CN110791456B - 一种耐盐促生芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种耐盐促生芽孢杆菌及其应用。本发明获得的菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18398。该菌株兼顾分泌有机酸、固氮、解磷、解钾能力，同时能够分泌生长素，本发明所筛选到的菌株能在不同类型盐碱地土壤生存繁殖，是一株理想的盐碱地改良菌株，该菌株为地衣芽孢杆菌属于肥料用安全菌株，可用于肥料生产。

Description

一种耐盐促生芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种耐盐促生芽孢杆菌及其应用。

背景技术

土地盐碱化是影响农业生产和生态环境的严重问题。我国盐渍土更是面积大、分布广、类型多。从太平洋沿岸的东海之滨到新疆的塔里木盆地，从海南岛到内蒙古呼伦贝尔高原，处处都有盐渍化土壤分布。全球气候的变暖进一步加剧了干旱、半干旱地区土壤盐渍化程度，导致盐渍化土壤面积不断扩大。如何确实改良和有效利用盐碱地，提高农林业生产的经济、社会和生态效益，是现代农林业所关注的重大问题。其中生物改良具有重要的现实意义，主要包括种植耐盐碱植物、使用微生物肥料制剂等。

开发高效的微生物菌肥制剂，首先就要从获得盐碱耐受的微生物菌株开始。目前对于盐碱耐受的微生物资源的开发研究，一是，仅关注菌株对盐碱耐受能力，而对其促生效果研究应用较少；二是，筛选得到的菌株一般耐盐碱类型单一，而不同的盐碱地土壤类型往往含有盐组分及酸碱度不同，从而使得单一菌株不能适应多种盐碱土壤，改良效果较差。

CN106434481B耐盐菌的分离纯化方法及分离得到的耐盐碱菌株及其应用公开了一种耐盐菌的分离纯化方法，但并未发现该菌株具有促生效果。CN106754481A从冰菜中筛选耐高盐固氮菌株的方法及相关培养基公开了一种具有固氮效果的耐盐菌株筛选方法，但并未说明该菌株的其他促生功能，对耐盐土壤类型也未可知。

发明内容

因此，为了解决上述问题以及不足，本发明提供了一种耐盐促生芽孢杆菌及其应用，该菌株酸碱耐受性强，无机盐培养基中代谢产酸至pH 4.0，可耐受pH 10.5的碱浓度，该菌株具有优异的促生效果，可以固氮、解磷、解钾等，同时具备代谢色氨酸产生长素的功能，并提供了一种盐碱地土壤调理剂，可用于不同类型的盐碱地土壤改良。

发明人从黄河三角洲盐碱地土壤中筛选得到耐盐促生菌株，编号为YJY19-05，利用biolog微生物鉴定系统，确定了该芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18398，保藏日期为2019年08月20日。

上述耐盐促生芽孢杆菌，其形态特征如下：该菌株生长迅速，液体培养物呈白色，固体平板培养基上呈现2-3mm不规则的菌落形态，菌落半透明，边缘不整齐，表面不光滑，中间凸起。

该菌株的筛选过程如下：

(1)将黄河三角洲盐碱地土壤样品按1-5％比例接种于生理盐水中，样品充分散开后获得菌悬液。

(2)按1％比例转接菌悬液于增菌培养液中，气浴恒温震荡箱内培养过夜，获得富集液；所述的增菌培养液的配方为：蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-8g/L，，氯化钠5-8g/L，pH6.8-7.0。

(3)按5％比例转接步骤(2)中富集液于驯化培养液中，35℃震荡培养15h至菌液浑浊，驯化结束后利用接种针蘸取少量菌液划线分离培养基固体平板，若菌液较澄清，可吸取50-100μL涂布分离培养基固体平板；所述的驯化培养液配方为：蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-8g/L，氯化钠30g/L，pH 6.8-7.0；分离培养基固体平板配方为：蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-8g/L，氯化钠30g/L，琼脂粉15-20g/L，pH 6.8-7.0；该步骤中将驯化培养液的氯化钠浓度增加到30g/L，有利于筛选耐盐菌菌株。

