CN111979157B - 一种马铃薯干腐病拮抗菌jz3-1-15及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马铃薯干腐病拮抗菌JZ3‑1‑15及其应用，该拮抗菌JZ3‑1‑15的保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61050，分离自青稞白酒糟醅中。本发明的马铃薯干腐病拮抗菌JZ3‑1‑15发酵液产蛋白酶较多，淀粉酶次之，不具有产葡聚糖酶的能力，具有产生表面活性功能的脂肽类物质的能力，能够抑制马铃薯干腐病的病原菌镰刀菌，用于防治马铃薯干腐病。

Description

一种马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15及其应用

技术领域

本发明涉及一种马铃薯干腐病拮抗菌，具体涉及一种马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15及其应用。

背景技术

马铃薯是全球第四大重要的粮食作物，在贮藏过程中，马铃薯容易被多种病害所侵袭。其中，马铃薯干腐病是马铃薯贮藏期主要的真菌性病害之一，其由多种镰刀菌(Fusarium spp.)引起。据统计，每年由马铃薯干腐病造成的马铃薯贮藏期产量损失为6～25％，最高可达60％。生产中对这种病害的防治以化学防治手段为主，常用的药剂有苯醚甲环唑·嘧菌酯、霜脲·锰锌、戊唑醇等，但长期使用化学药剂防治，造成菌株抗药性、环境污染和农药残留等严重的问题。

生物防治是利用有益生物及其代谢产物来控制植物病虫害的方法，具有安全无毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点。因此，利用微生物等天然资源及其产生的天然产物对马铃薯干腐病进行生物防治具有重要的意义。目前，已报道的可对马铃薯干腐病进行生物防治的生防菌有芽孢杆菌(Bacillus sp.)、放线菌(Actinomyces)和木霉菌(Trichoderma sp.)等生防菌株以及寡雄蛋白(Oligandrin)和蓝桉精油等活性物质。

酒糟是以谷物为原材料经发酵、蒸馏、提取酒精等加工过程后所残余的废渣物料。近年来，酒糟多应用于食品、饲料、以及抗癌等方面的研究。目前，已有研究显示酒糟菌在抑草、抑菌和抗病毒等方面具有生物活性。目前，有关生防细菌抑制植物病原真菌的报道越来越多，但有关生防细菌抑制马铃薯干腐病病原菌活性方面的报道还很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15及其应用，解决了现有采用化学防治马铃薯干腐病易造成环境污染的问题，通过拮抗菌JZ3-1-15抑制马铃薯干腐病，具有安全无毒、不污染环境和不易产生抗药性的优点。

为了达到上述目的，本发明提供了一种马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15，该拮抗菌JZ3-1-15的保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61050。

优选地，所述拮抗菌JZ3-1-15分离自青稞白酒糟醅中。

本发明的另一目的是提供一种马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15在抑制马铃薯干腐病方面的应用。

优选地，所述拮抗菌JZ3-1-15发酵液的正丁醇萃取物具有抑制马铃薯干腐病的作用。

优选地，所述拮抗菌JZ3-1-15发酵液的制备，将拮抗菌JZ3-1-15接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃，180r/min恒温摇瓶柜中振荡培养5～7d，去除菌体，收获拮抗菌JZ3-1-15发酵液。

本发明的马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15及其应用，解决了现有采用化学防治马铃薯干腐病易造成环境污染的问题，具有以下优点：

本发明的马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61050，其从酒糟中分离出来，该菌株JZ3-1-15发酵液产蛋白酶较多，淀粉酶次之，不具有产葡聚糖酶的能力，具有产生表面活性功能的脂肽类物质的能力，能够抑制马铃薯干腐病的病原菌镰刀菌。

附图说明

图1本发明的菌株JZ3-1-15发酵液生防因子分析结果。

图2为本发明的菌株JZ3-1-15发酵液提取物的稳定性测定结果。

图3为本发明的菌株JZ3-1-15的培养性状及革兰氏染色结果。

图4为本发明的基于16S rDNA序列的菌株JZ3-1-15的系统发育树。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实验所用材料如下：

1、菌株

JZ3-1-15分离自青稞白酒糟醅(该拮抗菌JZ3-1-15的保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61050)；马铃薯干腐病病原真菌青9B-4-6和青9D-2-6分离自马铃薯青薯9号薯块病样，病原真菌65C-4-3和65D-5-2分离自马铃薯下寨65薯块病样，为镰刀菌(Fusarium sp.)，均纯化并保存至青海省农林科学院生物技术研究所微生物实验室4℃冰箱。

2、培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂粉20g、蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2。

