CN110452848A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110452848A
CN110452848A CN201910768596.2A CN201910768596A CN110452848A CN 110452848 A CN110452848 A CN 110452848A CN 201910768596 A CN201910768596 A CN 201910768596A CN 110452848 A CN110452848 A CN 110452848A
Authority
CN
China
Prior art keywords
candida albicans
velezensis
albicans
bei laisi
cyclic lipopeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910768596.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110452848B (zh
Inventor
梁小波
陈玮玮
丁冯玲
翟艺
罗扬
韩鹏
易恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kunming University of Science and Technology
Original Assignee
Kunming University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kunming University of Science and Technology filed Critical Kunming University of Science and Technology
Priority to CN201910768596.2A priority Critical patent/CN110452848B/zh
Publication of CN110452848A publication Critical patent/CN110452848A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110452848B publication Critical patent/CN110452848B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FS001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17946，其是从云南野生动物园梅花鹿的粪便样品中分离获得的，该菌株对于临床妇科病人阴道分泌物中的白色念珠菌具有很强的抑制活性，而对其中的光滑念珠菌、毕赤酵母以及热带假丝酵母无抑制活性；该菌株经发酵产生一种含有15个碳原子脂肪酸尾巴与7个氨基酸环的环脂肽；该环脂肽通过抑制白色念珠菌细胞壁β‑（1,3）‑D葡聚糖合成酶活性发挥其对白色念珠菌的特异性抗菌作用；本发明中贝莱斯芽孢杆菌FS001在新型药物开发方面具有广阔的应用前景。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于应用微生物领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FS001及其在白色念珠菌防治中的应用。
背景技术
白色念珠菌（Candida albicans）是人类最主要的致病真菌之一。约25%～50%健康人的口腔、阴道、消化道带有白色念珠菌，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约失调时，就会引起疾病；近年来，随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的使用以及器官移植的普遍发展，白色念珠菌发病率近年来渐趋增高。研究表明，深部白色念珠菌感染病死亡率高达40%。目前，临床上用于治疗白色念珠菌的药物种类较少，长期的预防性治疗和反复给药，促进了白色念珠菌的致病与耐药性白色念珠菌的产生，从而使对白色念珠菌的防治效果越来越差。
微生物产生抗生素与抗菌活性物质的发现与开发是近年来颇受关注的领域，已有多种抗生素与抗菌肽被发现、生产并被应用于多种疾病的防治与治疗。微生物产生的抗菌活性物质具有抗菌机制独特、天然无毒、生产效率高、易于工业化生产等优势。然而对于微生物抑制病原酵母菌白色念珠菌的研究与产品尚鲜有报道。因而寻找具有抑制白色念珠菌活性的微生物并将其应用于相应疾病的预防与治疗是一种研发白色念珠菌疾病防治的新思路。B.velezensis是近年来被发现能够产生抗真菌活性物质，并被用于农业真菌病害生物防治相关研究与应用的新型生物防治微生物，而将其用于人类与动物疾病防治的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株从鹿粪便分离得到的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FS001，该菌株已于2019年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，CGMCC No.17946。
本发明贝莱斯芽孢杆菌是从云南野生动物园梅花鹿的粪便中分离得到，并经过鉴定获得的；该贝莱斯芽孢杆菌的菌落呈白色不透明状，表面有褶皱，边缘不规则；菌体呈短小杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，细胞椭圆形，可以形成芽孢，芽孢中生，革兰氏阳性。
对该菌株16S rRNA基因进行PCR扩增，并进行测序及系统发育分析，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌FS001（Bacillus velezensis FS001）。
本发明另一目的是将上述贝莱斯芽孢杆菌应用在抑制白色念珠菌中。
使用琼脂打孔扩散法测定其抑菌活性，发现本发明的B. velezensis FS001对于白色念珠菌Canidia albicans ATCC90029具有较强抑制活性。
在白色念珠菌细胞的显微观察中发现添加B. velezensis FS001发酵液后白色念珠菌的细胞发生膨大，子细胞不能与母细胞分离乃至细胞裂解死亡。
本发明的B. velezensis FS001对于临床上妇女阴道白色念珠菌具有较强的特异性抑制活性。对妇科病人阴道分泌物中携带的8株白色念珠菌、9株光滑念珠菌、1株毕赤酵母和1株热带假丝酵母进行抑菌实验，结果表明B. velezensis FS001发酵液对所有白色念珠菌均具有较强抑制作用，而对光滑念珠菌、毕赤酵母以及热带假丝酵母无抑制。
