CN114717125A - 一株嗜热地衣芽孢杆菌amcc101380及其在尾菜高温堆肥中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株嗜热地衣芽孢杆菌AMCC101380及其在尾菜高温堆肥中的应用，本发明涉及的地衣芽孢杆菌AMCC101380，能够耐受高温，在高温条件下生长繁殖较快且具有淀粉、纤维素等降解功能，利于应用于堆肥温度大于60℃的高温期，以提高堆体温度，提升堆肥微生物多种降解酶的活性，促进堆肥物料降解和无害化程度。

Description

一株嗜热地衣芽孢杆菌AMCC101380及其在尾菜高温堆肥中的 应用

技术领域

本发明属于农业微生物及废弃物资源化利用技术领域，具体涉及一株促进尾菜高温堆肥 腐熟的嗜热地衣芽孢杆菌AMCC101380及其应用。

背景技术

农业有机废物主要包括农作物秸秆、畜禽粪便等，是有机废弃物中的一种。随着我国农 村经济的发展，农村的生产、生活方式也发生了巨大变化，农村固体废物的种类也随之增多， 尤其自实施“菜篮子”工程建设以来，市场对蔬菜产品的需求日益增长，种植产业结构有所 调整，推进了蔬菜种植产业蓬勃发展，促使蔬菜成为我国种植业中仅次于粮食的第二大农作 物。但是，在蔬菜生产及产品收获、加工的过程中也产生了大量烂根、烂叶等蔬菜废弃物(即 尾菜)，大量的尾菜并不能得到充分的利用，大部分都被当垃圾随意处理而带来了众多问题， 不仅对环境造成了巨大的压力，也造成了资源的浪费。近年来，随着新农村建设的速度加快， 农村固体废弃物的无害化、资源化集中处理受到了高度重视，尾菜资源的循环利用也普遍受 到政府、企业及农民的倡导和实践。

除了尾菜之外，我国玉米、小麦等其他农作物秸秆同样面临着产量过剩的问题，农作物 秸秆自然条件下降解缓慢，随意焚烧现象严重。好氧高温堆肥处理是解决尾菜问题的科学有 效的方法，能够将有机废物生物转化成腐殖质类物质，从而实现对环境保护和资源的循环利 用。通过好氧高温堆肥处理，可以将尾菜与玉米秸秆进行混合发酵制成有机肥料，实现废弃 物“变废为宝”，不仅可以解决尾菜的弃置和秸秆随意焚烧等带来的环境问题，也可以在一定 程度上缓解由过度施用化肥带来的土壤盐碱化和肥力下降的问题。

堆肥处理对消除环境污染、改善生态环境。好氧堆肥是实现有机废弃物无害化处理和资 源化利用的最佳途径，其过程实际上就是微生物的代谢活动的过程。影响好氧堆肥腐熟的因 素有很多，它们主要通过直接或间接地影响微生物的酶活及代谢活动来影响堆肥腐熟的进程 和堆肥产品的质量。温度是反映堆肥过程最直接的指标。根据堆肥过程中温度的变化，可将 堆肥分为升温阶段、高温阶段和降温阶段，高温期是堆肥腐熟和无害化的主要时期，可以实 现物料的降解和虫卵、杂草种子及病原菌的杀灭，向堆肥中添加微生物菌剂可以调节微生物 菌群结构，提高高温期微生物的数量及活性，从而促进堆肥腐熟进程、缩短周期、提高产品 质量。虽然国内外研究人员对好氧高温堆肥的过程及微生物菌剂作用方面进行了一系列研究， 但目前可用于促进堆肥高温期堆肥降解的菌种数量还远远不足，因此筛选耐高温降解菌种资 源、开发堆肥腐熟菌剂对促进堆肥进程仍具有十分重要的意义。

中国专利文献CN106957807A(申请号：201710184427.5)公开了一种地衣芽孢杆菌菌株 TA65及其在促进堆肥腐熟中的应用，该菌株能够产耐高温木质纤维素降解酶；相对于该发明， 本发明涉及的菌株具有的优点和区别为：可耐受更高的温度60℃，培养48h后菌液浓度至少 可达到10⁹cfu/mL，55℃条件下产生的纤维素酶具有更高的酶活，纤维素酶(内切β-葡聚糖 酶)活力为14.64U/mL，比其该发明中纤维素酶活力高16倍，在提高堆体温度和高温持续时 间方面的效果更加明显，整个过程的有机质(OM)降解率更高，较初始含量下降了19.6％。

