CN111676177A - 一种萌发促生菌组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种萌发促生菌组合物及其应用。具体技术方案为：包括枯草芽孢杆菌、假单胞菌和巨大芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA如SEQ ID NO：1所示，所述假单胞菌的16S rDNA如SEQ ID NO：2所示；所述巨大芽孢杆菌保藏编号为：CGMCC 1.1870。本发明提供了一种新的微生物组合物，该微生物组合物可单独作为浸种剂或作为种子包膜剂的组成成分，应用到促进种子萌发上；还可作为生物有机肥的组成成分，帮助改善土壤质量、提高种子萌发率、改善植物生长情况。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种萌发促生菌组合物及其应用。
背景技术
青稞生育期短、营养丰富，且秸秆可作为牲畜越冬季的饲草料，在高原农区被广泛种植。但藏区太阳辐射强、水蒸发量大、降水变率明显，降水多与作物耗水盛期错位，加之耕作土层浅、土壤贮水能力弱，导致土壤水分易散失，使作物频繁受旱。统计结果显示，青稞播种季(四月上旬)藏区降雨量约为1.90～14.7mm，因干旱造成的出芽受挫面积可达青稞种植总面积的30％～50％，是造成其产量减少的主要原因之一。不仅如此，藏区土地养分数据还表明，常年连作造成了土壤有机质含量的巨幅下降，且化肥大量施用导致面源污染和养分固定化效应的情况普遍发生。
因此，改善藏区土地质量，提高青稞产量，具有重要的现实意义。但青稞在种植时，种子的萌发是第一道难关。种子萌发是指种子从吸胀作用开始的一系列有序的生理过程。不同植物种类的吸胀持水量不同，持续时间也有所差别，维持该阶段外围水分的持续供应对种子顺利萌发十分关键。但在非雨季的藏区农业种植地区，水分缺乏，80％以上的灌溉用水以蒸发和渗透形式流失，仅有10％左右的水分能够在植物种子或根系周围短暂停留，水分运筹不足往往成为限制其萌发的主要原因。
同时，种子萌发也受到内在因子的调控。基因和生理方面的研究结果显示，微量水平变化的植物激素即能够对种子萌发过程产生重要影响。其中，赤霉素(GA)和细胞分裂素(CTK)是控制种子萌发的两种关键植物激素。自然情况下，种子萌发初期根系数量较少、活性相对不高，常常表现出对干旱逆境的不适应，造成出苗困难的现象时有发生。
如果能够在种衣剂中添加适宜的活性促生菌，例如能够分泌GA3和 ZT(玉米素，一种细胞分裂素)的微生物，一方面能提高萌发促生的植物激素，另一方面也能帮助提升保水性能，则有望提高种子萌发率，加速胚乳养分的运转，促进早发壮苗的形成，增加植物根系活性，强化根系吸收养分和水分的功能，从而提高幼苗对逆境的抗性达到顺利出苗的目的；是一种极具应用和推广价值农业技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种萌发促生菌组合物及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种微生物组合物，包括枯草芽孢杆菌、假单胞菌和巨大芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA如SEQ ID NO：1所示，所述假单胞菌的16S rDNA如SEQ ID NO：2所示；所述巨大芽孢杆菌保藏编号为：CGMCC1.1870。
相应的，一种微生物组合物，包括枯草芽孢杆菌、假单胞菌和巨大芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的于2018年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为：CGMCCNo.16171；所述假单胞菌（Pseudomonas sp.）于2018年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号为：CGMCC No.15914；所述巨大芽孢杆菌保藏编号为：CGMCC 1.1870。
优选的，按活菌量，枯草芽孢杆菌：假单胞菌：巨大芽孢杆菌＝2： 2：1。
优选的，所述萌发促生菌组合物中，各微生物的活菌浓度均≥ 109CFU/mL。
相应的，所述微生物组合物在种子萌发中的应用。
优选的，将微生物组合物制备为种子包膜剂，所述种子包膜剂的组分包括：微生物组合物、成膜剂、粘结剂、保护剂、保水剂、硒肥；
或；
所述种子包膜剂的组分包括：微生物组合物、成膜剂、粘结剂、保护剂、保水剂、硒肥、填充料、警示染料。
优选的，所述成膜剂为羟乙基纤维素；和/或；所述粘结剂为黄原胶；和/或；所述保护剂为甘油；和/或；所述保水剂为γ-聚谷氨酸和/ 或甘油；和/或；所述硒肥为亚硒酸钾或硒代半胱氨酸或两者的混合物；和/或；所述填充料为腐殖酸钙。
