CN111567563A - 一种玉米微生物种衣剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种玉米微生物种衣剂及其制备方法，包括活性成分和助剂，以解淀粉芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌作为活性成分；助剂以水为介质，以海藻酸钠和聚乙烯醇作为成膜剂，添加了增稠剂、防腐剂和着色剂，获得的玉米微生物种衣剂不含杀菌剂，在拮抗病原菌生长的同时，具有良好的促生作用，能够促进玉米种子萌发，促进玉米的苗期生长，该种衣剂高效低毒、安全可靠，符合绿色农业的发展需求，制备方法简单易行，具有重要的实用价值。

Description

一种玉米微生物种衣剂及其制备方法

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种玉米微生物种衣剂及其制备方法。

背景技术

玉米是我国主要的粮食之一，因其含有丰富的粗纤维、维生素、微量元素和大量的蛋白质等而具有很高的经济发展前景和研究价值。随着玉米重要地位的提升，提高玉米的品质和总产量已经成为我国农业发展的重要研究方向。

影响玉米产量的重要原因之一是土传病害的侵染，而抑制病害的发生也成为提高玉米产量的关键。种衣剂是将一种或多种活性成分、粘合剂和着色剂结合的组合物，在种子消毒、缓释药肥、防治病虫鼠害、提高作物抗逆性和降低环境污染等方面均发挥着重要作用。

目前，种子包衣技术应用范围较窄，主要应用于农作物，而适用于花卉、蔬菜的种衣剂类型却很少。我国种子包衣技术较国外发展缓慢，种衣剂容易出现物理稳定性差、成膜时间长、缓释作用差、农药利用率低、包衣脱落率和均匀度差、高毒高残留、操作不安全、相对易产生包衣药害等问题，影响种子包衣技术推广和应用。

生物种衣剂是以生物制剂为有效成份的一种新型种衣剂，含有对作物有效益的微生物或其分泌物，如木霉菌、根瘤菌，固氮菌等，根据生物菌类之间的拮抗原理，筛选有益的拮抗菌，以抵抗有害病菌的繁殖、侵害而达到防病的目的，这一类型的种衣剂低毒低残留，符合环保要求。

现有生物种衣剂存在的问题主要有：(1)功能比较单一，缺乏针对性，对于一些特殊农作物或者特殊地区，常用的包衣剂起到的效果一般；(2)包衣方法较少，一般都是均一型包衣，且包衣率低，外面的薄膜容易脱落，导致里面的活性成分流出，活性成分受环境影响较大，降低种衣剂的田间效果；(3)包衣种子难以储存，长时间储存会降低种子包衣剂的作用。

目前市场上所使用的玉米种衣剂大多数是农药型种衣剂，许多产品存在药剂老化、性状不稳定、包衣脱落率高等问题，微生物在玉米种衣剂上的应用比较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米微生物种衣剂及其制备方法，选用了合适的菌株，结合满足一定复配种类及比例的复合型成膜剂，获得的玉米微生物种衣剂在拮抗病原菌生长的同时，兼具促进玉米苗期生长的作用，该种衣剂高效低毒、安全可靠，制备方法简单易行，具有重要的实用价值。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种玉米微生物种衣剂，包括活性成分和助剂，所述活性成分为含菌量大于等于10⁷cfu·mL^-1的解淀粉芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌菌液；

所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TXM-1，于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19548；

所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-2，于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19549；