中国专利文献CN104357357A(申请号：201410631705.3)公开了一种高产α-淀粉酶的 耐高温地衣芽孢；该菌株HWyb1401可产生一种耐高温α-淀粉酶，适应于禽畜粪便高温堆肥； 而本发明地衣芽孢杆菌除了具有一定的产耐高温α-淀粉酶功能外，还具有较好的产耐高温纤 维素酶的功能，主要应用于尾菜高温好氧堆肥。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株嗜热地衣芽孢杆菌AMCC101380及其在尾菜高 温堆肥中的应用。

本发明与现有技术相比，改进了尾菜处理过程中能力不足的问题，主要通过增加堆体的 温度和持续时间，促进尾菜的处理效率，减少尾菜体积和堆积空间，同时也保证了堆肥过程 中的腐熟化和无害化程度。本发明涉及地衣芽孢杆菌突出的区别点：在55℃条件下产生纤维 素酶活力显著高于现有技术中其他芽孢杆菌(CN 105524858 A的枯草芽孢杆菌H1-7；CN 106957807 A的地衣芽孢杆菌TA65；CN 110066746 A中芽孢杆菌属细菌NJAU-ND8)。本发 明涉及的地衣芽孢杆菌在堆肥应用中涉及的堆肥相关指标与现有技术相比主要的突出区别点 或者改进点：在促进升温保温、有机质(OM)降解、发芽指数(GI)的升高、C/N的降低方 面效果显著，另外本发明还进行改进测定了堆肥过程中脲酶、纤维素酶和过氧化氢酶活力的 变化，从而对堆肥过程中氮的累积、大分子有机物的降解和有毒物质含量的降低进行了评估。

本发明涉及的尾菜即蔬菜废弃物，与其他物料相比，其含水量高，一般在90％以上，干 物质含量少，体积大；多在蔬菜收获季的蔬菜产地、集散地及销售点大量集中产生；与秸秆 畜禽粪便等一般堆肥物料相比更接近人口聚集区，易腐坏产生环境问题需要及时处理。现有 堆肥技术对高含水尾菜处理效果差，体积减量作用小，酶活转化效率低，本发明涉及的菌剂 是从尾菜高温自然堆肥中筛选分离的对高含水物料的堆肥处理具有先天优势，能促进升温、 维持高温实现尾菜快速腐解减量，且可以分泌多种耐热高活性酶，转化效果好。

脲酶是影响氨转化和有机氮转化的主要酶，影响堆肥过程中氮的累积和排放，能够将堆 肥物料中的有机氮转化为作物根系易吸收的NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N等氮素，同时过高的脲酶也可 能导致堆肥高温期氮的释放，因此堆肥前期应尽量提高脲酶的活性，后期应使脲酶活性降低。 但本发明主要针对尾菜的处理(尿素含量低)和有机肥的生产，凯氏氮含量变化结果也表明， 较高的脲酶活性有利于尾菜对堆肥中有机氮转化为植物易吸收的氮形态，从而对有机肥肥效 有提升作用。

本发明的目的在于基于目前有机废弃物堆肥领域中出现的进程慢、腐熟质量差等实际问 题，提供一株能在高温环境下良好地存活且具有淀粉、纤维素降解功能的地衣芽孢杆菌 AMCC101380。

一株嗜热地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AMCC101380，保存日期2020年11月 23日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保 藏编号为CCTCC NO：M2020769。

所述地衣芽孢杆菌AMCC101380的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

所述的地衣芽孢杆菌AMCC101380筛选自花椰菜尾菜好氧高温堆肥中高温时期的样品。

上述地衣芽孢杆菌AMCC101380菌株的培养方法，包括如下步骤：

将AMCC101380菌株进行活化，挑取单菌落接入LB液体培养基进行高密度培养，起始 pH 6.5-7.5，45-60℃恒温培养，转速150-220r/min，培养得到发酵液。

根据本发明优选的，所述培养方法，包括如下步骤：

将AMCC101380菌株进行活化，挑取单菌落接入LB液体培养基进行高密度培养，起始 pH 6.5-7.5，装液量40-50mL，55℃恒温培养，转速180r/min，培养48h得到发酵液。

