CN114958678B

CN114958678B - 一种肠杆菌y1-10及其应用

Info

Publication number: CN114958678B
Application number: CN202210675187.XA
Authority: CN
Inventors: 程辉彩; 杨玲; 习彦花; 何强; 王馨芝; 张丽萍
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN114958678A

Abstract

本发明涉及一种高效释硅的肠杆菌（Enterobacter cancerogenus）Y1‑10，保藏编号为CGMCC No.24892，其菌体为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阴性。该菌株具有较高的释硅特性，还有溶磷、解钾、固氮、产嗜铁素和耐盐性能。本发明同时涉及该菌株在土壤质量提升和硅肥等方面的应用。以该菌株为有效成分可制成生物硅肥、土壤改良剂等，可有效改善土壤养分结构，提升土壤质量，减少化肥农药使用量，达到提质增产的目的。

Description

一种肠杆菌Y1-10及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种肠杆菌Y1-10及其应用。

背景技术

硅是氮、磷、钾之外植物健康生长所必须的第四大元素，在世界农业生产中作用显著。硅的缺乏在一定程度上影响着作物的产量和品质，同时也影响作物与环境及作物与其他生物间的生态关系。据统计，欧盟内土壤约有60%~70%归属不健康，我国缺硅或潜在缺硅土壤占耕地面积的80%，土壤里的硅元素能被植物根系吸收利用的有效硅只占土壤全硅0.1%~0.2%。寻找多种途径提高土壤硅素营养与植物硅素吸收一直是国内外研究的重点。

提高土壤硅素营养的途径很多，生产实践表明施用化学硅肥是改善土壤供硅能力，促进作物提质增产的有效技术措施之一。然而化学硅肥的大量施用造成了诸如土壤结构破坏、有机质含量下降、地下水及地表污染严重等一系列生态环境问题，对农业可持续发展构成威胁和挑战。随着生态农业在世界范围内迅速兴起，出于食品安全、环境保护的需要，对肥料、农药提出了一系列的要求和限制。

因此，开辟新的效果好、成本低又不污染环境的高效释硅微生物，开发新型生物硅肥，将囤积在土壤中的“硅元素”释放出来，提质增产的同时调节土壤酸碱度、改良土壤结构、修复污染土壤等，对发展生态、经济农业具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种既可高效释硅，又具有良好解磷、解钾和固氮能力的耐盐肠杆菌Y1-10及其应用。

本发明采用如下技术方案：

一种肠杆菌（Enterobacter cancerogenus）Y1-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 24892。

所述的肠杆菌Y1-10在LB培养基上生长良好，单个菌落表面湿润光滑，边缘整齐；菌体呈短小杆状，大小约为0.6~1.0×1.2~1.5μm，革兰氏染色呈阴性，兼性厌氧、无芽孢；V-P、柠檬酸盐、D-葡萄糖产酸、产H₂S、吲哚试验均呈阳性，明胶、甲基红、脲酶试验均为阴性。

进一步的，该菌株具有释硅、溶磷、解钾、固氮的能力。

进一步的，该菌株可产嗜铁素和IAA。

进一步的，该菌株在pH为4~10均能生长。

进一步的，该菌株在培养温度20-40℃均能生长。

进一步的，该菌株具有耐盐能力。

一种上述肠杆菌Y1-10在植物促生中的应用。

一种包含上述肠杆菌Y1-10的生物硅肥，其中肠杆菌Y1-10的含量不低于10⁸个/mL。

一种上述肠杆菌Y1-10在土壤修复中的应用，特别是在盐碱土壤修复和改良中的应用。

一种包含上述肠杆菌Y1-10的土壤改良剂，其中肠杆菌Y1-10的含量不低于10⁸个/mL。

一种上述肠杆菌Y1-10在制备产嗜铁素和/或IAA中的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）利用本发明的肠杆菌Y1-10，可以用于富硅地区如铁尾矿区土壤改良。

（2）利用本发明的肠杆菌Y1-10应用于土壤，不仅有释硅作用，还能解磷、解钾、固氮、产嗜铁素和IAA，为植物生长提供养分，促进植物生长等作用。

（3）本发明的肠杆菌Y1-10，在盐碱土耐受性方面优势显著，最适生长NaCl浓度为4%，最高NaCl耐受浓度为12%，定殖能力强，可用于盐碱地土壤改良及质量提升；另外还可以为释硅、解磷解钾功能微生物的开发提供优质的菌种资源，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。

附图说明

图1为肠杆菌Y1-10系统发育树。

图2为不同初始pH对肠杆菌Y1-10生长的影响图。

图3为NaCl浓度对肠杆菌Y1-10生长的影响图。

图4为温度对肠杆菌Y1-10生长的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。

实施例1 肠杆菌Y1-10分离和保藏

由河北省武安市采集铁矿尾矿砂样品，研磨过200目筛，制备成10^-3、10^-4、10^-5的3个稀释度菌悬液，均匀涂布于亚历山大罗夫培养基上，于30 ℃恒温培养箱中培养2~3天，挑取不同形态单菌落重复划线2~3次，直至获得纯培养，转接到斜面4℃冰箱保存备用。