优选的，所述硒肥为亚硒酸钾和硒代半胱氨酸按质量比为1:1混匀后获得的混合物。
优选的，按重量份数，所述种子包膜剂的组成包括：100～150份混合发酵液、5～10份成膜剂、1～5份粘结剂、10～20份保护剂、1～5 份保水剂、10～20份硒肥、5～10份填充料和3～5份警示染料；
所述混合发酵液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌、假单胞菌、巨大芽孢杆菌分别培养至活菌浓度109CFU/mL，获得各微生物发酵液，将各微生物发酵液按体积比为2:2:1混匀，得混合发酵液。
相应的，所述微生物组合物在制备生物有机肥中的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的微生物组合物。具体的，该组合物可单独作为浸种剂或作为种子包膜剂的组成成分，应用到促进种子萌发上；该组合物还可作为生物有机肥的组成成分，帮助改善土壤质量、提高种子萌发率、改善植物生长情况。
本发明在微生物组合物的基础上，还进一步提供了一种具体的种子包膜剂，具有促进种子萌发、保水、富硒等多重作用。所述种子包膜剂的原料可降解、无污染，制作方便、成本低，使用简单、效果好。其中，含有多种微生物，可加速种子胚乳养分运转，提高种子萌发率，明显增加幼苗根系数量和活性，强化根系吸收养分和水分的能力，促进早发壮苗的形成。另外，包被材料中的γ-聚谷氨酸的保水、蓄水功能强劲，能有效降低干旱、半干旱地区土壤中的重力失水率和扩散失水率，显著减少灌溉次数和用水量；且其降解产物为谷氨酸可被幼苗直接吸收利用。包膜剂中还特别添加富硒成分，具有硒肥集中度高，作用时间长等特点，大大提高了硒肥利用率，可显著提高作物中的硒含量。
该种子包膜剂尤其适用于高原、缺水环境中，青稞种子的萌发生长。其中富含的微生物来自高原环境，能够与青稞互营共生，且可特异性合成植物激素、分泌胞外酶，促进青稞生长，提高其抗逆性。同时，还可改善土壤质量，帮助土壤固定氮素、活化矿物磷、钾，以充分满足青稞的养分需求。
具体实施方式
一、本发明提供了一种萌发促生菌组合物。
所述萌发促生菌组合物包括：枯草芽孢杆菌YX7(Bacillus subtilis)、假单胞菌KSX1-2(Pseudomonas sp.)和巨大芽孢杆菌CGMCC 1.1870(Bacillus megaterium)。
将活菌浓度均为109CFU/mL的枯草芽孢杆菌YX7发酵液、假单胞菌 KSX1-2、巨大芽孢杆菌CGMCC 1.1870发酵液按照体积比2:2:1混匀，即得所需的萌发促生菌组合物的混合发酵液。
所述萌发促生菌组合物的混合发酵液具有溶磷、降钾效应，还可分泌生长激素，产生胞外ACC脱氨酶(1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶)，以降低逆境环境中植株体内的乙烯含量从而提高植物抗性；抑制病原微生物的正常代谢，从而减少病害的产生；从而促进植物快速生长。尤其适用于高原环境的促进青稞的生长。
二、本发明在萌发促生菌组合物的基础上，还提供了一种种子包膜剂。
所述种子包膜剂的组成包括：萌发促生菌组合物的混合发酵液、成膜剂、粘结剂、保护剂、保水剂、硒肥。优选的方案为，还包括填充料和警示染料。
优选的方案为，按重量份数，所述种子包膜剂的组成包括：100～ 150份混合发酵液、5～10份成膜剂、1～5份粘结剂、10～20份保护剂、 1～5份保水剂、10～20份硒肥、5～10份填充料和3～5份警示染料。
在一种实施方式下，所述成膜剂为羟乙基纤维素。所述粘结剂为黄原胶，黄原胶具有独特的流变性及对热和酸碱的稳定性等显著特点，可强化包膜的稳定性。所述保护剂为甘油，可保护种子和萌发促生菌组合物中的菌株，避免菌株和种子因对条件变化和其他添加剂的不适应而导致失活或活性降低。
所述保水剂为γ-聚谷氨酸和甘油，γ-聚谷氨酸保水透气能力强，且降解产物为谷氨酸，能够被植物吸收利用。
所述硒肥为亚硒酸钾和硒代半胱氨酸的混合物。优选为：亚硒酸钾与硒代半胱氨酸的质量比为1:1。其中，硒代半胱氨酸可直接被青稞吸收利用，而亚硒酸钾可长时间附着在青稞根表，从而发挥一定的缓释作用，提高硒肥的利用效率。
所述填充料为腐殖酸钙。腐殖酸可刺激作物生长，钙离子能够补充钙元素，增加钙调素含量，增加细胞壁强度，具有一定的防倒伏功效。
所述警示染料为罗丹明B，颜色鲜艳，可起到警示作用；避免种子被鸟兽吞食。
所述种子包膜剂的制备方法为：将上述各组分混合后，在＜35℃下缓慢搅拌至均一状态，转速≤500r/min。
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐释。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一：萌发促生菌组合物中各菌株的筛选
1、配制培养基。
