CN115786163B

CN115786163B - 一株地衣芽孢杆菌scau1602及其应用

Info

Publication number: CN115786163B
Application number: CN202210923677.7A
Authority: CN
Inventors: 陈强; 王祖昱; 余金阳; 刘轶豪; 蔡金桥; 余秀梅; 辜运富; 张凌子; 赵珂; 马孟根; 林春雪
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-08-02
Filing date: 2022-08-02
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2042-08-02
Also published as: CN115786163A

Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SCAU1602及其应用。该菌株于2022年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022712，其16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明提供的地衣芽孢杆菌SCAU1602具有耐高温特性，可在28～70℃生长，最适温度范围45～60℃；同时该菌株在堆肥处理中具有良好的抑制氨气产生能力。在鸡粪高温堆肥中接种该菌剂，可有效降低鸡粪堆肥处理的氨气逸失，减少堆肥臭气产生，从而提升鸡粪堆肥品质，具有良好的应用前景。

Description

一株地衣芽孢杆菌SCAU1602及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一株地衣芽孢杆菌SCAU1602及其应用。

背景技术

随着我国家禽养殖业的发展，养殖场规模化、集约化水平不断提升，家禽养殖粪便产量急剧增加，据统计，我国仅蛋鸡养殖的粪便产生量每天约14万吨，若处理不当会带来严重的污染环境，制约蛋鸡产业的可持续发展。鸡粪营养价值高，含有大量未被消化吸收的营养物质，是农业生产的重要肥料资源。然而，鸡粪成分复杂，堆放过程中常常产生硫化氢、氨气、胺类和一些低级脂肪酸类等恶臭气味化学物质。其中，浓度最高、危害最大的是氨气，既对家禽上呼吸道产生腐蚀和刺激作用，引发多种呼吸道疾病及氨中毒，影响机体健康和生长性能；同时，氨气扩散后与大气中水分结合，进入土壤会导致土壤酸化，进入水体则引起水体富营养化。

好氧堆肥是鸡粪无害化处理的有效处理途径，可转化为优质有机肥，具有成本低、操作简单的优点。鸡粪堆肥过程中会产生大量氨气，抑制氨气产生的方法很多，包括堆肥过程中采取物理或化学方法控制、接种除臭微生物等措施。研究表明，好氧堆肥接种高效除臭菌剂，利用除臭菌的代谢作用，可有效减少臭味产生，降低氮素损失，在堆肥生产中具有重要的现实意义。

地衣芽孢杆菌是公认的安全菌株，分布于动物肠道、堆肥制品和土壤环境，部分菌株具备益生菌效果。作为益生菌可促使宿主机体产生抗菌活性物质，具有改善肠道菌群平衡、保护动物回肠黏膜，提高机体的免疫功能，加之其具有独特的生物夺氧机制，可有效抑制病原菌生长繁殖；同时，地衣芽孢杆菌具有较强的产酶能力，促进肠道营养物质消化和吸收，可有效提高饲料利用率。

尽管地衣芽孢杆菌已普遍用作动物益生菌，亦作为畜禽粪便堆肥处理接种剂，但尚未见筛选兼具耐高温和除臭保氮效果的地衣芽孢杆菌应用于畜禽粪便堆肥处理、减少氨气产生的相关报道。因此筛选耐高温、抑制氨气产生和除臭能力强的地衣芽孢杆菌，应用于畜禽粪便高温堆肥处理，减少氨氮逸失和臭气产生，减轻空气污染，具有积极的现实意义。

发明内容

为达到上述目的，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SCAU1602及其应用，旨在解决堆肥过程中的氨气逸失以及堆肥除臭等问题，提升堆肥品质，具有广阔的应用前景。

本发明提供了一株地衣芽孢杆菌SCAU1602，该菌株已于2022年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2022712。

优选地，该菌株的生长pH范围为5.0～10.0，生长温度范围为28～70℃，尤其在45～60℃温度范围内长势较好。

本发明提供的地衣芽孢杆菌SCAU1602可应用于制备生物菌剂。

本发明还提供了一种由上述地衣芽孢杆菌SCAU1602所制备的生物菌剂，尤其可用于制备液体生物菌剂。

优选地，上述液体生物菌剂中的活菌数不少于1.0*10⁹CFU/mL。

本发明提供的上述生物菌剂可应用于堆肥，尤其可用于鸡粪堆肥处理，能有效降低鸡粪发酵时氨气的产生量，提高堆肥的氮含量。

本发明提供的上述生物菌剂可应用于其他畜禽粪便原料的堆肥处理，还可应用于含蛋白质原料的发酵或堆肥中，可起到抑氨除臭保氮的作用。

本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SCAU1602及其应用，可减少堆肥过程中的氨气产生及逸失，从而解决堆肥除臭问题，具有以下优点：

