CN117050913B - 类芽孢杆菌cbp-2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种类芽孢杆菌（Paenibacillus xylanilyticus）CBP‑2，保藏编号为CGMCC No.26727，该菌株施用于土壤，不仅具有释硅、溶磷、解钾功能，而且该菌还具有产嗜铁素、IAA和纤维素酶的能力。该菌株在pH 5~10、NaCl浓度0~7%、温度20~40℃时均能很好生长，具有较好的耐酸碱、耐盐性特性。本发明还公开了该菌株在促进植物生长、加速有机质降解和土壤质量提升方面的应用。另外，根据菌株生长及抗逆特性，其在新型生物有机肥和土壤调理剂研制、尾矿区和盐碱地土壤改良等方面有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌CBP-2及其应用。
背景技术
近年来，由于工业化快速发展及我国掠夺式的种植模式，导致50~80%以上的农田土壤可溶性Si元素严重不足，土壤有效微生物多样性失衡，20%以上的土壤受到Cd、As、Pb等重金属污染，严重影响到农业生产与农产品的品质安全，农田土壤修复及污染防控问题已引起全社会的高度关注。
研究表明，硅肥不仅可以提升土壤硅素含量，改善作物品质和提高作物产量，还可以作为重金属钝化剂修复污染土壤、调节土壤酸碱度、改良土壤结构、降低土壤盐碱危害等，对解决障碍土壤生产力水平有着明显作用。矿物硅肥虽具有较高含量的有效硅，但由于结构方面存在缺陷，在种植多年设施土壤及重金属污染农田中的应用受到限制。
释硅功能微生物对于土壤中难溶性硅的有效转化意义深远。当前的释硅细菌主要包括胶质类芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、土壤芽孢杆菌等。研究表明一些释硅细菌同时具有活化土壤中不溶物、耐高温耐盐碱、耐干旱等功能，如；解淀粉芽孢杆菌KY15可以将土壤中的磷酸盐、硅酸盐等活化；胶质芽孢杆菌JDzhs-b有效适应盐碱板结土壤；硅酸盐胶质芽孢杆菌h-3菌株，对一般旱田土壤环境的适应潜力较强，且具有较强的释硅、解钾能力。但是很多研究还处于试验阶段，释硅微生物在生产应用过程中呈现出效果不稳定、将土壤中无定形态硅转化成植物可以吸收利用的有效硅的报道相对较少。
因此，筛选可以分解难溶性含硅矿物的高效功能微生物，将囤积在土壤中的“硅元素”释放出来，开发具有高效释硅功能且具有较强抗逆性的功能微生物，对研制新型生物硅肥、提高土壤质量和促进种植业可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种既可高效释硅、溶磷、解钾，又可以产嗜铁素、IAA、纤维素酶的类芽孢杆菌CBP-2。应用于土壤，不仅促进植物生长，而且可以提高土壤质量，还有利于土壤中有机废弃物的降解。
本发明采用如下技术方案：
一种类芽孢杆菌（Paenibacillus xylanilyticus）CBP-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26727，保藏日期为2023年3月3日。
所述的类芽孢杆菌CBP-2在LB培养基上生长良好，单个菌落暗白色、不透明、表面凸起，边缘整齐；CBP-2菌体呈短杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢。甲基红、V.P反应阳性，具有水解淀粉、明胶和纤维素等特性，能很好地利用葡萄糖、甘露醇、蔗糖、果糖、可溶性淀粉和麦芽糖等为碳源。
进一步的，该菌株具有释硅、溶磷、解钾的能力。
进一步的，该菌株可产嗜铁素、IAA和纤维素酶。
进一步的，该菌株在pH为5~10、NaCl浓度0~7%、温度20~40℃时均能很好生长，具有耐酸碱、耐盐和广适温特性。
一种上述类芽孢杆菌CBP-2在促进植物生长、加速有机废弃物降解和提升土壤质量中的应用。
一种上述类芽孢杆菌CBP-2在制备生物有机肥，特别是在生产嗜铁素和/或IAA中的应用。
一种上述类芽孢杆菌CBP-2在土壤修复中的应用，特别是尾矿区土壤生态修复和酸性或盐碱土壤修复及改良中的应用。
一种上述类芽孢杆菌CBP-2在制备土壤调理剂和人工基质中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）利用本发明的类芽孢杆菌CBP-2应用于土壤或者尾矿区生态修复，不仅有释硅作用，还能解磷、解钾、产嗜铁素、产IAA和纤维素酶，为植物生长提供养分，促进植物生长。
（2）利用本发明的类芽孢杆菌CBP-2，在盐碱土耐受性方面优势显著，最适生长NaCl浓度为3~4%，最高NaCl耐受浓度为7%，定殖能力强，可用于铁尾矿区土壤及盐碱地土壤改良和质量提升。
（3）本发明可以为研制新型生物有机肥、土壤调理剂、人工基质等提供优良菌种，还可以为释硅、解磷、解钾功能微生物的开发提供优质的菌种资源，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。