(4)选取分离培养基平板上不同菌落形态的菌株进行划线平板法进行纯化3-5代，直至获得纯培养物；

(5)配制含不同盐类型固体平板，该基础培养基配方为：蛋白胨5-10g/L，酵母粉2-5g/L，琼脂粉15-20g/L，pH 6.0-7.0。将不同盐的母液，加入到上述基础培养基配方中，配制成不同盐类型不同浓度的固体平板，本申请发明人选择硫酸盐、氯化物盐、重碳酸盐，具体分别选择硫酸钠、氯化钠、碳酸氢钠，并分别配制20％，20％，10％质量浓度的盐溶液母液。培养基中三种盐质量浓度设置梯度分别为：

硫酸盐：15-16％，1.0-1.5％，3.0％-4.0％；

氯化物：1.5-2.0％，12-15％，3.0％-4.5％；

重碳酸盐：1.2-1.5％，0.8-1.1％，7％-8％；

上述的三种盐溶液类型在于模拟硫酸盐盐碱地土壤、氯化物盐盐碱地土壤、重碳酸盐盐碱地土壤的盐分构成种类以及比例。

(6)将步骤(4)得到菌株分别在3种不同盐类型最低浓度固体平板上划线，35℃培养2d，待菌落长出后，用接种针蘸取最低浓度梯度的生长良好的菌落划线下一盐浓度平板，35℃培养2d，直至菌株在该盐类型浓度下不能生长为止，并将上一浓度确定为最大耐受浓度。

(7)将步骤(6)中菌株在产酸液体培养基中培养，评价其产酸能力；产酸液体培养基以下列2种配方培养基培养中pH较低者计算，具体为：

S1：葡萄糖5-10g/L，硫酸铵0.1-0.5g/L，氯化钾0.2-1g/L，硫酸镁0.25-5g/L，七水氯化镁5-10g/L，蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0；

S2：磷酸氢二钾0.5-1.0g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，硫酸亚铁0.01-0.06g/L，硫酸锰0.01g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸铵1g/L，可溶性淀粉5-10g/L，pH 6.8-7.0；

(8)将步骤(6)得到菌株进行碱耐受性平板培养，评价其耐碱能力；碱耐受性平板的培养基组分如下：蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-8g/L，牛肉膏2-3g/L，pH 8.5-10.5。由于pH范围为8.5-10.5属于中度盐碱地至重度盐碱地的范畴，具体的pH设置梯度为8.5，9.5，10.5。

通过上述过程，筛选得到本发明的耐盐促生芽孢杆菌YJY19-05，该菌株在三种盐类型固体平板上均能生长，具体耐受范围分别为：硫化物盐浓度0-5％，氯化物盐浓度0-3％，重碳酸盐浓度0-3％。并且通过实验发现该菌株还具有固氮、解磷、解钾、分泌生长素等促生效果。将该菌株转接至营养琼脂培养基上，并进行低温保存。

因此针对该菌株，发明人将其应用于盐碱地土壤改良，并具体研发了一种盐碱地土壤调理剂，该调理剂能够在硫化物和氯化物等盐碱地土壤中具有优异的改良效果！

该盐碱地土壤调理剂，其组分按重量份计，包括：有机肥料70-85份，保水剂10-20份，微生物菌剂1-5份。

有机肥主要增加土壤有机质，给微生物繁殖提供碳源，同时提供少量的无机养分和微量元素，保水剂主要锁住水分，同时利用聚谷氨酸的保肥机制，改善土壤结构，提高土壤对铵态氮的固定能力。加速植物氮代谢，促进作物生长。

所述有机肥为常规有机肥，但为了获得更好的效果，优选该有机肥采用机械打碎后玉米秸秆(2-3cm)和牛粪按碳氮比为25-30:1混合后，室内槽式堆肥发酵，发酵周期30-45d，发酵结束后，有机肥料颜色黑色，无明显臭味，秸秆一拉即断。指标检测要求为有机质含量≥45％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)≥5％；重金属检测不超标。

所述的保水剂由农用保水剂和生物保水剂按质量比9:1混合而成。

农用保水剂为农用聚丙烯酸钾。

聚谷氨酸属于生物保水剂，在土壤易被降解，因此，需要选择农用保水剂进行补充，聚丙烯酸钾，为农业常用保水剂，具有很长的使用寿命，吸水能力强。同样具有保水、保肥的功能。