(1)LB液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水 1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min。在LB液体培养基中加琼脂18g后得LB固体培养基。
(2)萌发激素发酵培养基：豆饼粉10g、鱼粉10g、玉米粉5g、酵母提取物5g、C6H5O7(NH4)3 0.5g、MgSO4·7H2O 0.25g、FeSO4·7H2O 0.25g、CaCO3 3.0g、NaCl 2.5g、CoCl2 0.1g、K2HPO4 0.3g、NaHCO3 0.15g、蒸馏水1000mL，pH＝7.5。
(3)高氏1号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g， MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，pH＝7.4～7.6。在高氏 1号液体培养基中加琼脂12g后得高氏1号固体培养基。
(4)PDA液体培养基：称取去皮土豆200g，切成小块，加水煮沸 20～30分钟，用八层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20.0g，补充水分到 1000mL。在PDA液体培养基中加琼脂12g后得PDA固体培养基。
2、采集、筛选菌株。
采集雅鲁藏布江河谷农业种植区域青稞和小麦拔节期附带根际土壤的根系样品，用无菌水洗涮根表，将所得混合物转移至已灭菌的广口瓶内，于室温震荡器中摇晃至均一状态。随后静置10min，吸取上层液体，在LB固体培养基上进行稀释涂布。将涂布好的培养皿倒置于35℃恒温箱培养1～2天。再蘸取培养出的不同类型的典型单菌落，经3次以上平板划线纯化，4℃保存于LB斜面培养基，并按照GJ-X的顺序编号待用。
另取藏区常用青稞(白浪散、肚里黄、门农1号、昆仑2号、南繁 3号)、小麦(山南白麦、拉萨无芒红、昌都小麦、太昭红麦、藏春10 号、日喀则27号)品种的适量种子，使用无菌水浸泡24h后，于超净工作台内小心研磨。随后转移至盛有种子粉末10倍重量的无菌水的灭菌广口瓶内，于室温震荡器中摇晃至均一状态，静置10min。吸取上层液体在LB固体培养基上进行稀释涂布，将涂布好的培养皿倒置于35℃恒温箱培养1～2天。再蘸取培养出的不同类型的典型单菌落，经3次以上平板划线纯化后，4℃保存于LB斜面培养基，并按照ZZ-X的顺序编号待用。
3、各菌株产植物激素情况试验。对上述分离获得的菌株，及实验室既往分离、保藏及购买的微生物资源进行试验比对，一并筛选所需的萌发促生菌。需要说明的是，发明人进行的前期试验非常多，因篇幅限制，此处只展示其中具有代表性的一部分。除步骤2筛选的微生物外，既往分离、保藏及购买的备选微生物如表1所示。
表1既往分离、保藏及购买的微生物资源一览表
将上述3种来源的各菌株分别进行活化(分别接种在LB液体培养基或高氏1号液体培养基或PDA液体培养基上，于35℃恒温培养箱内培养24h)。挑取一接种环已活化的各菌株分别接种至LB液体培养基中，于35℃、180r/min下培养24h，得到各菌株的种子液。将种子液以5％ (v/v)的接种量接入萌发激素发酵培养基中，在35℃、180r/min条件下培养72h，得到各微生物发酵液。
将各发酵液在4℃下离心10min(10000r/min)，收集上清液。再用氮气在室温下吹脱水分至1mL，再利用甲醇定容至2mL。随后采用液相色谱法(HPLC)测定各菌株产的植物激素(GA3和ZT)含量，每株菌重复3 次。HPLC色谱条件为：固定相为Agilent ZORBAX EclipsePlus C18 column(4.6mm×250mm,5-Micron)，流动相为二元混合溶剂(甲醇：0.2％冰乙酸溶液＝2:3，v/v)，检测波长为210nm，柱温为30℃，流速为1.0 mL/min，进样量为20μL。
各菌株植物激素产量如表2所示。表2中，“-”表示不产生对应的植物激素。需要说明的是，表2中只体现了具有分泌所需植物激素潜力的微生物，上述三种来源中完全不符合要求的微生物，表2中并未体现。表2的同行数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05,n＝3,Duncan’s新复极差法)。
表2各菌株产植物激素能力展示表
从表2可以看出，GA3产量最高的菌株为YX7；ZT产量最高的菌株为KSX1-2；菌株CGMCC 1.1870可分泌两种植物激素，但产量属于中等水平。将上述三种菌株作为青稞萌发活性促生菌的备选材料。
枯草芽孢杆菌YX7(Bacillus subtilis)的生理生化特征为：该菌在牛肉膏蛋白胨平板上培养24h后，菌落呈不规则形状、白色，边缘锯齿状，表面凸起呈山包状，不透明，表面干燥，内部湿润粘稠，易挑取。菌体呈直杆状(6.32～7.21μm×10.75～20.65μm)，两端顿圆，多数单生。该菌于2018年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.16171；其16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。