地衣芽孢杆菌AMCC101380在降解纤维素中的应用。

地衣芽孢杆菌AMCC101380在制备淀粉酶中的应用。

地衣芽孢杆菌AMCC101380在堆肥中的应用。

根据本发明优选的，地衣芽孢杆菌AMCC101380在尾菜堆肥中的应用。

根据本发明优选的，地衣芽孢杆菌AMCC101380在促进尾菜好氧高温堆肥腐熟中的应 用。

进一步优选的，所述应用，包括如下步骤：

将所述芽孢杆菌AMCC101380发酵液用无菌水稀释后，达到10⁸cfu/mL以上的菌浓度， 按2％(v/v)的接种量接入尾菜堆体中发酵。

所述芽孢杆菌AMCC101380菌株，在高温条件下具有良好的代谢活性，在55℃条件下 的LB液体培养基中培养2天产生的α-淀粉酶活为17.56U/mL，纤维素酶活为14.64U/mL。

芽孢杆菌AMCC101380对人、动物和作物无害，对环境无污染。

有益效果

1、本发明提供的地衣芽孢杆菌AMCC101380，利于应用于堆肥温度大于60℃的高温期；

2、本发明提供的地衣芽孢杆菌AMCC101380从花椰菜高温好氧堆肥高温期样品中分离 筛选得到，能够耐受高温，在高温条件下生长繁殖较快且具有淀粉、纤维素等降解功能；

3、通过在堆肥中接种包含地衣芽孢杆菌AMCC101380菌种的堆肥菌剂，可以提高堆体 温度，提升堆肥微生物多种降解酶的活性，促进堆肥物料降解和无害化程度；

4、本菌剂微生物构成简单，成本低，制备方便，使用安全、简单，应用效果良好且范围 广泛。

附图说明

图1为本发明实施例提供的B.licheniformis AMCC101380菌株16S rDNA序列进化树；

图2为B.licheniformis AMCC101380菌落图；

图3为B.licheniformis AMCC101380菌株淀粉降解图；

图4为B.licheniformis AMCC101380菌株纤维素降解图；

图5为温度随堆肥时间的变化曲线；

图中：Ecvironment：环境温度；空白组(CK)；实验组(T)；

图6为堆肥过程中pH的变化曲线；

图中：空白组(CK)；实验组(T)；

图7为堆肥过程中EC的变化曲线；

图中：空白组(CK)；实验组(T)；

图8为含水率随堆肥时间变化曲线；

图中：空白组(CK)；实验组(T)；

图9为有机质在堆肥过程中的变化曲线；

图中：空白组(CK)；实验组(T)；

图10为凯氏氮在堆肥过程中的变化曲线；

图中：空白组(CK)；实验组(T)；

图11为C/N在堆肥过程中的变化曲线；

图中：空白组(CK)；实验组(T)；

图12为发芽指数随堆肥时间的变化曲线；

图中：空白组(CK)；实验组(T)；

图13为堆肥过程中脲酶活性的变化；

图中：空白组(CK)；实验组(T)

图14为堆肥过程中纤维素酶活性的变化；

图中：空白组(CK)；实验组(T)；

图15为堆肥过程中过氧化氢酶活性的变化；

图中：空白组(CK)；实验组(T)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明的保护范围不限于此。实 施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作， 若无特殊说明，均为本领域常规操作。

生物材料保藏信息

菌株AMCC101380，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2020年11月23 日，保藏编号为CCTCC NO：M2020769。

实施例1

本发明涉及的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AMCC101380的筛选及鉴定

1.实验试剂与设备

1.1主要试剂，见表1

表1

1.2主要仪器与设备，见表2

表2

1.3培养基

LB培养液：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，去离子水1000mL；固体培养基再加琼脂15-20g。

淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，去离子水1000mL；琼脂15-20g。

CMC-Na培养基：KNO₃ 2g，MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，NaCl 1g，Na₂PO₄ 1g，羧甲基纤 维素钠20g，刚果红0.2g，琼脂15-20g，去离子水1000mL。

