CN105754909B - 凤凰单丛茶树内生拮抗假单胞菌zf02及在生防中应用 - Google Patents

凤凰单丛茶树内生拮抗假单胞菌zf02及在生防中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种凤凰单丛茶树内生拮抗假单胞菌ZF02及在生防中应用，通过从凤凰单丛茶树茎中取样，分离纯化、筛选和培养，获得一株有较高生防效果的假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02 GDMCC No：60013，菌种在生理生化特性和分子水平方面与常见的假单胞菌具有明显的差异，是一种典型的新菌种，菌株ZF02对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有较高抑制效果，菌丝生长抑制率分别为为73.13％，35.75％，61.42％和15.50％，是一种典型性突出、专一性强的生防菌，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景，在生防中具有广泛的应用价值。

Description

凤凰单丛茶树内生拮抗假单胞菌ZF02及在生防中应用
技术领域
本发明涉及农业生物生防技术领域，具体涉及一种从凤凰单丛茶树内生拮抗菌及其在生物防治中应用的技术领域。
背景技术
植物内生菌(Endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物各种组织内部或细胞间隙，而不使宿主产生明显病理症状的微生物。拮抗内生菌是指能够产生拮抗作用的微生物。植物体是一个复杂的微生态系统，健康植物体内含有大量的内生细菌(Endophytic Bacteria)，已从小麦、棉花、水稻、花生、马铃薯、番茄、柠檬、柑桔等50多种植物体内分离鉴定出内生细菌50多个属，几乎所有健康植物体内均含有内生细菌。
在农业种植业中，梨、核桃、红枣、棉花等农作物遭受梨果黑斑病菌、核桃叶枯病菌、梨腐烂病菌、红枣黑斑病菌、立枯丝核病菌等的侵害严重，化学杀菌剂是控制以上病害常用的方法，但化学杀菌剂污染环境，诱导病菌产生抗药性，破坏生态平衡，它的残留问题令人担忧，因此植物病害的生物防治研究越来越受到重视。
目前植物病害的生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治的技术与方法。单丛茶是我国重要的茶树品种，从单丛茶树内生细菌中筛选出对农林作物病原菌有抑菌作用的拮抗菌株，对开发生物防腐剂及抑菌剂，保障食品和环境安全具有重要的意义。
国外已有报道从不同的植物中分离出Acinetobacter、Agrobacterium、Alcaligenes、Bacillus、Clavibacter、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Phyllobacterium、Pseudomonas和Serratia等属的内生细菌。国内黄晓琴，张丽霞等从茶树内生菌中进行了冰核细菌拮抗菌的筛选，得到菌株Y1，通过对其进行形态学观察、生理生化指标测定及16SrDNA序列测定，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。罗明对新疆棉花植株组织中的内生细菌进行分离，共得到102个菌株，初步鉴定分属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、黄单孢菌属(Xanthomonas sp.)、假单孢菌属(Pseudomonas sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)及短小杆菌属(Curtobacterium sp.)，从中筛选出对棉花枯萎病菌有体外拮抗活性的菌株22个，对立枯丝核菌有体外拮抗活性的菌株15株。
生物防治不仅可降低对环境的影响，还不易产生抗药性。假单胞菌营养要求简单，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，可研究其用于植物病害的生物防治，为研究开发生物防控菌杀菌剂奠定基础。
凤凰单丛茶产于潮州市凤凰山，素以滋味浓醇鲜爽，香气似天然花果香著称，种植历史悠久，种质资源丰富，已达80多个品系。目前对凤凰单丛茶的研究主要集中在品种鉴定、遗传多样性分析、品质化学特性、生理活性、质量安全和做青工艺的研究，对于凤凰单丛茶树内生菌的研究不多。因此对凤凰单丛茶树内生菌进行分离，从中筛选出具有抑菌活性的拮抗菌株都具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术中关于凤凰单丛茶树内生细菌对常见细菌腐败菌和梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉等植物病原菌的研究未见报道，本发明旨在于提供一种新的凤凰单丛茶树内生拮抗假单胞菌ZF02及在生防中应用，通过试验证明获得新的菌种对于梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉等植物病原菌具有相对高防治能力且性能稳定，表明本发明提供一种新的抗性菌株，作为植物病原菌的生物防治材料，无论是开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。
本发明采用的主要技术方案：
本发明通过凤凰单丛茶树茎中分离筛选出一株对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉等植物病原菌有较高抑制效果的细菌菌株ZF02，与常见的假单胞菌不同的新菌种，通过利用分离出的新菌种对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉等植物病原菌进行抑菌试验，并提供一种利用假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCCNo：60013进行植物病原菌生物防治中应用技术方案，ZF02菌株对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有较好的抑菌作用，菌丝生长抑制率分别为73.13％，35.75％，61.42％和15.50％，作为植物病原菌的生物防治材料，无论是开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。