生物保水剂为聚谷氨酸溶液，分子量为300-500kDa，聚谷氨酸质量含量为3％-4％之间。

所述的微生物菌剂为菌株YJY19-05的培养物，更为优选的为该菌株的发酵液，其有效活菌数≥200亿cfu/mL。菌剂发酵方法如下：

1)种子罐发酵

种子液制备：利用增菌培养基制备地衣芽孢杆菌三级种子液1-2L；

培养基配方：蛋白胨1-2％、酵母粉0.2-0.5％、氯化钠1-3％、氢氧化钠0.02-0.05％，消泡剂0.1-0.2％，pH7.2，将称量完毕的物料，预先在小桶中进行溶解，检测溶液pH值，调节pH在7.2左右即可。

将上述培养基装入种子罐后灭菌并接种种子液后进行培养，设定发酵过程参数具体如下：温度35～37℃，发酵罐罐压0.05MPa，溶氧≥20％，发酵6h左右，开始取样镜检，培养至对数期末期时，进行转罐。

2)发酵罐培养

发酵罐培养基配方：豆粕5.5-7.5％、玉米粉5-7％、玉米淀粉0.3-0.6％、玉米浆干粉0.2-0.3％、碳酸钙0.2-0.5％、硫酸铵0.02-0.05％、硫酸锰0.01-0.05％。中性蛋白酶0.1％、淀粉酶0.1％、消泡剂0.5％，pH 7.5-7.8。

物料称取时，需要先称取玉米粉、豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆干粉等四种原料进行蛋白酶和淀粉酶酶解，酶解完成后，再将剩余硫酸铵、碳酸钙、硫酸锰三种无机盐水溶后加入到发酵罐中，最后调节发酵液pH 7.5-7.8，按照0.5％加入消泡剂。

将制备好的液体种子按照5～15vt％的接种量接种到灭菌的发酵罐进行扩大培养，发酵罐控制如下：温度35℃，发酵罐罐压0.05MPa，溶氧≥20％，当菌体生长衰落期时(溶氧、pH开始上升)时发酵结束，得到微生物菌剂。

将聚丙烯酸钾和有机肥肥料进行预混，然后将聚谷氨酸和微生物菌剂混合后喷洒到预混的固体料表面，混合均匀。

利用该方法制备的盐碱地土壤调理剂有效活菌数为2～10亿cfu/g。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明筛选得到的地衣芽孢杆菌对硫化物盐，氯化物盐，重碳酸盐具有较高的耐受度；并且在产酸液体培养中产酸至4.0，同时可耐受10.5的碱浓度，在该pH区间范围内，该菌株即可以的利用土壤中无机养分，又可以耐受高盐碱环境，具有良好的固氮、解磷、解钾、分泌生长素等促生效果，利用其制备的盐碱地土壤调理剂可适用于不同硫酸盐土及氯化物盐土类型盐碱地土壤改良，适用范围广，促生效果优异。

菌种保藏信息

保藏时间：2019年08月20日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No.18398；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

邮政编码：100101；

分类命名：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但本领域的技术人员将理解，下列实施例仅用于本发明，不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者。均为通过市售购买获得的常规产品。

试验例1菌株YJY19-05酸碱耐受性实验

将菌株YJY19-05在产酸液体培养基中培养，评价其产酸能力，产酸液体培养基以下列2种配方培养基培养中pH较低者计算，具体为：

S1：葡萄糖5-10g/L，硫酸铵0.1-0.5g/L，氯化钾0.2-1g/L，硫酸镁0.25-5g/L，七水氯化镁5-10g/L，蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0；

S2：磷酸氢二钾0.5-1.0g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，硫酸亚铁0.01-0.06g/L，硫酸锰0.01g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硝酸铵1g/L，可溶性淀粉5-10g/L，pH 6.8-7.0；

将菌株YJY19-05在碱耐受性平板培养，评价其耐碱能力，耐碱培养基配方为；蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏2g/L，pH 8.5-10.5。具体的pH设置梯度为8.5，9.5，10.5。

最终结果显示，该菌株在在S1配方产酸液体培养中产酸至pH4.0，同时可耐受pH10.5的碱浓度。

试验例2菌株YJY19-05的促生功能评价

本实施例对菌株YJY19-05进行促生功能评价，具体进行固氮、解磷、解钾、分泌生长素试验：

S1:挑取菌株YJY19-05单菌落点接到无氮培养基平板上，然后倒置到28℃生化培养箱中，培养4～5d，观察生长情况，判断其是否能在无氮培养基上正常生长。如果有菌体生长则表明菌株有固氮能力。