本发明的B. velezensis FS001对酿酒酵母无抑制作用。
本发明的B. velezensis FS001对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌无抑制作用。
本发明的B. velezensis FS001对于绿色木霉（Trichoderma viride）、总状毛霉（Mucor racemosus）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）菌具有一定的抑制作用。
本发明B. velezensis FS001的应用，包括将活菌、菌种发酵液用于抑制白色念珠菌的生长与繁殖；本发明应用还可以将该菌株作为活性成分，添加适宜的辅料用于制成粉剂、微胶囊、干混悬剂、栓剂、洗液、喷剂等产品用于抑制白色念珠菌的生长与繁殖。
本发明另一个目的是提供一种产生于贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FS001的环脂肽，对B. velezensis FS001发酵液中抑制白色念珠菌的化合物进行分离纯化后通过结构分析确认该发酵液中的抑菌活性物质为一种环脂肽。
该环脂肽的分子式为C47H74N10O16, 其分子量为1034.528 Da。
该环脂肽的分子中含有一个15个碳原子的脂肪酸链。
该环脂肽的分子中含有7个氨基酸，其中有3个D-氨基酸，4个L-氨基酸。这7个氨基酸与脂肪酸中的羧基碳原子以及α、β碳原子形成一个环状结构。
本发明的环脂肽对白色念珠菌的抑菌机制是特异性抑制了白色念珠菌葡聚糖合成酶活性从而抑制白色念珠菌细胞壁的合成；红外光谱分析白色念珠菌细胞壁β-1,3-D葡聚糖发现B.velezensis FS001处理后的白色念珠菌细胞壁葡聚糖大大减少；提取白色念珠菌的细胞壁葡聚糖合成酶并进行酶活性分析，发现添加环脂肽后该合成酶活性丧失。
本发明的环脂肽性能十分稳定，肽在100℃处理30min后其活性仍然保留90%以上；在pH1-9环境中处理过夜后其活性仍然保留87%以上，尤其在pH4-9之间，处理后的活性均为90%以上。
本发明环脂肽的应用是将环脂肽作为活性成分，可以添加适宜的辅料用于制成粉剂、微胶囊、干混悬剂、栓剂、洗液、喷剂等产品用于抑制白色念珠菌的生长与繁殖。
总之，本发明提供的从梅花鹿粪便中分离得到的贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）FS001以及其产生的特异性抑制白色念珠菌的环脂肽，均具有特异性抑制白色念珠菌的能力，具有较高的应用价值；尤其是能够抑制对氟康唑不敏感或敏感性较低的白色念珠菌，对于研制和开发高效、不易引起耐药性的新型抗白色念珠菌药物，减少临床上唑类药物的使用具有积极意义和广阔的应用前景。
附图说明
图1为B.velezensis FS001的菌落形态图；
图2为B.velezensis FS001的菌体细胞革兰氏染色后的显微照片；
图3为B.velezensis FS001的16S rRNA基因片段PCR扩增结果图；
图4为B.velezensis FS001的系统发育树图；
图5为B.velezensis FS001对临床白色念珠菌的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为B.velezensis FS001发酵液；
图6为正常白色念珠菌细胞的电镜照片；
图7 为B.velezensis FS001发酵液处理过的白色念珠菌细胞的电镜照片；
图8为B.velezensis FS001对临床妇科病人白色念珠菌的特异性抑制作用；
图9为正常白色念珠菌细胞壁β-1,3-D葡聚糖的红外光谱图；
图10为被B.velezensis FS001抑制的白色念珠菌细胞壁β-1,3-D葡聚糖的红外光谱图。
图11 为白色念珠菌中细胞壁β-1,3-D葡聚糖合成酶活性的测定；
图12为B.velezensis FS001产生的环脂肽在不同温度下的稳定性；
图13 为B.velezensis FS001产生的环脂肽在不同pH下的稳定性。
图14为B.velezensis FS001对酿酒酵母的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为B.velezensis FS001发酵液；
图15为B.velezensis FS001对大肠杆菌的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为B.velezensis FS001发酵液；
图16为B.velezensis FS001对金黄色葡萄球菌的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为B.velezensis FS001发酵液；
图17 为B.velezensis FS001对绿色木霉的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为B.velezensis FS001发酵液；
图18为B.velezensis FS001对总状毛霉的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为B.velezensis FS001发酵液；
图19 为B.velezensis FS001对尖孢镰刀菌的抑制作用图；其中a为空白培养基对照，b为B.velezensis FS001发酵液。
具体实施方式
本发明中涉及到的主要材料、试剂和仪器设备：供试病原菌采用白色念珠菌ATCC90029（Candida albicans ATCC90029），购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。鹿的粪便样品采自云南野生动物园，取样后低温保存，至实验室进行分离；培养基采用LB培养基（氯化钠1%（w/v），胰蛋白胨1%（w/v）），酵母膏0.5%（w/v），琼脂1.5%（w/v））；BPH-9082型恒温培养箱，BXM-30R型高压自动灭菌锅，SW-CJ-1F型超净工作台，Thermo X1R小型台式高速冷冻离心机，THZ-100B型恒温摇床，Tprofessional梯度PCR仪，DYY-6C，DYCP-31E/31BN型DNA电泳系统，Bio-rad Geldoc XR+凝胶成像系统，奥林巴斯BX53研究型生物显微镜，德国布鲁克（Bruker）ALPHA红外光谱仪，其余试剂均为分析纯。
本发明中选用的主要材料、试剂和仪器设备都为本领域所熟知，其他领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、B.velezensis FS001的分离、筛选及鉴定