附图说明
图1为类芽孢杆菌CBP-2系统发育树。
图2 为CBP-2菌株培养过程中的释硅动态变化。
图3为培养基初始pH对类芽孢杆菌CBP-2生长的影响。
图4为NaCl浓度对类芽孢杆菌CBP-2生长的影响。
图5为温度对类芽孢杆菌CBP-2生长的影响。
图6为类芽孢杆菌CBP-2对小白菜幼苗生长的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
实施例1 类芽孢杆菌CBP-2分离、鉴定和保藏
分离样品来自石家庄某地植物根际土壤（0~40cm土层），采样时遵循随机均匀取样原则，采集到的新鲜样品使用无菌袋收集，将样品用无菌水稀释制备成10-4、10-5、10-6三个稀释度的土壤悬液，均匀涂布于亚历山大罗夫培养基上，于30℃恒温培养箱中培养2~3天，挑取具有明显透明圈的单菌落，重复划线2~3次，直至获得纯培养，转接到LB斜面，4℃冰箱保存备用。
铁尾矿砂样品来源于河北省涞源县尾矿库，研磨过200目筛，以铁尾矿砂为底物，以发酵液中有效硅含量的增加为标准，对初筛得到的单菌落进行释硅能力复筛。复筛过程中，种子液由LB培养基发酵至对数生长期，按10%体积接入浸矿脱硅培养基，30℃摇床180r/min振荡培养，第5d取样，离心发酵液取上清，用硅钼蓝比色法测定有效硅含量。
表1 铁尾矿砂样品的化学成分
培养基配方：
（1）亚历山大罗夫培养基：蔗糖 5.0g、Na2HPO42.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeCl30.005g、CaCO30.1g、三硅酸镁 1.0g、琼脂 15~20g、水 1000mL，pH调为7.0~7.4。
（2）浸矿脱硅培养基：葡萄糖 10g、KH2PO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.2g、CaCl2·2H2O 0.2g、铁尾矿砂 1.0g、CaCO35g、水 1000mL、pH 7.0~7.2。
（3）LB培养基：胰蛋白胨 10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、水 1000mL，pH 7.2~7.5（固体培养基需加琼脂 15~20g）。
菌株CBP-2在LB培养基上生长良好，单个菌落暗白色、不透明、表面凸起，边缘整齐；CBP-2菌体呈短杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢。甲基红、V.P反应阳性，具有水解淀粉、明胶和纤维素等特性，能很好地利用葡萄糖、甘露醇、蔗糖、果糖、可溶性淀粉和麦芽糖等为碳源。
用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取CBP-2菌株的总DNA，以其为模板，通用16SrDNA引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），进行扩增，琼脂糖电泳检测得到1条1500 bp左右的条带。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。
将测序结果提交NCBI，与数据库中已有的16S rDNA 序列进行同源性比较分析,并从Genebank中选择近缘菌株的16S rDNA 基因序列，利用MEGA7.0构建系统进化树。结果如图1所示，与类芽孢杆菌Paenibacillus xylanilyticusstrain W4（CP044310.1）的亲缘关系最近，相似性达99.42%。结合形态特征观察和生理生化反应结果，将菌株CBP-2鉴定为解木聚糖类芽孢杆菌（Paenibacillus xylanilyticus）。
菌株CBP-2于2023年3月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26727。
实施例2类芽孢杆菌CBP-2培养过程中释硅动态变化
制备菌株CBP-2种子液，将菌液浓度调整为1×109CFU/mL，以2%（v/v）的接种量，将种子液接种到浸矿脱硅培养基中，装液量50mL（摇瓶100mL），置于30℃、120r/min摇床上培养7d，以不接菌的释硅基础培养基为空白对照，每个处理重复3次。每隔24h取样，取出样品在8000r/min离心5min，取上清液，过0.22μm滤膜，采用NYT1121.15-2006硅钼蓝比色法测定培养后发酵液中有效硅含量，确定释硅菌株的动态释硅能力。
结果表明（见图2），随着培养时间的延长，上清液中有效硅的含量逐渐上升，之后趋于平缓并不再增加。在培养6d时达到最大值，此时该菌株释硅基础培养液中的有效硅含量达到22.46mg/L，较未接菌的释硅基础培养液11.09mg/L提高了102.45%。说明菌株CBP-2能显著提高含硅矿物的转化速率，促进其中不溶性Si元素的释放。