S2:利用接种针蘸取菌株YJY19-05单菌落于解磷培养基固体平板上进行划线，35℃培养4-5天，在平板上能够生长，说明该菌具有溶解难溶性无机磷的能力，可以判断该菌能够溶解周围环境中的无机磷，将其转化为自身所需要的生长因子。

S3:采用牛津杯法，每个孔上样30微升YJY19-05的发酵液，培养两天后观察有无透明圈现象产生，有透明圈说明具有解钾功能。

YJY19-05的发酵液：利用接种针挑取少量菌体至增菌培养液中，37℃培养24h。

S4:将菌株YJY19-05接种于50mL刚果红培养基中摇床培养，做3个重复，于28℃，125r/min培养7～10d。向比色板上加入100μL的比色液和加入200μL的菌悬液，进行显色反应。30min后观察，红色为阳性，表示菌株能够分泌IAA，红色颜色越深表示分泌IAA能力越大；无色为阴性，表示菌株不能分泌IAA。在比色液中分别加入10ppm、30ppm、50ppm IAA作对照进行红色颜色深度的比较。

标准曲线制定：称取吲哚乙酸标准品，用三级水配置浓度为l00mg/L的母液,分别按相应的倍数稀释到浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90和100mg/L的标准溶液。将不同浓度的标准溶液与Fe-HClO4显色液按照1:2(v/v)混合，避光条件下反应30min，测定OD₅₃₀nm的值。

Fe-HClO₄显色液:1mL 0.5M FeCl₃溶液与50mL 35％HCIO₄溶液混合。

上述实验中所用到的培养基具体为：

无氮培养基配方为：磷酸氢二钾0.2g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙5g/L，硫酸钙0.1g/L，甘露醇10g/L，蒸馏水1L，pH7.0，琼脂15g，121℃灭菌20min。

解磷培养基配方为：葡萄糖10g/L，磷酸钙5g/L，硫酸铵0.1g/L，氯化钾0.2g/L，硫酸镁0.25g/L，七水氯化镁5g/L，蒸馏水1L，pH 6.8-7.0；

解钾培养基配方为：蔗糖10g/L，酵母粉0.5g/L，七水和硫酸镁0.5g/L，硫酸铵1g/L，磷酸氢二钠2g/L，碳酸钙1g/L，钾长石粉1g/L，琼脂15g/L，去离子水1L，pH 7.0；

刚果红培养基配方：甘露醇10g/L，氯化钠0.1g/L，L-色氨酸0.1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，酵母膏1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，硝酸铵1g/L，蒸馏水1L，pH 7.0。

结果表明菌株YJY19-05同时具备固氮、解磷、解钾能力，可在解钾培养基上产生1cm左右的透明圈，其还具备代谢色氨酸产生长素的功能，代谢产生生长素的能力为31.14mg/L。

上述试验证明，该菌株酸碱适当范围广，盐碱地类型耐受种类多，同时具备促生效果。

实施例1氯化钠盐胁迫条件下的促生效果

将菌株YJY19-05开展盆栽实验，确定其对小麦苗生长以及土壤酸碱度的影响。

实验材料：小麦种子，本地土壤，直径10cm的花盆。

实验设计：

(1)土壤指标检测：选取本地土壤为试验对象，该土壤有机质含量低，浇水后易板结，将土壤过2mm筛网并进行筛分，分别采用电位测定法以及电导仪法，检测土壤pH以及土壤含盐量，

(2)增加土壤含盐量：根据土壤初始指标后，利用NaCl溶液一次性浇透并晾干，作为实验土壤。

(3)小麦苗的获得：挑选颗粒饱满、大小一致的小麦种子，利用75％乙醇表面消毒2次后，无菌水洗净，在光照培养箱内培养。白天光照培养16h，培养温度30℃，夜间黑暗培养，培养时间8h，培养温度26℃。当麦芽顶到皿盖时，摘去皿盖继续培养，培养过程中注意适当补充蒸发的水分。

