CN112011487B - 一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌菌株c40及其应用 - Google Patents

一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌菌株c40及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌菌株C40及其应用，涉及菌株筛选和应用技术领域。本发明所述菌株C40的保藏编号为CGMCCNo.20347。本发明所述菌株C40具有高效降解苯酚的功能，将所述菌株C40应用于苯酚污染土壤中，苯酚降解率最高可达95.1％。菌株C40具有较好的解磷和解钾能力，在摇瓶条件下C40对磷酸三钙的转化量达到325.62mg·L‑1，对钾长石粉的转化量达到25.99mg·L‑1。在土壤中接种菌株C40能够提高土壤磷和钾的有效性并促进作物对磷和钾的吸收。所述菌株C40还具有促生作用，显著促进玉米的生长和对养分的吸收，并提高玉米抗性，提高小白菜生物量和品质。

Description

一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌菌株C40及其应用
技术领域
本发明属于菌株筛选和应用技术领域，具体涉及一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌菌株C40及其应用。
背景技术
苯酚是常见的工业原料和中间产物，在医药、农药等工业领域中具有重要用途[1]，苯酚具有毒性，是一种常见的、普遍的有机污染物。近年来，由于污水灌溉和滥用农药，一些地区的土壤已被苯酚污染[2]。进入土壤的苯酚污染物会破坏土壤原有的生态平衡，抑制土壤微生物的生物活性，进入植物组织后，会对叶绿体造成严重的破坏，抑制植物的光合作用[3]。我国已经把苯酚列入中国环境优先污染物的“黑名单”之中[4]。
传统的物理化学技术像吸附法[5]、膜分离法[6]、溶剂萃取法[7]和高级氧化法[8]等可以用来从环境中去除苯酚，但是由于成本高和产生其他有毒的最终产物，这些技术在处理土壤中的苯酚污染物方面的应用具有一定的限制性。因此，寻找一种经济可行的处理方法来解决土壤苯酚污染问题已成为当前研究的热点。
微生物的吸附能力很强，降解性良好，几乎不产生二次污染，对环境的影响小，可以忽略并且成本低，可大面积使用。在通过生物技术处理污染物中的方法中，微生物成为降解污染物的主要处理方法[9]。降解苯酚菌株主要存在于苯酚污染企业的废水、污泥和土壤中[10]。目前，相关人员经过对被污染土壤中的具有苯酚降解能力细菌的长期不断研究，已经分离得到了多种具有苯酚降解能力的细菌，主要有醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)[11]、红球菌(Rhodococcussp.)[12]、根瘤菌(Rhizobia)[13]等，但是基于菌种多样化的考虑，以及菌种生存条件的限制性，需要更多种具有苯酚降解能力的细菌以应对不同污染条件下苯酚的降解处理。
在农业生产中，由于化学肥料的过量施用，导致土壤肥力的降低，对农业的可持续发展带来很大的影响。化肥的过量施用造成肥料利用率的降低[14]，大量的养分元素进入环境中也可能带来一系列的环境问题，例如水体富营养化[15]，地下水的硝酸盐污染等[16]，肥料的过量施用也是粮食和蔬菜品质下降的原因之一。提高化肥利用效率，减少化肥用量，提高土壤肥力成为可持续农业发展中急需解决的问题。土壤中磷和钾元素主要以难溶态存在于土壤中，因此利用土壤中原有的难以被利用的营养元素，成为农业可持续发展的重要途径之一。环境中存在很多具有解磷和解钾作用的微生物[17]。这些微生物在自身新陈代谢过程中能够将难以被作物利用的无机磷和钾转化成有效态磷钾。解磷解钾微生物在土壤中具有持续释放土壤养分的作用，保障作物对养分的吸收利用。因此，筛选并培养具有解磷解钾等作用的微生物，并应用于农业生产中，对促进作物生长，保持生态环境平衡具有重要意义。
参考文献：
[1]王乾.苯酚高效降解菌的筛选及其代谢动力学研究[D].武汉科技大学,2011.
[2]王图锦,潘瑾,刘雪莲.高效苯酚降解菌PDB1的筛选及降解特性研究[J].科学技术与工程,2017,17(02):301-304.
[3]刘娜,胡元森,王丹,等.苯酚对土壤中微生物数量及酶活性的影响[J].河南农业大学学报,2009,43(01):88-91.
[4]周文敏,傅德黔,孙宗光.中国水中优先控制污染物黑名单的确定[J].环境监测管理与技术,1991(04):18-20.
[5]马娜,李咏梅,顾国维,等.难降解有机污染物的生物治理技术进展[J].工业水处理,2002,22(10):1-2.