1.4功能菌株的分离和鉴定

称取采集的高温期堆肥样品10g装入已灭菌且装有玻璃珠和90ml无菌水三角瓶中，在摇 床上55℃，180r/min下振荡30min，混合均匀，得到土壤悬浮液。用移液枪吸取土壤悬浮液 60mL分别加入90mL LB培养基中，摇床富集培养24h。在无菌条件下吸取培养液500μL， 加入4.5mL的无菌水中，用涡旋振荡器振荡均匀，进行梯度稀释。分别吸取10^-4、10^-5、10^-6浓度的稀释液100uL分别加到LB培养基平板中央，用无菌涂布棒涂匀，每个梯度作三个平行，然后在55℃，180r/min条件下倒置静态培养2d。用接种环挑取单菌落于基本培养基进行三区划线纯化，继续55℃培养，待长出肉眼可见的单菌落后编号并于4℃冰箱中保存。

通过降解功能的定性和定量筛选，最终从高温自然堆肥中获得一株细菌，命名为AMCC101380，如图2所示，其在LB平板上的菌落较大，表面粗糙、呈淡黄色、菱形且边 缘不规则，有突起，具有一定的黏稠性，易挑起。显微镜下观察其呈杆状，革兰氏染色阳性， 产芽孢。其最适生长温度为45-60℃，在55℃下可正常生长，兼性厌氧，具有糖发酵功能， 能产生接触酶，对淀粉及纤维素有较强的分解能力，如表3～表4和图3～图4所示。

以菌株AMCC101380菌液为模板，以16S rDNA通用引物27F(5'-GAG AGT TTG ATCCTG GCT CAG-3')和1492R(5'-ACG GAT ACC TTG TTACGA CTT-3')引物进行菌液PCR 扩增16S rDNA序列。PCR反应体系为：10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，上游引物27F 0.5μl，下 游引物1492R 0.5μl，Taq酶0.15μl，DNA模板1μl，超纯水18.35μl。PCR程序为：94℃预变 性10min，94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min，4℃ 保温。琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR产物条带单一大小约为1.5kb，将PCR产物送至上海铂 尚测序公司测序，测序结果见序列表SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

通过对AMCC101380菌株的16S rDNA序列分析，在GenBank核苷酸序列数据库中进行 Blast比对搜索，选择与AMCC101380同源性较高的序列进行系统发育学分析，结果如图1所示。结合菌株的形态特征、理化特征和16S rDNA序列分析，将菌株AMCC101380鉴定为 地衣芽孢杆菌，将其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020769。

表3高温菌AMCC101380的降解功能

表4高温菌AMCC101380的生理生化性状

“+”表示为阳性；“-”表示为阴性

实施例2

菌株AMCC101380产酶活性的测定

将菌株进行活化后挑取菌落接种于LB液体培养基，在摇床中55℃，180r/min条件下振 荡培养24h制得种子液。

2.1淀粉酶活性的测定

淀粉酶产酶培养基：可溶性淀粉20g，酵母膏5g，蛋白胨5g，NaCl 5g，KH₂PO₄ 1g，CaCl₂ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.5g，去离子水1000mL。稀碘液：称取0.1g碘和1.0g碘化钾，将 其充分溶解于20mL水中，使用时稀释100倍。

粗酶液的制备：吸取2mL种子液于100mL淀粉酶产酶液体培养基中，置于摇床中55℃， 180r/min条件下振荡培养48h。将发酵液转移至2mL离心管中，10000rpm离心10min，吸取 上清液制得酶液。

测定：在试管中加入5mL浓度为5mg/mL的淀粉底物溶液，55℃水浴预热10min后加入 1mL酶液，以水代替酶液作为对照组，继续水浴反应30min，反应终止液为0.1mol/L的硫酸溶 液。将反应液与稀碘液1:10混合后，测620nm处吸光度。酶活定义：在55℃条件下，1mL酶 液在30min内水解1mg淀粉为1个酶活力单位。酶活力(U/mL)＝(D₀-D)/D₀×25×稀释倍数， 其中D₀为对照组的吸光值，D为反应液的吸光值。

2.2纤维素酶活性的测定

纤维素酶产酶培养基：KNO₃ 2g，MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，NaCl 1g，Na₂PO₄ 1g，羧甲基纤维素钠20g，去离子水1000mL。

粗酶液的制备：吸取2mL种子液于100mL纤维素酶产酶液体培养基中，置于摇床中55℃， 180r/min条件下振荡培养48h。将发酵液转移至2mL离心管中，10000rpm离心10min，吸取上 清制得酶液。