(4)实验处理：将处理后的盐土转移至直径10cm花盆内，设置盐胁迫对照组和盐胁迫处理组，每个处理3个平行，选取长势一致的小麦苗进行移栽，每盆10棵小麦苗，将两组处理转移至光照培养箱内继续培养。

胁迫对照组：每5-8d浇灌1次LB液体培养基25倍稀释液，共培养30d；

盐胁迫处理组：每5-8d浇灌1次菌株YJY19-05发酵液25倍稀释液，共培养30d，YJY19-05发酵液为利用LB液体培养基温度35～37℃，摇瓶培养16-24h获得。

(5)指标检测：培养30d跟踪检测盐胁迫对照组及处理组的小麦苗生长指标(株高、根长、干重、湿重)，分别采用电位测定法以及电导仪法，对比检测土壤pH以及土壤含盐量变化。

实验结果：

检测本地初始土壤电导率为775μs/cm，土壤含盐量低，初始pH为7.48。利用1.2％的氯化钠溶液进行一次性浇透后，土壤含盐量为2.18ms/cm。该盐胁迫下，对小麦苗生长产生了明显的抑制。

培养30d后对所有实验组小麦苗进行测量统计，试验结果如表1

表1

备注：上标字母不同代表差异显著；

结果表明，使用YJY19-05发酵液浇灌后，可促进小麦苗株高以及根的伸长，NaCl胁迫处理条件下，30d的数据表明，处理组较对照组株高及根长分别增长幅度为25％，15％。

实施例2本发明土壤调理剂在冬枣种植上的应用

采用菌株YJY19-05制备土壤调理剂，并在黄河三角洲盐碱地上进行效果验证。

土壤调理剂各组分具体用量如下：有机肥料85份，保水剂15份，微生物菌剂2份。

所述有机肥为采用机械打碎后玉米秸秆(2-3cm)和牛粪按碳氮比为30:1比例混合后，室内槽式堆肥发酵，发酵周期40d，发酵结束后，有机肥料颜色黑色，无明显臭味，秸秆一拉即断。指标检测要求为有机质含量55％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)5.3％；重金属检测不超标。

所述的保水剂由农用保水剂和生物保水剂按质量比9:1混合而成。农用保水剂为聚丙烯酸钾；生物保水剂为聚谷氨酸溶液，分子量为400kDa，聚谷氨酸质量浓度为3％。

所述的微生物菌剂为该菌株的发酵液YJY19-05，其有效活菌数212亿cfu/mL。菌剂发酵方法如下：

1)种子罐制备

发酵罐完成空消和空气滤芯灭菌后，开始进行装料，灌装体积为发酵罐容积的60％，装料结束后完成实消，并冷却至接种温度。接种采用火焰封口接种，种子罐接菌完成后进行培养，设定发酵过程参数及适宜的控制模式，具体如下：温度37℃，罐压0.05MPa，溶氧≥20％，发酵6h左右，开始取样镜检，培养至对数期末期时，进行转罐。

2)发酵罐培养

发酵罐培养基配方：豆粕6.86％、玉米粉5.5％、玉米淀粉0.46％、玉米浆干粉0.17％、碳酸钙0.3％、硫酸铵0.04％、硫酸锰0.034％、中性蛋白酶0.1％、淀粉酶0.1％、消泡剂0.5％，pH 7.5-7.8。

物料称取时，需要先称取玉米粉、豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆干粉等四种原料进行蛋白酶和淀粉酶酶解，酶解完成后，再将剩余硫酸铵、碳酸钙、硫酸锰三种无机盐水溶后加入到发酵罐中，最后调节发酵液pH 7.5-7.8，按照0.5％加入消泡剂。实消结束后，进行转罐操作。

将制备好的液体种子按照5～15vt％的接种量接种到发酵罐进行扩大培养，发酵罐控制如下：温度35℃，发酵罐罐压0.05MPa，溶氧≥20％。上述过程中，需当溶氧小于20％时，增加通气量，当菌体生长衰落期时(溶氧、pH开始上升)时放罐。

将聚丙烯酸钾和有机肥肥料在混料机内进行预混，然后将聚谷氨酸和YJY19-05发酵液喷洒到固体料表面，继续搅拌，使物料均匀。利用该方法制备的土壤调理剂有效活菌数为2亿cfu/g。