所述助剂以水为介质，包括成膜剂、增稠剂、防腐剂和着色剂，其中，所述成膜剂由海藻酸钠和聚乙烯醇组成，两者的质量比为海藻酸钠：聚乙烯醇＝3：7-1：9。

又，所述活性成分与助剂的用量为所述菌液：水＝0.9-1：1，体积比。

优选地，所述助剂中，成膜剂8-10wt％，增稠剂0.45-0.5wt％，防腐剂0.08-0.1wt％，着色剂0.45-0.5wt％，其余为水。

又，所述增稠剂为膨润土、羧甲基纤维素钠、明胶、琼脂或淀粉；所述防腐剂为苯甲酸钠、或山梨酸钾；所述着色剂为着色珠光粉、水溶性伊红或玫瑰精。

本发明提供所述玉米微生物种衣剂的制备方法，包括以下步骤：

1)按比例称取各原料，将成膜剂的组分海藻酸钠和聚乙烯醇与增稠剂加入水中，加热溶解成粘稠状混合物后冷却至40～50℃；

2)再加入防腐剂和着色剂，混合搅拌均匀，最后加入活性成分，充分混合搅拌均匀；搅拌均匀后即制得呈粘稠液体状的种衣剂。

一种抑制玉米病原菌的菌株，其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TXM-1，于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19548；所述贝莱斯芽孢杆菌TXM-1的IAA产量为10μg·mL^-1以内，其产铁载体能力为10个活性单位。

一种抑制玉米病原菌的菌株，其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)TXM-2，于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19549；所述解淀粉芽孢杆菌TXM-2的IAA产量为10μg·mL^-1以内，其产铁载体能力为15.8个活性单位。

本发明提供所述抑制玉米病原菌的菌株在玉米微生物种衣剂中的应用，所述病原菌为茎腐病原菌、稻瘟病原菌、尖孢镰刀菌和玉米大斑病病原菌。

本发明提供所述玉米微生物种衣剂在玉米包衣中的应用。

本发明根据生物菌类之间的拮抗原理，筛选对玉米有益的拮抗菌作为种衣剂的活性成分，抵抗有害病菌的生长，从而达到防病目的，本发明的微生物种衣剂适用于防治玉米茎腐病、玉米大斑病、稻瘟病、枯萎病等病害，所选用的菌株具有良好的产铁载体能力、产IAA能力，在拮抗玉米茎腐病病原菌的同时可对玉米的苗期生长有促进作用，在玉米种植中具有替代化学种衣剂的潜力。

本发明从菌株的活性、玉米种子的发芽率和苗期生长等不同阶段进行分析考察，对于成膜剂的比例参数进行了筛选，本发明的成膜剂中，将海藻酸钠和聚乙烯醇的质量比控制在3：7-1：9，海藻酸钠含有大量的羟基和羧基，可与聚乙烯醇里面的羟基结合形成较稳定的氢键，从而膜的性能更加稳定；成膜剂中两种组分之间的配比，还影响到种衣剂菌株的活菌数和活性维持时间，从而影响玉米种子的萌发和生长。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明用微生物替代传统以农药为主要活性成分，以玉米病原菌的拮抗菌株为活性成分，本发明分离出的两种菌株在种衣剂中，活性维持时间长，可达2个月，降低了玉米茎腐病、稻瘟病、玉米大斑病等的发病率，安全无毒，符合绿色农业的发展需求。

本发明的微生物种衣剂成膜时间短，粘度适中，包衣脱落率低，酸碱度适宜，pH6.8-8.72，成膜时间在5分钟以内，包衣均匀度高，性状较稳定，包衣均匀度达到90％以上，包衣脱落率均在7％以内。

本发明的微生物种衣剂在具有良好的促生作用，能够促进玉米种子萌发，促进玉米的苗期生长，与裸种相比，经过本发明的微生物种衣剂包衣的玉米种子，根长提高了40％以上，茎长提高25％以上，地上株高提高18％以上，鲜重提高了72％以上，干重提高了60％以上。

本发明的新型环保种衣剂以生物制剂为有效成份，含有对作物有效益的微生物或其分泌物，不含杀菌剂，对环境友好，增稠剂、防腐剂和着色剂均采用低添加量方式，制备方法简单，使用方便，安全可靠，具有较好的应用潜力和价值。

附图说明

图1-2为本发明实施例中的玉米苗期生长情况对比图，其中，CK为种子未经处理的玉米生长情况，BSCA-1和BSCA-2为种子经本发明实施例的微生物种衣剂处理的玉米生长情况。

