CN110343630B

CN110343630B - 一种藤黄微球菌及其应用

Info

Publication number: CN110343630B
Application number: CN201910098274.1A
Authority: CN
Inventors: 谢承卫; 高弦; 钟艳; 王应兰; 张景宁
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN110343630A

Abstract

本发明公开了一种藤黄微球菌及其应用，该菌株分类命名为藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)GZU‑Mi02，于2017年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2017514。本发明藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)GZU‑Mi02广泛适用于多种类型的煤矸石，可以有效地解离高硫、低硫不同类型煤矸石中的不溶性的钾、磷、硅、钙、硫等成分，将其变成速效钾、有效磷、有效硅、交换性钙、有效硫等植物能吸收的营养成分。工艺简单可靠，成本低，对环境友好，是一种绿色利用煤矸石的新方案。

Description

一种藤黄微球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种藤黄微球菌及其应用，特别是一种高效解离煤矸石释放其中钾、磷和其它有用成分的藤黄微球菌。

背景技术

我国煤炭资源丰富、分布广泛、品种齐全，煤炭在我国能源组成中占据主要地位，对我国经济的发展起到举足轻重的作用。煤炭根据硫含量的高低，可分为高硫煤和低硫煤，硫含量在煤炭中含量的变化幅度很大，最高为8％，最低为0.12％。煤矸石是在煤炭开采及洗选过程中产生的一种炭含量低，比煤坚硬的固体废弃物，约占原煤炭产量的15％-20％。历年来国内各产煤区估计有数十亿吨煤矸石废弃，多以露天形式堆积，形成无数个煤矸石山，至今未得到有效利用。露天堆放的煤矸石，经雨水冲淋后，其中有害物质会被逐渐溶解，并随雨水流进土壤、地表水体或地下水体，造成严重的污染。

煤矸石中含有丰富的植物生长所需营养成份，如含有有机质，钾、磷、硅、氮等。但煤矸石中钾、磷等多以难溶的矿物形式存在，不能被植物直接吸收利用。由于多种原因，煤矸石未得到有效利用，造成资源的闲置和对环境的巨大污染，开发煤矸石的新用途，保护环境生态，具有重要的现实意义。

由此可见，本领域有待进一步地发掘出更多的新菌株应用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种藤黄微球菌及其制备和应用。本发明从煤矸石中分离纯化出藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)GZU-Mi02，该菌株是一株新的、且可用于多种类型的煤矸石，高效解离煤矸石释放其中钾、磷和其它植物能吸收的营养成分。工艺简单可靠，成本低，对环境友好。

本发明的技术方案：一种藤黄微球菌，所述菌株命名为藤黄微球菌GZU-Mi02Micrococcus Luteus GZU-Mi02，于2017年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2017514，保藏地址为中国、武汉、武汉大学。

用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品，所述制品的活性成分包括权利要求 1所述的藤黄微球菌GZU-Mi02。

用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品，所述制品的活性成分是前述的藤黄微球菌GZU-Mi02。

一种解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品的制备方法，采用前述的藤黄微球菌 GZU-Mi02作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的方法，在解离的过程中添加和/或使用前述的制品。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂，所述菌剂的活性成分包括前述的藤黄微球菌GZU-Mi02。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂菌剂，所述菌剂的活性成分是前述的藤黄微球菌GZU-Mi02。

前述的用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂菌剂，还包括用于制备菌剂的常规成分。

一种前述的金黄杆菌属菌株的应用，用于解离煤矸石中难溶的钾、磷、硅、钙和硫。

前述菌株GZU-Mi02菌株的分离与筛选：具体包括以下步骤：

(1)菌株的分离筛选：包括菌株的初筛和复筛。

所述菌株的初筛是：称取完全风化煤矸石样品1.0g，于无菌带塞的三角瓶中，加入99mL 无菌水，30℃摇床振荡30min；取上清液逐级稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分别取各浓度样品100μL涂布于无机磷固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养24-48h，再将无机磷固体培养基上长出的细菌接种于营养琼脂培养基上平板，待长出之后，进行平板划线分离提纯。