本实施例试验地点为山东省滨州市沾化区冬枣种植区，试验材料为氮磷钾常规底肥，土壤调理剂，冬枣树苗。

试验设计

(1)土壤指标检测

取当地土壤，自然晾干后，粉碎，筛分，按《土壤分析技术规范》中国农业出版社，规定的相关方法检测土壤盐分总量以及pH，硫酸根、氯离子、钠离子百分含量。

(2)试验的3个处理分别为：

处理1：常规施氮磷钾肥

处理2：常规施氮磷钾肥+灭活后土壤调理剂

处理3：常规施氮磷钾肥+土壤调理剂，有效活菌数≥2亿cfu/g。

试验步骤：

实验分为3个处理，每个处理随机选取5棵长势一致的冬枣树开展试验，氮磷钾底肥作为基肥按500g/棵一次性施肥，施肥深度15cm，沿树干周围1m的距离施肥，处理2灭活后土壤调理剂及处理3土壤调理剂在开花期进行追肥，使用量为2kg/棵，施肥时避开底肥施肥处。

试验结束后检测冬枣的百粒重以及平均单株产量；同时检测土壤的脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶活性。

土壤脲酶的检测方法：扩散法，参照丰骁等《土壤脲酶活性两种测定方法比较》；

过氧化氢酶活性的测定：高锰酸钾滴定法；

土壤脲酶检测方法：3,5-二硝基水杨酸比色法，具体方法参照王智慧等《生物炭对土壤养分、酶活性及玉米产量的影响》

试验结果与分析

土壤初始指标检测结果为总盐含量1.64％，氯离子含量1.37％，硫酸根含量0.08％，钠离子含量0.7％，pH 8.08，其中，氯化物盐占大多数，属于氯化物盐碱土。

处理3和处理2的百粒重比处理1分别提高了了18.21％，10.19％，单株产量提高了10.23％，5.14％，详见表2.

表2

备注：上标字母不同代表差异显著；

土壤脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶变化如表3所示。

表3土壤指标变化

备注：上标字母不同代表差异显著；

土壤酶活检测结果表明，在氯化物为主的盐碱地土壤上，处理3可显著提高土壤脲酶活性，土壤中氮素含量高，促进了冬枣的生长，这与冬枣百粒重增加有直接关系。同时，处理3能提高土壤蔗糖酶活性10％以上，过氧化氢酶活性各处理间无显著差异。

实施例3土壤调理剂在在绿肥种植上的应用

采用菌株YJY19-05制备土壤调理剂，土壤调理剂其组分具体用量如下：有机肥料75份，保水剂20份，微生物菌剂5份。

土壤调理剂制备工艺按实施例2执行，本次制备的土壤调理剂有效活菌数为4亿cfu/g。

本应用例试验地点为山东省滨州市沾化区生态湿地公园。

试验材料为氮磷钾常规底肥，土壤调理剂，苜蓿种子、草帘子。

试验设计：

(1)土壤指标检测

取当地土壤，自然晾干后，粉碎，筛分，按《土壤分析技术规范》中国农业出版社，规定的相关方法检测土壤盐分总量以及pH，硫酸根、氯离子、钠离子百分含量。

(3)试验的3个处理分别为：

处理1：不使用任何肥料，播撒苜蓿种子后，浇水，盖上草帘。

处理2：添加灭活后的土壤调理剂

处理3：添加土壤调理剂，有效活菌数≥4亿cfu/g。

试验步骤：

实验同样分3个处理，每个处理1亩地，处理1直接进行旋耕，处理2和3按每亩70kg的比例，将肥料分散均匀后进行旋耕。旋耕结束后播撒苜蓿种子，小水浇透，附上一层草帘子，1个月后统计苜蓿出苗率，同时检测土壤的解氮、有效磷、速效钾、活菌数的含量变化。

土壤指标检测参照《土壤分析技术规范》中国农业出版社，相关的方法；出苗率采用五点取样法进行统计，取5点平均值；活菌数统计，采用稀释涂布平板法，取地表0-10cm的新鲜土样进行菌量检测，利用生理盐水将土样稀释至合适浓度后，涂布营养琼脂固体平板，置于35℃生长2d后统计的菌落总数。

