CN113462618B - 一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu及其应用，该菌株隶属于Lysobactersoli，已于2021年6月8号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021693。该菌株具有较强的耐铜特性，其生长能耐受的最高铜浓度为3.2mM。此外，该菌株能在铜胁迫条件下，对小麦的生长(叶长和鲜重)起到显著的促进作用，在铜胁迫条件下，明显缓解了小麦铜毒害。因此，相比已报道的耐铜菌株，本发明所述的耐铜细菌RCu可在菌株的培养、运输和定殖等条件上合理降低要求，有利于降低生产成本、便于推广应用。

Description

一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体来说涉及一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu及其应用。

背景技术

随着工业生产的发展，大量的重金属铜被排放到了环境中，造成了土壤和水体不同程度的污染。重金属铜污染是指由于人类不合理的活动，环境中的重金属铜含量升高，超过了环境对铜的自净能力，或金属铜在环境中的含量超过背景值，进而造成生态环境恶化的现象。重金属在环境中易累积，且污染后难分离，重金属铜污染不但会影响植物的生长、破坏人类赖以生存的环境，还会通过食物链累积，从而损害人类的健康。

目前，重金属污染治理的途径主要有物理法、化学法和生物法。物理法主要包括客土法、换土法、电动修复法等，物理修复投资大，且不易操作，不适合大范围推广应用。化学修复法主要通过使用化学修复剂，使之与土壤中的污染物质发生氧化反应、还原反应、吸附反应、沉淀反应和络合反应等，达到将土壤中的污染物质分离、降解或转化成无毒或低毒的形式去除，但去除污染物的同时可能会将化学成分引入到土壤中，从而造成二次污染。微生物修复是利用微生物的生物活性对重金属的亲和吸附或转化为低毒产物，从而降低重金属的污染程度。

只有微生物对重金属有较高的耐受性才能将其运用于重金属污染的治理中，目前尚无溶杆菌属(Lysobacter)对重金属有耐受、吸附能力，以及促进植物生长的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新菌种，该菌种属于溶杆菌属。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu，该菌株具有强耐受铜性的特性，其生长能耐受Cu²⁺浓度高达3.2mM。

本发明的另一目的在于提供一种利用菌株RCu制备的微生物菌剂在重金属铜污染的土壤中促进植物生长中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一株从中国科学院栾城农业生态系统试验站土壤中分离获得的耐铜细菌Lysobacter soli RCu，该菌株保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2021年6月8号，保藏编号：CCTCC M 2021693。

所述的耐铜细菌RCu，其菌落呈现柠檬黄色，菌落边缘呈微透明状。

所述的耐铜细菌RCu，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，隶属于Lysobactersoli菌种。

所述的耐铜细菌RCu，其生长能耐受高达3.2mM的Cu²⁺。

所述的耐铜细菌RCu，其在铜胁迫条件下明显舒缓了重金属铜对小麦的毒性，能对重金属胁迫下的小麦起明显的促进作用。主要表现为小麦的鲜重增加了37％，叶长分别增加了14.55％。

本发明的优点和有益效果为：

本发明公开了一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu，该耐铜细菌RCu对重金属铜有极佳的耐受性，这为研究重金属铜污染环境中利用RCu菌来富集重金属铜打下了基础，丰富了利用微生物修复重金属污染的微生物菌库。所述耐铜细菌RCu在铜胁迫条件下，具备促进植物生长和缓解植物盐害能力的优良特性，一方面为制备微生物菌剂和肥料用于促进植物生长中的应用提供资源和技术支撑，实现替代或者部分替代化学肥料的投入使用、减少环境污染，另一方面，相比其它已报道的菌株，本发明所述的耐铜促生细菌RCu可在菌株的培养、储存、运输和定殖等条件上合理降低要求，有利于降低生产成本、便于推广应用。

附图说明

图1是本发明耐铜细菌RCu的菌落观察图；

图2是本发明耐铜细菌RCu的16S rDNA序列系统发育树；

图3是基于本发明耐铜细菌RCu的比较基因组圈图；

图4是本发明耐铜细菌RCu在不同铜浓度中生长情况；

图5是本发明耐铜细菌RCu缓解小麦盐害和促进小麦生长观察图；

图6是本发明耐铜细菌RCu对小麦生长(叶长)的影响；

图7是本发明耐铜细菌RCu对小麦生长(鲜重)的影响。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员能更好的理解本发明的目的、技术方案以及优点，以下结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：菌株的分离纯化