假单胞菌KSX1-2(Pseudomonas sp.)的生理生化特征为：该菌在牛肉膏蛋白胨平板上培养24h后，菌落呈橘黄色，半透明，菌落几乎呈圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，挑取有丝；其生长pH值范围为5.0～10.0，最适生长pH值为7，生长温度范围为4～37℃，最适生长温度为28℃。该菌于2018年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15914。其16S rDNA如SEQ ID NO： 2所示。
实施例二：萌发活性促生菌对青稞种子萌芽的影响
采用菌液浸种的方式来验证实施例一获得的各微生物是否存在促进青稞种子萌发、加速胚乳养分转化、增加根系数量以及提高幼苗逆境抗性的功效。
将实施例一筛选获得的3株菌(枯草芽孢杆菌YX7、假单胞菌KSX1-2 和巨大芽孢杆菌CGMCC 1.1870)分别刮取一接种环，接种于含300mL灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基的500mL锥形瓶内，于30℃、180r/min下摇床培养至菌体浓度约为109CFU/mL时停止，获得各发酵液。再取各发酵液分别装于250mL烧杯，获得各微生物的单一浸种菌液(表3中的对照组1～3)。同时将各发酵液按不同比例混合后装于250mL烧杯中，获得微生物的混合浸种菌液(表3中的实验组1～4)。混合比例如表3所示，表3中，“-”指未添加对应物质。
表3各浸种菌液组成
| 处理编号 | YX7 | KSX1-2 | CGMCC 1.1870 | LB培养基 | 无菌水 |
| 对照组1 | 120mL | — | — | — | — |
| 对照组2 | — | 120mL | — | — | — |
| 对照组3 | — | — | 120mL | — | — |
| 实验组1 | 40mL | 40mL | 40mL | — | — |
| 实验组2 | 48mL | 48mL | 24mL | — | — |
| 实验组3 | 24mL | 48mL | 48mL | — | — |
| 实验组4 | 48mL | 24mL | 48mL | — | — |
| LB对照组 | — | — | — | 120mL | — |
| 无菌水对照组 | — | — | — | — | 120mL |
挑选330粒大小基本一致的青稞种子，分别置于上述各单一浸种菌液、混合浸种液中浸泡4h，将浸种后的青稞种子平均分配并转移至平皿(直径20cm)内，平皿中放有用50mL无菌水浸透的3层滤纸。在10℃、 95％的湿度条件下培养(光照12h，黑暗12h)，同时每组设置不浸种的平皿作为无菌水对照(以无菌水代替对应的浸种菌剂)，所有处理均重复3次。
24h后，每个处理随机选取10枚青稞种子进行低温研磨、破碎，并测定植物激素(GA3和ZT)含量、α-淀粉酶和β-淀粉酶活性(采用3,5- 二硝基水杨酸法，以每克组织每分钟催化产生1g还原糖定义为1个酶活力单位U)以及可溶性糖含量(蒽酮比色法)。3d后，记录种子发芽势。
从第4d开始进行干旱处理。处理方式为：每天早上8时开始，将平皿中的积水倒净，并下调湿度至40％，保存4个小时，中午12时向平皿中加水30mL，待滤纸浸透后倒净多余水分，再保持4个小时，下午 16时再向平皿中加水30mL，待滤纸浸透后倒净多余水分，再保持4个小时，当天完善20时向平皿中加水40mL，上调湿度至95％，保持至次日早上8时。如此循环，直至第7d的16时，全部收获。届时确定单株幼苗芽长、须根数量及根长，并挑选10棵幼苗进行低温研磨分析检测幼苗的干旱抗性生理指标：脯氨酸含量采用酸性茚三酮法，丙二醛(MDA) 含量采用硫代巴比妥酸法进行测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝 G-250法进行测定。结果如表4、5所示。
表4各组效果对比展示表
表5各组效果对比展示表
结果表明，混合浸种菌液处理的青稞种子，萌发24h时种子体内的赤霉素和玉米素含量显著优于其它组别，这无疑对胚的快速分化和发育十分有利。不仅如此，由于浸种处理提高了能够将胚乳贮藏淀粉转化为可溶性糖类的淀粉酶活性，使得幼苗生长能量供给充分，对早发壮苗的形成意义重大；与单一浸种菌液处理相比，混合浸种菌液处理后，植物激素和淀粉酶活性增加更为显著。
需要指出的是，以枯草芽孢杆菌YX7、假单胞菌KSX1-2和巨大芽孢杆菌CGMCC1.1870按照2:2:1比例混合获得的混合浸种菌液(实验组2)，其浸种处理后青稞种子发芽势达到68.87％，显著高于其他比例混合发酵液的处理。
