CN114317373A - 一种鞘氨醇单胞菌pah02、微生物制剂及其作为农作物降镉富硒功能调理剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鞘氨醇单胞菌PAH02、微生物制剂及其作为农作物降镉富硒功能调理剂的应用。鞘氨醇单胞菌PAH02从重金属污染稻田土壤中筛选分离得到，其对镉耐受性好且可以促进农作物对土壤中硒的富集，将其制成菌剂接种至农作物幼苗根际，在农作物分蘖期二次接种，能显著降低成熟期农产品中镉含量的同时增加硒富集量，可大规模用于中低度镉污染土壤的农作物种植并获得镉含量安全达标且富硒的农产品。

Description

一种鞘氨醇单胞菌PAH02、微生物制剂及其作为农作物降镉富 硒功能调理剂的应用

技术领域

本发明涉及一种鞘氨醇单胞菌、微生物制剂和应用，具体涉及一种从重金属污染土壤中筛选得到的鞘氨醇单胞菌PAH02，还涉及一种包含该鞘氨醇单胞菌的微生物制剂，以及涉及该微生物制剂在农作物降镉富硒方面的应用，属于重金属污染农田土壤治理技术领域。

背景技术

据2020年生态环境部土壤污染状况详查显示影响农用地土壤质量的主要污染物是重金属，其中镉为首要污染物。近年来，镉大米事件等引起了社会的广泛关注，主要水稻生长期内易吸收和富集积累镉，稻米中镉经食物链进入人体，极易引发健康风险，如生长延缓、肾功能受损和骨质疏松等。硒是人和动物必需的微量营养元素之一，在增强抗氧化、提高免疫力和预防癌症等方面有重要功效，然而目前中国有72％的县市的土壤存在不同程度缺硒(“Selenium geochemistry of paddy soils in Yangtze River Delta”，Z.H Cao,etal,.Environment International,2001,26(5))，严重制约着食物的硒营养状况。水稻是我国主要粮食作物，全国稻米硒含量平均为0.032mg/kg，低的仅有0.016mg/kg(“不同因素对水稻离体根吸收四价硒影响”,张联合等,土壤,2006(04):417-421.)，远不能满足人体正常的需求，合理提高农产品硒水平是人类硒营养健康需要的根本途径。可见，防治稻米镉污染的同时提高硒含量是保障国家粮食安全，提高居民饮食质量的重要基础。

目前，我国重金属污染稻田土壤修复技术已广泛使用了VIP+n技术，包括采用低镉品种(V)、淹水灌溉(I)，pH调控(P)、其他高效技术(n)。其中,长期淹水管理可还原形成S^2-与镉形成沉淀，显著降低镉活性；施用生石灰可提高pH值，使土壤中有效镉含量降低；其他高效技术包括施用有机肥、土壤调理剂和种植结构调整等。由于在农业生产过程当中，该技术需同时精准推进多项技术措施，难度大、不易操作，一方面需要大量专业的技术人员确保精确性，增加人力成本；另一方面也会消耗大量的原料(生石灰、有机肥、叶面阻控剂、土壤调理剂等)，造成资源浪费。微生物修复稻田重金属污染方面微生物修复法以其物种的多样性、低成本、低能耗、高效率和无二次污染等特点显示了良好的应用前景，已经建立了一系列基于大肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌和微球菌等细菌的重金属修复方法，如中国专利(申请号CN201710542854.6)公开了一种高效耐受重金属镉且具有pH自调节功能和生物活化-矿化功能的菌株及其应用。中国专利(申请号CN201810855138.8)公开了一种贪铜菌及贪铜菌制剂和贪铜菌制剂在重金属污染土壤修复中的应用。其具体公开贪铜菌Cd02具有高效耐重金属、自诱导pH增加而提高重金属离子的吸附、积累和沉淀，以及伴随产生具有氮磷缓控释肥作用的磷酸铵镁，特别适合镉污染土壤的修复。鞘氨醇单胞菌分布在不同的生态系统中，从恶劣的环境到适合微生物生长友好的环境。鞘氨醇单胞菌因其在不同污染场地降解和修复大量有机和无机化合物的能力而广为人知。鞘氨醇单胞菌通过增加金属硫蛋白相关基因的表达，去除并阻控重金属离子与植物中的蛋白质结合，具有在细胞内积累锌离子和降低镉离子吸收的独特特性。

目前富硒植物产品主要依靠土壤或叶面添加硒元素来获得，而提高稻米中硒含量则主要借助于叶面喷施亚硒酸，但这些措施不仅提高了生产成本，而且还存在潜在的环境风险，很难获得硒含量稳定的产品。