[6]王绍洪,王红军,徐志康,等.膜萃取器设计及应用研究进展[J].膜科学与技术,2002,22(1):39-43.
[7]史长林.含酚废水处理方法的研究[J].河北煤炭建筑工程学院学报,1995,4(4):4-9.
[8]Li M,Feng C P.Electrochemical degradation of phenol usingelectrodes of Ti/RuO2-Pt and Ti/IrO2-Pt[J]2009,162:455-462.
[9]何全.微生物在污水处理中的应用分析[J].环境与发展,2019,31(07):50-51.
[10]赵宇虹,王月,兰莹,等.高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究[J].农业与技术,2016,36(17):4-6.
[11]陈明,张维,徐玉泉,等.醋酸钙不动杆菌PHEA-2对苯酚的降解特性研究[J].中国环境科学,2001,21(3):226-229.
[12]沈锡辉,刘志培,王保军,等.苯酚降解菌红球菌PNAN5菌株(Rhodococcussp.strain PNAN5)的分离鉴定、降解特性及其开环双加氧酶性质研究[J].环境科学学报,2004(03):482-486.
[13]Latha S,Mahadevan A.Role of rhizobia in the degradation ofaromatic substances[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,1997,13(6):601-607.
[14]叶昴成,陈振华.提高我国肥料利用率技术的现状研究进展[J].种子科技,2019,037(008):111.
[15]王琳琳,姜彬慧.水生植物在水处理中的应用现状[J].环境生态学,2020,2(Z1):48-50.
[16]安宝明,徐从海,黄永军.农村饮用水水源地硝酸盐污染特性研究[J].水资源开发与管理,2020(02):52-55.
[17]Li C,Li Q,Wang Z,et al.Environmental fungi and bacteriafacilitate lecithin decomposition and the transformation of phosphorus toapatite[J].Scientific reports,2019,9(1):1-8.
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌(Myroides xuanwuensis)菌株C40及其应用，所述菌株C40具有高效苯酚降解能力，并且具有较好的解磷解钾能力，在实际的苯酚污染物降解以及提高作物生长、品质以及抗逆性的应用中有良好的前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株类香味菌(Myroides xuanwuensis)菌株C40，所述菌株C40的保藏编号为CGMCCNo.20347。
优选的，所述菌株C40为革兰氏阴性菌，呈不规则杆状；菌落表面光滑，边缘整齐，不透明，略带黄色。
优选的，所述菌株C40的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述菌株C40在降解苯酚中的应用。
优选的，所述苯酚以溶液计，浓度不高于1000mg/L。
本发明还提供了一种苯酚降解剂，所述苯酚降解剂的活性成分包括上述菌株C40。
本发明还提供了一种降解苯酚的方法，包括以下步骤：向含有苯酚的溶液中接种上述类香味菌(Myroides xuanwuensis)菌株C40的菌液后培养；所述菌液的接种量为1％，所述培养的时间为48h。
本发明还提供了一种解磷解钾的方法，包括以下步骤：在土壤中接种所述类香味菌(Myroides xuanwuensis)，接种量为108CFU/g土壤，培养时间为30d。
本发明还提供了上述菌株C40或上述苯酚降解剂在修复苯酚污染土壤中的应用。
本发明还提供了上述菌株C40或上述苯酚降解剂在提高苯酚污染土壤中磷钾有效性、种植作物和蔬菜的产量品质和抗性中的应用。
本发明以苯酚为筛选压力，通过富集和平板分离，从受污染的菜地土壤中获得了一株具有高效苯酚降解能力的菌株C40；将C40接种于PKO培养基与解钾细菌培养基中，发现该菌株也具有高效的解磷解钾能力。
经过16S rDNA序列分析比对，该菌株与类香味菌(Myroides xuanwuensis)的同源性最高，16S rDNA序列的同源性为99.13％。且经过试验发现菌株C40的最佳降解条件为：培养时间为48h，接种量为1％，苯酚初始浓度为250mg/L，pH为7，装液量为25mL/250mL，氮源为酵母粉。本发明通过分析菌株在不同苯酚初始浓度的培养基中的生长情况与降解效率，发现随着苯酚初始浓度的增加，菌株对苯酚的降解效率显著下降，和所需的降解完成时间显著延长。当培养基浓度低于250mg/L时，菌株在48h内可以基本上完全降解。当达到500mg/L的苯酚浓度时，仍有一定的降解作用。当苯酚浓度达到1000mg/L时，几乎抑制了苯酚在培养基中的降解。