1、菌株的分离
梯度稀释分离菌株：取鹿的粪便样品10g，放入装有90mL无菌水的锥形瓶中，37℃，200rpm振荡30min，之后用无菌水进行梯度稀释，各取0.1mL稀释液（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）分别涂布于LB平板上，37℃培养箱中培养24h，对平板上长出的菌落进行划线纯化。
2、菌株的鉴定
（1）形态观察
参见图1，获得的有抑制白色念珠菌活性的菌株，在LB平板上35℃条件下，培养20-24h，菌落中等大小，呈白色不透明状，表面有褶皱，边缘不整齐；挑取单菌落，置载玻片上的生理盐水中，涂匀，风干后进行固定，经革兰氏染色后观察菌体形态。观察结果（图2）表明菌体呈短小杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，革兰氏阳性，染色均匀，可以形成芽孢，芽孢中生，椭圆形。
（2）生理生化性质鉴定
依照第九版《伯杰氏系统细菌学手册》（<Bergey's Manual of SystematicBacteriology>）和《常用细菌系统鉴定手册》对有抑制白色念珠菌活性的菌株的生理生化性质进行鉴定。结果如表1所示，表明该菌是一株芽孢杆菌（Bacillus），命名为FS001。
（3）PCR扩增FS001的16S rDNA序列及其测序
根据引物设计的原则，通过软件Vector NTI设计PCR引物；引物如下：
引物1（F）：5＇-caagtcgagcggacagatgggagct-3＇
引物2（R）：5＇-acctgcggctggatcacctcctt-3＇
以菌株FS001的总DNA为模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增反应；PCR反应体系为50µL，PCR反应条件为：95℃ 0.5min，55℃ 0.5min，72℃ 1.5min，共30个循环；反应结束后取2μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外检测在1500bp附近有一条明显的条带（图3）。
（4）16S rDNA序列比对及系统发育分析
将测序得到的16S rDNA序列与NCBI数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取同源性相近的16S rDNA序列，用MEGA 7.0中的邻位相连法（Neighbor-joining）构建系统发育树。
经过序列分析，目标片段长1492bp如SEQ ID NO:1所示；将FS001的16S rDNA序列进行BLAST分析，结果显示，FS001与菌株B.velezensis DSYZ的同源性最高。构建系统发育树发现（图4），FS001与B.velezensis DSYZ之间的进化距离最短，结合FS001的形态特征及生理生化特征，确定其为贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）。
实施例2：B.velezensis FS001对白色念珠菌以及妇科临床病人白色念珠菌的特异性抑制活性
B.velezensis FS001在LB固体培养基上划线培养进行活化，35℃培养24h后，挑取单菌落接种到装有50mL最适生长培养基的250mL的锥形瓶中，在35℃，摇床转速250rpm的条件下培养24h。用离心机10000rpm离心20min，收集上清液。将上清液用0.22μm的无菌滤膜过滤，得到FS001发酵的无细胞上清液。
采用琼脂扩散法，将白色念珠菌ATCC90029在马铃薯葡萄糖肉汤培养基上培养至对数期，以5%的添加量将菌液加入灭菌的PDA培养基中，混匀后倒平板；用8mm打孔器在平板上打孔，然后在孔中加入0.1mL的B.velezensis FS001发酵的无细胞上清液，空白对照为未发酵培养基；将平板置于28℃培养，2天后观察白色念珠菌生长情况，记录透明圈直径。结果见图5，由图可见B.velezensis FS001发酵无菌上清液对白色念珠菌具有较强的抗菌活性。
将过夜培养的白色念珠菌按照1：100稀释度分别接种在PDA液体培养基和含有FS001发酵无菌上清液的PDA液体培养基中，28℃培养8h后，取对照白色念珠菌与FS001发酵无菌上清液处理后的白色念珠菌细胞于电子显微镜下观察；发现对照白色念珠菌细胞完整、卵圆形有小突起（图6）；而经FS001发酵无菌上清液处理后的白色念珠菌细胞破碎明显（图7）。
从23个临床病人阴道分泌物样品中分离得到19株菌，采用琼脂扩散法测定FS001发酵无菌上清液对其抗菌活性，同时通过18S rDNA序列分析对这19株菌进行鉴定；结果表明FS001发酵无菌上清液对所有8株白色念珠菌均具有较强抗菌活性，而对与之相近的所有9株光滑念珠菌（Candida glabrata）没有抗菌活性，对毕赤酵母（Pichia cecembensis 16）与热带假丝酵母（Candida tropicalis 79）也没有抗菌活性（图8）。
实施例3：B.velezensis FS001发酵液抗白色念珠菌活性物质的分离纯化与鉴定
将B.velezensis FS001无菌发酵上清液真空冷冻干燥后，用甲醇浸提1-2h后减压蒸发，所得的蒸发残留物甲醇溶解，即得到粗提物。
粗提物用C18色谱柱经过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步纯化后收集活性峰冷冻干燥。重蒸水溶解干燥物后经LC-MS-ddMS2分析得到活性物质的离子流谱图；通过质谱分析得到活性物的分子量为1034.528 Da；
对质谱结果进行解谱分析，确定其分子式为C47H74N10O16；进一步分析二级质谱的特征基团确定FS001产生的抗菌物质为含有15个碳原子脂肪酸尾巴的环脂肽，其结构如下式所示：
。
实施例4：B.velezensis FS001产生的环脂肽对白色念珠菌细胞壁葡聚糖含量的影响
在白色念珠菌ATCC90029中加入经纯化的环脂肽后，在28℃、180r/min培养24h；收集细胞并冻干；白色念珠菌细胞壁β-(1-3)-D葡聚糖通过1M氢氧化钠和0.5M乙酸反复处理，用无水乙醇反复脱水后得到难溶于水、酸和碱的多糖，即为白色念珠菌细胞壁β-(1,3)-D葡聚糖；对提取的白色念珠菌细胞壁β-(1,3)-D葡聚糖用KBr压片做红外光图谱，对照未处理白色念珠菌细胞壁葡聚糖（图9）和加入环脂肽的白色念珠菌细胞壁葡聚糖红外光谱（图10），结果表明环脂肽处理过的白色念珠菌细胞壁葡聚糖含量大大降低。
实施例5：B.velezensis FS001产生的环脂肽对白色念珠菌细胞壁葡聚糖合成酶活性的影响