实验条件下，经过浸种菌液处理，尤其是混合浸种菌液的浸种处理，青稞幼苗芽长、须根数量以及根系长度均得到不同程度的提高。经过水分胁迫处理后，各典型生理指标变化(脯氨酸和丙二醛)不如对照处理强烈，这表明经萌发促生菌发酵液的浸种处理后的幼苗对水分胁迫的耐受性增强。另外，这些处理较对照处理(LB对照和纯水对照)存在更高可溶性蛋白含量；可溶性蛋白是逆境环境中维护生物膜活性和协调细胞渗透压平衡的重要物质，非常有利于幼苗在缺水环境中的生存。
实施例三：种子包膜剂中除微生物外其余材料的筛选
1、成膜材料的筛选。
备选材料包括：羟乙基纤维素(HC)、羧甲基纤维素钠(CMC)、阿拉伯树胶(GA)、聚乙烯醇(PVA)。
将各备选材料用热水(70～80℃)在磁力搅拌器的搅拌作用下溶解，按质量百分比，分别配制5％的羟乙基纤维素溶液，5％羧甲基纤维素钠溶液，5％阿拉伯树胶溶液，5％聚乙烯醇；并进入如下测试：
成膜时间测试：将配制好的各成膜剂取适量于干净的载坡片上，观察其流延成膜的过程并用秒表计时，以便了解不同成膜剂的成膜时间。
成膜性测试：将配制好的各成膜剂溶液置于干净载玻片(10×2cm) 上流延成膜，随后放入40℃的烘箱内烘干，考察成膜性：流延性好，均匀成膜，经过0.5h水中浸泡，膜能从载玻片上完整刮下，表示成膜性好，标记为I级；流延性好，均匀成膜，经过0.5h水中浸泡，膜不能从载玻片上完整刮下，表示成膜性中等，标记为Ⅱ级；成膜剂在玻板不能成膜，表示成膜性差，标记为Ⅲ级，每个处理重复3次。
透水性测定：将配置好的成膜剂各取1mL，选用直径为9cm的圆形滤纸并事先做好标记，将成膜剂分别均匀涂抹在直径为9cm的圆形滤纸上，待干燥后将涂抹有成膜剂滤纸扇形折叠后放在漏斗中(涂抹有成膜剂一面向下)，取移液管吸取10mL蒸馏水于滤纸表面(无涂抹成膜剂的一面)，3h后用分析天平称取烧杯重量，由此计算出通过滤纸下渗的蒸馏水质量，每个处理重复3次，取平均值。
透气性测定：将配置好的成膜剂各取1mL，选用直径为9cm的圆形滤纸并事先做好标记，将成膜剂分别均匀涂抹在直径为9cm的圆形滤纸上，待干燥后将涂抹有成膜剂一面的圆形滤纸向上盖在盛有50mL蒸馏水的100mL高脚烧杯(事先称重)上，四周密封。将烧杯置于80℃恒温水浴锅中3h后取出，称重、计算杯中蒸发的水量。每个处理重复3次，取平均值。
上述各测试结果如表6所示。
表6各备选材料成膜性能展示
| 备选材料 | 成膜时间(min) | 成膜性 | 透水性(g) | 透气性(g) |
| HC | 18.01 | I级 | 9.27 | 18.67 |
| CMC | 14.23 | Ⅲ级 | 5.69 | 14.29 |
| GA | 17.67 | Ⅲ级 | 7.01 | 15.83 |
| PVA | 16.34 | Ⅱ级 | 6.62 | 12.98 |
从表6可以看出，不同成膜剂的成膜时间差异不大，但成膜性存在显著区别，以羟乙基纤维素(HC)成膜效果最为理想，且该材料制备的包膜在透气性和透水性测试中也更为出色。故选择羟乙基纤维素作为成膜材料。
2、保水材料的筛选。
备选材料包括：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、甘油(G)、壳聚糖(CS)、海藻酸钠(SA)、羧甲基纤维素钠(CMC)。对这些材料进行如下测试：
吸湿试验：温度为20℃，在干燥器底部加入饱和盐溶液，选用硫酸铜、氯化铵、氯化钙从而控制干燥器内的相对湿度分别为98％、84％、32％。然后精确称取1g备选材料放入直径为25mm的结晶皿中，再置于相对湿度恒定的干燥器内，进行吸湿试验，每隔24h将结晶皿取出称重，按下式计算吸湿率，每个处理重复3次，取平均值。
式中：m0为原始质量，m24为放置24小时后的质量。
保湿试验：温度为20℃时，在干燥器底部盛有200g经干燥的变色硅胶，再放入100％含水率的备选材料进行保湿实验。每隔120h将结晶皿取出称量，由下式计算保湿率，每个处理重复3次，取平均值。
式中：H0为备选材料原始含水质量，H120为放置120小时后备选材料含水质量。
上述测试的结果如表7所示。
表7各备选材料的吸湿性能展示
从表7可以看出，在湿度较高时(98％和84％)，γ-聚谷氨酸具有较高的吸湿率，而湿度较低时甘油表现出更强的吸湿作用。由保湿实验可知，甘油更有利于水分保持。因此，包膜保水材料选用γ-聚谷氨酸和甘油。另外，γ-聚谷氨酸的降解产物是谷氨酸，能够直接被植物吸收利用，对于早壮苗的产生十分有利；而甘油还可作为微生物菌体的保护剂，避免在包被过程中造成菌体的大量死亡。
实施例四：种子包膜剂的制备和效果展示
1、按如下步骤制备种子包膜剂：
(1)将枯草芽孢杆菌YX7、假单胞菌KSX1-2和巨大芽孢杆菌CGMCC 1.1870从保藏斜面上取出，分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中， 35℃恒温培养箱内培养8h，活化。
