CN116925950B - 一种花椒圆斑病生防菌株及其应用 - Google Patents

一种花椒圆斑病生防菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种花椒圆斑病生防菌株及其应用。该生防菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)HJYBJK‑7，其保藏号为CGMCC No.21545，于2020年12月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明发现随着菌株Bv‑7浓度的增加，病害预防效果更好，在接种浓度为108cfu/mL时效果最好，对花椒圆斑病的治愈率高达96％。并且发现，先接种贝莱斯芽孢杆菌然后再接种引起圆斑病的病原菌，也就是在患病之前先接种生防菌具有最佳的防治效果，最佳防治效果为96％，表明其在花椒圆斑病的防治方面具有广阔的发展前景。

Description

一种花椒圆斑病生防菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种花椒圆斑病生防菌株及其应用。
背景技术
竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC.)俗称青花椒，是芸香科植物。它是香料四川花椒的来源，被用于民间医学、精油生产和观赏性园林植物。花椒圆斑病严重威胁到了花椒叶片的正常生长，特别对幼苗植株造成的影响比较大，对整体形态、生理健康造成了不利影响。Jiang等人(2021)最近的一项研究首次报道在四川省眉山市的花椒园，Fusariumfujikuroi是引起花椒圆斑病的原因。该病导致花椒苗期叶片出现近圆形病斑，发病严重时可达70％以上，影响花椒幼苗的正常生长，造成损失严重。
目前，植物病害的主要防治方法是使用化学农药。然而，长期使用化学农药会造成环境污染，农药残留会导致抗病性增强和土壤肥力降低。此外，化学控制导致自然资源恶化、产品质量下降和生态平衡破坏，严重影响人类健康和生态安全。相比之下，利用有益微生物来控制疾病发生和发展的生物控制技术已被提出作为解决方案。
事实上，开发有效的抗病原真菌生物制剂是控制植物病害的重要方法(Boukaew等人，2017年)。生防细菌在环境中普遍存在，具有广泛的预防和控制特性；此外，这些细菌在控制植物病害方面表现出良好的效果，并且没有病原体抗性。因此，生防细菌在植物疾病控制方面很有前景。生防微生物非常丰富，包括细菌、真菌和放线菌。相关细菌主要为巴氏杆菌属、假单胞菌属、农杆菌属和芽孢杆菌属。其中，芽孢杆菌属以其通过各种机制控制植物疾病的能力而闻名，包括次级代谢产物的产生。芽孢杆菌对由土壤传播以及叶片和采后真菌病原体引起的植物病害有效。芽孢杆菌属的大多数细菌具有耐热性、耐旱性和抗紫外线辐射性。几乎所有健康的植物都含有内生细菌，它们在细胞间定殖，对寄主植物有许多影响，例如促进生长、预防疾病和固氮。因此，这些细菌是植物病害生物防治的天然资源，具有广阔的研究价值和发展前景。
目前只有关于竹叶花椒圆斑病分离并鉴定其致病病原的报道，而关于从竹叶花椒中筛选拮抗细菌及其对圆斑病应用的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种花椒圆斑病生防菌株及其应用，开发了一种新的花椒圆斑病生防菌株，为预防和控制这种花椒圆斑病提供更经济、高效和环境友好的解决方案。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种花椒圆斑病生防菌株，该生防菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)HJYBJK-7，其保藏号为CGMCC No.21545，于2020年12月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
上述菌株在抑制花椒圆斑病中的应用。
进一步地，菌株抑制引起花椒圆斑病的致病菌的生长。
进一步地，致病菌为藤仓镰孢菌。
进一步地，花椒为竹叶花椒。
一种发酵上清液，包括上述生防菌株。
上述发酵上清液在抑制花椒圆斑病中的应用。
一种抑制花椒圆斑病的菌剂，该菌剂以上述生防菌株，或发酵上清液作为活性成分，并包括其在药学上可接受的辅助成分。
进一步地，菌剂中活性成分的浓度为108cfu/mL。
本发明的有益效果：
本发明通过研究发现，随着菌株Bv-7(贝莱斯芽孢杆菌HJYBJK-7)浓度的增加，病害预防效果更好，在接种浓度为108cfu/mL时效果最好，对花椒圆斑病的治愈率高达96％，而随着Bv-7稀释度的增加，预防效果降低。并且发现，先接种贝莱斯芽孢杆菌然后再接种引起圆斑病的病原菌，也就是在患病之前先接种生防菌具有最佳的防治效果，最佳防治效果分别为98％和96％，表明其在花椒圆斑病的防治方面具有广阔的发展前景。
附图说明
图1为菌株HJYBJK-7的形态学特征；
图2为菌株HJYBJK-7的系统发育树；
图3为菌株HJYBJK-7处理下的花椒幼苗生长情况比较；
图4为菌株HJYBJK-7与藤仓镰孢菌HJYB-4在PDA平板上对峙培养时的菌落状态；