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、蒸馏水1000mL。

淀粉培养基：可溶性淀粉10g、牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH值7.2。

酪蛋白培养基：牛肉膏3g、酪蛋白8g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2。

葡聚糖酶培养：葡聚糖5g、NaNO₃2 g、K₂HPO₄1 g、KCl 0.5g、MgSO₄ 0.5g、FeSO₄0.01g、刚果红0.05g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。

羧甲基纤维素培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10g、(NH₄)₂SO₄4 g、酵母浸粉5g、K₂HPO₄2 g、刚果红0.4g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH值7.6。

实验例1活性菌株的筛选及稳定性评价

1、菌株活化

将保存的酒糟菌菌株从4℃冰箱取出，划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，接种完毕的平板放于37℃恒温培养箱中倒置培养48h，备用。

2、活性菌株的筛选

采用平板对峙法，在距直径9cm的培养皿边缘2cm处的一侧点接酒糟菌菌株，相对的另一侧接种直径5mm的病原真菌，每个处理重复3次，以只接病原真菌的处理作为对照(CK)。置于28℃生化培养箱中培养7d观察酒糟菌与病原真菌之间有无抑菌带出现，测量菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率计算公式为：

抑菌率(％)＝(对照菌落直径—处理菌落直径)/对照菌落直径×100％

酒糟菌菌株对马铃薯干腐病病原真菌的抑制活性结果，为：

对酒糟菌JZ3-1-15进行抑制病原真菌青9D-2-6、65D-5-2、青9B-4-6、65C-4-3的活性测定，由表1可知，菌株JZ3-1-15对病原真菌具有中等的抑制作用：菌株JZ3-1-15对病原真菌青9D-2-6的抑制率为57.24％，对青9B-4-6的抑制率为51.92％，对65C-4-3的抑制率为50.18％，对65D-5-2的抑制率为49.83％。由上述结果可知，供试菌株中，菌株JZ3-1-15对病原真菌青9D-2-6的抑制活性最高。

表1酒糟菌对病原真菌的抑制活性

注：表中数值为平均值±标准差，“-”为无数据，下同。

3、活性菌株的稳定性评价

为了确定活性菌株的稳定性，将初筛得到的有抑制活性的酒糟菌菌株进行稳定性评价，方法同活性菌株的筛选。分别将供试酒糟菌和病原真菌对峙培养7d和14d后，测量抑菌带宽度，计算14d时抑菌带宽度缩小率(VF)，比较各酒糟菌菌株的抑制稳定性。稳定评价标准为：“--”：VF≥70％，不稳定；“-”：50％≤VF＜70％，较不稳定；“+”：20％≤VF＜50％，较稳定；“++”：VF＜20％，稳定。

抑菌带宽度缩小率计算公式为：

VF(％)＝(7d抑菌带宽度值-14d抑菌带宽度值)/7d抑菌宽带值×100％

活性菌株的稳定性评价结果，为：

对菌株JZ3-1-15进行抑菌活性的稳定性评价，由表2可知，菌株JZ3-1-15对病原菌的抑制活性的抑菌带缩小率为0.78％，稳定性为“++”。因此，菌株JZ3-1-15对病原菌的抑制作用稳定。

表2酒糟菌对病原真菌抑制活性的稳定性

注：表中同一列中不同字母表示各处理间差异显著(P＜0.05)。

实验例2活性菌株发酵液的制备及菌株生防因子分析

1、菌株JZ3-1-15发酵液制备

将筛选到的活性菌株接种到装瓶量为400mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃，180r/min恒温摇瓶柜中振荡培养5～7d，收获发酵液，然后将其经布氏漏斗减压过滤去除菌体，得到去菌体发酵液(即下述菌株JZ3-1-15发酵液)，备用。

2、活性菌株生防因子分析方法

(1)菌株JZ3-1-15发酵液的产酶能力测定

采用透明圈法，分别在淀粉培养基、酪蛋白培养基、葡聚糖酶培养、羧甲基纤维素培养基上打3孔(直径6mm)，每孔加菌株JZ3-1-15发酵液100μL，设三个重复。以只加NA液体培养基为对照组。放置在37℃恒温培养箱培养培养24～48h，向淀粉酶培养基中加入2mL的碘液，将碘液均匀覆盖平板，静置10min，记录碘液染色的蓝紫色平板上出现透明圈情况。同时观察记录酪蛋白酶培养基、葡聚糖酶培养和羧甲基纤维素培养基出现透明圈的情况。

菌株JZ3-1-15发酵液的产酶能力结果，为：

如图1所示，菌株JZ3-1-15发酵液在酪蛋白培养基(图1中的A)、淀粉培养基(图1中的B)和羧甲基纤维素培养基(图1中的C)上均有明显酶解圈产生，且在酪蛋白培养基和淀粉培养基上酶解圈边缘界限清晰，酪蛋白培养基上的酶解圈明显较大，羧甲基纤维素培养基上酶解圈边缘界限模糊，说明菌株JZ3-1-15发酵液产蛋白酶较多，淀粉酶次之。如图1中的D所示，在葡聚糖酶培养基上未有透明圈产生，说明菌株JZ3-1-15发酵液不具有产葡聚糖酶的能力。