(2)各挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌YX7、假单胞菌KSX1-2 和巨大芽孢杆菌CGMCC 1.1870的单菌落，分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于35℃、180r/min下培养24h，得到各微生物种子液。
(3)将上述各微生物种子液分别以20％(v/v)的接种量接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在35℃下，0.2(v/v·min-1)的通气量(无菌空气)， 100r/min的搅拌速度下培养，至各菌体浓度达到109CFU/mL，获得各微生物发酵液。
(4)将各发酵液按照体积比为2:2:1的比例均匀混合，获得萌发促生菌组合物的混合发酵液。
(5)按重量份数，在100份萌发促生菌组合物的混合发酵液中，加入5份羟乙基纤维素、1份黄原胶、10份甘油、2份γ-聚谷氨酸、5 份亚硒酸钾、5份硒代半胱氨酸、5份腐殖酸钙、2份警示染料，在低温 (＜35℃)条件下慢速(500r/min)搅拌均匀，即得所需的种子包膜剂。
其中，羟乙基纤维素在添加前，先用热水(70～80℃)配制成质量百分比为5％的羟乙基纤维素水溶液，用磁力搅拌器搅拌均匀后，冷却至 35℃，再加入萌发促生菌组合物的混合发酵液中。
2、包膜后萌芽效果展示：
通过包衣造粒机，将种子包膜剂与青稞种子分别按照重量比为 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的比例制成生物-保水-富硒包膜种子，并检测发芽率和发芽势。检测方法为：选取不同存放时间下、每种混合比例的青稞种子各300颗，分别置于3个直径为15cm且铺有2层滤纸的玻璃培养皿中，加入30mL蒸馏水，置于20℃、湿度为85％的培养箱中，连续培养7天。同时设置未包膜的青稞种子，作为空白对照组，其余条件完全相同。结果如表8所示。
表8萌芽结果展示
根据表8，膜种比较低时(即种子包膜剂用量较高时)，种子的发芽势和发芽率低于未包膜组别，可能的原因为：微量元素硒的用量过量，对种子萌芽起到了抑制作用；包膜过厚，影响了种子的正常萌芽。膜种比在1:30～50之间，效果比较理想。
3、微生物存活率检测：选取膜种比为1:40的生物-保水-富硒包膜种子，分别选取包膜当天、30天、180天的生物-保水-富硒包膜青稞种子各300颗，用500mL无菌生理盐水溶解洗脱(180r/min摇晃1h)后，将各洗脱液稀释涂布于牛肉膏蛋白胨培养基中，置于35℃培养箱中24～ 48h，每个处理设置3个重复，记录相同稀释梯度下的菌落数目。
将包膜当天的微生物存活量记为1，检测结果表明，与包膜当天相比，30天的微生物存活率为89.17％，180天的微生物存活率仍可达到 69.43％。
4、放置时间与萌芽效果的关系测定：选取膜种比为1:40的生物- 保水-富硒包膜种子，分别选取包膜后5天、60天、180天以及1年种子各300颗，每个时间段的种子分别置于3个直径为20cm且铺有2层滤纸的玻璃培养皿中，加入50mL蒸馏水，置于10℃、湿度为95％的培养箱中，连续培养3～5天，观察并记录发芽率和发芽指数，以未经存储的、未做包膜处理的青稞种子作为空白对照，其中发芽指数的计算方式如下：
结果如表9所示。
表9存放时间与萌芽效果对照表
| 处理 | 空白对照 | 5天 | 60天 | 180天 | 1年 |
| 发芽势(％) | 34.00 | 64.03 | 63.58 | 62.67 | 59.00 |
| 发芽率(％) | 74.67 | 98.33 | 98.00 | 95.67 | 91.33 |
| 平均根长(cm) | 2.21 | 3.27 | 3.11 | 2.83 | 2.61 |
| 发芽指数 | — | 162.36％ | 153.77％ | 136.72％ | 120.37％ |
5、种子在干旱环境中的出芽效果测试：将50颗青稞生物-保水-富硒包膜种子(膜种比为1:40)均匀散布在盛有38cm干沙土(含水率＜ 8％，实际含水率记作r1，单位％)层的大烧杯(烧杯本身重量记为m1，单位g)中，摆放好种子后，再在种子上覆盖2～3cm的干沙土，称量整个烧杯质量并记为m2。用计量喷壶向烧杯中均匀喷洒蒸馏水M(单位g)，调节土壤含水率至“黄墒”(含水率为12～15％)水平，置于20℃，空气湿度为40％的恒温培养箱中进行萌发，作为实验组，每组设置3个重复。同时以未包膜处理的青稞种子作为对照组。
实验期间观察、记录青稞种子发芽率和发芽势。一周以后测定株高、根长、鲜重等生长性状，及幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量以及生理胁迫指标：过氧化物酶活性(愈创木酚显色法)、丙二醛。其中，喷洒的蒸馏水M的计算公式如下：