实施例3类芽孢杆菌CBP-2溶磷、解钾能力测定
NBRIP溶磷培养基：葡萄糖 10g、Ca3(PO4)25g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.25g、KCl 0.2g、MgCl2·6H2O 5g、琼脂15g、0.4%溴酚蓝 6mL、水1000mL，pH 7.0~7.2。
解钾培养基：蔗糖 10g、Na2HPO4 1g、(NH4)2SO40.5g、MgSO4·7H2O 1g、酵母粉 0.2g、NaCl 0.1g、CaCO30.1g、FeCl30.005g 、钾长石 5g、水 1000mL，pH 7.0~7.2。
制备菌株CBP-2种子液，分别点接于NBRIP溶磷培养基和解钾培养基上，于30℃恒温培养箱中培养2d后，观察其生长情况及是否有溶解圈。
计算方法为：溶解能力＝溶解圈直径D/菌落直径d。
结果表明：在NBRIP溶磷培养基和解钾培养基中，CBP-2菌落周边均出现明显的透明圈，D/d值为1.38和1.47，说明其具有一定的溶磷、解钾能力。
实施例4 类芽孢杆菌CBP-2的抗逆性
根据菌株CBP-2在不同pH、NaCl浓度和温度下的生长情况，探究该菌株的抗逆性。具体方法是：设置pH 3~12、NaCl浓度0~15%、温度20℃~50℃范围，按1%（v/v）接种量将菌株CBP-2种子液接到30mL LB液体摇瓶中，在30℃、180r/min条件下摇床培养24h，然后用稀释涂布平板法测定发酵液中细菌浓度。
稀释涂布平板法测定细菌浓度：吸取1mL发酵液至9mL去离子水的试管中，震荡混匀，得到10-1发酵稀释液，进一步通过梯度稀释至不同浓度，分别吸取10-6、10-7、10-8稀释液100μL涂布至LB培养基平板，每个梯度设置3个平行，于30℃恒温倒置培养24h。选取菌落数在30~300个之间的平板进行计数，计算1mL发酵液中CBP-2的菌体数量即为CBP-2的细菌浓度。
菌株CBP-2的生长受pH影响较小，在pH 5~10的范围内均能较好的生长（见图3）。当pH<5或pH>10时，几乎检测不到菌株，说明菌株生长受到抑制。细菌作为有机生命体，初始pH会促进或抑制菌种生长，而菌株CBP-2在pH 5~10均生长良好，说明具有较强的耐酸碱能力和环境适应能力，可以应用于酸性或碱性土壤，研制土壤改良剂有明显优势。另外铁尾矿区土壤多数呈碱性，在尾矿区土壤生态复垦中有很好的应用优势。
菌株CBP-2在0~7%的NaCl范围内生长良好（见图4）。当NaCl浓度为8%时，菌株数量急剧下降，说明菌株生长受到了强烈抑制。细菌在一定的盐浓度范围内才能生长，当浓度较高时，发酵液中渗透压大于细菌内渗透压，细胞失水收缩，从而抑制了微生物体内的生理生化反应，抑制其生长繁殖。而在低渗溶液中，由于细胞壁的保护作用，微生物受低渗的影响不大。该菌株CBP-2能够在0~7%的NaCl范围内生长良好，说明其具有较好的耐盐性，在进行盐碱地土壤修复时也能保证其自身不受抑制，具有较大优势。
测定结果表明，菌株CBP-2在20℃~40℃范围内生长良好，具有较好的广适温性（见图5）。而当温度小于20℃或大于40℃（45℃、50℃）时菌株数量急剧下降，说明菌株生长受到了强烈抑制。适宜的温度是细菌发酵必不可少的条件，当温度过低，会使细胞中所含生物酶活性降低导致相应酶促反应速率下降，生命代谢和增殖速度也会降低；而温度过高时，会使菌体内蛋白质失活，造成细胞死亡，呈现出菌株生长缓慢或不生长现象，而菌株CBP-2最佳培养温度为30℃。
综合上述结果，说明菌株CBP-2具有较强的耐酸碱、耐盐特性和广适温特性，其对逆境条件耐受能力强。
实施例5 类芽孢杆菌CBP-2产嗜铁素和IAA能力
制备菌株CBP-2种子液，点接于CAS检测培养基上，30℃培养2d，若出现黄绿色晕圈，则说明产嗜铁素。将菌液浓度调整为1×109CFU/mL，以体积比2%接种于LB液体培养基中（含100mg/L的L-色氨酸），置于30℃、180r/min的摇床上振荡培养1~2d，取经过8000r/min离心后的上清液50μL，加入50μL Salkowski比色液，滴在白瓷板上避光显色30min后，若出现粉红色则为阳性，表示该菌株能够分泌IAA，颜色越深表示分泌的强度越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。
结果表明，菌株CBP-2在CAS培养基可溶性指数＞2，说明具有较好的产嗜铁素能力，同时Salkowski比色结果显示菌株CBP-2也具有产IAA的能力，进一步说明其具有促进植物生长的能力。
实施例6 类芽孢杆菌CBP-2对小白菜种子萌发及幼苗生长的影响
供试种子：“口口香奶油2号”小白菜，购自河北某种业公司。挑取成熟饱满、大小均匀的健康种子，用0.1%高锰酸钾溶液对种子表面消毒30min，用蒸馏水冲洗3次，风干待用。