图3为本发明实施例中的菌株TXM-2与玉米茎腐病病原菌拮抗平板。

图4为本发明实施例中的菌株TXM-1与玉米茎腐病病原菌拮抗平板。

图5为本发明实施例中的菌株促生特性测定结果图。

图6为本发明实施例中包衣处理后种子的发芽率和种子活力指数图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1本发明的玉米微生物种衣剂及其制备方法

1、种衣剂BSCA-1的配方

活性成分：贝莱斯芽孢杆菌TXM-1菌液≥10⁷cfu·mL^-1；

助剂：100毫升水中，添加成膜剂10g、增稠剂0.5g、防腐剂0.1g、着色剂0.5g；其中，所述成膜剂由海藻酸钠和聚乙烯醇组成，SA：PVA＝1：9，增稠剂为膨润土，防腐剂为苯甲酸钠；

所述贝莱斯芽孢杆菌菌液与助剂中的水体积比为1：1。

2、种衣剂BSCA-2的配方

活性成分：解淀粉芽孢杆菌TXM-2菌液≥10⁷cfu·mL^-1；

助剂：成膜剂10wt％、增稠剂0.5wt％、防腐剂0.1wt％、着色剂0.5wt％；其中，所述成膜剂由海藻酸钠和聚乙烯醇组成，SA：PVA＝1：9，增稠剂为膨润土，防腐剂为苯甲酸钠；

所述解淀粉芽孢杆菌TXM-2菌液与助剂中的水体积比为1：1。

3、制备方法

按照上述玉米微生物种衣剂的配方比例称取各原料，海藻酸钠与聚乙烯醇按照1：9混合作为成膜剂，向成膜剂中加入增稠剂及无菌水，沸水浴直至溶解，成粘稠状，冷却至40～50℃；

再按照比例加入防腐剂和着色剂，混合搅拌均匀，最后加入活性成分充分混合搅拌均匀。

获得的玉米微生物种衣剂pH6.8-8.72，成膜时间在5分钟以内，包衣均匀度93％，包衣脱落率均在5％。

4、包衣

将玉米种子先用75％的乙醇进行表面消毒10min，置于超净台中风干。按照药种比1：10称取种衣剂和种子，将其倒入烧杯中，摇动烧杯手动包衣，至种子表面颜色均匀，晾干，制成两种活性成分的种衣剂包衣的种子。

5、微生物种衣剂对玉米苗期生长的影响

将包衣种子播种于花盆中，每盆10粒包衣种子，每个处理三个重复，以未包衣的种子为对照。3天后计算发芽势，7天后计算发芽率，14天后测定根长、根数、株高、植株鲜重和干重，参见图1-2和表1。

表1

处理	BSCA-1	BSCA-2	CK
				发芽势/％	50.00±10.0a	43.33±5.78a	36.67±5.78b
发芽率/％	90.00±10.0a	86.67±5.78a	76.67±5.78b
				种子活力指数/VI	27.19±2.46a	26.50±3.51a	17.58±0.93b
根长/cm	20.66±1.50a	20.40±1.48a	14.44±1.45b
				茎长/cm	10.34±1.25a	10.32±1.09a	8.14±1.20b
根数	13.00±3.74a	12.00±4.24a	6.00±0.71b
				地上株高/cm	29.38±1.44a	29.42±1.38a	24.74±2.92b
鲜重/g	1.77±0.08a	1.71±0.08a	0.99±0.08b
				干重/g	0.32±0.03a	0.29±0.05a	0.18±0.03c

从表1可知，经本实施例生物种衣剂包衣的玉米种子发芽势、发芽率、种子活力指数均明显提高；从苗期生长来看，与裸种相比，经BSCA-1种衣剂处理后的根长、茎长、地上株高、鲜重和干重分别提高了43.00％、27.03％、18.76％、78.79％和77.78％；经种衣剂BSCA-2处理后的根长、茎长、株高、鲜重和干重分别提高了41.27％、26.78％、18.92％、72.73％和61.11％。