试验结果与分析

土壤指标检测结果为总盐含量2.52％，氯离子含量0.77％，硫酸根含量1.57％，钠离子含量0.47％，pH 8.25，属于硫酸盐重度盐碱地。

土壤指标变化如表4所示

表4

指标	初始土壤	处理1	处理2	处理3
					含盐量(％)	2.52％	2.49％	1.25％	1.21％
pH	8.25	8.26	8.10	7.86
					碱解氮(mg/kg)	90	95	150	230
有效磷(mg/kg)	18.6	18.6	20.8	21.7
					速效钾(mg/kg)	106	107	180	196
菌量总数cfu/g	3.2×10<sup>6</sup>	3.2×10<sup>6</sup>	3.6×10<sup>7</sup>	36×10<sup>7</sup>
					出苗率	\	11.3％	56.3％	75.2％

使用本发明的土壤调理剂，可大大降低土壤的含盐量，增加土壤养分和有效活菌数。

本发明的实施例是为了更好的说明本发明做的举例，而非对本发明实施方式的限制凡是属于本发明的技术方法所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护之内。

Claims (8)

1.一种耐盐促生芽孢杆菌，其特征在于，编号为YJY19-05，为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18398。

2.权利要求1所述的一种耐盐促生芽孢杆菌应用于盐碱地土壤改良。

3.一种盐碱地土壤调理剂，其特征在于，该盐碱地土壤调理剂，其组分按重量份计，包括：有机肥料70-85份，保水剂10-20份，微生物菌剂1-5份；所述的微生物菌剂为权利要求1所述耐盐促生芽孢杆菌的发酵液，有效活菌数≥200亿cfu/mL。

4.根据权利要求3所述的一种盐碱地土壤调理剂，其特征在于，有机肥料有机质含量≥45%，总养分N+P₂O₅+K₂O≥5%。

5.根据权利要求3所述的一种盐碱地土壤调理剂，其特征在于，所述的保水剂由农用保水剂和生物保水剂按质量比9:1混合而成。

6.根据权利要求5所述的一种盐碱地土壤调理剂，其特征在于，农用保水剂为农用聚丙烯酸钾。

7.根据权利要求5所述的一种盐碱地土壤调理剂，其特征在于，生物保水剂为聚谷氨酸溶液，分子量为300-500 kDa，聚谷氨酸质量含量为3%-4%之间。

8.根据权利要求3所述的一种盐碱地土壤调理剂，其特征在于，所述的微生物菌剂为权利要求1所述耐盐促生芽孢杆菌的发酵液，其发酵方法如下：

1）种子罐发酵

种子液制备：利用增菌培养基制备地衣芽孢杆菌三级种子液1-2L；

培养基配方：蛋白胨1-2%、酵母粉0.2-0.5%、氯化钠1-3%、氢氧化钠0.02-0.05%，消泡剂0.1-0.2%，pH7.2，将称量完毕的物料，预先在小桶中进行溶解，检测溶液pH值，调节pH在7.2即可；

将上述培养基装入种子罐后灭菌并接种种子液后进行培养，设定发酵过程参数具体如下：温度35～37℃，发酵罐罐压0.05MPa，溶氧≥20%，发酵6h，开始取样镜检，培养至对数期末期时，进行转罐；

2）发酵罐培养

发酵罐培养基配方：豆粕5.5-7.5%、玉米粉5-7%、玉米淀粉0.3-0.6%、玉米浆干粉0.2-0.3%、碳酸钙0.2-0.5%、硫酸铵0.02-0.05%、硫酸锰0.01-0.05%、中性蛋白酶0.1%、淀粉酶0.1%、消泡剂0.5%，pH 7.5-7.8；

物料称取时，需要先称取玉米粉、豆粕粉、玉米淀粉、玉米浆干粉四种原料进行蛋白酶和淀粉酶酶解，酶解完成后，再将剩余硫酸铵、碳酸钙、硫酸锰三种无机盐水溶后加入到发酵罐中，最后调节发酵液pH 7.5-7.8，按照0.5%加入消泡剂；

将制备好的液体种子按照5～15vt%的接种量接种到灭菌的发酵罐进行扩大培养，发酵罐控制如下：温度35℃，发酵罐罐压0.05MPa，溶氧≥20%，当菌体生长衰落期时发酵结束，得到微生物菌剂。