收集培养至对数期的白色念珠菌ATCC90029菌体细胞，使用真菌/酵母β-(1,3)-D葡聚糖合成酶活性比色法定量检测试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司）提取菌体细胞中的β-(1,3)-D葡聚糖合成酶，添加FS001产生的环脂肽、酶反应底物进行反应，以无环脂肽的缓冲液为对照。使用同样试剂盒测定环脂肽对白色念珠菌葡聚糖合成酶活性的影响。结果显示添加了环脂肽的白色念珠菌细胞壁β-（1,3）-D葡聚糖合成酶丧失了酶活性（图11）。
实施例6：B.velezensis FS001产生的环脂肽的稳定性分析
1、温度稳定性
提取的环脂肽分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃、120℃处理30min，然后迅速置于冰上；处理后的样品通过琼脂扩散的方法，用白色念珠菌ATCC90029为测试菌进行抗菌活性的测试，结果发现环脂肽在低于80℃时抗菌活性基本不变，在100℃处理后其活性仍然剩余90%（图12）。
2、pH稳定性
提取的环脂肽分别置于pH 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14的缓冲液中，4℃处理过夜，然后将pH值调节至7；处理后的样品通过琼脂扩散的方法，用白色念珠菌ATCC90029为测试菌进行抗菌活性的测试。结果发现在pH1-9范围内，环脂肽抗菌活性均保持在90%以上，当pH大于9时，其抗菌活性急剧下降（图13）。
实施例7：B.velezensis FS001对其他菌株的抑制活性
本实施例采用琼脂扩散法检测了B. velezensis FS001对酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿色木霉、总状毛霉、尖孢镰刀菌的抑制活性，具体如下:
琼脂扩散法（酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）：将酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别在培养基上（其中酿酒酵母使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌使用LB琼脂培养基）培养至对数期，并分别以5%的添加量将菌液加入灭菌的培养基（其中酿酒酵母使用PDA，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌使用LB）中，混匀后倒平板；用8mm打孔器在平板上打孔，然后在孔中加入0.1mL的B.velezensis FS001发酵的无细胞上清液，空白对照为未发酵培养基；将平板置于恒温培养箱中（其中酿酒酵母在28℃，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37℃）培养，2天后观察菌株生长情况，记录透明圈直径；结果见图14，图15和图16，由图可见B.velezensis FS001发酵无菌上清液对酿酒酵母、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无抗菌活性。
琼脂扩散法（绿色木霉、总状毛霉、尖孢镰刀菌）：将绿色木霉、总状毛霉、尖孢镰刀菌分别在PDA培养基上培养2天后，用8mm打孔器在平板上打孔，然后在孔中加入0.1mL的B.velezensis FS001发酵的无细胞上清液，空白对照为未发酵培养基，再将平板置于28℃培养箱培养，3-5天后观察真菌生长情况，记录抑菌圈直径并拍照，结果见图17，图18和图19，由图可见B.velezensis FS001发酵无菌上清液对绿色木霉、总状毛霉、尖孢镰刀菌有较好的抗菌活性。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1492
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌FS001(Bacillus velezensis FS001)
<400> 1
caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60
acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aatagcggat 120
ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 180
acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc 240
gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300
cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360
tgaaggtttt cggatcgtaa ggctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg 420
gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa 600
cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg 660
gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc 720
gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780
tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840
gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900
tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc 960
ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080
agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca 1200
aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc 1260
agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc 1380