测定：首先在干洁的试管中加入1.5mL CMC-Na底物溶液，在55℃下水浴预热5min后， 再向试管中加入0.5mL稀释好的酶液，在55℃下保温30min后，立即加入DNS试剂3mL，放入沸水浴中准确反应10min，最后用冷水终止反应，以水代替酶液作为对照组，测定520nm处吸光度。酶活定义：1mL粗酶液在55℃条件下，每分钟水解CMC-Na产生1μg还原糖(以 葡萄糖记)定义为1个酶活力单位。酶活计算：酶活力(U/mL)＝C×稀释倍数×1000。式中C 为吸光度所对应的葡萄糖浓度(mg/mL)。

上述酶活测定结果，见表5。

表5菌株AMCC101380产酶活性测定

如表5所示，菌株AMCC101380产淀粉酶活力为17.56U/mL，纤维素酶的活力为14.64U/mL。

实施例3

菌株AMCC101380在尾菜堆肥中的应用

AMCC101380接种菌剂的制备：将AMCC101380菌株保藏斜面进行活化，挑取单菌落接 入LB液体培养基进行高密度培养，起始pH 6.5～7.5，装液量40～50mL，在摇床中55℃、180r/min培养48h，使其最终浓度达到10⁹cfu/mL，得到发酵菌液。AMCC101380菌液用无菌水稀释后，使接种菌液浓度达到10⁸cfu/mL。

将白菜与玉米秸秆按照1.5:1比例制成尾菜堆肥，控制含水率为63％，C/N为30-35，将 上述菌剂按2％(v/v)的接种量接入尾菜堆体中，在容量为6L的具有保温功能的堆肥桶中进 行发酵，以无菌培养基代替菌剂进行添加作为对照组，每组处理作3个平行，每2h以50L/H 的速率通气20min，以进行好氧发酵。

堆肥过程包括3个阶段，分别为升温阶段、高温阶段和降温腐熟阶段，如图5。堆肥共 进行了12d，分别在第0、2、5、10d取样，测定了温度，pH，EC，含水率，种子发芽指数， 有机质，凯氏氮含量和脲酶、纤维素酶、过氧化氢酶等参数。温度、pH和电导率(EC)指 标分别使用温度计、pH计和电导率仪测定；发芽指数(GI)采用萝卜种子进行发芽测定；有 机质(OM)含量的测定采用水合热重铬酸钾氧化-比色法；凯氏氮采用半微量凯氏(Kjedahl)定氮法测定；脲酶的测定采用苯酚钠比色法，脲酶活性以每克样品每小时酶促反应消耗尿素 生成氨的数量表示；纤维素酶的测定采用DNS比色法，纤维酶活性以单位样品重量24h产 生葡萄糖的量表示；过氧化氢酶的测定采用紫外分光光度计法，过氧化氢酶活性以1g样品 每分钟反应消耗过氧化氢的量表示。

温度是堆肥过程的直接体现，也反映出了堆肥的腐熟程度和产品质量。接菌处理T在1 天后堆体温度达到了60.9℃，并在温度为50℃以上保持了7d、在60℃以上保持了3天，在 第3天达到了最高温度62.5℃。而对照CK处理在温度为50℃以上保持了5d，但在堆肥过程 中始终未达到60℃，最高温度为57.9℃。当堆体的温度在50℃以上保持7天以上，即可杀灭 堆体中的大部分的病菌、达到堆肥无害化标准。因此，与对照组CK相比，添加菌剂的T组具有更高的无害化程度。结果显示添加含有AMCC101380的菌剂后显著促进了堆体温度的升高，表明地衣芽孢杆菌AMCC101380促进了堆肥腐熟程度，促进了堆肥的进程。堆体温度也影响了含水率，堆肥过程中含水率呈现下降趋势(图8)，其中T处理从初始62.8％下降至50.7％，下降了12.1％；而对照CK处理从处理64.1％下降至52.5％，下降了11.6％，接种菌剂加快了堆体体积的下降。