由图1-2可见，未包衣的种子根系稀疏，包衣后的种子根系粗壮且茂密，这表明包衣后对玉米种子有明显的促生作用。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的特性测定

1、拮抗特性

共测试了11株菌株，7株芽孢杆菌和4株木霉，分别为TXM-1(解淀粉芽孢杆菌)、TXM-2(贝莱斯芽孢杆菌)、TXM-3(解淀粉芽孢杆菌)、TXM-4(短小芽孢杆菌)、TXM-5(枯草芽孢杆菌)、TXM-6(解淀粉芽孢杆菌)、TXM-7(蜡状芽孢杆菌)、TXMT-2(里氏木霉)、TXMT-3(里氏木霉)、TXMT-4(哈茨木霉)和TXMT-5(绿色木霉)。

用打孔器分别在木霉和病原菌上打孔，各挑一块至平板两侧的中央，间距5～6cm。芽孢杆菌则用移液枪头点至距离病原菌块2～3cm处，放置于28℃培养箱倒置培养，以单独培养的病原菌平板为对照，参见图3-4。

培养3～5天后，测量对照组病原菌菌落的直线生长距离D_ck，对峙培养组病原菌菌落的直线生长距离D_s，用以下公式计算抑菌率。

所试菌株中具有对玉米茎腐病病原菌明显拮抗作用的有TXM-1、TXM-2、TXM-3、TXM-4、TXM-5和TXMT-3，抑菌率参见表2。

表2

菌株Strain	抑菌率Inhibitory ratio/％
		TXM-1	14.67±1.22c
TXM-2	23.11±1.22a
		TXM-3	21.33±1.22a
TXM-4	16.44±1.22c
		TXM-5	16.89±3.37bc
TXMT-3	19.56±1.86b

注：同列不同小写字母表示差异在P＜0.05水平具有统计学意义。

由表2可见，抑菌效果效果最好的菌株是TXM-2，抑菌率达到23.11％，对病原菌的抑制作用表现依次为：TXM-2＞TXM-3＞TXMT-3＞TXM-5＞TXM-4＞TXM-1。

2、促生特性测试

共测试了11株菌株，7株芽孢杆菌和4株木霉，分别为TXM-1(解淀粉芽孢杆菌)、TXM-2(贝莱斯芽孢杆菌)、TXM-3(解淀粉芽孢杆菌)、TXM-4(短小芽孢杆菌)、TXM-5(枯草芽孢杆菌)、TXM-6(解淀粉芽孢杆菌)、TXM-7(蜡状芽孢杆菌)、TXMT-2(里氏木霉)、TXMT-3(里氏木霉)、TXMT-4(哈茨木霉)和TXMT-5(绿色木霉)。

菌株铁载体的测定采用CAS法：将测试菌株于MKB培养基培养24～48h，10 000r·min^-1离心10min，取上清液稀释10倍，加入等体积CAS检测液并混合，静置1h后于630nm检测吸光度A。

将培养基稀释10倍后与CAS等体积混合测得吸光度Ar，用以下公式计算铁载体活性。

吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)的测定采用Salkowski试剂比色法：将培养2～3天的菌悬液5000r·min-¹离心10min，上清液与检测液1：2比例混匀，在暗处放置30min后测其在530nm处吸光值，离心的空培养基为空白对照。

在所试菌株中显示有六株具有产铁载体能力，菌株TXM-2产铁载体能力较高，含量达到15.8个活性单位；六株菌株产具有产IAA的能力，含量均在10μg·mL-¹以内，参见图5。