cgaagtcggt gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg 1440
tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa cctgcggctg gatcacctcc tt 1492
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
caagtcgagc ggacagatgg gagct 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
acctgcggct ggatcacctc ctt 23

Claims (5)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FS001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17946。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在抑制白色念珠菌（Candida albicans）中的应用。
3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在抑制绿色木霉（Trichoderma viride）、总状毛霉（Mucor racemosus）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中的应用。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌产生的环脂肽，其特征在于：分子式为C47H74N10O16,其分子量为1034.528 Da，该环脂肽的分子中含有一个15个碳原子的脂肪酸链、7个氨基酸，7个氨基酸与脂肪酸中的羧基碳原子以及α、β碳原子形成一个环状结构；其结构式如下式所示：
。
5.权利要求4所述的环脂肽在抑制白色念珠菌（Candida albicans）中的应用。
CN201910768596.2A 2019-08-20 2019-08-20 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用 Active CN110452848B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910768596.2A CN110452848B (zh) 2019-08-20 2019-08-20 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910768596.2A CN110452848B (zh) 2019-08-20 2019-08-20 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110452848A true CN110452848A (zh) 2019-11-15
CN110452848B CN110452848B (zh) 2022-04-15

Family

ID=68487791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910768596.2A Active CN110452848B (zh) 2019-08-20 2019-08-20 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110452848B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057656A (zh) * 2019-12-02 2020-04-24 轻工业环境保护研究所 一种高效降解冰激凌生产废液的酵母菌及其应用
CN111979157A (zh) * 2020-09-02 2020-11-24 青海省农林科学院 一种马铃薯干腐病拮抗菌jz3-1-15及其应用
CN114317317A (zh) * 2021-10-27 2022-04-12 沈阳农业大学 一株耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌及应用
CN114381403A (zh) * 2022-01-21 2022-04-22 中山大学 一种贝莱斯芽孢杆菌loh112及其应用
CN114395509A (zh) * 2022-01-26 2022-04-26 杭州师范大学 一种从温郁金中分离的芽孢杆菌wyj-e14及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN116082470A (zh) * 2022-12-12 2023-05-09 南京工业大学 一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用
WO2023124450A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 鹤山市新的生物制品有限公司 一株贝莱斯芽孢杆菌株及其应用
CN116622683A (zh) * 2023-03-27 2023-08-22 昆明理工大学 一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途

Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100781300B1 (ko) * 2006-03-02 2007-11-30 (주)바이오쉴드 신규한 바실러스속 미생물균주를 이용한 딸기 시들음병방제용 미생물제제 및 그 제조방법
US20080233093A1 (en) * 2007-03-23 2008-09-25 Novozymes Biologicals, Inc. Preventing and Reducing Biofilm Formation and Planktonic Proliferation
US20100008893A1 (en) * 2008-07-11 2010-01-14 Novozymes A/S Bacillus velezensis strain
KR20100055625A (ko) * 2008-11-18 2010-05-27 한국화학연구원 바실러스 벨레젠시스 ｓ3-5 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법
CN102060914A (zh) * 2009-11-13 2011-05-18 华东理工大学 海洋芽孢杆菌b-9987产脂肽类化合物及其制备和应用