图6为堆肥过程中pH的变化曲线，随着堆肥时间的增加，pH为先上升后下降的趋势， 且相对于对照CK处理，添加菌剂的T处理具有更高的pH值。pH的变化是微生物生长的结果，堆肥初始阶段pH上升是细菌快速繁殖增长和产生了大量NH₄ ⁺-N的结果。随着微生物的生长和代谢，产生了有机酸的积累，同时在高温期间释放出了较多的氨气，导致pH下降， 最终CK和T处理的pH分别降至8.16和8.30。图7为堆肥过程中EC的变化曲线，电导率 反应了堆肥过程中可溶性盐含量的变化，本次实验中EC值随着堆肥的进程逐渐升高，T处理 的EC值普遍低于CK处理，最终CK和T处理的EC指数分别为2.91mS·cm^-1和2.74mS·cm^-1(EC<3.0mS·cm^-1)。

堆肥过程中的OM、凯氏氮和C/N分别如图9、10和11所示，T处理在堆肥过程中OM 从805.22mg·g^-1降至647.75mg·g^-1，下降了19.56％；凯氏氮从16.52mg·g^-1上升至23.14mg·g^-1， 增幅了40.07％。而CK处理OM由786.92mg·g^-1降至679.21mg·g^-1，共下降了13.69％，凯氏 氮从16.20mg·g^-1上升至21.50mg·g^-1，共增幅了32.72％。从结果来看，添加AMCC101380菌 剂的T组的OM下降和凯氏氮上升程度更高，表明腐殖化程度更高。从碳氮比(C/N)变化 来看，由于总有机碳(TOC)的下降和凯氏氮的上升，C/N呈不断下降趋势，最终CK和T 处理的C/N分别降至18和16左右，最终C/N保持在15-20之间则达到了堆肥基本腐熟的标 准。

发芽指数(GI)是用来评价有机肥的毒性和腐熟度的重要指标。从GI值的变化(图12)来看，两组处理的起始GI值均在30％左右。随着堆肥的进程，T处理的GI值上升的更快，仅在第5天就达到了88.13％，比CK处理更早地达到腐熟标准(≥80％)。最终T处理的GI 值达到100.73％，CK处理为91.00％，T处理的GI值显著高于CK处理(P<0.05)。GI结果 表明AMCC101380菌剂的添加促进了堆肥的腐熟和无害化程度。

脲酶是影响氨转化和有机氮转化的主要酶，能够分解大分子有机氮和促进NH₄ ⁺-N的形 成，影响着堆肥产品的含氮量。脲酶的活性与有机质含量和微生物数量相关，从堆肥过程中 脲酶活性的变化情况来看(图13)，整体呈现出先上升后下降的趋势，原因是堆肥起始阶段 微生物数量低，酶活性较低，此时CK和T处理脲酶活性分别为14.33mg·g·h^-1和18.11mg·g·h^-1； 脲酶的测定采用苯酚钠—次氯酸钠比色法，随着堆肥的进程和温度的升高，微生物数量增多， 与氮转化有关的代谢活动旺盛，酶活性逐渐增加，在第5天达到最高(44.02mg·g·h^-1和 56.97mg·g·h^-1)；随着物料的降解完全，酶活性又逐渐下降。相较于对照CK处理，整个堆肥 过程中添加AMCC101380菌剂的T组处理酶活性值处于更高的范围，说明T组中含氮有机 物矿化程度可能更高，结合堆肥过程中凯氏氮的变化情况，表明本发明菌剂增加了堆肥产品 的肥效。

堆肥过程中纤维素酶的变化指示着堆肥物料的降解情况，同脲酶活性变化趋势一样，纤 维素酶的测定采用DNS比色法，纤维素酶活性变化也是呈现先升高后降低的趋势(图14)。CK和T处理初始酶活性较低，分别处在3.90mg·g·d^-1和4.62mg·g·d^-1；随着堆肥的进程，在 高温期第5天分别达到最高值27.48mg·g·d^-1和33.78mg·g·d^-1，此时与纤维素降解有关的代谢 活动最旺盛。堆肥过程中T组处理的纤维素酶活性明显高于CK组，说明T组的物料降解程 度更高，表明本发明菌剂可促进堆肥的腐熟。