M＝(m2-m1)×(13.5-r1)。
结果如表10所示。
表10干旱环境下萌芽情况展示
| 测试项目 | 对照组 | 实验组 |
| 发芽势(％) | 17.33 | 39.00 |
| 发芽率(％) | 42.67 | 85.67 |
| 芽长(cm) | 5.72 | 7.43 |
| 根长(cm) | 2.34 | 4.98 |
| 鲜重(g/棵) | 0.2571 | 0.4839 |
| 可溶性糖含量(mg/g) | 7.03 | 13.91 |
| 可溶性蛋白含量(mg/g) | 10.78 | 19.54 |
| POD(△A470/min·g) | 3.51 | 8.35 |
| MDA(μmol/g) | 27.26 | 19.67 |
试验结果表明，在干旱模拟条件下，与对照组相比，经生物-保水- 富硒包膜的青稞种子，出芽更整齐且发芽率更高，幼苗根、茎生长迅速且茁壮，幼苗体内的可溶性糖和可溶性蛋白含量分别增加了97.87％和 81.26％。可溶性糖和可溶性蛋白质是重要的能量来源物质，在平衡细胞渗透压方面十分重要，这些成分含量的提高说明经过包膜处理后萌芽的青稞幼苗在逆境中具有更强的抵抗作用和生存能力。另外，包膜处理后的青稞幼苗体内POD酶活性显著提高2.38倍，丙二醛含量减少38.59％，表明包膜处理后的青稞种子对幼苗体内过氧化物质的消除能力以及防止氧自由基与活性脂质发生反应的作用显著，这些指标均反应出生物- 保水-富硒包膜对青稞种子萌发的积极作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一种萌发促生菌组合物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌YX7(Bacillus subtilis)
<400> 1
gtggaatgcg ggtgctatac atgcagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60
tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120
gaaaccgggg ctaataccgg atgcttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 180
ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240
accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300
cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360
cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420
gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540
cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600
agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660
cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720
actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780
gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtgtccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840
cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960
gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200
acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260
atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320
aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1440
aagtgacaga aga 1453
<210> 2
<211> 1380
<212> DNA
<213> 假单胞菌KSX1-2(Pseudomonas sp.)