(2)菌株JZ3-1-15发酵液是否具有产生脂肽类物质的能力测定取适量橄榄油加入苏丹Ⅲ染色剂混匀，向培养皿(直径9cm)中加入60mL纯水及缓慢加入染色的橄榄油，水面形成一层油膜。用移液器吸取菌株JZ3-1-15发酵液，向培养皿油膜中心持续滴加，观察是否形成排油圈。以只滴加NA液体培养基为对照组。检测菌株JZ3-1-15发酵液是否有表面活性功能的脂肽类产物生成。

测定菌株JZ3-1-15发酵液产生表面活性功能的脂肽类物质的能力测定结果，为：

如图1中的E所示，有明显的排油圈产生，说明菌株JZ3-1-15发酵液具有产生表面活性功能的脂肽类物质的能力。

实验例3活性菌株发酵液萃取物的制备、其抑菌活性及稳定性测定

1、活性菌株JZ3-1-15发酵液萃取物的制备

取去菌体发酵液600mL置于3000mL的分液漏斗中，分别用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇对发酵液依次进行等体积萃取，萃取液经旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏；将萃取物预溶于二甲基亚砜(≤0.1％)，并用无菌水分别配成浓度为1.25、2.5、5、10和20mg/mL的萃取物溶液，溶液经0.22μm微孔滤膜抽滤三次，以等体积的二甲亚砜(≤0.1％)溶液作为空白对照，每个处理重复三次。

2、活性菌株JZ3-1-15发酵液萃取物的抑菌活性测定

采用牛津杯法，在直径9cm培养皿底部用“十字交叉法”划线，并以交叉点为中心，取距离中心点2.5cm的4个点。中心点放置牛津杯并加入250μL供试浓度下的发酵液萃取物溶液，4个点接种直径5mm的同一种病原真菌，每个处理重复3次。以只接病原真菌的实验处理作为对照。测量菌落直径，计算抑制率，并用毒力回归方程求得酒糟菌萃取物对马铃薯干腐病病原真菌的抑制中浓度(EC₅₀)。

活性菌株JZ3-1-15发酵液萃取物的抑菌活性结果，为：

由表3可知，当乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取溶液浓度为20mg/mL时对病原真菌的抑菌活性最高，抑制率分别为62.67％、67.52％和80.07％。当氯仿和正丁醇萃取物溶液浓度为10mg/mL时，对病原真菌仍具有较高的抑制活性，抑制率分别为52.42％和61.41％。由显著性分析结果可知，当乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取溶液浓度为20mg/mL时与其它抑制效果差异显著(P＜0.05)。

由毒力回归方程可知：乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取物溶液对病原真菌青9D-2-6抑制活性的EC₅₀分别为14.06、8.88和5.18mg/mL。

因此，酒糟菌菌株JZ3-1-15发酵液正丁醇萃取物溶液对病原真菌青9D-2-6的抑菌效果更强。

表3菌株JZ3-1-15发酵液萃取物对病原真菌青9D-2-6的抑菌活性

注：表中同一萃取物的同一列中不同字母表示各处理间差异显著(P＜0.05)。

3、菌株JZ3-1-15发酵液提取物的稳定性测定

选取20mg/mL的正丁醇萃取物溶液作为研究对象，以马铃薯干腐病病原菌青9D-2-6作为指示菌，采用牛津杯法分别检测正丁醇萃取物溶液对病原菌青9D-2-6抑菌活性的稳定性，每个处理重复三次。

(1)热稳定性

将浓度为20mg/mL正丁醇萃取物溶液分别进行40、60、80、100℃水浴处理及121℃高压蒸汽灭菌锅处理60min，待其冷却后，用0.22μm无菌滤膜抽滤三次，以抽滤后未进行加热处理的溶液作为对照，检测其对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性。

热稳定性结果，为：

参见图2中的A，在80℃高温下，正丁醇萃取物抑菌率能达到70％以上；当温度上升至121℃时，抑菌率仍达65％以上，表明菌株JZ3-1-15发酵液正丁醇萃取物中的抑菌物质耐高温。

(2)酸碱稳定性

将浓度为20mg/mL正丁醇萃取物溶液分别用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠分别调节pH值为5、6、7、8、9，静置24h后用0.22μm滤膜抽滤三次，以未调节pH值的溶液作为对照，检测其对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性。