图5为生防菌HJYBJK-7对病原菌HJYB-4的显微形态的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
本申请中使用到的培养基如下：
(1)PDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，用马铃薯葡萄糖琼脂培养病原菌。
(2)NA培养基：蛋白胨10克，牛肉提取物3克，氯化钠5克，琼脂15-20克，蒸馏水1000毫升，pH值7.4-7.6。采用牛肉蛋白胨固体培养基进行细菌分离纯化。
实施例1菌株筛选鉴定
1、生防菌株的分离筛选
(1)分离
为了分离内生细菌，用70％乙醇和3％次氯酸钠对黄杨树皮进行消毒。然后用无菌水清洗树皮组织数次。下一步是通过稀释分离法收集内生细菌(Fang等人，1998年)。将彻底灭菌的组织充分研磨并稀释，将10-3、10-4和10-5稀释的100μL组织溶液涂在NA培养基上，并在3℃培养箱中培养1d，以分离因菌落形态而明显不同的单个菌落。
(2)筛选
根据Edwards和Mcbride(1975)的拮抗细菌筛选方法，通过对抗培养法初步筛选拮抗细菌。选择具有明显抑制圈的菌株，测量其宽度。纯化后，再次筛选菌株，具体过程如下：
选择LB培养基在恒温25℃和135r/min的摇床培养箱中培养拮抗菌株2天。收集发酵培养滤液并通过滤纸过滤，以4000r/min的速度离心8分钟，上层通过0.22-μm的膜过滤以制备无菌培养滤液。Bekierkunst和Szulga(1954)的生长速率法用于确定菌株拮抗性。使用涂有无菌水和无发酵培养滤液的LB平板作为对照。样品在25℃恒温下培养，该过程重复三次。每天观察记录对峙培养情况，测量抑菌带的宽度并作记录情况，计算相对应的抑菌率。抑菌率计算公式如下：
抑菌率＝(处理组抑菌圈直径-空白组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径×100％。
用接种针挑取对峙培养的病原菌有明显抑菌带边缘的新生菌丝，显微镜下观察菌丝形态特征，观察生防菌对其形态变化的影响。
通过上述过程，分离得到65株形态各异的菌株，命名为HJYBJK1-65。通过对抗培养筛选出4株对该病原菌有不同抑制作用的菌株(HJYBJK1、HJYBJK7、HJYBJK12和HJYBJK22)。HJYBJK7的拮抗效果最好，抑制率为85.4％(表1)。
表1抑菌率
2、生防菌株HJYBJK7鉴定
(1)形态学观察：将拮抗细菌接种到NA培养基上，并在25℃的培养箱中培养。根据常见细菌系统鉴定手册(Cai等人2001；Montanari等人2015)评估菌落的形态学特征，结果见图1。
如图1所示，菌株HJYBJK7在LB固体培养基上纯化培养后长出乳白色菌落(图1-A)，菌落不透明，表面粗糙，边缘不光滑，在菌落中央有凸起，菌落大小中等；该菌株在油镜下观察为短杆状(图1-B)；对该菌株进行革兰氏染色后镜检观察菌落呈现为紫色(图1-C)。
(2)生理生化检测：对拮抗菌进行革兰氏染色、孢子染色、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、糖氧化发酵试验、接触酶反应、乙酰甲基甲醇试验和硫化氢试验，见表2。
表2菌株HJYBJK7生理生化指标特征测定结果
注：“+”表示反应结果呈现阳性；“-”表示反应结果呈现阴性。
(3)分子生物学鉴定：将该菌株在20mL NA液体培养基中恒温休克培养24h。将培养液收集到2mL离心管中，并在4℃和12000rpm下离心10分钟。根据细菌基因组DNA试剂盒(天根生化科技有限责任公司)提取DNA。以菌株基因组DNA为模板，利用通用引物27F/1492R、UP1-F/UP-2R分别扩增16SrDNA和gyrB基因序列片段，利用特异性引物Bvel-F/Bvel-R检测kdgK基因(D-葡萄糖醛酸钠代谢基因)，相关基因引物信息见表3。通过聚合酶链反应扩增提取的DNA。
每个25-μL PCR混合物包含0.5μL DNA模板、12.5μL 2×Taq主混合物、1μL上游和下游引物以及10μL ddH2O。该反应包括在94℃下预变性4分钟，在94℃下变性40秒，在55℃下退火30秒，在72℃下延伸1分钟，在72℃下最终延伸10分钟。5微升扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行评估并测序。通过Blast同源比对分析序列，并从GenBank下载高度同源菌株的16S rDNA序列。最后，使用MEGA5.0软件邻接法构建系统发育树，确定拮抗菌株的系统发育状态，结果见图2。
表3生防菌鉴定相关引物信息
如图2所示，对扩增产物进行测序，获得长度为959bp(GenBank登录号：MW365301)的rDNA ITS序列管家基因gyrB片段长度为970bp(MW382277)。将获得的序列与GenBank中报告的序列进行同源性BLAST分析。用MEGA5构建了系统发育树。B18菌株和贝莱斯芽孢杆菌(GenBank编号：HQ662593和KC790268)具有99％的核苷酸序列相似性；较高的自蔓延值支持一个分支远离芽孢杆菌的其他成员。因此，菌株HJYBJK-7被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)，于2020年12月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.21545。