以铁尾矿砂为底物，以发酵液中有效硅含量的增加为标准，对初筛得到的单菌落进行释硅能力复筛。复筛过程中，种子液由LB培养基发酵至对数生长期，按10%体积接入浸矿脱硅培养基，30 ℃摇床180r/min振荡培养，第5 d取样，离心发酵液取上清，用硅钼蓝比色法测定有效硅含量。

培养基配方：

（1）亚历山大罗夫培养基（g/L）：蔗糖5.0 g、Na₂HPO₄ 2.0 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、FeCl₃ 0.005 g、CaCO₃ 0.1 g、土壤矿样1.0 g、琼脂15~20 g，pH调为7.0~7.4。

（2）浸矿脱硅培养基（g/L）：葡萄糖10 g、KH₂PO₄ 0.2 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、NaCl0.2 g、CaCl₂·2H₂O 0.2 g、CaCO₃ 5 g、pH 7.0~7.2。

（3）LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，固体培养基需加琼脂15~20 g，pH 7.2~7.5。

实验发现，菌株Y1-10在LB培养基上生长良好，菌落圆形、淡黄色，边缘整齐，隆起、表面光滑，粘稠。菌体呈短小杆状，革兰氏染色呈阴性，无芽孢；兼性厌氧，大小约为0.6~1.0×1.2~1.5 μm；V-P、柠檬酸盐、D-葡萄糖产酸、产H₂S、吲哚试验均呈阳性，明胶、甲基红、脲酶试验均为阴性。

取菌株Y1-10对数生长期菌液，按照常规方法提取菌株基因组总DNA，以此为模板进行16S rDNA PCR扩增，经上海生工测序得16S rDNA基因序列（SEQ ID No.1）。

将基因序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明（图1），该菌株与Enterobacter cancerogenus strain C2P1的同源性最高达99.72%。结合形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，将菌株Y1-10鉴定为生癌肠杆菌（Enterobacter cancerogenus）。并于2022年5月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24892。

实施例2 肠杆菌Y1-10释硅特性

用接种环取少量纯菌株Y1-10接种于装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，30℃，180 r/min震荡培养16-24 h，得到活化菌种。

将Y1-10菌液浓度调整为1×10⁹ CFU/mL，以体积比2%分别接种于浸矿脱硅培养基中（见实施例1）。分别考察不同浸矿温度、时间、初始pH、矿浆密度、粒径、搅拌速率等因素对菌株Y1-10脱硅性能的影响。取第5天的发酵液8000 r·min^-1离心10 min，取上清过0.22 μm滤膜，采用NYT1121.15-2006硅钼蓝比色法测定培养后发酵液中有效硅含量。

试验结果表明，菌株Y1-10脱硅的最适条件为：温度30 ℃，初始pH 7.0，矿砂浓度7%，矿砂粒径0.076 mm，接种量10%，装液量40 mL和转速180 r/min，有效硅含量达42.18mg/L。

实施例3 肠杆菌Y1-10溶磷、解钾、固氮能力测定

制备菌株Y1-10种子液，分别点接于NBRIP溶磷培养基和解钾培养基上，于30 ℃恒温培养箱中培养3 d后，观察其生长情况及是否有溶解圈。

计算方法为：溶解能力＝溶解圈直径D/菌落直径d。

NBRIP溶磷培养基：葡萄糖 10 g、Ca₃(PO₄)₂ 5 g、(NH₄)₂SO₄0.5 g、MgSO₄·7H₂O0.25 g、KCl 0.2 g、MgCl₂·6H₂O 5 g、琼脂15 g、0.4%溴酚蓝 6 mL、超纯水1 L，pH 7.0~7.2。

解钾培养基：蔗糖 10 g、Na₂HPO₄ 1 g、(NH₄)₂SO₄ 0.5 g、MgSO₄·7H₂O 1 g、酵母粉0.2 g、NaCl 0.1 g、CaCO₃ 0.1 g、FeCl₃ 0.005 g、钾长石 5 g、水 1000 mL。

测定结果表明：在NBRIP溶磷培养基和解钾培养基中，Y1-10菌落周边均出现明显的透明圈，说明其具有一定的溶磷、解钾能力。

制备菌株Y1-10种子液，将菌液浓度调整为1×10⁹CFU/mL，以体积比2%接种于固氮活性检测培养基中，30℃培养2 d，观察其生长情况。转接3次后，菌株仍能够生长，说明菌株Y1-10具有自生固氮功能。

固氮活性检测培养基（Ashby无氮培养基）：甘露醇 10 g、KH₂PO₄0.2 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO₄·2H₂O 0.2 g、CaCO₃5 g、pH 7.2。