实施例3含有不同成膜剂的微生物种衣剂的性能

本实施例中的微生物种衣剂除成膜剂外，其余组成与实施例1相同。

1、对玉米苗期生长的影响

将玉米种子浸泡在75％乙醇中进行表面消毒，风干；然后以含不同组成成膜剂的微生物种衣剂对玉米种子进行包衣，成膜时间均在5分钟以内，于室温晾干，最后置于两层浸湿滤纸的发芽盒内，常温下培养。

每个处理10颗种子，三个重复；7天后，计算发芽率，14天后，测量根长、茎长、叶长、叶宽和种子活力指数(VI)，参见表3和图6。

表3不同比例成膜剂对玉米苗期生长的影响

注：不同小写字母表示差异在P＜0.05水平具有统计学意义。

由表3和图6可见，成膜剂比例为SA：PVA＝1：9的混合成膜剂时发芽率、根长、叶长均有明显提高，发芽率比对照提高16.67％，根长和叶长分别提高32％和20％。

2、对菌株活性的影响

将成膜剂配制成溶液，与稀释100倍后的菌株发酵液按照1：1(V：V)比例混合均匀，密封放于37℃的培养箱中5天，以无菌水与稀释10倍的发酵液1：1混合液为对照，通过稀释平板计数法计算活菌数，以活菌下降率判断不同质量比的成膜剂助剂对菌株活性的影响，参见表4。

表4不同比例成膜剂对菌株活性的影响

注：同列不同小写字母表示差异在P＜0.05水平具有统计学意义。

由表4可见，菌株培养时，成膜剂的添加导致贝莱斯芽孢杆菌TXM-1和解淀粉芽孢杆菌TXM-2的活菌数均有不同程度的下降，其中SA：PVA＝1：9的成膜剂使菌株活性下降率较低，分别为10％和20％，表明该比例可以较好的维持菌株活性。

Claims (10)

1.一种玉米微生物种衣剂，包括活性成分和助剂，其特征在于，

所述活性成分为含菌量大于等于10⁷cfu·mL^-1的解淀粉芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌菌液；

所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TXM-1，于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19548；

所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-2，于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19549；

所述助剂以水为介质，包括成膜剂、增稠剂、防腐剂和着色剂，其中，所述成膜剂由海藻酸钠和聚乙烯醇组成，两者的质量比为海藻酸钠：

聚乙烯醇＝3：7-1：9。

2.根据权利要求1所述玉米微生物种衣剂，其特征在于，所述活性成分与助剂的用量为所述菌液：水＝0.9-1：1，体积比。

3.根据权利要求1或2所述玉米微生物种衣剂，其特征在于，所述助剂中，成膜剂8-10wt％，增稠剂0.45-0.5wt％，防腐剂0.08-0.1wt％，着色剂0.45-0.5wt％，其余为水。

4.根据权利要求1所述玉米微生物种衣剂，其特征在于，所述增稠剂为膨润土、羧甲基纤维素钠、明胶、琼脂或淀粉；所述防腐剂为苯甲酸钠、或山梨酸钾；所述着色剂为着色珠光粉、水溶性伊红或玫瑰精。

5.如权利要求1所述玉米微生物种衣剂的制备方法，包括以下步骤：

1)按比例称取各原料，将成膜剂的组分海藻酸钠和聚乙烯醇与增稠剂加入水中，加热溶解成粘稠状混合物后冷却至40～50℃；

2)再加入防腐剂和着色剂，混合搅拌均匀，最后加入活性成分，充分混合搅拌均匀；搅拌均匀后即制得呈粘稠液体状的种衣剂。

6.一种抑制玉米病原菌的菌株，其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TXM-1，于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19548。

7.一种抑制玉米病原菌的菌株，其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TXM-2，于2020年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19549。

8.如权利要求6或7所述抑制玉米病原菌的菌株在玉米微生物种衣剂中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述病原菌为茎腐病原菌、稻瘟病原菌、尖孢镰刀菌和玉米大斑病病原菌。

10.如权利要求1所述玉米微生物种衣剂在玉米包衣中的应用。

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