CN109943498B - 一种金黄杆菌属菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金黄杆菌属菌株及其应用，所述菌株为金黄杆菌属；所述菌株命名为金黄杆菌属(Chryseobacterium sp)GZU‑Ch01，于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2017810。本发明金黄杆菌属(Chryseobacterium sp)GZU‑Ch01可以有效地分解煤矸石中的不溶性的钾、磷、硅、钙、硫等成分，变成速效钾、有效磷、有效硅、交换性钙、有效硫等作为植物吸收的营养物质成分。特别是GZU‑Ch01能有效地解离煤矸石中的不溶性钾，使其成为速效钾，提供了宝贵的钾资源来源，同时GZU‑Ch01对其它含钾矿物也有良好的解离作用，可在煤矸石中参杂其它含钾矿物如钾长石，可进一步提升以煤矸石为基础原料的矿物微生物复合肥中的钾含量。

Description

一种金黄杆菌属菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种金黄杆菌属菌株及其应用，特别是一种用于解离煤矸石释放钾、磷、硅、钙和/或硫的金黄杆菌属菌株。

背景技术

我国是以煤炭为主要能源的国家，煤炭资源丰富、分布广泛、品种齐全，煤炭对我国经济发展起到举足轻重的作用。煤矸石是在煤炭开采及洗选过程中产生的一种炭含量低，比煤坚硬的固体废弃物，约占原煤炭产量的15％-20％。历年来国内各产煤区估计有数十亿吨煤矸石废弃，多以露天形式堆积，形成无数个煤矸石山，至今未得到有效利用。

露天堆放的煤矸石，经雨水冲淋后，其中有害物质会被逐渐溶解，并随雨水流进土壤、地表水体或地下水体，造成严重的污染。污染的地下水被人们饮用后，人体的健康会受到其中有害物质的严重威胁，甚至危及生命。被污染的地表水水体中的水质会逐渐酸化，当用来养殖或浇灌植物时，会对畜牧业和植被造成不可逆的损害。同时当淋溶水随雨水流进土壤时，会破坏土壤的养分，影响土壤中微生物的代谢活动，阻碍了植物根系的发育和生长。

煤矸石中含有丰富的营养元素，有很多成份是植物生长所必需的。通过微生物细菌解离煤矸石的方法，是一种工艺简单可靠的、低成本的、绿色利用煤矸石的新方法。通过微生物细菌解离煤矸石，释放其中植物可利用的营养成分，创制以煤矸石为基本原料的微生物复合肥料，是煤矸石综合利用的新途径。

由于多种原因，煤矸石未得到有效利用，造成资源的闲置和对环境的巨大污染，开发煤矸石的新用途，保护环境生态，具有重要的现实意义。

由此可见，本领域有待进一步地发掘出更多的新菌株应用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种金黄杆菌属菌株及其应用。本发明从煤矸石中分离纯化出金黄杆菌属菌株(Chryseobacterium sp)GZU-Ch01，该菌株是一株新的、且可以有效地分解煤矸石中的不溶性的钾、磷、硅、钙、硫等成分，变成速效钾、有效磷、有效硅、交换性钙、有效硫等作为植物吸收的营养物质成分的菌株。特别是GZU-Ch01能有效地解离煤矸石中的不溶性钾，使其成为速效钾，提供了宝贵的钾资源来源，同时GZU-Ch01对其它含钾矿物也有良好的解离作用，可在煤矸石中参杂其它含钾矿物如钾长石，可进一步提升以煤矸石为基本原料的矿物微生物复合肥中的钾含量。且本发明GZU-Ch01菌株解钾效果优于传统巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和硅酸盐细菌(Silicate bacteria)。

本发明的技术方案：一种金黄杆菌属菌株，所述菌株为金黄杆菌属；所述菌株命名为GZU-Ch01Chryseobacterium sp.GZU-Ch01，于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2017810，保藏地址为中国、武汉、武汉大学。