最后用进行革兰氏染色法来初筛菌株。

革兰氏染色法操作如下：

涂片固定：无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定；固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

革兰氏染色的过程包括初染、媒染、脱色、复染几个步骤，具体操作方法是：

(1)加上结晶紫后，染色1分钟，水洗；

(2)加上碘液后染色1分钟，水洗；

(3)加上95％酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20-60秒，水洗，吸去水分；

(4)加上蕃红后，染色1分钟，水洗；

(5)吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。

结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色；并在镜检中观察是否存在多种形态的细菌，若存在则初筛所得细菌存在杂菌，需要再次纯化后再进行革兰氏染色镜检。

初筛菌株，在无菌条件下，用LB液体培养基制成菌悬液保存于冰箱中冷冻保藏。

所述的菌株的复筛是：

菌株的复筛，先将保存的初筛菌株进行活化。

活化方法：在无菌条件下，将冷冻保藏的菌悬液置于室温下解冻，用移液枪吸取100ul 解冻后的菌悬液于营养琼脂培养基上，涂布均匀，置于30℃恒温培养箱中培养24-48h。

活化初筛菌株并进行培养后，分别进行高硫煤矸石和低硫煤矸石解离试验，通过测定其样品中的速效钾和有效磷的含量，筛选出解钾、解磷效果好的菌株；以巨大芽孢杆菌为参照物，分别处理低硫和高硫煤矸石，测定解离后样品中的有效磷含量，若样品中有效磷含量高于巨大芽孢杆菌处理的样品中的有效磷含量，则认为该菌株的解磷效果较好；以硅酸盐细菌为参照物，分别处理低硫和高硫煤矸石，测定解离后样品中的速效钾含量，若样品中速效钾含量高于硅酸盐细菌处理的样品中的速效钾含量，则认为该菌株的解钾效果较好。

(2)菌株的培养

各种培养基的组成：

难溶性无机磷液体培养基：葡萄糖10g，(NH₄)SO₄0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂10g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0-7.2。

难溶性无机磷固体培养基：在难溶性无机磷液体培养基中加琼脂15g-20g。

解钾细菌筛选液体培养基：蔗糖5.0g，Na₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃·6H₂O 0.005g，CaCO₃0.1g，钾长石粉(200目)10g，蒸馏水1L，pH＝7.0～7.5。

解钾细菌筛选固体培养基：在解钾细菌筛选液体培养基中加琼脂15g～20g。

LB液体培养基：蛋白胨5g、氯化钠5g、牛肉膏1g、酵母膏2g、pH＝7.4，蒸馏水1L。

LB固体培养基：在液体LB液体培养基中加琼脂15g-20g。

培养基的使用：

难溶性无机磷固体培养基、解钾细菌筛选固体培养基：分别取经稀释法处理的各浓度样品100μL涂布于难溶性无机磷固体培养基(或解钾细菌筛选固体培养基)上，于30℃恒温培养箱中培养24-48h。

LB固体培养基、LB液体培养基：无菌操作条件下，用接种环挑取细菌单菌落于LB固体培养基中于30℃恒温培养箱中培养24h；无菌操作条件下，用接种环挑取LB固体培养基中细菌单菌落，接种于LB液体培养基中，于30℃，180r/min振荡培养15h，制成种子液。

难溶性无机磷液体培养基、解钾细菌筛选液体培养基：取种子菌液2mL接种于难溶性无机磷液体培养基(或解钾细菌筛选液体培养基)中，于30℃，160r/min振荡培养7d。