酸碱稳定性结果，为：

参见图2中的B，pH对菌株JZ3-1-15发酵液正丁醇萃取物中的抑菌物质有较小影响，pH＝4时抑制率为59.28％，pH＝8时抑制率为63.24％，抑制率虽然有小幅下降，但仍在55％以上，表明强酸、强碱对菌株JZ3-1-15发酵液正丁醇萃取物中的抑菌物质有较小的影响。

(3)紫外稳定性

将浓度为20mg/mL正丁醇萃取物溶液置于254nm的紫外灯下20cm处分别照射1、3、5、7、9h后，用0.22μm滤膜抽滤三次，以未经紫外照射处理的提取物溶液作为对照，检测其对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性。

紫外稳定性结果，为：

参见图2中的C，紫外线对菌株JZ3-1-15发酵液正丁醇萃取物中的抑菌物质几乎无影响，抑制率均接近80％，抑制率浮动小于5％。

实验例4活性菌株的鉴定

1、活性菌株JZ3-1-15的形态学鉴定

将活化后的活性菌株JZ3-1-15接种于NA培养基上，观察其生长的菌落形态特征(包括形状、光泽、隆起形状、透明度、边缘等)及菌体形态特征(包括革兰氏染色、芽孢形态)，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行形态学鉴定。

形态学鉴定结果，为：

如图3所示，菌株JZ3-1-15在NA培养基上培养24h后(图3中A)呈乳白色，单菌落形态呈圆形或椭圆形，边缘整齐，不透明，表面光滑、湿润，明显向上突起，黏液状；培养72h后(图3中B)表面出现褶皱，边缘不规则，呈雾状散开；革兰氏染色(图3中C)后镜检呈蓝紫色，杆状，表明该菌株JZ3-1-15为阳性菌。

2、活性菌株的生理生化特征

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)和《常见细菌系统鉴定手册》对活性菌株JZ3-1-15进行葡萄糖氧化发酵试验、柠檬酸盐利用试验、接触酶试验、石蕊牛奶测试、明胶液化试验、甲基红试验(M.R)、硝酸盐还原试验、V-P测定试验、O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶(ONPG)测定试验，以及糖、醇类发酵等。

由表4可知，菌株JZ3-1-15可使明胶液化，石蕊牛乳凝固，可利用蔗糖、甘露醇及麦芽糖，有氧或无氧分子均参与分解葡萄糖，可以产生ONPG，硝酸盐还原、接触酶试验均呈阳性。而不能利用柠檬酸，甲基红、V-P试验均呈阴性。

表4菌株JZ3-1-15的生理生化特征

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

3、活性菌株的分子生物学鉴定

活性菌株JZ3-1-15的DNA提取根据上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。选择通用的细菌16S rDNA引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′)和P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3′)进行PCR扩增。

PCR扩增体系为：10×Buffer 2.5μL，dNTP(10mmol·L-1)2μL，模板DNA 1μL，引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，水补足至25μL。

PCR反应条件为：94℃5min；变性94℃40s，退火55℃45s，延伸72℃80s，35个循环；72℃10min。

反应结束后，取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至上海生工生物工程公司测序，序列见SEQ ID NO.1。将得到的16S rDNA序列在网站https://www.ezbiocloud.net/上进行序列对比，并下载与菌株JZ3-1-15的16S rDNA序列同源性大于95％的序列，用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-Joining方法(Bootstrap值为1000次)，绘制系统发育进化树(图4)。

参见图4，结果表明，菌株JZ3-1-15与菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)聚类同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.78％。结合菌株JZ3-1-15的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，最终将菌株JZ3-1-15鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 青海省农林科学院

<120> 一种马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> JZ3-1-15

<400> 1

gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60

acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120

gcttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 180

acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc 240

gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300

cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360

tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg 420

gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480

taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540

tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa 600

cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg 660

gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc 720

gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780

tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840

gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900

tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc 960

ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080

agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca 1200

aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc 1260

agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380

cgaagtcggt gaggtaacct ttaggagcca gcc 1413

Claims (5)

1.一种马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15，其特征在于，该拮抗菌JZ3-1-15的保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61050。

2.根据权利要求1所述的马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15，其特征在于，所述拮抗菌JZ3-1-15分离自青稞白酒糟醅中。

3.一种如权利要求1或2所述的马铃薯干腐病拮抗菌JZ3-1-15在抑制马铃薯干腐病方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述拮抗菌JZ3-1-15发酵液的正丁醇萃取物具有抑制马铃薯干腐病的作用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述拮抗菌JZ3-1-15发酵液的制备，将拮抗菌JZ3-1-15接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃，180r/min恒温摇瓶柜中振荡培养5～7d，去除菌体，收获拮抗菌JZ3-1-15发酵液。

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