用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品，所述制品的活性成分包括前述的金黄杆菌属GZU-Ch01。

用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品，所述制品的活性成分是前述的金黄杆菌属GZU-Ch01。

一种解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品的制备方法，采用前述的金黄杆菌属GZU-Ch01作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的方法，在解离的过程中添加和/或使用前述的制品。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂，所述菌剂的活性成分包括前述的金黄杆菌属GZU-Ch01。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂菌剂，所述菌剂的活性成分是前述的金黄杆菌属GZU-Ch01。

前述的用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂菌剂，还包括用于制备菌剂的常规成分。

一种前述的金黄杆菌属菌株的应用，用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和硫。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、从完全风化的煤矸石中分离、筛选、提纯，获得高效分解煤矸石中钾的菌株。此方法获得的菌株针对性强，解离效果好，能有效地解离煤矸石中的多种成分，特别是对煤矸石中难溶钾的解离，具有良好的效果。利用GZU-Ch01菌株使得煤矸石创制微生物复合肥料成为可能。

2、煤矸石资源化的开发利用，能缓解煤矸石带来的环境危害，创制的微生物复合肥料可以缓解土壤中缺钾的问题，而且还可以避免长期使用化肥带来的环境问题如土壤板结等，与目前应用化学方法处理煤矸石相比，对环境更友好。

综上所述，本发明从废弃的煤矸石中分离，筛选，提纯，获得高效分解煤矸石中钾和磷的菌株。此方法不仅可以有效处理废弃的煤矸石，缓解煤矸石带来的环境危害，而且还可以让煤矸石变废为宝，成为能再利用的有效资源。如果将煤矸石创制的微生物矿物复合肥料施于土壤，不仅可以缓解土壤中缺钾问题，还可以避免大量化肥使用带来的如土壤板结、磷素固化等环境问题，更好地促进磷钾资源的利用。

附图说明

图1是本发明GZU-Ch01菌株生长曲线；

图2是本发明GZU-Ch01菌株菌落外观图；

图3是本发明GZU-Ch01菌体形态图；

图4是GZU-Ch01菌株基于部分16S rRNA基因序列建立的系统进化树。

具体实施方式

实施例：

金黄杆菌属GZU-Ch01的分离，包括以下步骤：

1.功能菌株GZU-Ch01菌株的分离与筛选

1)样品的采集

(1)样品采自于某煤炭产区煤矸石山，选择完全风化的煤矸石，将采集的样品装入采集袋；

(2)将采集的样品破碎、筛分，收集过100目的样品；

(3)将样品保存于4℃冰箱中备用；

(4)煤矸石样品的成分为：C 8.24％，SiO₂ 40.56％，Al₂O₃ 19.46％，Fe₂O₃15.12％,TiO₂ 4.61％，CaO 3.32％，MgO 2.5％，K₂O 1.66％，Na₂O 0.6％，P₂O₅ 1.42％，S1.07％，H 0.88％，N 0.54％，灰分82.81％。