本发明通过从凤凰单丛茶树茎中取样，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为ZF02的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株从其分类学角度属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株。本发明采用菌株编号为ZF02的细菌菌株，通过对所获菌株进行形态特征、生理生化特性及总DNA的提取、16SrDNA的PCR扩增和序列测定及系统发育分析，初步确定了是一株新菌，并依据其分类地位，获得一种与常见的假单胞菌菌株存在明显不同特性的假单胞菌菌株(Pseudomonas sp.)，从科学角度证明了是一株新菌，并确定其分类地位。同时，利用筛选出的菌株ZF02对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉进行抑菌试验，ZF02菌株对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有较好的抑菌作用，菌丝生长抑制率分别为73.13％，35.75％，61.42％和15.50％，是一种典型性突出、专一性强的生防菌。
本发明具体提供一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013，通过从凤凰单丛茶树茎中分离、筛选和培养，从中筛选出一株对防治梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉方面具有突出功效的ZF02，经微生物学分类与鉴定，属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
具体的，本发明通过从凤凰单丛茶树茎中取样，样本是凤凰单丛茶树茎，采集于广东省潮州饶平县浮滨镇，树龄15、25和50年，种植海拔高度750m，茶树品种为凤凰单丛茶水仙，进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为ZF02的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株。本发明采用菌株编号为ZF02的细菌菌株，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510075。菌种的保藏日期为2016年3月10日，菌种保藏编号为GDMCC No：60013。该菌株最适生长条件为：温度37℃，培养基采用常见的营养琼脂培养基。
本发明提供的ZF02菌株，经20h培养后，在营养琼脂培养基上菌落为白色，湿润，不透明，边缘不整齐。将菌种ZF02通过镜检观察，该菌株属革兰氏染色阴性，在显微镜下个体形态呈杆状或略弯。该菌具鞭毛，能运动。根据以上形态特征，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对菌株进行分类鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。经分子测序结果表明，假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013的16SrDNA基因序列为1439bp，与NCBI数据库Pseudomonasfluorescens NBRC 14160(NR_113647.1)同源性最高，最高相似性为94％，但本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013与常见的细菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为ZF02的菌种是一种典型的新菌种，有别于常见的假单胞菌(Pseudomonas)，与常见的细菌菌种相比，其对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有较好的抑菌作用，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，将编号为ZF02的菌种大致分类归属为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
本发明进而提供假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013的分离和培养方法。
(1)分离培养基采用：牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2，营养琼脂培养基为蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
(2)分离和筛选条件：
茎中内生细菌的分离：采用组织块培养法，将表面消毒后的茎剪成0.5×0.5cm的组织块，茎采用树龄15、25和50年，种植海拔高度750m，茶树品种为凤凰单丛茶水仙，每三个组织块为一组置于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃下培养20h，取80μL涂布于营养琼脂平板，37℃培养18h。待长出细菌菌落后，挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线涂布于营养琼脂平板，37℃培养18h，反复在营养琼脂平板上划线分离纯化，直至得到单个纯菌落。
经培养筛选确定的假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013在营养琼脂培养基上菌落白色，湿润，不透明，边缘不整齐。。
进一步，本发明提供一种假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013在生防中的应用，通过假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013在防治梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉中应用，ZF02菌株对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有较好的抑菌作用，菌丝生长抑制率分别为73.13％，35.75％，61.42％和15.50％，是一种典型性突出、专一性强的生防菌。
通过实施本发明具体技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明提供了一种新的凤凰单丛茶树内生拮抗菌-假单胞菌(Pseudomonassp.)ZF02GDMCC No：60013。