本发明将所述菌株C40接种于受苯酚污染的土壤中后能够稳定存在，并在接菌后6天内降解速率最快，之后逐渐趋于平稳，培养15天后，苯酚降解率达95.1％。
所述菌株C40还有促生作用，将所述菌株C40接种到土壤中能够提高土壤磷钾养分有效性，提高作物养分吸收，改善根系构型，促进作物生长并增强作物抗性和品质。在轻度苯酚污染土壤中可以实现边修复边生产，具体表现在：苗期玉米的株高、地上部和地下部生物量均比CK显著提高，C40处理显著改善玉米根系构型，增加总根长和根体积，同时根表面积和根尖数也显著提高，地上部MDA含量降低，SOD活性提高。从植株养分含量上看，与CK相比，C40处理对植株全氮含量没有影响，但是提高了全磷和全钾的含量。在小白菜种植中，增加小白菜产量，提高可溶性糖、可溶性蛋白和维生素C等含量，提升了小白菜品质。
附图说明
图1为菌株C40的菌落形态特征图；
图2为根据16S rDNA序列构建的C40菌株的系统发育树，其中标尺代表每100个核苷中有1个核苷替代；
图3为培养时间对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响，且图中的不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)，下同；
图4为接种量对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响；
图5为苯酚初始浓度对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响；
图6为初始pH对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响；
图7为装液量对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响；
图8为氮源对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响；
图9为C40处理下土壤苯酚含量的动态变化(A)和C40菌株的定殖情况(B)。
图10为C40处理下玉米植株MDA含量(左)和SOD活性(右)。
生物保藏信息
类香味菌(Myroides xuanwuensis)菌株C40，于2020年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.20347。
具体实施方式
本发明提供了一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌(Myroidesxuanwuensis)菌株C40，所述菌株C40的保藏编号为CGMCCNo.20347。
本发明所述菌株C40筛选自河南省中牟市官渡桥村(34°75'N，114°5'E)的一处长期被农药污染的菜地土，本发明在进行所述筛选时，优选以苯酚为筛选压力，通过富集和平板分离，从受污染的园林土壤中获得了一株具有高效苯酚降解能力的菌株C40。经过16SrDNA序列分析比对，该菌株与类香味菌(Myroides xuanwuensis)的同源性最高，16S rDNA序列的同源性为99.13％。本发明所述16S rDNA序列优选如SEQ ID NO.1所示。本发明所述菌株C40优选为革兰氏阴性菌，呈不规则杆状；菌落表面光滑，边缘整齐，不透明，略带黄色。
本发明还提供了上述菌株C40在降解苯酚中的应用。
本发明所述苯酚优选以溶液计，浓度不高于1000mg/L。
本发明还提供了一种苯酚降解剂，所述苯酚降解剂的活性成分包括上述菌株C40。本发明所述苯酚降解剂中还包括菌剂常用的辅料，以保持菌株活性。
本发明还提供了一种降解苯酚的方法，包括以下步骤：向含有苯酚的溶液中接种上述类香味菌(Myroides xuanwuensis)菌株C40的菌液后培养；所述菌液的接种量为1％，培养时间为48h。
本发明利用所述菌株C40用于降解苯酚时，优选的设置为：培养时间为48h，接种量为1％，苯酚初始浓度为250mg/L，pH为7，装液量为25mL/250mL，氮源为酵母粉，在此条件参数下，可达到最大降解率。
本发明提供了一种解磷解钾的方法，在土壤中接种所述类香味菌(Myroidesxuanwuensis)，接种量为108CFU/g土壤，培养时间为30d。本发明为了测定所述菌株C40的解磷解钾，优选采用摇瓶试验，将C40菌株分别接种于30mLPKO培养基或解钾细菌培养基中，在30℃和转速180r/min条件下培养72h后，菌株C40对磷酸三钙和钾长石粉的转化量分别达到325.62mg·L-1和25.99mg·L-1。在本发明实施例中，还通过盆栽实验验证了其解磷解钾能力：将C40菌株接种与土壤中，接种量为108CFU/g土壤，培养时间为30天，菌株C40处理与对照相比显著增加土壤中速效磷和速效钾含量。
本发明还提供了上述菌株C40或上述苯酚降解剂在修复苯酚污染土壤中的应用。本发明优选将上述菌株C40制备成菌水剂，并按照108CFU/g土壤的接种量接种到土壤中，接菌处理下土壤中苯酚浓度显著降低，接菌后6天内降解速率最快，之后逐渐趋于平稳。培养15天后，接菌处理下苯酚降解率达95.1％。