该菌种保藏于中国微生物中心(CGNMCC：21545)。
实施例2抑菌效果测定
1、盆栽试验中控制效果的测定
将拮抗细菌在28℃和180r/min的摇床培养箱中在NA液体培养基中培养48h。以培养得到的不同浓度的菌株HJYBJK-7(104、106和108cfu/mL)制备培养基。然后通过打孔法获得五块致病真菌菌丝体(致病真菌为藤仓镰孢菌HJYB-4(Fusarium fujikuroi)，由四川省森林保护重点实验室提供，Φ＝8mm)，并接种到每瓶PDA液体培养基中；选择100株健康的一年生竹叶花椒幼苗，分为三组，分别进行如下处理：
A1：用20mL病原菌悬液进行伤口接种，15d后接种，通过喷雾在接种的原始位置接种20毫升不同浓度的生防菌HJYBJK-7悬浮液(等人，2016年)；
A2：首先用20mL不同浓度的生防菌HJYBJK-7悬浮液处理植株15d，然后接种20mL病原菌悬浮液；
A3：植物同时接种不同浓度的生防菌HJYBJK-7悬浮液和20mL病原真菌悬浮液。
以无菌水作为对照，每次治疗重复10次。用无菌水和无菌培养基对该病进行30d调查，计算发病率、病情指数和防治效果。
疾病评分如下：(I)在植株上未观察到疾病；(Ⅱ)叶片发病小于25％；(Ⅲ)叶片发病25％-50％；(Ⅳ)叶片发病51％-75％；(V)叶片发病超过75％。
如图3所示，图中A1-A3为菌株HJYBJK-7处理，B1-B3为清水对照。如图可知，当菌株HJYBJK-7的浓度为108cfu/mL时，竹叶花椒的叶片发病明显。在相同条件下，预先接种生防菌株可获得最佳控制效果(A2)。
表4生防防治细菌HJYBJK-7在盆栽试验30d后的防治效果
注：同一列中不同小写字母表明差异性显著，P<0.05。
Note:Different lowercase letters in the same column indicatesignificant difference at P＜0.05.
3、拮抗细菌对病原菌的抑制作用
(1)对病原菌菌丝生长的影响—采用打孔法进行了拮抗试验
使用无菌水作为对照，并在添加拮抗剂上清液后24、48、72、96和120h对样品进行评估。该试验用于测定真菌菌落的直径和对照真菌菌落的直径；每次治疗重复3次。用平板覆盖对照菌丝体后，在光学显微镜下观察周围菌落的菌丝体与对照菌落的正常菌丝体之间的差异，结果见图4。
由于控制作用，致病真菌的菌丝体和培养基的颜色逐渐加深和变暗。在光学显微镜下，抑制菌落边缘菌丝的形态被破坏，主要表现为菌丝肿胀和分生孢子变形，HJYBJK-7无菌培养滤液对病原体的萌发有明显的抑制作用(图4A1和A2)，相比之下，对照组的菌丝生长旺盛，发育良好，且对照组的孢子能够正常萌发，发芽率为77％(图4中B1和B2)。
生防菌HJYBJK-7与病原菌的对峙培养试验表明(图5，图中A、B、C为对照组；D、E、F为对峙组；标尺＝15μm)，该生防菌对病原菌的生长有明显抑制作用。从图5看出对峙培养拮抗作用存在的，病原菌菌丝伸展抑制，整体菌丝扭曲挤压(图5-D)，菌丝出现膨大(图5-E，F)；正常情况菌丝伸展松弛状态，向外延伸(图5-B，C)，菌丝上多产孢结构(如图5-A)。
综上可知，盆栽试验表明，随着菌株Bv-7浓度的增加，病害预防效果更好，在接种浓度为108cfu/mL时效果最好。同样地，在我们的现场控制分析中，花椒圆斑病的防治效果达96％，并且随着Bv-7稀释度的增加，预防效果降低。在申请的盆栽试验中，先接种贝莱斯芽孢杆菌，然后接种引起圆斑病的病原菌；最佳防治效果为96％，具有广阔的发展前景。

Claims (8)

1.一种花椒圆斑病生防菌株，其特征在于，所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacilus velezensis）HJYBJK-7，其保藏号为CGMCC No.21545，于2020年12月23日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.权利要求1中所述的菌株在抑制花椒圆斑病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌株抑制引起花椒圆斑病的致病菌的生长。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述致病菌为藤仓镰孢菌（Fusarium fujikuroi）。
5.一种菌悬液，其特征在于，包括如权利要求1所述的生防菌株。
6.权利要求5所述的菌悬液在抑制花椒圆斑病中的应用。
7.一种抑制花椒圆斑病的菌剂，其特征在于，所述菌剂以权利要求1所述的生防菌株，或权利要求5所述的菌悬液作为活性成分，并包括其在药学上可接受的辅助成分。
8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于，菌剂中生防菌株的浓度为108 cfu/mL。
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