(2)本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013可高效抑制梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉，菌丝生长抑制率分别为73.13％，35.75％，61.42％和15.50％，经测定，ZF02对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有很强的抑制效果；作为植物病原菌的生物防治材料，无论开发新的生物农药或者生物防治菌剂，该菌都具有很好的应用前景。
附图说明
图1所示为假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013的个体形态及菌落特征图。
图2所示为假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013琼脂糖凝胶电泳图。
图3所示为假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013系统发育树状图。
图4所示为假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013对枯草芽孢杆菌的抑制效果图
图5所示为假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013对四种植物病原菌的抑菌效果图，其中：D-梨果黑斑病菌，F-梨腐烂病菌，X-瓜果腐霉，Y-立枯丝核菌。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：由溶剂和溶质组成，溶质为牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，溶剂为蒸馏水；加入牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2，在121℃的条件下灭菌15min。
营养琼脂培养基：由溶剂和溶质组成，溶质为牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂，溶剂为蒸馏水；加入蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，121℃条件下灭菌15min。
水琼脂培养基：加入琼脂25g、蒸馏水1000mL，121℃条件下灭菌15min：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：由溶剂和溶质组成，溶质为马铃薯浸出粉、葡萄糖、琼脂，溶剂为蒸馏水；加入马铃薯浸出粉6g、葡萄糖20g、琼脂12g、蒸馏水1000mL，121℃条件下灭菌15min。
采用主要设备仪器：LD2X-30KA型立式电热压力蒸汽灭菌锅、DHP-9162型电热恒温培养箱武汉诺贝思机械制造有限公司；TGRADIENT型PCR仪、PowerPac型电泳仪、FluorchemXplor型荧光-可见光凝胶成像分析系统北京弘图科技有限公司。
采用的试验指示细菌：A大肠杆菌(Escherichia coli)、B枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、C金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、P白色念珠球菌(Moniliaalbican)属于常见的对照菌。
采用的D梨果黑斑病菌(Alternaria alternate)、E核桃叶枯病菌(WalnutBlight)、F梨腐烂病菌(Valsa ambiens Pets)、G红枣黑斑病菌(Alternaria sp)、H茄腐镰刀病菌(Fusarium solani)、X瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、Y立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为常见的农林作物病原菌，本领域普通技术人员可以通过病害作物梨、核桃、红枣、棉花、茄科植物中分离；细菌基因组DNA快速提取试剂盒、引物27F、引物1492R、2×TapPCRMaster mix，生物生工(上海)有限责任公司。
本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013的分离、筛选及鉴定
1、菌种的分离和筛选
本发明所使用的假单胞菌(Pseudomonas sp.)由韩山师范学院从广东省潮州饶平县浮滨镇中凤凰单丛茶树茎中取样，样本采用凤凰单丛茶树的茎，采集于广东省潮州饶平县浮滨镇，树龄15、25和50年，种植海拔高度750m，茶树品种为凤凰单丛茶水仙，有机种植。经过采用组织块培养法分离出茎中内生细菌，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，经过优化筛选出一批生长良好的细菌菌株，从中优选出一株编号为ZF02的菌株。
分离步骤：
(1)分离培养基采用：牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2，营养琼脂培养基为蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
表面消毒：先将茎剪成约5cm长，用75％乙醇浸泡根4min，无菌水冲洗7次，用3.0％的双氧水浸泡3min，再用无菌水冲洗10次。
(2)分离纯化：
茎中内生细菌的分离：采用组织块培养法，将上述步骤表面消毒后的凤凰单丛茶树茎剪成0.5×0.5cm的组织块，每三个组织块为一组置于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃下培养20h，取80μL涂布于营养琼脂平板，37℃培养18h。
待长出细菌菌落后，挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线涂布于营养琼脂平板，37℃培养18h，直至无杂菌落，反复在营养琼脂平板上划线分离纯化，直至得到单个纯菌落。
2、菌株的培养条件
(1)编号为ZF02的菌株的生长培养基：营养琼脂培养基，蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，经37℃、20h培养。
(2)编号为ZF02的菌株在37℃-41℃条件下均能生长，最适生长温度为37℃，培养时间为20h。
(3)编号为ZF02的菌株的生长pH为7.0-7.2。