KR20120010017A (ko) * 2010-07-23 2012-02-02 대한민국(농촌진흥청장) 다기능 신규 균주 바실러스 벨리젠시스 비42
WO2014038216A1 (ja) * 2012-09-10 2014-03-13 三菱レイヨン株式会社 メタクリル酸及び／又はそのエステルの製造方法
CN103844210A (zh) * 2012-11-30 2014-06-11 Cj第一制糖株式会社 传统豆饼的制备方法
CN105087423A (zh) * 2014-05-16 2015-11-25 Cj第一制糖株式会社 新型芽孢杆菌cjbv及含有其的抗菌组合物
CN105132508A (zh) * 2015-09-28 2015-12-09 昆明理工大学 一种生物磁分离筛选抗真菌活性抗菌肽的方法
KR20160059474A (ko) * 2016-05-12 2016-05-26 씨제이제일제당 (주) 신규한 바실러스 벨레젠시스 cjbv 및 이를 포함하는 항균 조성물
CN106520591A (zh) * 2016-09-18 2017-03-22 贵州医科大学 一种促生芽孢杆菌及其应用
WO2017139510A1 (en) * 2016-02-09 2017-08-17 Cool Planet Energy Systems, Inc. Biochars for use in composting
WO2018093199A2 (ko) * 2016-11-18 2018-05-24 주식회사 제일그린산업 바실로펩틴 계열의 고리형 리포펩타이드를 생산하는 신규 미생물 바실러스 오리지콜라 yc7011 및 이를 포함하는 미생물 제제
CN108374030A (zh) * 2018-01-18 2018-08-07 昆明理工大学 一种尖孢镰刀菌胞外多糖的制备方法及应用
CN108611388A (zh) * 2018-04-11 2018-10-02 大连民族大学 一种提高解淀粉芽孢杆菌q-426环脂肽类抗生素产量的方法
CN109055281A (zh) * 2018-09-19 2018-12-21 北京化工大学 贝莱斯芽胞杆菌zf2及其在植物病害防治中的应用
CN109123264A (zh) * 2018-08-29 2019-01-04 昆明理工大学 一种活菌型罗伊氏乳杆菌发酵果汁饮料及其制备方法
US10322389B2 (en) * 2014-10-01 2019-06-18 Cool Planet Energy Systems, Inc. Biochar aggregate particles
EP3524670A1 (en) * 2016-10-07 2019-08-14 Idemitsu Kosan Co., Ltd Method for culturing bacillus bacterium, and method for producing useful substance
CN110229856A (zh) * 2019-06-19 2019-09-13 光明乳业股份有限公司 一种环脂肽类抗生素Fusaricidin B的制备方法
CN110272854A (zh) * 2019-07-29 2019-09-24 北京林业大学 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
US20200040300A1 (en) * 2016-10-07 2020-02-06 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Method for culturing spore-forming bacteria, and method for producing useful substance
CN110982724A (zh) * 2018-09-29 2020-04-10 福建省农业科学院农业生物资源研究所 一种拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌及其应用
CN111567563A (zh) * 2020-06-22 2020-08-25 上海市农业科学院 一种玉米微生物种衣剂及其制备方法
WO2020206518A1 (pt) * 2019-04-10 2020-10-15 Agrivalle Brasil Industria E Comércio De Produtos Agrícolas Ltda Composições biológicas de funções múltiplas
CN108753664B (zh) * 2018-06-28 2021-03-26 广东省农业科学院农业资源与环境研究所 一种生物防治剂、生物有机肥及其应用

Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100781300B1 (ko) * 2006-03-02 2007-11-30 (주)바이오쉴드 신규한 바실러스속 미생물균주를 이용한 딸기 시들음병방제용 미생물제제 및 그 제조방법
US20080233093A1 (en) * 2007-03-23 2008-09-25 Novozymes Biologicals, Inc. Preventing and Reducing Biofilm Formation and Planktonic Proliferation
CN101679087A (zh) * 2007-03-23 2010-03-24 诺维信生物股份有限公司 防止和减少生物膜形成与浮游增殖
US20100008893A1 (en) * 2008-07-11 2010-01-14 Novozymes A/S Bacillus velezensis strain
KR20100055625A (ko) * 2008-11-18 2010-05-27 한국화학연구원 바실러스 벨레젠시스 ｓ3-5 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법
CN102060914A (zh) * 2009-11-13 2011-05-18 华东理工大学 海洋芽孢杆菌b-9987产脂肽类化合物及其制备和应用
KR20120010017A (ko) * 2010-07-23 2012-02-02 대한민국(농촌진흥청장) 다기능 신규 균주 바실러스 벨리젠시스 비42
WO2014038216A1 (ja) * 2012-09-10 2014-03-13 三菱レイヨン株式会社 メタクリル酸及び／又はそのエステルの製造方法