2)功能菌株的筛选

(1)准确称取1g样品于灭菌的250mL的锥形瓶中，加入99mL无菌水；

(2)然后在170r/min，30℃的恒温摇床中振荡30min；

(3)对照组是加入100mL无菌水于250mL锥形瓶中；

(4)振荡30min以后，取上清液逐级稀释至10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7；

(5)每种浓度分别取100uL涂布于3个解钾细菌筛选固体培养基上，空白为涂布无菌水的平板；

(6)将平板放于30℃的恒温培养箱中培养3～4天；

(7)将外观特征不同的单菌落划线接种于解钾细菌筛选固体培养上；

(8)待菌株长出后，通过初步外观形态观察以及显微形态观察，观察菌株纯化情况，没有达到纯化要求，则多次重复进行，直到获得单一菌株，同时区别出不同的菌株；

(9)将纯化的菌株，进行革兰氏染色；

(10)对初筛的已纯化的菌株进行培养，解离煤矸石，通过测定其中的速效钾含量，确认菌株的解钾效果，筛选出解钾效果好的菌株。

2.功能菌株的生长曲线的绘制

1)种子液的制备。取该菌株用接种环接种于LB液体培养基中，在30℃条件下，培养至对数期。

2)接种。取上述种子液的10mL接种于装有200mL的液体LB培养基中，混匀后分别取5mL混合液分别装于上有标记的18支无菌试管中。

3)培养。将已接种的试管置30℃，170r/min的摇床中培养，分别培养相应的时间取出。

4)测量。用未接种的LB液体培养基做空白，在600nm波长下与待测样一起进行光电比浊。

测定结果如图1，从图中可知，0-10h为延滞期，10-15h为对数期，15h-25h为稳定期，25h以后为衰亡期。

3.功能菌株的鉴定

1)菌落外观形态

如图2，从图中可知该菌株在LB固体培养基上的菌落外观形态：深黄色，不透明圆形，菌落隆起，边缘整齐，有光泽，表面光滑湿润，质地粘稠，其大小约为1mm。

2)革兰氏染色，菌体形态

如图3，从图中可知该菌株为革兰氏阴性杆菌，单个菌体分散存在，无芽孢和荚膜。

3)菌株鉴定

(1)细菌DNA的提取

挑取纯化的菌株的单菌落至装有LB液体培养基的锥形瓶中进行培养，得到纯菌种发酵液后，以细菌基因组提取试剂盒(离心柱型，天根生化科技北京有限公司)提取DNA，以其作为模版进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)，使用Taq DNA聚合物扩增16S r RNA，用2F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA-3′)，1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC-3′)的通用引物进行扩增，PCR扩增反应体系和扩增反应条件如表1所示。

以1×TBE缓冲液配制1.0％琼脂糖凝胶，加入40μL PCR扩增产物，加8μL2000bpDNA Marker，在电压110V，电流70mA，电泳45min，观察凝胶成像结果。

(2)同源性比对

将聚合酶链式反应扩增产物经凝胶回收试剂盒纯化，送交测序公司(上海立菲生物技术有限公司)测序，将测得的序列在NCBI(美国国立生物技术信息中心)上利用Standard Nucleotide Blast进行比对，并利用ClustalW、MEGA5.05等软件基于邻接法(Neighbor Joining Method)进行系统发育分析，构建系统发育树(图4)，以获得菌种的分类信息。从图中可知，GZU-Ch01细菌与金黄杆菌属Chryseobacterium sp.India-R31(KF751764.1)，聚在同一个分支上，结合生理生化特性和形态观察，序列同源性达99％，GZU-Ch01鉴定为金黄杆菌属。

(3)生理生化实验

通过一系列生化实验，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，1999)，经鉴定该菌株为金黄杆菌属。

4.菌株对煤矸石的解离能力的测定

1)所用煤矸石主要成份为：C 11.05％，SiO₂ 35.44％，Al₂O₃ 17.26％，Fe₂O₃18.11％,TiO₂ 3.22％，CaO 4.48％，MgO 2.52％，K₂O 2.04％，Na₂O 1.73％，P₂O₅ 1.62％，S1.05％，H 0.79％，N 0.66％，灰分79.63％

2)影响煤矸石解离的四个主要因素为：解菌量，体系的培养时间，粒径大小，体系pH值。先进行GZU-Ch01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌单因素实验，分别寻找各菌的最佳单因素条件，再通过设计正交实验寻找GZU-Ch01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌最佳解离煤矸石条件。

3)针对成分为1)煤矸石，用GZU-Ch01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌进行解离比较实验。

4)解离实验过程如下：取已破碎过指定目数的煤矸石，于控温搅拌器中，GZU-Ch01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌菌液浓度控制在：5.5×10¹⁶-6.0×10¹⁶cfu/mL，三株细菌与煤矸石的用量比例为1:1,在连续搅拌下，喷撒菌液，搅拌均匀，每间隔2-3小时翻动一次，温度控制在不高于30℃，解离煤矸石数天。