(3)菌株的保种

包括以下三种方式：

1)将需要保存的菌株，划线于LB固体培养基平板上或斜面试管中，30℃培养18-24h，置于4℃冰箱中保存，可保存一个月。

2)将在平板上已长好的菌株(复筛得到的菌株)用灭菌的20％的甘油液体培养基冲洗，而后保存于-20℃的冰箱中，可保存一年。

3)将在平板上已生长良好的菌株，加入30％的脱脂奶，混匀后倾倒入无菌安瓿管中，用无菌脱脂棉塞住管口，放入-20℃冰箱预冻3-4h，再抽真空，熔封管口，放入-80℃的冰箱中保存，该方法可长期保存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)GZU-Mi02适用广泛适用于多种类型的煤矸石，高效解离煤矸石释放其中钾、磷和其它植物能吸收的营养成分。

2、申请人经过实验发现，本发明藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)GZU-Mi02，解磷、解钾效果均与优于巨大芽孢杆菌(B.megaterium phosphaticum)、硅酸盐细菌(Silicate bacteria)。GZU-Mi02是一株优异的同时能解磷、解钾的细菌。

3、本发明利用微生物细菌解离煤矸石释放其中的营养成分，工艺简单可靠，成本低，对环境友好，是一种绿色利用煤矸石的新方案。通过微生物细菌解离煤矸石，释放其中植物可利用的营养成分，创制以煤矸石为基础的微生物矿物复合肥料，可大量的消耗煤矸石，是煤矸石综合利用的新途径。

综上所述，本发明从废弃的煤矸石样品中分离，筛选，提纯，获得高效分解煤矸石中钾和磷的菌株。此方法不仅可以有效处理废弃的煤矸石，缓解煤矸石带来的环境危害，而且还可以让煤矸石变废为宝，成为能再利用的有效资源。将煤矸石创制的微生物矿物肥料施于土壤，不仅可以缓解土壤中缺磷、缺钾问题，还可以避免大量化肥使用带来的如土壤板结、磷素固化等环境问题，更好地促进磷钾资源的利用。

附图说明

图1是GZU-Mi02菌株生长曲线；

图2是GZU-Mi02菌株菌落外观图；

图3是GZU-Mi02菌体形态图；

图4是GZU-Mi02菌株基于部分16S rRNA基因序列建立的系统进化树。

具体实施方式

实施例：

一种藤黄微球菌，所述菌株命名为藤黄微球菌GZU-Mi02Micrococcus LuteusGZU-Mi02，于2017年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2017514，保藏地址为中国、武汉、武汉大学。