CN104769123A (zh) * 2012-09-10 2015-07-08 三菱丽阳株式会社 甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法
CN103844210A (zh) * 2012-11-30 2014-06-11 Cj第一制糖株式会社 传统豆饼的制备方法
CN105087423A (zh) * 2014-05-16 2015-11-25 Cj第一制糖株式会社 新型芽孢杆菌cjbv及含有其的抗菌组合物
US10322389B2 (en) * 2014-10-01 2019-06-18 Cool Planet Energy Systems, Inc. Biochar aggregate particles
CN105132508A (zh) * 2015-09-28 2015-12-09 昆明理工大学 一种生物磁分离筛选抗真菌活性抗菌肽的方法
WO2017139510A1 (en) * 2016-02-09 2017-08-17 Cool Planet Energy Systems, Inc. Biochars for use in composting
KR20160059474A (ko) * 2016-05-12 2016-05-26 씨제이제일제당 (주) 신규한 바실러스 벨레젠시스 cjbv 및 이를 포함하는 항균 조성물
CN106520591A (zh) * 2016-09-18 2017-03-22 贵州医科大学 一种促生芽孢杆菌及其应用
US20200040300A1 (en) * 2016-10-07 2020-02-06 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Method for culturing spore-forming bacteria, and method for producing useful substance
EP3524670A1 (en) * 2016-10-07 2019-08-14 Idemitsu Kosan Co., Ltd Method for culturing bacillus bacterium, and method for producing useful substance
EP3524669A4 (en) * 2016-10-07 2020-05-06 Idemitsu Kosan Co., Ltd METHOD FOR CULTURING SPORTED BACTERIA AND METHOD FOR PRODUCING A USEFUL SUBSTANCE
WO2018093199A2 (ko) * 2016-11-18 2018-05-24 주식회사 제일그린산업 바실로펩틴 계열의 고리형 리포펩타이드를 생산하는 신규 미생물 바실러스 오리지콜라 yc7011 및 이를 포함하는 미생물 제제
CN108374030A (zh) * 2018-01-18 2018-08-07 昆明理工大学 一种尖孢镰刀菌胞外多糖的制备方法及应用
CN108611388A (zh) * 2018-04-11 2018-10-02 大连民族大学 一种提高解淀粉芽孢杆菌q-426环脂肽类抗生素产量的方法
CN108753664B (zh) * 2018-06-28 2021-03-26 广东省农业科学院农业资源与环境研究所 一种生物防治剂、生物有机肥及其应用
CN109123264A (zh) * 2018-08-29 2019-01-04 昆明理工大学 一种活菌型罗伊氏乳杆菌发酵果汁饮料及其制备方法
CN109055281A (zh) * 2018-09-19 2018-12-21 北京化工大学 贝莱斯芽胞杆菌zf2及其在植物病害防治中的应用
CN110982724A (zh) * 2018-09-29 2020-04-10 福建省农业科学院农业生物资源研究所 一种拮抗植物病原菌和促生根的芽孢杆菌及其应用
WO2020206518A1 (pt) * 2019-04-10 2020-10-15 Agrivalle Brasil Industria E Comércio De Produtos Agrícolas Ltda Composições biológicas de funções múltiplas
CN110229856A (zh) * 2019-06-19 2019-09-13 光明乳业股份有限公司 一种环脂肽类抗生素Fusaricidin B的制备方法
CN110272854A (zh) * 2019-07-29 2019-09-24 北京林业大学 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
CN111567563A (zh) * 2020-06-22 2020-08-25 上海市农业科学院 一种玉米微生物种衣剂及其制备方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOYUN ZHANG等: ""Lipopeptides, a novel protein, and volatile compounds contribute the antifungal activity of the biocontrol agent Bacillus atrophaeus CAB-1"", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
ZHIYUN LIU等: ""Bacillus velezensis DP-2 isolated from Douchi and its application in soybean meal fermentation"", 《J SCI FOOD AGRIC》 *
ZONGWANG MA等: ""NMR spectroscopic and MS/MS spectrometric characterization of a new lipopeptide antibiotic bacillopeptin B1 produced by a marine sediment derived Bacillus amyloliquefaciens SH-B74"", 《THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS 》 *
刘雪娇等: ""贝莱斯芽孢杆菌3A3-15生防和促生机制"", 《河北大学学报（自然科学版）》 *
张德锋等: ""贝莱斯芽孢杆菌的分类、拮抗功能及其应用研究进展"", 《微生物学通报》 *