因此，利用鞘氨醇单胞菌剂施加于稻田土壤，降低稻米中镉的含量并增加硒的含量是提高稻米品质的一条理想的途径。截止目前，鲜有报道利用鞘氨醇单胞菌剂用于稻米降镉富硒的应用。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的第一个目的在于提供了一种从重金属污染稻田土壤中分离、筛选和纯化得到的鞘氨醇单胞菌PAH02(Sphingomonas sp.strain PAH02)，该鞘氨醇单胞菌对重金属镉具有较好的耐受性且能够促进农作物对土壤中硒的富集。

本发明的第二个目的是在于提供一种微生物制剂，该微生物制剂主要包含鞘氨醇单胞菌PAH02，具有降低农作物中镉含量和提高农作物对硒富集量的功能，可广泛应用于镉污染农田土壤中农作物的种植。

本发明的第三个目的在于提供一种微生物制剂的应用，将该微生物制剂应用于镉污染农田中农作物种植过程，可以有效降低农作物中镉含量和提高农作物对硒的富集量，以实现在中低度镉污染农田中种植农作物并获得镉含量达标且富硒的高品质农产品。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种鞘氨醇单胞菌PAH02(Sphingomonassp.strain PAH02)，其保藏编号为CCTCCM NO:2022026。本发明的鞘氨醇单胞菌是从重金属污染稻田采集的土壤样品中分离、筛选和纯化得到，并且于2022年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM NO:2022026，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

本发明还提供了一种微生物制剂，其包含所述的鞘氨醇单胞菌PAH02。

作为一个优选的方案，所述微生物制剂包含营养液。营养液为鞘氨醇单胞菌提供生长所需营养成分并为水稻提供营养。

作为一个优选的方案，所述营养液包含以下组分KNO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₃PO₄、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、NaMoO₄·2H₂O；FeSO₄·7H₂O和EDTA-Na₂。

作为一个优选的方案，所述营养液由A溶液、B溶液、C溶液及D溶液按照体积比10:10:1:1混合并稀释至1L得到；所述A溶液组成为：500～510mg/L KNO₃，1100～1200mg/L Ca(NO₃)₂·4H₂O；所述B溶液组成为：480～510mg/L MgSO₄·7H₂O，130～150mg/L KH₃PO₄；所述C溶液组成为：25～35mg/L H₃BO₃，15～25mg/L MnCl₂·4H₂O，2～3mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.5～1mg/L CuSO₄·5H₂O，0.5～1.5mg/L NaMoO₄·2H₂O；所述D溶液组成为：50～60mg/L FeSO₄·7H₂O，70～80mg/L EDTA-Na₂。

作为一个优选的方案，鞘氨醇单胞菌PAH02在微生物菌剂中的质量百分比含量为0.5～5％。

本发明还提供了一种微生物制剂的应用，其作为农作物降镉富硒功能调理剂应用。

作为一个优选的方案，将微生物制剂接种在农作物幼苗根际。

作为一个优选的方案，将微生物制剂接种在农作物幼苗根际并在农作物分蘖期二次接种。

本发明技术方案将鞘氨醇单胞菌微生物制剂添加至种植在重金属镉超标的稻田的水稻(黄华占)根际，或者可以进一步在水稻分蘖期二次接种。由于筛选得到的鞘氨醇单胞菌PAH02能较好地耐受重金属镉，并且可以通过调控水稻镉转运基因OsCd1、OsHMA2、OsHMA3和OsNramp5等表达，减少水稻根系对镉的吸收，同时将镉转运进液泡隔离起来减少其向地上部的运输，从而减少水稻籽粒中镉的积累，从而有效降低水稻稻米中镉的含量，同时能够促进水稻根系对土壤中微量元素硒的吸附。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益效果：

本发明技术方案通过从重金属污染稻田土壤中筛选分离出鞘氨醇单胞菌PAH02，这种鞘氨醇单胞菌对镉具有较好的耐受性，且可以促进农作物根系对土壤中硒的富集。

本发明技术方案将鞘氨醇单胞菌制成菌剂接种至水稻幼苗根际，可实现在中低度镉污染农田中种植水稻，且获得的稻米中镉含量安全达标，并提高稻米中硒的含量，成本低，无污染。

附图说明

图1为本发明筛选的鞘氨醇单胞菌PAH02的革兰氏染色图。

图2为本发明筛选的鞘氨醇单胞菌PAH02系统发育树图；由图2可知，鞘氨醇单胞菌PAH02与鞘氨醇单胞菌有很好的亲缘关系。

图3为本发明的鞘氨醇单胞菌PAH02制剂添加至水稻根际后不同时期水稻各部位镉含量图；a为水稻根部各时期镉含量，b为水稻茎部各时期镉含量，c为水稻叶部各时期镉含量，d为水稻穗部各时期镉含量，e为水稻大米中镉含量。

