番茄枯萎病和烟草根腐病中的应用。
4.根据权利要求2所述的生防制剂在抑制茄科雷尔式菌、阴沟肠杆菌、菠萝泛菌、克雷伯氏菌、尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、禾谷镰刀菌和拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种中的应用。
5.根据权利要求1中所述的粘类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)和/或其发酵液在以下中的任意一项或几种中的应用：
防控桑树青枯病、桑树枯萎病、桑树拟干枯病、番茄枯萎病和/或烟草根腐病中的任意一种或几种；
制备防控桑树青枯病、桑树枯萎病、桑树拟干枯病、番茄枯萎病和/或烟草根腐病中的任意一种或几种的制剂；
抑制茄科雷尔式菌、阴沟肠杆菌、菠萝泛菌、克雷伯氏菌、尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、禾谷镰刀菌和/或拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种；
制备抑制茄科雷尔式菌、阴沟肠杆菌、菠萝泛菌、克雷伯氏菌、尖孢镰刀菌、层出镰刀菌、禾谷镰刀菌和/或拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种的制剂。
6.根据权利要求3或5所述的应用，其特征在于，
所述桑树青枯病为由桑树茄科雷尔式菌引起的桑树青枯病；
所述桑树枯萎病为桑树阴沟肠杆菌、桑树菠萝泛菌和/或桑树克雷伯氏菌中的任意一种或几种引起的桑树枯萎病；
所述桑树拟干枯病为桑树尖孢镰刀菌、桑树层出镰刀菌、桑树禾谷镰刀菌和/或桑树拟枝孢镰刀菌中的任意一种或几种引起的桑树拟干枯病；
所述番茄枯萎病为番茄阴沟肠杆菌引起的番茄枯萎病；
所述烟草根腐病为烟草尖孢镰刀菌引起的烟草根腐病。
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