本发明还提供了上述菌株C40或上述苯酚降解剂在提高苯酚污染土壤中磷钾有效性、种植作物和蔬菜的产量品质和抗性中的应用。
本发明优选将上述菌株C40制备成菌水剂，并按照108CFU/g土壤的接种量接种到土壤中，以盆栽玉米为例，可显著改善玉米根系构型，增加总根长和根体积，同时根表面积和根尖数也显著提高；提高速效磷和速效钾含量和作物磷和钾的吸收量。以盆栽小白菜为例，菌株C40处理可显著增加小白菜生物量，增加可溶性糖、可溶性蛋白和维生素C含量，提高小白菜品质。因此，所述菌株C40接种到土壤中能够提高土壤养分供应能力，提高作物养分吸收，改善根系构型，促进作物生长，提高作物品质和抗性。
下面结合实施例对本发明提供的降解苯酚且具有促生功能的类香味菌菌株C40及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
高效苯酚降解菌的筛选
1、供试土壤
采自河南省中牟市官渡桥村(34°75'N，114°5'E)的一处长期被农药污染的菜地土。土壤基本理化性质如表1所示。
表1供试土壤的基本性质
Figure BDA0002679798260000071
Figure BDA0002679798260000081
2、培养基
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，调节pH值为7.0～7.2，121℃灭菌20分钟(固体培养基在此配方上加琼脂20g)。
无机盐培养基：七水硫酸亚铁0.018g，三水磷酸氢二钾1.31g，七水硫酸镁0.5g，硝酸钠3.0g，氯化钾0.5g，蒸馏水1000mL，调pH值为7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
KPO培养基(无机磷细菌培养基)：
氯化钠0.3g，葡萄糖10g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5g硫酸铵0.5g，七水合硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，蒸馏水1000mL，调节pH值至7.0～7.2，115℃灭菌30min，即为PKO培养基。
解钾细菌培养基：
蔗糖10.0g，酵母膏0.5g，硫酸铵1.0g，磷酸氢二钠2.0g，七水硫酸镁0.5g，碳酸钙1.0g，钾长石粉1.0g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌，20min。
3、菌株的分离与纯化
取污染层土壤，自然条件下风干、研碎，过60目筛，然后取5g加入到45mL无菌水中震荡，取震荡沉淀后的上清液1mL转移至盛有9mL去离子水的试管中摇匀，稀释前重复此操作四到五次，之后稀释后将1mL的溶液在LB固体培养基上涂布均匀，放入35℃的恒温培养箱中培养48h，将固体培养基中的单菌落挑取在新的LB固体培养基上进行划线纯化，重复多次该步骤，纯化后培养基放入4℃冰箱保存。
4、苯酚降解菌株菌悬液的制备
将分离纯化的菌株接种在LB液体培养基中，在30.0℃，170r/min的恒温摇床中培养2天，然后在离心机中4000r/min离心15min后，弃去上清液，将下层的菌体收集起来并用灭菌水洗涤2～3次后重新制成菌悬液，调整菌体浓度使之在紫外分光光度计下OD600＝1后作为种子液保存。
5、高效苯酚降解菌的筛选
在以苯酚为唯一碳源的25mL基础培养基内，接种1mL的菌悬液，逐渐提高苯酚浓度(10mg/L、50mg/L、100mg/L)进行驯化，选取长势较好的菌悬液，调至OD600＝1，之后将优势菌株接种于以100mg/L苯酚为唯一碳源的基础培养基中，以未接菌悬液的培养基作为对照，每处理3次重复，振荡培养，4-氨基安替比林法(任瑞凡,刘永阳,曲文浩,等.一株苯酚降解菌株的筛选鉴定及特性研究[J].天津农业科学,2018,24(11):11-16.)测定48h后各培养瓶内苯酚的含量。筛选具有较强降解能力的菌株作为苯酚降解菌。
6、苯酚含量的测定
通过使用略有改进的4-氨基安替比林法测定苯酚含量。将培养液置于12000r/min的离心机中离心1min后，将30μL的上清液加入到10mL的试管中，然后加蒸馏水到4mL，接着加pH为10的氨水缓冲溶液40μL，再加2％的4-氨基安替比林80μL混合均匀，接着加8％的铁氰化钾溶液80μL混合均匀。等待15min后，在510nm处测定吸光值。
从河南省中牟市的一处长期被农药污染的菜地土上分离纯化出43株菌，用于苯酚降解菌的筛选。经过48h的单一苯酚作为碳源的无机盐培养基培养，用4-氨基安替比林法筛选出8株有苯酚降解能力的菌株(表2)，分别命名为H9、H13、C39、C1、C40、C33-2、H5、C11，C40菌株降解苯酚能力最高。
表2不同菌株的降解能力
Figure BDA0002679798260000091
Figure BDA0002679798260000101
注：不同的小写字母表示同一列间差异显著(P<0.05)，下同。
7、C40解磷解钾能力测定
把C40菌株进行解磷情况测定，在三角瓶中加入30mLPKO培养基，接种C40菌株，在30℃和转速180r/min条件下培养72h，将培养液转入离心管中，在4℃、10000r/min条件下离心15min，吸取上清液，用钼蓝比色法测定其中磷含量。在实验室摇瓶条件下，所述苯酚降解菌株C40对磷酸三钙的转化量达到325.62mg·L-1。因此说明C40菌具有溶磷作用，能够溶解磷酸三钙，利用难溶性无机磷盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷盐。
把苯酚降解菌株C40菌进行解钾情况测定，将供试菌株接种于盛有30mL解钾细菌培养基中，并置于250mL三角瓶，在30℃，180r/min条件下培养72h，将培养液于6000r/min转速下离心20min，吸取上清液，用火焰光度计测定其中K含量。所述苯酚降解菌株C40对钾长石粉的转化量达到25.99mg·L-1。说明C40菌能够溶解钾长石粉，利用以难溶性含钾硅酸盐为钾源进行生长，将其转化为可溶性钾盐。
因此所述苯酚降解菌株C40具有一定的解磷和解钾能力。
实施例2
菌株形态学、生理生化特征及16S rDNA分子学鉴定
1、菌落形态学
在30℃的培养箱中培养1天筛选出来的具有高效苯酚降解能力的菌株后接种于LB平板上，观察菌落的形状、大小、透明度、光滑度等。革兰氏染色确定菌落性质。
经过平板划线、革兰氏染色，对菌株的形态特征和培养特征进行观察，发现C40菌株表面光滑，边缘整齐，不透明，略带黄色(表3)。经革兰氏染色发现，C40菌株呈革兰氏阴性，不规则杆状(图1)。
表3细菌C40的菌落特征
Figure BDA0002679798260000102
Figure BDA0002679798260000111
2、菌株生理生化特征
好氧性试验、接触酶的测定、淀粉水解试验、甲基红试验(M.R试验)、乙酞甲基甲醇试验(VP试验)、明胶水解试验、柠檬酸盐的利用试验均参照《常见细菌鉴定手册》进行。
生理生化特征结果为明胶水解试验、V-P、甲基红试验、柠檬酸盐利用、硫化氢试验为阴性，接触酶试验、淀粉水解试验的测定结果为阳性(表4)。
表4菌株C40的生理生化特征
Figure BDA0002679798260000112
Figure BDA0002679798260000121
注：“+”表示阳性反应，“－”表示阴性反应。
3、16S rDNA分子学鉴定
用SDS-CTAB法提取细菌基因组总DNA，制备菌体裂解液，然后使用细菌16S rDNA的通用引物27f(SEQ ID NO.2，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492r(SEQ ID NO.3，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA的PCR扩增；最后PCR产物送往武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，并将获得的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行比对，Blast搜索同源序列，使MEGA7.0软件，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，结合形态学和生理生化特征确定菌株的种属。
根据16S rDNA测序结果，将C40菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)与NCBI数据库Blast进行同源性比较，并采用MEGA7.0构建系统发育树。结果如图2所示，C40菌株与类香味属菌(Myroides xuanwuensis)的同源性最高，亲缘关系最近。结合形态学分析，结合生理生化特征结果，C40菌株被鉴定为类香味属菌。
实施例3
不同培养条件对菌株C40生长情况及降解苯酚能力的影响
1、培养时间对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响
将含有100mg/L苯酚的50mL无机盐培养基装于250mL三角瓶中，按照1％(V/V)的接种量接种OD值约为1的菌悬液，30℃，180rpm摇床培养，分别在12、24、48、72、120h动态取样，以未接菌悬液的培养基作为对照，每处理3次重复，180r/min，30℃摇床振荡培养48h后分别取样，测定菌体OD600值并用4-氨基安替比林法测定各处理中的苯酚浓度。
结果如图3所示，菌株在24h内迅速繁殖，OD600达到最大，在第48小时是降解率基本上达到了100％，再往后降解率基本持平，细菌的生长情况也相应的呈下降趋势，因为随着时间的延长，培养基中的营养物质不断的消耗，随着菌体数量的扩增，细菌之间出现了竞争营养物质的情况导致菌体数量下降。
2、接种量对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响
将供试菌种的菌体OD600＝1的菌悬液分别按1％、5％、10％、15％、20％(V/V)的接种量接入添加苯酚质量浓度100mg/L，装液量50mL(250mL三角瓶)的灭菌的基础盐培养基中，48h后取样，培养条件和测定方法同上。
结果如图4所示，当接种量为1％时，菌株C40对苯酚的降解率最高，随着接种量的增加，降解率随之下降，但总体的降解率都在70％以上，降解率下降是因为细菌数量大而营养物质少导致菌体生长不良，生长状况下降，由图中的OD600值表征的菌种生长情况也可以得到证明。因此，1％接种量是最佳接种量。
3、苯酚初始浓度对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响
将供试菌种的菌体OD600＝1的菌悬液按照1％的接种量接种于基础盐培养基中，分别添加苯酚，使其初始质量浓度分别为100、250、500、1000、1500、2000mg/L，装液量50mL(250mL三角瓶)，48h后取样，培养条件和测定方法同上。
结果如图5所示，随着苯酚初始浓度的增加，起初降解率还稍微增加，但是后来由于浓度超过了菌株降解能力的极限，降解率显著下降，之后随着更大浓度的加入，菌株由于无法在苯酚浓度过高的环境下生长，所以降解率很差。250mg/L的苯酚初始浓度下，C40的降解率最高，几乎可以全部降解完毕，当苯酚初始浓度达到500mg/L时，降解率开始出现下降趋势，当达到1000mg/L时，菌株可能由于无法适应高浓度苯酚的环境，生长不好，所以降解效果很差。综上，该菌株的最佳降解浓度为250mg/L，最高耐苯酚浓度为500mg/L。
4、初始pH对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响
分别在基础盐培养基中加入苯酚使其质量浓度达到100mg/L，装液量50mL(250mL三角瓶)，用NaOH或HCl调整培养基的初始pH分别为3，4，5，6，7，8，9，按照1％(V/V)的接种量加入菌体OD600＝1的菌悬液，48h后取样，培养条件和测定方法同上。
结果如图6所示，菌株C40在pH为3时，降解率很低，OD600值也很低，说明在此环境下生长状况不好，在pH为6、7时，菌株降解率最大，达到了几乎百分百，其中pH为7时，菌株降解效率最高，并且在这种条件下，菌株生长情况也是最好。因此，pH为7是菌株C40的最适pH。
5、通气量对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响
设置25、50、75、100、150mL的培养液装于250mL的三角瓶中，按照1％(V/V)的接种量加入菌体OD600＝1的菌悬液，48h后取样，培养条件和测定方法同上。
结果如图7所示，当往250mL三角瓶中装入菌悬液体积为25mL时，其降解苯酚的能力达到最优，随着装液量的增加，C40菌株的降解苯酚能力总体上呈下降趋势。由此得知，装液量的增加，瓶内氧气体积的减少，随着细菌的生长，耗氧量不断增加，消耗营养物质量增加，造成菌株代谢缓慢。因此菌株C40生长及降解苯酚能力最佳加入菌悬液体积为25mL，综合生理生化特征鉴定结果为好氧性细菌，这是因为随着氧气含量的减少，菌株生长量越来越少，代谢逐渐减缓，导致菌株降解苯酚的能力也逐渐降低。
6、不同氮源对菌株生长情况及降解苯酚能力的影响
在不包括含氮物质的无机盐培养基(含有100mg/L苯酚)中分别加入0.1％(W/V)的氮源，氮源包括蛋白胨、酵母粉、硝酸钠、尿素、硫酸铵，培养48h，培养条件和测定方法同上。
结果如图8所示，不同氮源对菌株降解苯酚能力的影响不同，在以酵母粉为氮源时，菌株C40的苯酚降解率最大，并且菌株生长情况也最好，所有氮源对于菌株C40降解苯酚都有效果，其中菌株降解苯酚能力最差的氮源是硫酸铵，所有氮源降解率也都在60％以上。菌株C40降解苯酚的最适氮源为酵母粉。
实施例4
土壤中苯酚的降解试验
试验所用土壤为前述长期农药污染的菜地土，土壤类型为潮土。土壤采集后挑去其中的根系、石块和土壤动物等杂质，过2mm筛，经60Co-γ射线灭菌(25kGy)。按照300mg/kg的量加入苯酚。菌株C40的接种量为108CFU/g土壤，以不接种菌株为对照，并将土壤样品装入无菌培养瓶中进行好氧培养，用纱布对培养瓶口进行密封，以保持通风并减少苯酚的挥发。每瓶装土量为100g，每个处理设置4个重复。将培养瓶置于培养箱中，保持培养箱内温度为25℃，湿度为60％。定期补充土壤水分，保持含水量至田间最大持水量的65％。从接种之日起，每三天取样测定一次土壤中苯酚的含量和C40菌株的定殖数量，测定方法参照ChenJ,Li S,Xu B,et al.Characterization of Burkholderia sp.XTB-5 for phenoldegradation and plant growth promotion and its application in bioremediationof contaminated soil[J].Land Degradation&Development,2017,28(3):1091-1099。培养试验共进行15天。
结果如图9所示，其中从A可以看出，与不接菌相比，接菌处理下土壤中苯酚浓度显著降低，接菌后6天内降解速率最快，之后逐渐趋于平稳。培养15天后，接菌处理下苯酚降解率达95.1％，而不接菌处理下降解率仅为16.8％。因此，菌株C40接种在苯酚污染土壤中能够快速高效的降解土壤苯酚。从B中看出，C40菌株在土壤中接种后能够稳定存在。
实施例5
菌株C40的对玉米的促生作用
试验所用土壤为前述长期农药污染的菜地土，土壤类型为潮土。土壤采集后挑去其中的根系、石块和土壤动物等杂质。过10目筛，充分混匀，每盆装土量为1kg。盆栽试验所用玉米品种为‘郑单958’。
玉米种子经双氧水消毒后，每盆播种10粒种子。出苗一周后间苗，保留长势均匀一致的植株，每盆保留3株。供试C40菌株经培养后制成菌水剂，按照108CFU/g土壤的接种量接种到土壤中，以不接种菌株C40为对照，每个处理设置3个重复。盆栽在温室中进行，每天定时浇水，保持土壤含水量在田间持水量的60～70％。30天后采样，测定玉米株高，玉米根系形态构型用根系扫描仪(Perfectioon v700Photo，Epson)测定，植株地上地下部采集后部分烘干，测定生物量、土壤基本理化性质和植株养分含量，部分用液氮冷冻保存，测定丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。
玉米种子：玉米种子播种前采用20％H2O2进行表面消毒30分钟，采用无菌水冲洗，备用。
接菌处理：将菌株C40接种于LB液体培养基，在30℃，180r·min-1摇床中培养，菌株生长至对数生长期，将菌水剂在10000r·min-1转速下离心10min，重复操作三次，菌株的接种量为108CFU·g-1土壤。
对照处理：土壤喷洒与C40菌液处理等量的无菌水作为对照。
结果如表5～8和图10所示，接种菌株C40之后，苗期玉米的株高、地上部和地下部生物量均比CK显著提高。C40处理显著改善了玉米根系构型，增加了总根长和根体积，同时根表面积和根尖数也显著提高。从植株样分含量上看，与CK相比，C40处理对植株全氮含量没有影响，但是提高了全磷和全钾的含量。从图10看出，C40接种处理与CK相比，玉米植株MDA含量显著降低而SOD活性显著提高。说明C40处理能够增强玉米植株的抗性。从表8看出，C40处理与CK相比，土壤pH和碱解氮没有显著变化，而速效磷和速效钾含量均显著提高。因此，菌株C40接种到土壤中能够提高土壤养分供应能力，提高作物养分吸收，改善根系构型，促进作物生长并提高抗性。在轻度苯酚污染土壤中可以实现边修复边生产。
表5菌株C40处理对苗期玉米株高和生物量的影响
Figure BDA0002679798260000161
注：表格中的※表示差异显著，下同。
表6菌株C40处理对苗期玉米根系形态构型的影响
Figure BDA0002679798260000162
表7菌株C40处理对苗期玉米植株氮磷钾养分含量的影响
Figure BDA0002679798260000163
Figure BDA0002679798260000171
表8菌株C40处理对土壤理化性质的影响
Figure BDA0002679798260000172
实施例6
菌株C40的对小白菜生长和品质的影响
试验所用土壤为前述长期农药污染的菜地土，土壤类型为潮土。土壤采集后挑去其中的根系、石块和土壤动物等杂质。过10目筛，充分混匀，每盆装土量为1kg。
小白菜种子经双氧水消毒后，每盆播种10粒种子。出苗一周后间苗，保留长势均匀一致的植株，每盆保留3株。供试C40菌株经培养后制成菌水剂，按照108CFU/g土壤的接种量接种到土壤中，以不接种菌株C40为对照，每个处理设置3个重复。盆栽在温室中进行，每天定时浇水，保持土壤含水量在田间持水量的60～70％。45天后采样，植株地上地下部采集后部分烘干，测定生物量，部分用置于4℃冰箱保存，用于测定品质指标。
小白菜种子：玉米种子播种前采用20％H2O2进行表面消毒30分钟，采用无菌水冲洗，备用。
接菌处理：将菌株C40接种于LB液体培养基，在30℃，180r·min-1摇床中培养，菌株生长至对数生长期，将菌水剂在10000r·min-1转速下离心10min，重复操作三次，菌株的接种量为108CFU·g-1土壤。
对照处理：土壤喷洒与C40菌液处理等量的无菌水作为对照。
结果如表9和表10所示。接种C40菌株之后，小白菜地上部鲜重、地上部干重和根系干重均比CK显著提高，提高幅度分别为16.7％、31.3％和40.8％。同时，小白菜叶片的品质也得到显著提高。其中硝酸盐含量没有显著差异，而可溶性糖、维生素C和可溶性蛋白含量均比CK显著提高。因此，菌株C40接种到土壤中能够提高蔬菜产量，并提高蔬菜品质。
表9菌株C40处理对小白菜生物量的影响
Figure BDA0002679798260000181
表10菌株C40处理对小白菜品质的影响
Figure BDA0002679798260000182
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌菌株C40及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1374
<212> DNA
<213> Myroides xuanwuensis
<400> 1
aggggtagaa gaagcatgct tttttgagac cggcgcacgg gtgagtaacg cgtatgcaac 60
ctaccttata caggggaata gcccgaagaa attcggatta atgctccatg gtttatcgat 120
atggcatcgt attgataata aagatttatc ggtataagat gggcatgcgt atcattagct 180
agttggtgtg gtaacggcat accaaggcaa cgatgattag gggtcctgag agggagatcc 240
cccacactgg tactgagaca cggaccagac tcctacggga ggcagcagtg aggaatattg 300
gtcaatggag gcaactctga accagccatg ccgcgtgcag gatgacggtc ctatggattg 360
taaactgctt ttgtacagga agaaacctcc ctacgagtag ggacttgacg gtactgtaag 420
aataaggatc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggaggatc cgagcgttat 480
ccggaattat tgggtttaaa gggttcgtag gcggccttat aagtcagtgg tgaaatttcc 540
tagcttaact aagacactgc cattgatact gtttaacttg aatagtatgg aagtaactag 600
aatatgtagt gtagcggtga aatgcttaga tattacatgg aataccaatt gcgaaggcag 660
gttactacgt atttattgac gctgatgaac gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 720
ccctggtagt ccacgccgta aacgatggat actagctgtt cggttttcgg actgagtggc 780
taagcgaaag tgataagtat cccacctggg gagtacgttc gcaagaatga aactcaaagg 840
aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatga tacgcgagga 900
accttaccag ggcttaaatg tagattgaca gatttggaaa cagatttttc ttcggacaat 960
ttacaaggtg ctgcatggtt gtcgtcagct cgtgccgtga ggtgtcaggt taagtcctat 1020
aacgagcgca acccctattg ttagttacca gcgcgtagtg gcggggactc tagcaagact 1080
gccggtgcaa accgtgagga aggtggggat gacgtcaaat catcacggcc cttacgtcct 1140
gggctacaca cgtgttacaa tggcaagtac agaaagcagc tacctggcaa caggatgcga 1200
atctccaaag cttgtctcag ttcggattgg agtctgcaac tcgactctat gaagctggaa 1260
tcgctagtaa tcggatatca gccatgatcc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1320
cgcccgtcaa gccatggaag ctgggggtac ctgaagtcgg tgaccgcaag gagc 1374
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.一株降解苯酚且具有促生功能的类香味菌（Myroides xuanwuensis）菌株C40，其特征在于，所述菌株C40的保藏编号为CGMCC No.20347。
2.权利要求1所述菌株C40在降解苯酚中的应用，其特征在于，所述苯酚以溶液计，浓度不高于1000mg/L。
3.一种苯酚降解剂，其特征在于，所述苯酚降解剂的活性成分包括权利要求1所述菌株C40。
4.一种降解苯酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：向含有苯酚的溶液中接种权利要求1所述菌株C40的菌液后培养，接种量为1%，所述培养的时间为48h，所述苯酚的浓度不高于1000mg/L。
5.一种解磷解钾的方法，其特征在于，包括以下步骤：在土壤中接种权利要求1所述菌株C40，接种量为108 CFU/g土壤，培养时间为30d。
6.权利要求1所述菌株C40或权利要求3所述苯酚降解剂在修复苯酚污染土壤中的应用。
7.权利要求1所述菌株C40或权利要求3所述苯酚降解剂在提高苯酚污染土壤中磷钾有效性、种植作物的产量品质和苯酚抗性中的应用。
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