样品来源：中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心栾城农业生态系统试验站土壤样品。

LB培养基(固体)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，121℃、30min高压蒸汽灭菌。

LB培养基(液体)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，121℃、30min高压蒸汽灭菌。

选择培养基(固体)：胰蛋白酶粉10g/L；酵母提取物5g/L；Na₂HPO₄ 12.8g/L(M9Minimal Medium改良)KH₂PO₄ 3.1g/L；NaCl 10.5g/L；MgSO₄ 0.5g/L；(NH₄)SO₄ 1.0g/L；Agar5g/L。

选择培养基(液体)：胰蛋白酶粉10g/L；酵母提取物5g/L；Na₂HPO₄ 12g/L；(M9Minimal Medium改良)KH₂PO₄ 3.1g/L；NaCl 10.5g/L；MgSO₄ 0.5g/L；(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L。

分离和纯化步骤：1)将从中国科学院栾城农业生态系统试验站采集的土壤样品(10g)加入到50mL无菌离心管中，重复操作4次，分别加入2mg、4mg、6mg和8mg硫酸铜混合培养一个月后，加入10mL无菌水震荡一小时；2)静置，取适量上清液，涂布于选择培养基(固体)上，置于30℃恒温培养箱中培养；3)待长出单菌落后，挑取单菌落进行平板划线培养以纯化细菌，为增加细菌活性，挑取单菌落并在选择培养基(液体)中活化。

实施例二：最小抑制浓度的测定

培养24小时后细菌没有生长的最低浓度(此处为铜离子浓度)为最小抑制浓度。将纯化后的细菌接种到液体培养基中，用恒温摇床150r/min、25℃的条件下培养6小时后，在相应的锥形瓶中加入不同浓度的硫酸铜溶液，在培养24小时，使用紫外分光光度计测量细菌OD₆₀₀值。结果显示菌株RCu能够在Cu²⁺浓度为3.2mM的培养基中生长，当Cu²⁺浓度大于等于3.25mM的情况下，细菌停止生长，即Cu²⁺对RCu的最小抑制浓度为3.25mM。

实施例三：菌株的鉴定

1)生物学特性鉴定

在LB固体培养基上菌落呈浅褐色，边缘光滑整齐，单菌落易挑取。如图1所示。

2)系统分类鉴定及铜抗性基因鉴定

本发明使用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)(产自TianGen公司)，根据说明书提取细菌的基因组DNA。采用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')扩增菌株RCu 16S rDNA序列。PCR反应体系为25μL，其中含有12.5μL 2×GoldStar Best Master Mix、10.5μL ddH₂0、0.5μL引物27F、0.5μL引物1492R、1μL DNA模板。PCR反应程序为：(i)94℃5min预变性；(ii)30个循环95℃1min变性，55℃1min退火，72℃2min延伸；(iii)最后延伸条件为72℃10min。将PCR扩增产物提交生工生物工程(上海)股份有限公司进行双端测序，测序所得菌株RCu的16S rDNA序列如SEQ NO.1所述。

通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库对测序所得序列进行同源性比对，结果显示菌株RCu的16S rDNA序列与Lysobacter soli strainDCY21的序列相似度高达99.72％。利用MAGA X构建系统发育树(图2)。

将DNA提交至苏州金唯智生物科技有限公司，利用Illumina Hiseq测序平台进行全基因组测序。使用EggNOG数据库对基因组序列进行功能注释，注释结果显示菌株RCu具有大量铜抗性相关的基因(copLABMGA、cusABC、copL、czcABCD)，这些基因能够编码铜抗性蛋白，使本发明所述的菌株RCu具有较高铜抗性。

基于系统分类和RCu的生理特性，将RCu分类命名为溶杆菌(Lysobacter soliRCu)。

实施例四：菌株RCu铜耐受能力的测定

添加Cu²⁺至液体培养基中，使其终浓度分别为0.4、0.8、1.2和1.6mM，按照2％的接种量接种活化后的菌液，25℃、150r/min摇床培养，每隔8h取样，测定菌液OD₆₀₀的值，以未添加Cu²⁺的培养基为对照。以培养时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制菌株耐受铜的生长曲线。结果如图4所示，结果表明在0.4、0.8、1.2和1.6mM Cu²⁺处理下，该菌株仍然能正常生长。

实施例五：菌株RCu对重金属铜的去除

将活化后的菌液按2％接种量接种到50mL含0.4mM Cu²⁺浓度的LB培养基中，25℃、150r/min摇床培养48小时，样品经1000r/min离心10分钟，上清液使用原子火焰吸收测定铜离子的浓度。