供试菌种：菌株CBP-2，挑取菌株CBP-2单菌落接种于50mL无菌LB液体培养基中，180r/min、30℃摇床培养22h得到发酵原液。将发酵原液用去离子水按体积比进行稀释，获得稀释倍数为0、5、10、20、40、60、80、100、150、200倍的发酵液，保存备用。以无菌水为对照组CK，分别考察原液、5×、10×、20×、40×、60×、80×、100×、150×及200×稀释液（每天早晚各施加2mL）对小白菜种子萌发的影响。
测定指标及方法：每天统计发芽情况并计算发芽率，并计算发芽势（%）、发芽率（%）、发芽指数、活力指数；培养第7天测量芽长和根长等生长指标。
表2 CBP-2菌株催芽处理对小白菜种子萌发的影响
注: 发芽势（%）=（发芽达到高峰时正常发芽数/供试种子总数）×100%；发芽率（%）=（发芽种子数/供试种子数）×100%；发芽指数=∑Gt／Dt，Gt为在第t日种子的发芽数；Dt为种子发芽天数；活力指数=苗长度×发芽指数，同列不同字母表示处理间差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
由表2可知，随着不同浓度的菌液催芽对菌株的发芽效果影响显著，且随着稀释倍数的增加整体上呈先抑制后促进的影响效果。在原液催芽处理下的小白菜发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数均达到最小值，较对照处理催芽降低了18.79%、10.10%、4.73%、74.67%。在稀释100倍处理小白菜的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数均达到了最大值，较对照组催芽而言分别提高了4.98%、5.97%、5.98%、40.64%。说明CBP-2对小白菜种子萌发的有显著促进作用。
由图6可知，不同浓度CBP-2菌液催芽处理的小白菜幼苗生长差异达到显著水平，不同处理的芽长、根长均在稀释浓度为100倍时，达到最大值，分别较对照组提高了38.14%、73.85%。原液、稀释5倍、10倍、20倍处理组的芽长较对照组而言出现了明显的抑制效果，其余稀释处理组的根长较水处理组而言均有不同程度的促生效果。
实施例7 类芽孢杆菌CBP-2对土壤及植物生长的影响
制备菌株CBP-2种子液，将菌液浓度调整为1×109CFU/mL，按照100 mL·kg-1拌入基质，基质是由40%园林土、20%铁尾矿砂和40%蛭石复合而成。对照则在基质中拌入相同体积的培养基，进行玉米盆栽试验。25℃温室中，在种子萌发后保留每盆中生长最为良好的三株幼苗，50d后对土壤和植株的地上指标及根系生长状况进行测定。每组实验做3组平行处理。
表3 类芽孢杆菌CBP-2对玉米植株生长的影响
结果显示（具体见表3），玉米在植株长势及根系方面都要显著优于对照处理，特别是在株高、根长、茎粗、叶长、叶宽和叶绿素含量方面均显著高于对照组，分别比对照组提高了14.71%、28.79%、42.51%、18.63%、30.37%和27.05%。
表4 类芽孢杆菌CBP-2对土壤肥力的影响 单位：%
土壤养分含量是玉米生长发育的关键，是产量形成的前提。由表4可知，施加菌株CBP-2菌液，可以显著提高土壤中的铵态氮、硝态氮、有效硅、有效磷和速效钾含量，与对照相比，分别提高了12.35%、9.57%、30.08%、82.51%和48.62%。进一步说明，施用CBP-2菌液，可以有效提高土壤养分含量，与提高植物生长量正相关。
根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种类芽孢杆菌（Paenibacillus xylanilyticus）CBP-2，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.26727。
2.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌CBP-2，其特征在于，该菌株施用于土壤，具有释硅、溶磷、解钾的能力，而且该菌还可产嗜铁素和IAA。
3.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌CBP-2，其特征在于，其在pH为5~10、NaCl浓度0~7%、温度20~40℃时均能很好生长，具有耐酸碱、耐盐的特性。
4.一种如权利要求1所述的类芽孢杆菌CBP-2在促进植物生长和提升土壤质量中的应用。
5.一种如权利要求1所述的类芽孢杆菌CBP-2在制备生物有机肥、土壤调理剂和人工基质中的应用。
6.一种如权利要求1所述的类芽孢杆菌CBP-2在尾矿区土壤生态修复中的应用。
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