菌株SCAU1602生长温度范围较宽，具有良好的耐高温特性，由该菌制备的生物菌剂可用于堆肥处理，发挥其抑氨除臭保氮功能，可有效提升堆肥品质，具有较为广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明中地衣芽孢杆菌SCAU1602在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态。

图2为本发明中地衣芽孢杆菌SCAU1602在电镜形态。

图3为本发明中地衣芽孢杆菌SCAU1602的16S rRNA基因序列的系统发育图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明：下述实验例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实验例1菌株的分离、纯化和保存。

样品采集：从养鸡场采集鸡粪样品，装入无菌采样袋，带回实验室低温保存。

培养基制备：牛肉膏蛋白胨配方为牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，水1000mL，调节pH至7.0～7.2。

菌株分离纯化：称取10g鸡粪样品，转入带有玻璃珠且装有90mL无菌水的三角瓶中，放于50℃恒温摇床180r/min振荡30min后，在无菌水中进行10倍梯度稀释，制备稀释菌悬液至10^-6后，各取100μL稀释度为10^-4、10^-5和10^-6的菌悬液涂布到牛肉膏蛋白胨培养基平板，置于50℃恒温培养48h，挑取单菌落进行分离纯化。

除臭菌筛选：将纯化的细菌菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，50℃培养36h，离心、取上清液，用纳氏试剂检测菌株产氨气情况，无橙色沉淀出现为阴性，说明菌株不产氨气；有橙色沉淀出现为阳性，表明菌株产氨气。

从采集的样品中分离得到57株细菌，并最终筛选获得1株不产氨气的耐高温细菌菌株，编号为SCAU1602。

如图1所示，为本实施例的分离纯化得到的菌株SCAU1602在牛肉膏蛋白胨培养基平板上50℃培养24h，菌落形态为圆形、扁平、乳白色、不透明，菌落表面初期光滑、后期褶皱，边缘不整齐，直径为1.5～2.5mm。菌体电镜形态如图2所示，为短杆状，产芽孢，有鞭毛，无荚膜，革兰氏染色鉴定结果为阳性。

实验例2菌株的鉴定及系统发育分析

本发明采用Chelex 100裂解液法提取细菌DNA，取100μL 5％Chelex 100溶液于PCR管中，从试管斜面上挑取少许菌体，与裂解液充分混匀后在PCR仪上进行程序裂解，反应程序为：99℃10min。随后4℃下12000r/min离心10min，上清液即为供试菌株DNA。

以上述所得的细菌基因组DNA为模板，以如下所示的通用引物为PCR引物，扩增体系为：模板DNA 1.5μL，27f(10μM)0.15μL，1492r(10μM)0.15μL，2×PCRTaqMix 15μL，dd H₂O13.2μL，总体积30μL。PCR反应条件：预变性94℃3min，变性94℃1min、退火55℃1min、延伸72℃2min、30个循环，最终延伸72℃10min。

其中，所用到的引物如下所示(5’→3’)：

27f(SEQ ID NO：1)：AGAGTTTGATCCTGGCTCA

1492r(SEQ ID NO：2)：GGTTACCTTGTTACGACTT

扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并送北京擎科生物技术有限公司进行序列测定。对测得菌株的16S rRNA基因序列采用SeqMan拼接，其序列长度为1435bp，具体核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

通过Blast工具将序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库中进行比对分析，从GenBank搜索相似性最高的模式菌株为参比菌株，用MEGA 7.0软件，选择邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树，结果如图3所示。用软件DNAMAN7.0进行基因序列相似度计算，该菌株16S rRNA基因序列与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC14580^T的相似度为99.6％。

综合上述特征，该菌株在分类上属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，因此将其命名为地衣芽孢杆菌SCAU1602，并于2022年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2022712。

16S rRNA(SEQ ID NO：3)基因序列如下(5’→3’)：

TGCAAGTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTCCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACCAGAGTG

实验例3地衣芽孢杆菌SCAU1602的生长特性分析

(1)生长pH范围

将上述实验例所筛得的菌株SCAU1602分别接种到pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基，50℃、180r/min振荡培养24h，观察记载菌株长势，其长势见表1。该菌株生长pH范围为5.0～10.0，最适pH范围6.5～8.0。