实施例六：耐铜细菌RCu对小麦生长的影响

菌液的制备：挑取固体LB培养基上菌株RCu单菌落，接种于50mL液体LB培养基中，25℃、150r/min培养24后(同时测定并记录菌液OD₆₀₀)，按2％接种量接种于100mL液体LB培养基中，25℃、150r/min培养36h后，10000rpm、10min离心收集菌体，使用无菌水洗涤菌体2次后，使用无菌水调节菌液OD₆₀₀至1.0后备用。

土壤处理：将营养土过2mm筛后充分混匀，自然风干，将CuSO₄·12H₂O溶液喷洒至干土上，使其最终土壤CuSO₄·12H₂O含量为3g/kg和6g/kg。

小麦培养：种植小麦“小堰60”。每盆种植6粒种子(记作第1天)，出苗整齐后开始间苗(第3天)，使每盆保留4株小麦幼苗。培养条件为25℃、16h光照/8h黑暗(光照强度100μmol·m-2·s^-1)。每隔三天浇灌50mL菌液，并使用无菌水进行对照处理。小麦生长20天后，数据统计分析结果：1)观察小麦的生长情况：发现添加菌株RCu的小麦长势比对照(H₂O)的小麦好(图5)；2)测量小麦的生长情况：测量并统计小麦叶长和根长、鲜重和干重等指标，发现在重金属铜污染的土壤中，添加菌株RCu促进了小麦生长，主要表现为小麦鲜重和叶长的增加(图6、图7)；3)统计学分析小麦的生长情况：使用T-test(P<0.05表示显著差异)对测量结果进行统计学分析，在3000mg/kg和6000mg/kg重金属铜污染的土壤中，小麦的鲜重分别增加了46.8％和27.2％，叶长分别增加了17.7％和11.4％。综上所述，本发明所述的RCu菌能在铜胁迫条件下，对小麦的生长起到显著的促进作用，这些促进作用主要表现为小麦鲜重和叶长的增加，以及缓解了铜胁迫对小麦的伤害。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心

<120> 一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1421

<212> DNA

<213> Lysobacter soli

<400> 1

ctaccatgca gtcgacggca gcacagagga gcttgctcct tgggtggcga gtggcggacg 60

ggtgaggaat gcatcggaat ctgcctattt gtgggggata acgtagggaa acttacgcta 120

ataccgcata cgtcctacgg gagaaagtgg gggaccttcg ggcctcacgc agatagatga 180

gccgatgccg gattagctag ttggcggggt aaaggcccac caaggcgacg atccgtagct 240

ggtctgagag gatgatcagc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg 300

cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga 360

agaaggcctt cgggttgtaa agcacttttg tccggaaaga aaagcgctcg attaatactc 420

gggtgttatg acggtaccgg aagaataagc accggctaac ttcgtgccag cagccgcggt 480

aatacgaagg gtgcaagcgt tactcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg taggtggttt 540

gttaagtctg atgtgaaagc cctgggctca acctgggaac tgcattggaa actggcttac 600

tagagtgcgg tagaggggtg tggaattccc ggtgtagcag tgaaatgcgt agatatcggg 660

aggaacatct gtggcgaagg cgacaccctg gaccagcact gacactgagg cacgaaagcg 720

tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg cgaactggat 780

gttgggggca acttggccct cagtatcgaa gctaacgcgt taagttcgcc gcctgggaag 840

tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagtat 900

gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatgca cggaactttc 960

cagagatgga ttggtgcctt cgggaaccgt gacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1020

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctgtcc ttagttgcca 1080

gcacgtaatg gtgggaactc taaggagacc gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaagt catcatggcc cttacggcca gggctacaca cgtactacaa tggtagggac 1200

agagggctgc aaacccgcga gggcaagcca atcccagaaa ccctatctca gtccggattg 1260

gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgcagatc agcattgctg 1320

cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtttgttgca 1380

ccagaagcag gtagcttaac cttcgggagg gcgctgccac g 1421

Claims (5)

1.一株缓解植物铜毒害的耐铜细菌RCu，其特征在于：该菌隶属于Lysobacter soli，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2021693，保藏日期为 2021年6月8号。

2.根据权利要求1所述的耐铜细菌RCu，其特征在于：该菌株具有高铜抗性，其能耐受的Cu²⁺浓度为3.25 mM。

3.一种能缓解植物铜毒害的微生物菌剂，其特征在于：该菌剂采用权利要求1所述的耐铜细菌RCu制备得到。

4.权利要求1所述的耐铜细菌RCu，或权利要求3所述的微生物菌剂在制备生物肥料中的应用。

5.权利要求1所述的耐铜细菌RCu，或权利要求3所述的微生物菌剂，或权利要求4所述的生物肥料在缓解植物铜胁迫或促进植物在重金属铜污染土壤中生长的应用。

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