检测结果表明：菌株Y1-10在固氮培养基连续转接3次还可以生长，说明该菌株具有固氮能力。

实施例4 肠杆菌Y1-10的促生性能

嗜铁素产生能力：制备菌株Y1-10种子液，点接于CAS检测培养基上，30 ℃培养3d，若出现黄绿色晕圈，则说明产嗜铁素。

分泌IAA性能：制备菌株Y1-10种子液，将菌液浓度调整为1×10⁹CFU/mL，以体积比2%接种于LB液体培养基中（含100 mg/L的L-色氨酸），置于30℃、180 r/min的摇床上振荡培养1-2 d，取经过8000 r/min离心后的上清液50μL，加入50μL Salkowski比色液，滴在白瓷板上避光显色30min后，若出现粉红色则为阳性，表示该菌株能够分泌IAA，颜色越深表示分泌的强度越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。

实验结果表明，菌株Y1-10该菌株具有产IAA、嗜铁素的能力，具有较强的促进植物生长的能力。各种促进植物生长物质能力比较见表1。

表1 产各种促进植物生长物质能力比较

实施例5 肠杆菌Y1-10的抗逆性实验

制备菌株Y1-10种子液，将菌液浓度调整为1×10⁹ CFU/mL，以体积比2%分别接种于不同初始pH（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）、NaCl含量（0、0.5%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、15%）的LB液体培养液中，于32℃、180r/min振荡培养36 h，测定菌液OD₆₀₀。同时将菌株接入LB液体培养液后于不同温度条件下（4 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）培养36 h后测定OD₆₀₀。

测定结果表明，该菌株Y1-10可在pH 4~10条件下正常生长，最适合pH 7.0（如图2所示）。在培养基NaCl含量8％时仍可生长，最适NaCl浓度为4%（如图3所示），说明其具有很强的耐盐能力。菌株Y1-10在20~40℃均能很好生长（如图4所示），说明菌株Y1-10对逆境条件耐受能力强，具有高耐盐碱性、广适温特性。

实施例6 肠杆菌Y1-10对土壤及植物生长的影响

制备菌株Y1-10种子液，将菌液浓度调整为1×10⁹ CFU/mL，按照100 mL/kg拌入基质，基质是由部分园林土、铁尾矿砂和蛭石复合而成。对照则在基质中拌入相同体积的培养基，进行黑麦草盆栽试验。

25℃温室中，在种子萌发后保留每盆中生长最为良好的三株幼苗，3个月后对土壤和植株（黑麦草）的地上指标及根系生长状况进行测定。每组实验做3组平行处理。

结果显示，黑麦草在植株长势及根系方面都要显著优于对照处理，特别是在株高、根长、叶面积等方面差异显著，分析结果见表2所示。同时可以显著提高土壤中有效硅、速效钾和有效磷的含量（表3）。

表2 肠杆菌Y1-10对黑麦草植株生长的影响

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表3肠杆菌Y1-10对土壤肥力的影响

根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一种肠杆菌Y1-10及其应用

<130> 2022

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1445

<212> DNA

<213> Enterobacter cancerogenus

<400> 1

cagattgaac gctggcggca ggcctaacac atgcaagtcg aacggtaaca ggaagcagct 60

tgctgctttg ctgacgagtg gcggacgggt gagtaatgtc tgggaaactg cctgatggag 120

ggggataact actggaaacg gtagctaata ccgcataacg tcgcaagacc aaagaggggg 180

accttcgggc ctcttgccat cggatgtgcc cagatgggat tagctagtag gtggggtaac 240

ggctcaccta ggcgacgatc cctagctggt ctgagaggat gaccagccac actggaactg 300

agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag 360

cctgatgcag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc actttcagcg 420

gggaggaagg cggtaaggtt aataaccttg ccgattgacg ttacccgcag aagaagcacc 480

ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac 540

tgggcgtaaa gcgcacgcag gcggtctgtc aagtcggatg tgaaatcccc gggctcaacc 600

tgggaactgc attcgaaact ggcaggctag agtcttgtag aggggggtag aattccaggt 660

gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac 720

aaagactgac gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgtcg acttggaggt tgtgcccttg aggcgtggct tccggagcta 840

acgcgttaag tcgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac 960

ctactcttga catccagaga acttagcaga gatggtttgg tgccttcggg aactctgaga 1020

caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttatcctttg ttgccagcgg ttcggccggg aactcaaagg agactgccag 1140

tgataaactg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct 1200

acacacgtgc tacaatggcg catacaaaga gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc 1260

ataaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc 1320

tagtaatcgt agatcagaat gctacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gagggcgcta 1440

ccact 1445

Claims

1.一种生癌肠杆菌（Enterobactercancerogenus）Y1-10，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 24892。

2.一种如权利要求1所述的生癌肠杆菌Y1-10在植物促生中的应用。

3.一种包含权利要求1所述的生癌肠杆菌Y1-10的生物硅肥。

4.一种如权利要求1所述的生癌肠杆菌Y1-10在土壤修复中的应用。

5.一种包含权利要求1所述的生癌肠杆菌Y1-10的土壤改良剂。

6.一种如权利要求1所述的生癌肠杆菌Y1-10在制备产嗜铁素和/或IAA中的应用。