图4为本发明的鞘氨醇单胞菌PAH02制剂添加至水稻根际后不同时期水稻相关基因变化图；a为转运基因OsCd1表达变化，b为转运基因OsHMA2表达变化，c为转运基因OsHMA3表达变化，d为转运基因OsNramp5表达变化。

图5为本发明的鞘氨醇单胞菌PAH02制剂添加至水稻根际后稻米中硒含量图。

具体实施方式

以下具体实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制权利要求的保护范围。

实施例1

菌株PAH02的分离与筛选：该菌株是从湖南省湘潭市重金属和多环芳烃复合污染稻田采集的土壤样品中分离、筛选和纯化后获得的。具体方法如下：称取上述土壤样品1g，加入100mL无菌水，置转速150rpm的恒温摇床中振荡24h后，静置30min，取1mL上清液涂布于含有100mg/L的含镉固体LB培养基中，放入恒温培养箱培养24h后观察菌落形态，并将长出的单个菌落划线至新鲜的LB固体平板上培养，得到纯菌株，命名为PAH02。最后将PAH02菌株划线于斜面试管，置恒温培养箱中37℃培养24h后，于4℃的冰箱中保存。本实施例1中的LB培养基配方为：蛋白胨10g，NaCl10 g，酵母粉5g，琼脂粉20g，超纯水1000mL，pH 7，LB培养基于121℃、1个大气压下灭菌20min后，备用。

PAH02菌的菌落形态体征如下：在LB固体培养基上培养24h后，形成黄色菌落，湿润，不透明，表面光滑。经革兰氏染色后镜检呈红色(图1)，属革兰氏阴性菌。

提取该菌株的细菌基因组DNA，以该菌株的基因组DNA为模板，以用通用引物27F和1492R扩增该菌株的16S rDNA基因。PCR扩增后的16S rDNA产物送上海生物工程有限公司测序。测序结果显示该菌株的16S rDNA部分序列长度有1391bp，其序列特征如下：

GGCAACATCTGCTGGTCGCCTGCCTCCTTACGGTTAGCTCAACGCCTTCGAGTGAATCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCTGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGCCTTCACGCTCTCGAGTTGCAGAGAACGATCCGAACTGAGACGACTTTTGGAGATTAGCTCCCTCTCGCGAGGTGGCTGCCCACTGTAGTCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAACGCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTATCACCGGCGGTTCCTTTAGAGTACCCAACTAAATGCTGGCAACTAAAGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCACCTATCCAGCCGAACTGAAGGAAAGTGTCTCCACGATCCGCGATAGGGATGTCAAACGTTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCAGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGATAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCAAAACACCATGTGCCCTGACAGCTAGTTATCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAATACCAGTCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTCCTGGATTCAAGCTATCTAGTTTCAAAGGCAGTTCCGGGGTTGAGCCCCGGGCTTTCACCTCTGACTTGAATAGCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAACAACGCTAGCTCCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGAGCTTATTCTCCCGGTACTGTCATTATCATCCCGGGTAAAAGAGCTTTACAACCCTAAGGCCTTCATCACTCACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAATATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAAGGATCGTCGCCTTGGTGGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCTACGCGGGCTCATCCTTGGGCGATAAATCTTTGGACTTACGTCATCATCCGGTATTAGCTTCCGTTTCCAGAAGTTATTCCGAACCCAAGGGCAGATTCCCACGCGTTACGCACCCGTGCGCCACTAGATCCGAAGATCTCGTTCGACTGCATGTATACGTATGAGCTTCCAAC.