堆肥过程中产生的过氧化氢对生物体具有毒害作用，而过氧化氢酶能促进过氧化氢的分 解，有利于防止过氧化氢的毒害作用。过氧化氢酶的测定采用紫外分光光度计法，从过氧化 氢酶变化来看(图15)，随着堆肥的进程，过氧化氢酶活性是不断波动变化的，这主要与堆 体的温度有关，高温期较高的温度抑制了过氧化氢酶的活性，减少了相关微生物的数量。对 比两组处理的酶活力变化情况，其在堆肥初始和结束阶段的值差别不大，而在高温期具有明 显的差别，第2天的CK和T处理的酶活性值分别为469.89mg·g·min^-1和555.93mg·g·min^-1， 第5天分别为352.47mg·g·min^-1和442.56mg·g·min^-1，T处理的过氧化氢酶活性显著高于CK 处理(P<0.05)。结果表明添加AMCC101380菌剂T处理的过氧化氢酶活性更高，说明 AMCC101380菌剂的添加能促进堆肥中过氧化氢的分解，有利于防止过氧化氢对生物体的毒 害作用，促进的堆肥的无害化处理。

对比例1

与实施例3的不同之处在于，在尾菜堆肥中接种的菌剂用地衣芽孢杆菌CGMCC13531 代替地衣芽孢杆菌AMCC101380，其他相同。

该对比例1在堆肥过程中OM从795.32mg·g^-1降至671.83mg·g^-1，下降了15.53％；凯氏 氮从16.32mg·g^-1上升至22.03mg·g^-1，增幅了35％；由此可以看出，添加CGMCC13531菌剂 的OM下降和凯氏氮上升程度相对于本发明涉及的AMCC101380菌剂较低，表明腐殖化程度 较低。

综上，本发明涉及的地衣芽孢杆菌AMCC101380在高温条件(60℃)下具有良好的生存 和降解能力，具有较高的淀粉酶和纤维素酶活性，接种该菌株后能够有效提升尾菜堆肥的温 度，提升堆肥微生物多种降解酶的活性，促进堆肥物料降解和无害化程度，提高尾菜堆肥效 率。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一株嗜热地衣芽孢杆菌AMCC101380及其在尾菜高温堆肥中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1402

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcaagtcga gcggaccgac gggagcttgc tcccttaggt cagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120

atgcttgatt gaaccgcatg gttccattct aaaagggggc ttttaactac cactttccga 180

tggacccgcg gcgcattaac taattggtga aggaacggct ccccaagggg acgatgcgta 240

accgaactga aaaggtgatc ggccacactg ggactgaaac ccggcccaaa atcctacggg 300

aaggagcagt agggaatctt ccgcaatgga ccaaagtctg acggaaccac gccgcgtgag 360

tgatgaaggg tttccgatcc taaaactctg gtggtaagga agaacaagta ccgttccaat 420

aaggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480

cggtaatacg targtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg 540

gtttcttaag tctgatgtga aagccccccg gctcaaccgg ggarggtcat tggaaactgg 600

ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga 660

tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggcgcga 720

aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc 780

taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgcagcaaa cgcattaagc actccgcctg 840

gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900

agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac 960

aaccctagag atagggcttc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020

cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080

tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatgggcag 1200

aacaaagggc agcgaagccg cgaggctaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga 1260

tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320

cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380

cacccgaagt cggtgaggta ac 1402

Claims (10)

1.一株地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis AMCC101380，保存日期2020年11月23日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2020769。

2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌AMCC101380，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌AMCC101380的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌AMCC101380菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

将AMCC101380菌株进行活化，挑取单菌落接入LB液体培养基进行高密度培养，起始pH6.5-7.5，45-60℃恒温培养，转速150-220r/min，培养得到发酵液。

4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法，包括如下步骤：

将AMCC101380菌株进行活化，挑取单菌落接入LB液体培养基进行高密度培养，起始pH6.5-7.5，55℃恒温培养，转速180r/min，培养48h得到发酵液。

5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌AMCC101380在降解纤维素中的应用。

6.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌AMCC101380在制备淀粉酶中的应用。

7.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌AMCC101380在堆肥中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，地衣芽孢杆菌AMCC101380在尾菜堆肥中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，地衣芽孢杆菌AMCC101380在促进尾菜好氧高温堆肥腐熟中的应用。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用，包括如下步骤：

将地衣芽孢杆菌AMCC101380发酵液用无菌水稀释后，达到10⁸cfu/mL以上的菌浓度，按2％(v/v)的接种量接入尾菜堆体中发酵。

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