陶永梅等: ""新型生防微生物因子贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的研究与应用"", 《中国植保导刊》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057656B (zh) * 2019-12-02 2021-11-09 轻工业环境保护研究所 一种高效降解冰激凌生产废液的酵母菌及其应用
CN111057656A (zh) * 2019-12-02 2020-04-24 轻工业环境保护研究所 一种高效降解冰激凌生产废液的酵母菌及其应用
CN111979157B (zh) * 2020-09-02 2022-05-20 青海省农林科学院 一种马铃薯干腐病拮抗菌jz3-1-15及其应用
CN111979157A (zh) * 2020-09-02 2020-11-24 青海省农林科学院 一种马铃薯干腐病拮抗菌jz3-1-15及其应用
CN114317317A (zh) * 2021-10-27 2022-04-12 沈阳农业大学 一株耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌及应用
CN114317317B (zh) * 2021-10-27 2023-05-26 沈阳农业大学 一株耐盐并高产脂肽的贝莱斯芽孢杆菌及应用
WO2023124450A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 鹤山市新的生物制品有限公司 一株贝莱斯芽孢杆菌株及其应用
CN114381403A (zh) * 2022-01-21 2022-04-22 中山大学 一种贝莱斯芽孢杆菌loh112及其应用
CN114381403B (zh) * 2022-01-21 2023-06-30 中山大学 一种贝莱斯芽孢杆菌loh112及其应用
CN114395509A (zh) * 2022-01-26 2022-04-26 杭州师范大学 一种从温郁金中分离的芽孢杆菌wyj-e14及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN114395509B (zh) * 2022-01-26 2023-06-30 杭州师范大学 一种从温郁金中分离的芽孢杆菌wyj-e14及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN116082470A (zh) * 2022-12-12 2023-05-09 南京工业大学 一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用
CN116082470B (zh) * 2022-12-12 2023-08-15 南京工业大学 一种贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用
CN116622683A (zh) * 2023-03-27 2023-08-22 昆明理工大学 一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN110452848B (zh) 2022-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110452848A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用
US11459593B2 (en) Dendrobium officinale endophytic fungus strain and extracellular polysaccharide produced thereby, and extraction method and application of extracellular polysaccharide
CN112899201B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌及其应用以及防治香蕉枯萎病的方法
CN107099467B (zh) 一株铜绿假单胞菌xcs007及其在防治烟草黑胫病中的应用
CN102242069B (zh) 一种蝉拟青霉菌株及其应用
CN104946574B (zh) 一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C
CN111718881B (zh) 一种暹罗芽孢杆菌及其应用
CN111040976B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN110004095A (zh) 一种短小芽孢杆菌抗菌活性物质的制备方法及应用
CN110452832A (zh) 一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5及其应用
CN112080441A (zh) 一种抗镰刀菌贝莱斯芽孢杆菌及其分离筛选方法
CN114381403B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌loh112及其应用
CN103013852A (zh) 一种对黄瓜疫霉菌有抑制作用的放线菌及其筛选方法
CN112011478A (zh) 一种石斛内生唐菖蒲伯克霍尔德氏菌BL-HTie-5及其应用
CN105779346B (zh) 一种产细菌素的屎肠球菌及其应用
CN113025522B (zh) 解淀粉芽孢杆菌及其应用以及预防和/或治疗香蕉枯萎病的方法
CN104630111B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其活性代谢产物的分离方法与应用
CN108823101B (zh) 一株花青素产生菌株ch18及其应用
CN110804566B (zh) 防治七叶一枝花根腐病的芽孢杆菌及其制备方法与应用
CN116536195A (zh) 克劳氏盐碱芽孢杆菌及其在制备有机微生物菌肥中的应用
CN115197853B (zh) 内生菌Epicoccum thailandicum LF-28菌株及其应用
CN108102992B (zh) 一株金橙黄微小杆菌及其在防治番茄根结线虫中的应用
CN108315266B (zh) 蝉拟青霉及应用
CN114958660B (zh) 一种多粘类芽孢杆菌菌株及其应用
CN110699288A (zh) 防治马铃薯黑痣病的解淀粉芽孢杆菌菌株及菌剂和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant