CN105170628A - 一种植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，向含铅土壤中均匀撒入印度芥菜种子，然后浇水使土壤保持湿润状态，10～15天后待植物发芽生长，向印度芥菜根系土壤中添加微生物复合菌剂，利用印度芥菜对铅的吸收以及微生物复合菌剂的强化作用联合去除土壤中的铅；其中，所述的微生物复合菌剂为蕈状芽孢杆菌(Bacillus？mycoides)、希瓦氏菌(Shewanella)与铜绿假单胞菌(Pseudomonas？aeruginosa)按重量比3～10：1：1混合制成。本发明操作方便、费用低、易于管理、不产生二次污染，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环境修复技术领域，涉及植物与微生物菌剂联合修复铅污染土壤的方法。
背景技术
铅是一种有毒重金属元素，严重影响人类健康及动植物的生存。工业生产中的铅污染，一方面通过金属开采、冶炼及金属制品生产等企业构成污染源，以铅尘、铅烟污染周围环境、危害周围人群。大气中含铅尘粒可以直接降落到地面，或是含铅废渣堆集在地面，或因含铅污水、污泥作肥料使用，都可使土壤遭受铅的污染。铅在表土累计后，会影响土壤生化活性，降低农作物的产量，并可通过食物链影响人类健康。铅进入植物后叶绿素含量会降低，呼吸作用也会受到抑制。人体吸收的铅超过一定水平就会引起对健康的危害。铅中毒的临床症状表现为贫血，便秘，腹痛，呕吐以及食欲减退等，铅对人体多张组织器官产生危害，可以造成中枢神经损伤，严重的可导致脑病；引起血管痉挛，血压升高，增加脑溢血的发病率。而存在于土壤中的重金属铅难以被分解，因而对人类的危害具有隐蔽性，长期性和不可逆等特点。
目前，用来修复土壤重金属的方法主要有物理、化学、生物等方法。目前采用的物理化学方法修复重金属污染土壤，费用昂贵，破坏环境，容易造成二次污染，且往往并不能达到真正清除重金属的目的。而生物修复技术凭借二次污染较小，处理形式多样、操作相对简单、对环境的扰动较小，而受到人们的关注。而其中的植物和微生物的联合修复技术，因二者的联合会达到相互促进土壤修复的效果，对于受重金属铅污染土壤的修复更具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术活问题是针对现有技术的不足和缺陷，提供一种植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法。通过在铅污染土壤中种植富集植物印度芥菜，并在其根际接种微生物复合菌剂，通过利用微生物菌剂以增强印度芥菜对于土壤中铅的吸附能力，实现土壤重金属铅污染的高效、快速安全修复。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，向含铅土壤中均匀撒入印度芥菜种子，然后浇水使土壤保持湿润状态，10～15天后待植物发芽生长，向印度芥菜根系土壤中添加微生物复合菌剂，利用印度芥菜对铅的吸收以及微生物复合菌剂的强化作用联合去除土壤中的铅；其中，所述的微生物复合菌剂为蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、希瓦氏菌(Shewanella)与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)按重量比3～10：1：1混合制成。
其中，印度芥菜种子的播种量为3～6g/m2，优选5g/m2。
其中，优选的是，向含铅土壤中均匀撒入印度芥菜种子，上部覆土1cm。
其中，印度芥菜在铅污染土壤中的适宜温度为15～35℃，定期浇水，保持土壤含水量为田间最大持水量的60～80％。
其中，所述的蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015510，保藏日为2015年9月6日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。
其中，所述的希瓦氏菌(Shewanella)为ATCC700550。
其中，所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)为ATCC39018。
其中，蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、希瓦氏菌(Shewanella)与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的重量比优选为5:1:1。
其中，所述的微生物复合菌剂按如下方法制备得到：
(1)取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g和蒸馏水1L混匀，调pH值至7.0，灭菌，得到培养基；
(2)将保藏在斜面培养基的菌种分别接种到步骤(1)得到的培养基后，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下培养48h；
(3)将步骤(2)得到的菌种按照比例混合，再加入到步骤(1)制备得到的培养基中一起扩增，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下扩大培养48h，即得发酵液；
(4)将事先灭菌冷却后的麸皮，按其和发酵液的质量比30:1混匀，自然风干，装袋封口，制成菌剂。
其中，微生物复合菌剂的在土壤中的用量为1～5Kg/m2，优选3Kg/m2。
其中，所述的铅污染土壤中，铅含量为100～500mg/Kg。
有益效果：本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的微生物复合菌剂，其基本组分为复合菌群，比单一菌株对土壤环境的适应能力强，并且和麸皮制成干菌剂，更利于投加到土壤中区，以提高印度荠菜对铅的吸收能力，增强铅污染土壤的去除效果。
2)采用本发明提供的微生物复合菌剂和印度芥菜修复方法，修复效果好、费用低、易于管理、不产生二次污染，具有广泛的应用前景。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为系统发育树。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的印度芥菜为市售草种。
以下实施例所用的蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)ADB，武汉大学保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCCNO:M2015510，保藏日为2015年9月6日。
以下实施例所用的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)为ATCC39018。
以下实施例所用的希瓦氏菌(Shewanella)为ATCC700550。
实施例1：蕈状芽胞杆菌ADB的筛选、鉴定及生物学特征分析。
1)土壤样品来源：南京某电镀污泥厂活性污泥
2)菌种筛选：取1g活性污泥加到10ml的液体LB培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。)中富集培养，培养条件37℃180r/min，培养24h；取1ml富集培养液分别接种于含100mg/L铅的新鲜液体培养基,37℃、180r/min培养；待液体选择培养基混浊后，从中取1ml培养液接种于含100mg/L金属离子的液体培养基中，逐级类推提高金属离子浓度。然后用接种环取最高耐受浓度培养液划线接种于含100mg/L铅离子的固体平板上,37℃培养24h。根据平板菌落形态分别挑取单菌落再接种至铅离子选择培养基进行验证，循环三次，以获得金属耐受能力较好的纯菌株。
3)菌种鉴定：
16sRNA序列分析法：PCR扩增采用细菌16sRNA通用引物：
27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)
1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)
PCR反应体系(2.5μL)：5×扩增缓冲液(5μL)、基因组DNA(0.1μL)、dNTP(2μL)、引物F(0.5μL)、引物R(0.5μL)、TaqDNA聚合酶(0.25μL)、去离子水(16.65μL)。反应条件：98℃预变性10min，98℃变形10s，58℃退火10s，72℃延伸90s，共30个循环，72℃充分延伸10min。PCR产物直接用于碱基序列测定(SEQIDNo.:1所示)，然后利用NCBI网站的BLAST进行碱基序列的比对，构建系统发育树(图1)，确定菌株的系统分类。系统发育树结果表明，筛选得到的ADB和Bacillus的亲缘关系最近，其同源性达到99％，其生理生化实验中，菌落表面呈乳白色，不透明，边缘不光滑、中生芽孢，属革兰氏阳性，鉴定为蕈状芽孢杆菌，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，CCTCCNO:M2015510，保藏日为2015年9月6日。
实施例2：微生物复合菌剂的制备。
本发明中菌剂的制备方法具体包含以下步骤：
(1)取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g和蒸馏水1L混匀，调pH值至7.0，灭菌，得到培养基；
(2)将保藏在斜面培养基的菌种转接到分别接种到培养基后，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下培养48h；
(3)将步骤(2)得到的菌种按照比例混合，再次加入到步骤(1)制备得到的培养基中一起扩增，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下扩大培养48h，即得发酵液；
(4)将事先灭菌冷却后的麸皮，按其和发酵液的质量比30:1混匀，自然风干，装袋封口，制成菌剂。
其中，所使用的菌种为1)蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)ADBCCTCCNO:M2015510；2)希瓦氏菌(Shewanella)ATCC700550；3)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC39018的混合菌，其重量为例为3～10：1：1。
实施例3：印度芥菜与微生物菌剂不同组合工艺对土壤中铅的富集能力。
实验采用直径约10cm塑料盆，每盆装土约1kg，供试土壤风干后过2mm筛，重金属镉以溶液形式加入盆中混合均匀，配置成500mg/kg的铅污染土壤，调节盆中土壤含水量为田间最大持水量的80％，自然平衡一周后，在盆中撒入印度芥菜种子，播种量为4g/m2，上部覆土1cm，待植物生长后10d，开始进行各处理组的实验，其中有微生物菌剂的实验组其总加量2Kg/m2。
其中，
第1组为只有印度芥菜，不添加任何微生物。
第2组为印度芥菜+蕈状芽孢杆菌。
第3组为印度芥菜+希瓦氏菌。
第4组为印度芥菜+铜绿假单胞菌。
第5组为印度芥菜+蕈状芽孢杆菌+希瓦氏菌(湿菌重量比5:1)。
第6组为印度芥菜+蕈状芽孢杆菌+铜绿假单胞菌(湿菌重量比5:1)。
第7组为印度芥菜+铜绿假单胞菌+希瓦氏菌(湿菌重量比1:1)。
第8组为印度芥菜+蕈状芽孢杆菌+铜绿假单胞菌+希瓦氏菌(湿菌重量比5:1:1)。
各处理组，在植物生长的第90d收获，用去离子水冲洗干净，风干，测量生物量。将其置于105℃下杀青30min，60℃烘干后，粉碎装入样品袋。植物样品，通过湿法(HNO3-HClO4)消解后，采用原子吸收分光光度计进行测定。
表1植物生物量以及植物对于铅富集能力的情况
| 处理组 | 生物量(g) | 印度芥菜铅吸收量(mg/kg) |
| 1 | 21.3 | 140 |
| 2 | 27.3 | 170 |
| 3 | 26.3 | 166 |
| 4 | 25.3 | 164 |
| 5 | 29.1 | 220 |
| 6 | 28.9 | 200 |
| 7 | 28.4 | 190 |
| 8 | 34.8 | 320 |
如表1所示，添加微生物的情况下，对印度芥菜的生长和富集重金属铅都起到促进作用。在添加单一的蕈状芽孢杆菌、希瓦氏菌、铜绿假单胞菌处理组的印度芥菜其鲜重分别增加了28.1％、23.4％和18.7％，其吸收铅的总量分别增加了55.7％，46.5％和39.2％。同时添加两种微生物的情况下，印度芥菜富集铅的能力增强，第5,6,7处理组印度芥菜其鲜重分别增加了36.6％、35.6％和33.3％，其吸收铅的总量分别增加了114.8％、93.9％和81％。同时添加三种微生物的情况下，印度芥菜富集铅的能力进一步增强，印度芥菜鲜重增加了63.3％，其吸收铅的总量增加了273％。
实施例4：印度芥菜-微生物菌剂对土壤中铅的富集能力。
实验采用直径约10cm塑料盆，每盆装土约1kg，供试土壤风干后过2mm筛，重金属镉以溶液形式加入盆中混合均匀，配置成500mg/kg的镉污染土壤，调节盆中土壤含水量为田间最大持水量的80％，自然平衡一周后，在盆中撒入印度芥菜种子，播种量为5g/m2，上部覆土1cm，待植物生长后20d，微生物菌剂的接种量为3Kg/m2。其中蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)ADB、希瓦氏菌(Shewanella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的重量比为5:1:1同时设定一个对照组，其只加入印度芥菜种子，而不加入微生物菌剂。在植物生长的第90d收获，用去离子水冲洗干净，风干，测量生物量。将其置于105℃下杀青30min，60℃烘干后，通过湿法(HNO3-HClO4)消解后，采用原子吸收分光光度计进行测定。
表2植物生物量以及植物对于铅富集能力的情况
| 处理组 | 鲜重(g) | 铅含量(mg/kg) |
| 对照 | 29.1 | 210 |
| 接种微生物菌剂 | 55.2 | 400 |
如表2所示，在500mg/kg浓度的铅污染条件下，接种微生物菌剂对印度芥菜的生长发育起到促进作用，其中鲜重比对照组高出89.6％。其次，接种微生物菌剂对印度芥菜富集土壤中铅的能力加强，其中吸收铅的总量比对照组高出261％。
实施例5：印度芥菜-微生物菌剂对土壤中铅的富集能力。
实验采用直径约10cm塑料盆，每盆装土约1kg，供试土壤风干后过2mm筛，重金属镉以溶液形式加入盆中混合均匀，配置成500mg/kg的镉污染土壤，调节盆中土壤含水量为田间最大持水量的80％，自然平衡一周后，在盆中撒入印度芥菜种子，播种量为4g/m2，上部覆土1cm，待植物生长后20d，微生物菌剂的接种量为2Kg/m2。其中蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)ADB、希瓦氏菌(Shewanella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的重量比为3:1:1同时设定一个对照组，其只加入印度芥菜种子，而不加入微生物菌剂。在植物生长的第90d收获，用去离子水冲洗干净，风干，测量生物量。将其置于105℃下杀青30min，60℃烘干后，通过湿法(HNO3-HClO4)消解后，采用原子吸收分光光度计进行测定。
表3植物生物量以及植物对于铅富集能力的情况
| 处理组 | 鲜重(g) | 铅含量(mg/kg) |
| 对照 | 21.9 | 148 |
| 接种微生物菌剂 | 40.1 | 330 |
如表2所示，在500mg/kg浓度的铅污染条件下，接种微生物菌剂对印度芥菜的生长发育起到促进作用，其中鲜重比对照组高出83.1％。其.次，接种微生物菌剂对印度芥菜富集土壤中铅的能力加强，其中吸收铅的总量比对照组高出237.5％。
Claims (10)
1.一种植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，向含铅土壤中均匀撒入印度芥菜种子，然后浇水使土壤保持湿润状态，10～15天后待植物发芽生长，向印度芥菜根系土壤中添加微生物复合菌剂，利用印度芥菜对铅的吸收以及微生物复合菌剂的强化作用联合去除土壤中的铅；其中，所述的微生物复合菌剂为蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、希瓦氏菌(Shewanella)与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)按重量比3～10：1：1混合制成。
2.根据权利要求1所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，印度芥菜种子的播种量为3～6g/m2。
3.根据权利要求1所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，向含铅土壤中均匀撒入印度芥菜种子，上部覆土1cm。
4.根据权利要求1所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，印度芥菜在铅污染土壤中的适宜温度为15～35℃，定期浇水，保持土壤含水量为田间最大持水量的60～80％。
5.根据权利要求1所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，所述的蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2015510，保藏日为2015年9月6日。
6.根据权利要求1所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，所述的希瓦氏菌(Shewanella)为ATCC700550。
7.根据权利要求1所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)为ATCC39018。
8.根据权利要求1所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，所述的微生物复合菌剂按如下方法制备得到：
(1)取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g和蒸馏水1L混匀，调pH值至7.0，灭菌，得到培养基；
(2)将保藏在斜面培养基的菌种分别转接到步骤(1)制备得到的培养基后，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下各自单独培养48h；
(3)将步骤(2)得到的菌种按湿菌重量比混合后，再次加入到步骤(1)制备得到的培养基中扩增，在温度为37℃、转速为250r/min的条件下扩大培养48h，即得发酵液；
(4)将事先灭菌冷却后的麸皮，按其和发酵液的质量比30:1混匀，自然风干，装袋封口，制成菌剂。
9.根据权利要求1或8所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，微生物复合菌剂的在土壤中的用量为1～5Kg/m2。
10.根据权利要求1或8所述的植物-微生物联合修复铅污染土壤的方法，其特征在于，所述的铅污染土壤中，铅含量为100～500mg/Kg。
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