5)测定解离后煤矸石各指标含量，结果如表2。从表2中可以看出，GZU-Ch01解离煤矸石的总体效果优于巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌，主要指标速效钾、有效磷、碱解氮均优于巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌，特别是解钾效果较巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌有大的提升。

表1.PCR扩增反应体系和扩增反应条件

表2正交设计实验结果

。

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一种金黄杆菌属菌株及其应用

<130> 2017

<141> 2019-01-31

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1394

<212> DNA

<213> 金黄杆菌属(Chryseobacterium sp)

<400> 1

cacatgcaag ccgagcggta tttgtctttc gggacagaga gagcggcgta cgggtgcgta 60

acacgtgtgc aacctacctt tatctggggg atagcctttc gaaaggaaga ttaatacccc 120

ataatataat gattggcatc aattattatt gaaaactccg gtggatagag atgggcacgc 180

gcaagattag atagttggtg aggtaacggc tcaccaagtc aatgatcttt aggggtcctg 240

agagggagat cccccacact ggtactgaga cacggaccag actcctacgg gaggcagcag 300

tgaggaatat tggacaatgg gtgaaagcct gatccagcca tcccgcgtga aggatgacgg 360

tcctatggat tgtaaacttc ttttgtacag ggataaacct actctcgtga gggtagctga 420

aggtactgta cgaataagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 480

tgcaagcgtt atccggattt attgggttta aagggtccgt aggcggacct gtaagtcagt 540

ggtgaaatct catagcttaa ctatgaaact gccattgata ctgcaggtct tgagtaaatt 600

tgaagtggct ggaataagta gtgtagcggt gaaatgcata gatattactt agaacaccaa 660

ttgcgaaggc aggtcactaa gatttaactg acgctgatgg acgaaagcgt gggtagcgaa 720

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgc taactcgttt ttggattttc 780

ggattcagag accaagcgaa agtgataagt tagccacctg gggagtacgt tcgcaagaat 840

gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg attatgtggt ttaattcgat 900

gatacgcgag gaaccttacc aagacttaaa tgggaattga cagatttaga aatagatcct 960

ccttcgggca attttcaagg tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgttag 1020

gttaagtcct gcaacgagcg caacccctgt cactagttgc taacatttag ttgaggactc 1080

tagtgagact gcctacgcaa gtagagagga aggtggggat gacgtcaaat catcacggcc 1140

cttacgtctt gggccacaca cgtaatacaa tggccggtac agagggcagc tacacagcga 1200

tgtgatgcaa atctcgaaag ccggtctcag ttcggattgg agtctgcaac tcgactctat 1260

gaagctggaa tcgctagtaa tcgcgcatca gccatggcgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1320

ttgtacacac cgcccgtcaa gccatggaag tttggggtac ctgaagtcgg tgaccgtaaa 1380

aggagctgcc tagg 1394

Claims (9)

1.一种金黄杆菌属菌株，其特征在于：所述菌株的分类名称为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)GZU-Ch01，于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2017810。

2.一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的金黄杆菌GZU-Ch01。

3.一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的金黄杆菌GZU-Ch01。

4.一种解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品的制备方法，其特征在于：采用权利要求1所述的金黄杆菌GZU-Ch01作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。

5.一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的方法，其特征在于：在解离的过程中添加和/或使用权利要求2或3中任一项所述的制品。

6.一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的金黄杆菌GZU-Ch01。

7.一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分是权利要求1所述的金黄杆菌GZU-Ch01。

8.根据权利要求6或7所述的菌剂，其特征在于：还包括用于制备菌剂的常规成分。

9.一种如权利要求1中所述的金黄杆菌属菌株的应用，其特征在于：用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和硫。

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