<400> 2
ttagactagc tacttctggt gcaacccact cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg 60
cccgggaacg tattcaccgc gacattctga ttcgcgatta ctagcgattc cgacttcacg 120
cagtcgagtt gcagactgcg atccggacta cgatcggttt tgtgggatta gctccacctc 180
gcggcttggc aaccctctgt accgaccatt gtagcacgtg tgtagcccag gccgtaaggg 240
ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctccttaga 300
gtgcccacca ttacgtgctg gtaactaagg acaagggttg cgctcgttac gggacttaac 360
ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcagca cctgtctcaa tgctcccgaa 420
ggcaccaatc catctctgga aagttcattg gatgtcaagg cctggtaagg ttcttcgcgt 480
tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcatttgagt 540
tttaaccttg cggccgtact ccccaggcgg tcaacttaat gcgttagctg cgccactaag 600
agctcaaggc tcccaacggc tagttgacat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 660
atcctgtttg ctccccacgc tttcgcacct cagtgtcagt atcagtccag gtggtcgcct 720
tcgccactgg tgttccttcc tatatctacg catttcaccg ctacacagga aattccacca 780
ccctctacca tactctagct cgacagtttt gaatgcagtt cccaggttga gcccggggct 840
ttcacatcca acttaacgaa ccacctacgc gcgctttacg cccagtaatt ccgattaacg 900
cttgcaccct ctgtattacc gcggctgctg gcacagagtt agccggtgct tattctgtcg 960
gtaacgtcaa aacaattacg tattaggtaa ctgcccttcc tcccaactta aagtgcttta 1020
caatccgaag accttcttca cacacgcggc atggctggat caggctttcg cccattgtcc 1080
aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtgact 1140
gatcatcctc tcagaccagt tacggatcgt cgccttggtg agccattacc tcaccaacta 1200
gctaatccga cctaggctca tctgatagcg caaggcccga aggtcccctg ctttctcccg 1260
taggacgtat gcggtattag cgtccgtttc cgagcgttat cccccactac caggcagatt 1320
cctaggcatt actcacccgt ccgccgctct caagaggtgc aagcacctct ctaccgctcg 1380
Claims (10)
1.一种微生物组合物，其特征在于：包括枯草芽孢杆菌、假单胞菌和巨大芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA如SEQ ID NO：1所示，所述假单胞菌的16S rDNA如SEQ ID NO：2所示；所述巨大芽孢杆菌保藏编号为：CGMCC 1.1870。
2.一种微生物组合物，其特征在于：包括枯草芽孢杆菌、假单胞菌和巨大芽孢杆菌；所述枯草芽孢杆菌的于2018年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.16171；所述假单胞菌于2018年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15914；所述巨大芽孢杆菌保藏编号为：CGMCC 1.1870。
3.根据权利要求1或2所述的微生物组合物，其特征在于：按活菌量，枯草芽孢杆菌：假单胞菌：巨大芽孢杆菌＝2：2：1。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的微生物组合物，其特征在于：所述微生物组合物中，各微生物的活菌浓度均≥109CFU/mL。
5.权利要求1～4任意一项所述微生物组合物在种子萌发中的应用。
6.根据权利要求5所述微生物组合物在种子萌芽中的应用，其特征在于：将微生物组合物制备为种子包膜剂，所述种子包膜剂的组分包括：微生物组合物、成膜剂、粘结剂、保护剂、保水剂、硒肥；
或；
所述种子包膜剂的组分包括：微生物组合物、成膜剂、粘结剂、保护剂、保水剂、硒肥、填充料、警示染料。
7.根据权利要求6所述微生物组合物在种子萌芽中的应用，其特征在于：所述成膜剂为羟乙基纤维素；和/或；所述粘结剂为黄原胶；和/或；所述保护剂为甘油；和/或；所述保水剂为γ-聚谷氨酸和/或甘油；和/或；所述硒肥为亚硒酸钾或硒代半胱氨酸或两者的混合物；和/或；所述填充料为腐殖酸钙。
8.根据权利要求7所述微生物组合物在种子萌芽中的应用，其特征在于：所述硒肥为亚硒酸钾和硒代半胱氨酸按质量比为1:1混匀后获得的混合物。
9.根据权利要求6～8任意一项所述微生物组合物在种子萌芽中的应用，其特征在于：按重量份数，所述种子包膜剂的组成包括：100～150份混合发酵液、5～10份成膜剂、1～5份粘结剂、10～20份保护剂、1～5份保水剂、10～20份硒肥、5～10份填充料和3～5份警示染料；
所述混合发酵液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌、假单胞菌、巨大芽孢杆菌分别培养至活菌浓度109CFU/mL，获得各微生物发酵液，将各微生物发酵液按体积比为2:2:1混匀，得混合发酵液。
10.权利要求1～4任意一项所述微生物组合物在制备生物有机肥中的应用。
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