将该菌株的16S rDNA部分序列在NCBI Genbank上的相关细菌的16S rDNA序列进行BLAST比对，并进行同源性分析，结果表明，该菌株与鞘氨醇单胞菌属的同源性最高，相似度在99％以上，结合形态培养特征、生理生化实验分析以及16S rDNA序列分析，该菌株确定为鞘氨醇单胞菌。将该菌株的16S rDNA部分序列提交到NCBI Genbank，获得登录号为OL441033.1。

使用MEGA7.0软件构建得到的该菌的16S rDNA系统发育树如图2所示。

实施例2

接种鞘氨醇单胞菌PAH02对水稻镉含量的变化：分别将100mLOD₆₀₀＝1.5的鞘氨醇单胞菌制剂和100mL不含鞘氨醇单胞菌的营养液添加至水稻幼苗根际，在水稻分蘖期重复上述工作。利用ICP-MS测定分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期水稻各部位的镉含量如图3所示。

实验所用的土壤均为实地采集，pH约为6.2，其中镉浓度约为0.9033～0.97408mg/kg，超过《土壤环境质量-农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB15618-2018)限值0.4mg/kg(5.5<pH≤6.5)。由图3(e)可知，虽然未接种鞘氨醇单胞菌的CK组稻米中镉含量未超过《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB 2762-2017)限值0.2mg/kg，但接种鞘氨醇单胞菌PAH02后显著降低了稻米中镉的含量，下降幅度为17％，远低于限值0.2mg/kg。接种鞘氨醇单胞菌PAH02显著增加了分蘖期和抽穗期水稻根中镉含量(图3a)，显著降低了分蘖期水稻茎中镉含量(图3b)，显著增加了水稻叶中镉含量(图3c)，对水稻穗中镉含量未产生显著影响。

实施例3

接种鞘氨醇单胞菌PAH02对水稻相关镉基因的变化：

分别取接种PAH02菌和对照组水稻分蘖期、抽穗期、灌浆期和成熟期的叶尖加入液氮研磨成粉末，使用试剂盒获得高纯度水稻RNA，然后逆转录获得cDNA，利用荧光定量PCR测定水稻转运基因表达量的变化如图4所示。

接种鞘氨醇PAH02显著降低了水稻成熟期OsCd1基因的表达(图4a)和分蘖期与抽穗期OsNramp5基因表达(图4d)，同时显著增加了水稻分蘖期OsHMA2基因的表达(图4b)以及抽穗期、灌浆期和成熟期OsHMA3基因的表达(图4c)。

实施例4

接种鞘氨醇单胞菌PAH02对稻米中硒含量的变化：

分别将100mLOD₆₀₀＝1.5的鞘氨醇单胞菌制剂和100mL不含鞘氨醇单胞菌的营养液添加至水稻幼苗根际，在水稻分蘖期重复上述工作。利用ICP-MS测定稻米中的硒含量，如图5所示。

由图5可知，接种鞘氨醇单胞菌PAH02显著增加稻米中硒的含量，使得稻米硒浓度从0.08mg/kg增加至0.29mg/kg，增幅为255％，且未超过《富硒稻谷》(GB/T 22499-2008)规定的0.3mg/kg。

Claims (9)

1.一种鞘氨醇单胞菌PAH02(Sphingomonas sp.strain PAH02)，保藏编号CCTCC NO：M2022026。

2.一种微生物制剂，其特征在于：包含权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌PAH02。

3.根据权利要求2所述的一种微生物制剂，其特征在于：包含营养液。

4.根据权利要求3所述的一种微生物制剂，其特征在于：所述营养液包含以下组分KNO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₃PO₄、H₃BO₃、MnCl₂·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、NaMoO₄·2H₂O；FeSO₄·7H₂O和EDTA-Na₂。

5.根据权利要求4所述的一种微生物制剂，其特征在于：所述营养液由A溶液、B溶液、C溶液及D溶液按照体积比10:10:1:1混合并稀释至1L得到；

所述A溶液组成为：500～510mg/L KNO₃，1100～1200mg/L Ca(NO₃)₂·4H₂O；

所述B溶液组成为：480～510mg/L MgSO₄·7H₂O，130～150mg/L KH₃PO₄；

所述C溶液组成为：25～35mg/L H₃BO₃，15～25mg/L MnCl₂·4H₂O，2～3mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.5～1mg/L CuSO₄·5H₂O，0.5～1.5mg/L NaMoO₄·2H₂O；

所述D溶液组成为：50～60mg/L FeSO₄·7H₂O，70～80mg/L EDTA-Na₂。

6.根据权利要求2所述的一种微生物制剂，其特征在于：鞘氨醇单胞菌PAH02在微生物菌剂中的质量百分比含量为0.5～5％。

7.根据权利要求2～6任一项所述的一种微生物制剂的应用，其特征在于：作为农作物降镉富硒功能调理剂应用。

8.根据权利要求7所述的一种微生物制剂的应用，其特征在于：将微生物制剂接种在农作物幼苗根际。

9.根据权利要求7所述的一种微生物制剂的应用，其特征在于：将微生物制剂接种在农作物幼苗根际并在农作物分蘖期二次接种。

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