上述采用菌株编号为ZF02的细菌菌株，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510075。菌种保藏日期为2016年3月10日，菌种保藏编号为GDMCC No：60013。该菌株最适生长条件为：温度37℃，培养基采用营养琼脂培养基(蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL)。经20h培养后，在营养琼脂培养基上菌落为白色，湿润，不透明，边缘不整齐。将菌种ZF02通过镜检观察，该菌株属革兰氏染色阴性，在显微镜下个体形态呈杆状或略弯。该菌具鞭毛，能运动。假单胞菌(Pseudomonassp.)ZF02菌落和个体形态参见附图1。
本发明采用的菌株ZF02可在常见的牛肉膏蛋白胨固体培养基或液体培养基中进行增殖培养。利用常规固体斜面培养、低温保藏的方法，每次传代可保藏3个月以上；以干燥冷冻法制做的长期保藏菌种，可保藏1年以上；或是以甘油管进行长期保藏。
3、菌株ZF02的生理生化鉴定
生理生化特征：该菌株ZF02在牛肉膏蛋白胨液体培养基、营养琼脂培养基上生长良好，经试验，选择生长所需葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖试验，V-P试验、吲哚试验、甲基红试验、运动性试验、接触酶试验、4℃生长试验、水解淀粉试验、明胶液化试验、氧化酶试验、NaCl生长试验等对拮抗细菌进行鉴定，结果表明菌株ZF02可以利用葡萄糖、蔗糖，菌株ZF02生理生化特性具体见表1。
表1：菌株ZF02的生理生化特性
通过上述对于假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013的菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测定、耐性试验等试验，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌鉴定手册》的方法进行，编号为ZF02的菌种尽管与常见的假单胞菌相比，具有共性的一些属性，但是与常见的假单胞菌(Pseudomonas)菌种存在明显的生理生化特性差异性，表明ZF02菌株是一种典型的新菌种，从菌种分类角度将菌种编号为ZF02的菌株综合鉴定为假单胞菌(Pseudomonassp.)。
实施例二：假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013分子水平鉴定
利用细菌DNA基因组快速提取试剂盒提取目标菌系DNA。
引物选用细菌通用引物，细菌16SrDNA通用引物序列：
27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′
本发明所用引物27F、引物1492R、2×TapPCRMaster mix均购自生物生工(上海)有限责任公司。
提取基因组DNA采用的20μLPCR扩增体系：引物27F和引物1492R各1.0μL、2×TapPCRMaster mix7.0μL、内生细菌的DNA混合液1.0μL、双蒸水10.0μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸40s，从变性到延伸30个循环，72℃延伸7min，保温4min。PCR产物经1.8％琼脂糖电泳，EB染色后由荧光-可见光凝胶成像分析系统检测。
以提取的ZF02总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列是具有序列表的核苷酸序列。菌种ZF02的16SrDNA扩增产物的琼脂凝胶电泳约在1500bp处出现荧光条带，参见附图2。
经测定，假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013的16SrDNA基因片段为1439bp，序列提交GenBank数据库，具体序列参见附后的SEQUENCE LISTING。
将测序得到的16S rDNA序列输入NCBI，与NCBI数据库中已知序列进行比对，采用MEGA5.0软件、Clustal W程序进行多重比对，然后以各菌株在NCBI上查询的相近各个种的16S rDNA序列，采用Neighbour-joining方法构建系统发育树，并进行bootstrap分析，重复次数为1000次，参见附图3。菌株ZF02与其16SrDNA序列与NCBI数据库Pseudomonasfluorescens NBRC14160(NR_113647.1)同源性为94％，与该属其他标准菌株序列比对同源性分别为94％(Pseudomonas meridiana CMS 38(NR_025587.1)、94％(Pseudomonasantarctica CMS 35(NR_025586.1))、93％(Pseudomonas grimontii CFML 97-514(NR_025102.1)及93％(Pseudomonas orientalis CFML 96-170(NR_024909.1)。结合ZF02的形态结构特征及生理生化特性，经序列比对表明，初步鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
实施例三：假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013的生长因子
表3：温度、pH、NaCl对菌株ZF02生长的影响
温度(℃) 4 10 15 20 25 30 37 41
生长情况 - + + ++ ++ +++ ++++ ++
pH 4 5 6 7 8 9
生长情况 - - - +++ ++ +
NaCl浓度 5％ 6％ 7％ 8％ 9％ 10％
生长情况 ++ + - - - -
按照如上方式将假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013进行培养，菌种的培养条件为：培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基和营养琼脂培养基，培养条件：pH7.0，温度37℃条件下培养20h。
由表3得出，菌株ZF02最适合生长因子通过以上结果得出将假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013生长的最佳培养温度37℃，最适生长pH为7.0，耐受6％NaCl。
实施例四：假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013对试验指示细菌的抑菌作用
采用双层平板法测定假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02对以下试验指示细菌的抑制作用：A大肠杆菌(Escherichia coli)、B枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、C金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、P白色念珠球菌(Moniliaalbican)：