表1地衣芽孢杆菌SCAU1602的生长pH特性

注：“+”表示生长，“+”越多表示生长越旺盛；“-”为不生长。

(2)生长温度范围

将上述实验例所筛得的菌株SCAU1602接种到pH为7.0的牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别置于4℃、10℃、20℃、28℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃温度，180r/min振荡培养24h，观察记载菌株长势，其长势见表2。该菌株生长温度范围为28～70℃，最适生长温度为45～60℃。

表2地衣芽孢杆菌SCAU1602的生长温度特性

实验例4液体生物菌剂制备

将上述实验例所筛得的地衣芽孢杆菌SCAU1602从斜面试管上接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，50℃、180r/min振荡培养48h，作为种子液，以1％的接种量(v/v)接种于相同培养液，相同条件逐级扩大，即可生产获得液体菌剂，经检测，该液体菌剂活菌数≥1.0×10⁹CFU/mL。

实验例5地衣芽孢杆菌SCAU1602在鸡粪高温堆肥发酵的应用

堆肥试验地点为四川省成都天添农牧有限公司，发酵设备为康普天成TC-101A罐式发酵装置，该装置具备自动搅拌、通风换气、加热升温功能。每天向罐式发酵装置中添加5t新鲜鸡粪，发酵周期7d，随后将堆肥转至陈化车间。试验设置两个处理，T1：罐式发酵常规处理，每天添加5t鸡粪，不接种菌剂；T2：每天添加5t新鲜鸡粪，同时按0.5％(v/m)接种除臭菌剂SCAU1602。第1次接种菌剂时，罐式发酵装置中有连续发酵1～6天、未接种除臭菌的鸡粪堆肥处理样，菌剂按实验例4方法制备。

在鸡粪堆肥处理期间，采用便携式氨挥发采样装置收集T1、T2处理罐式设备产生的氨气，氨气吸收液为0.5mol/L硫酸，吸收液用量为每次100mL；每天11时收集，持续时间15min，各重复3次。按照《HJ 533-2009》所述纳氏试剂比色法测定吸收液中的铵浓度，计算单位体积气体中的氨气浓度，进而计算出罐式发酵的平均氨气抑制率(％)。

堆肥氨气抑制率(％)＝(T1处理单位体积气体中氨气浓度-T2处理单位体积气体中氨气浓度)/T1处理单位体积气体中氨气浓度*100％。

堆肥结束后，采集两个处理的堆肥产品，自然风干、过100目筛，凯氏定氮法测定堆肥产品全氮含量，重复3次，计算公式为：

堆肥全氮增加率(％)＝(T2全氮含量-T1全氮含量)/T1全氮含量*100％。

表3为两个不同处理的堆肥氨气产生量及抑制情况比较，结果可见，随着地衣芽孢杆菌SCAU1602菌剂的添加，鸡粪堆肥中T2处理单位体积(m³)气体中氨气浓度逐渐降低，说明SCAU1602逐渐发挥了抑制氨气产生的作用。期间，T1处理所产气体中氨气浓度始终保持在0.51～0.55g·m^-3；T2处理所产气体中氨气浓度从接种除臭菌当天(第1d)的0.47g·m^-3快速下降至第7d的0.26g·m^-3，随后保持稳定。据此计算出，鸡粪罐式发酵接种地衣芽孢杆菌SCAU1602后，其氨气产生抑制率从第1d的15.00±4.06％上升至第7d的50.96±9.10％，之后保持稳定。由此计算出接种除臭菌并进入稳定发酵(第7d)后，罐式装置的氨气产生平均抑制率为52.30±2.17％。

表3不同处理堆肥单位体积气体氨气浓度及氨气抑制率

进一步，实验测定了堆肥产品的主要指标，结果如表4所示，两个处理的堆肥产品pH介于7.0～8.0，有机质含量31.22％以上，总养分含量符合《NY/T525-2021》规定，达到了有机肥标准。尤其从堆肥产品的全氮含量看，T1处理为13.64±0.74g·kg^-1，T2处理为19.90±0.31g·kg^-1，T2较T1增加了45.89％。可见，地衣芽孢杆菌SCAU1602表现出了良好的保氮功效。

表4不同处理堆肥化学品质变化

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一株地衣芽孢杆菌SCAU1602，其特征在于，该菌株已于2022年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2022712。

2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌SCAU1602在制备生物菌剂中的应用。

3.一种生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包含如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌SCAU1602；其中，该生物菌剂为液体生物菌剂，其中的活菌数不少于1.0×10⁹ CFU/mL。

4.如权利要求3所述的生物菌剂在堆肥中的应用，其特征在于，所述应用包含鸡粪堆肥处理，能降低鸡粪发酵时氨气产生量，提高堆肥含氮量。