(1)菌株的活化：分别挑取一环保存于营养琼脂平板上的试验指示细菌划和ZF02，分别线于营养琼脂平板上，37℃下培养20h。
(2)挑取ZF02纯菌落三环接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、150r/min培养72h，将发酵后的菌液经5000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，去除菌体，制成ZF02无菌发酵滤液。
(3)灭菌后的水琼脂15mL倒在直径为9cm的培养皿内，待其凝固，将灭菌的100mL营养琼脂培养基冷却到50℃左右，加入1.25mL含有1×104-1×105cfu/mL试验指示细菌的菌液，摇均，取5mL加到水琼脂平板上；凝固后用打孔器(外径8mm)打孔，孔中加入ZF02菌株无菌发酵滤液240μL，同时在孔中加入240μL无菌水作对照，在4℃冰箱放置2h使无菌发酵滤液扩散，37℃培养18h，测量抑菌圈直径。
由测定结果可知，参见附图4，ZF02菌株对枯草芽孢杆菌有抑菌作用，抑菌圈直径分别为13.56mm，对白色念珠球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有抑制作用。
实施例五：假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC N0：60013对植物病原菌的抑菌作用
采用对峙培养法测定假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02对以下植物病原菌的抑制作用，D梨果黑斑病菌(Alternaria alternate)、E核桃叶枯病菌(Walnut Blight)、F梨腐烂病菌(Valsa ambiens Pers)、G红枣黑斑病菌(Alternaria sp.)、H茄腐镰刀病菌(Fusariumsolani.)、X瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、Y立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：
(1)菌株的活化：挑取一环保存于营养琼脂平板上的ZF02划线于营养琼脂平板上，37℃下培养20h，挑取一环植物病原菌划线于PDA培养基上，28℃下培养5d。
(2)挑取步骤(1)中得到的ZF02纯菌落三环接种于50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、150r/min培养72h，将发酵后的菌液经5000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，去除菌体，制成ZF02无菌发酵滤液。
(3)将内生细菌ZF02无菌发酵滤液200μL涂布于PDA平板上，对照为涂布200μL无菌水，取直径为1×1cm的农林作物病原菌菌块放于PDA平板正中央，28℃培养5d，测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。
菌丝生长抑制率的计算公式如下：
式中，B为对照农林作物病原菌菌落生长直径(mm)；T为涂内生细菌发酵滤液后植物病原菌菌落生长直径(mm)。
由测定结果可知，参见附图5，ZF02菌株对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有较好的抑菌作用，菌丝生长抑制率分别为73.13％，35.75％，61.42％和15.50％，经测定，ZF02对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有很强的抑制效果。
通过上述系列实施例，根据由韩山师范学院从广东省潮州饶平县浮滨镇中凤凰单丛茶树茎中取样，样品为茶树的茎，采集于广东省潮州饶平县浮滨镇，树龄15、25和50年，种植海拔高度750m，茶树品种为凤凰单丛茶水仙，有机种植，经过采用组织块培养法分离出茎中内生细菌，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的细菌菌株，从中优选出一株编号为ZF02的菌株。通过根据以上形态特征，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对菌株进行分类鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。经分子测序结果表明，假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013的16SrDNA基因序列为1439bp，与NCBI数据库Pseudomonasfluorescens NBRC 14160(NR_113647.1)同源性最高，最高相似性为94％，但本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)ZF02GDMCC No：60013与常见的细菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，编号为ZF02的菌种在生理生化特性和分子水平方面与常见的假单胞菌具有明显的差异，是一种典型的新菌种，有别于常见的假单胞菌(Pseudomonas)，与常见的细菌菌种相比，其对梨果黑斑病菌、梨腐烂病菌、立枯丝核菌和瓜果腐霉有较好的抑菌作用，依据菌种生理生化特性分析，分子水平分析及系统分类学的综合鉴定，将编号为ZF02的菌种大致分类归属为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (2)

1.一种凤凰单丛茶树内生拮抗的假单胞菌(Pseudomonas sp.) ZF02，其特征在于，所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.) ZF02的菌种保藏编号为GDMCC No：60013。
2.如权利要求1 所述凤凰单丛茶树内生拮抗的假单胞菌(Pseudomonas sp.) ZF02在防治Alternaria alternate、Valsa ambiens Pers、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）中的应用。
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