所述GZU-Mi02的分离，包括以下步骤：

1.菌株GZU-Mi02菌株的分离与筛选

1)样品的采集

(1)样品采自于某含硫煤矸石山上已风化煤矸石，然后将采集的样品装入塑料样品采集袋中；

(2)将采集的样品破碎；

(3)筛分，收集过100目的样品；

(4)将样品保存于4℃冰箱备用。

2)解钾功能菌株的筛选

(1)准确称取1.0g的煤矸石样品于灭菌的250mL的锥形瓶中，加入99mL无菌水；

(2)然后在170r/min，30℃的恒温摇床中振荡30min；

(3)对照组是加入100mL无菌水于250mL锥形瓶中；

(4)振荡30min以后，取上清液逐级稀释至10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7；

(5)每种浓度分别取100uL涂布于3个解钾细菌筛选固体培养基上，空白为涂布无菌水的平板；

(6)将平板放于30℃左右的恒温培养箱中培养3-4天；

(7)将外观特征不同的单菌落划线接种于解钾细菌筛选固体培养上；

(8)待菌株长出后，通过初步外观形态观察以及显微形态观察，观察菌株纯化情况，没有达到纯化要求，则多次重复进行，直到获得单一菌株，同时区别出不同的菌株；

(9)将纯化的菌株，进行革兰氏染色；

(10)对初筛的已纯化的菌株进行培养，解离煤矸石，通过测定其中的速效钾含量，确认菌株的解钾效果，筛选出解钾效果好的菌株。

3)解磷功能菌株的筛选

(1)准确称取1g样品于灭菌的250mL的锥形瓶中，加入99mL无菌水；

(2)然后在170r/min，30℃左右的摇床中振荡30min；

(3)对照组是加入100mL无菌水于250mL的锥形瓶中；

(4)半个小时以后，取上清液逐级稀释至10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7；

(5)每种浓度分别取100uL涂布于3个无机磷固体培养基上，空白为涂布无菌水的平板；

(6)将这些平板放于30℃的恒温培养箱中3-4天；

(7)将外观特征不同的单菌落划线接种于无机磷固体培养基上；

(8)待长出后，通过初步外观形态观察以及显微形态观察，观察菌株是否纯化，没有纯化则多进行几次，直到成为单一菌株，同时区别出不同的菌株；

(9)将纯化的菌株，进行革兰氏染色；

(10)对纯化的初筛的细菌进行培养，再将其处理高硫煤矸石和低硫煤矸石，通过测定其中的有效磷含量，含量越高则细菌的分解效果越好，从而选出解磷效果好的菌株。

2.功能菌株的生长曲线的绘制

1)种子液的制备。取该菌株一接种环接种于LB液体培养基中，在30℃条件下，培养至对数期。

2)接种。取上述种子液的10mL接种于装有200mL的液体LB培养基中，混匀后分别取5mL混合液分别装于上有标记的18支无菌试管中。

3)培养。将已接种的试管置30℃，170r/min的摇床中培养，分别培养相应的时间取出。

4)测量。用未接种的LB液体培养基做空白，在600nm波长下与待测样一起进行光电比浊。

测定结果如图1，从图中可知，0-23h为延滞期，23-40h为对数期，40h-45h为稳定期， 45h以后为衰亡期。

3.功能菌株的鉴定。

1)菌落外观形态

如图2，从图中可知该菌株在LB固体培养基上呈现黄色，不透明圆形，稍隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，有光泽，菌落大小约为2mm。

2)革兰氏染色，菌体形态

如图3，从图中可知该菌株为革兰氏阳性球菌，单个或成对排列。

3)菌株鉴定

(1)细菌DNA的提取

挑取纯化的菌株的单菌落至装有LB液体培养基的锥形瓶中进行培养，得到纯菌种发酵液后，以细菌基因组提取试剂盒(离心柱型，天根生化科技北京有限公司)提取DNA，以其作为模版进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)，使用Taq DNA聚合物扩增16S r RNA，用2F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA-3′)，1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC-3′)的通用引物进行扩增，PCR扩增反应体系和扩增反应条件如表1所示。

以1×TBE缓冲液配制1.0％琼脂糖凝胶，加入40μL PCR扩增产物，加8μL 2000bpDNA Marker，在电压110V，电流70mA，电泳45min，观察凝胶成像结果。

(2)同源性比对

将聚合酶链式反应扩增产物经凝胶回收试剂盒纯化，送交测序公司(上海立菲生物技术有限公司)测序，将测得的序列在NCBI(美国国立生物技术信息中心)上利用Standard Nucleotide Blast进行比对，并利用ClustalW、MEGA5.05等软件基于邻接法(Neighbor Joining Method)进行系统发育分析，构建系统发育树(图4)，以获得菌种的分类信息。从图中可知，GZU-Mi02细菌与藤黄微球菌Micrococcus Luteus strain.

India-BPB1(KF410697.1)，聚在同一个分支上，结合生理生化特性和形态观察，序列同源性达99％，GZU-Mi02鉴定为藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)。

(3)生理生化实验

通过一系列生化实验，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，1999)，经鉴定该菌株为藤黄微球菌。

4.菌株对煤矸石解磷、解钾能力的测定

1)所用煤矸石主要成份为：C 9.01％，SiO₂37.22％，Al₂O₃21.13％，Fe₂O₃16.01％,TiO₂2.34％，

CaO 5.63％，MgO 1.58％，K₂O 1.86％，Na₂O 1.53％，P₂O₅1.42％，S 0.84％，H0.69％，N 0.55％，灰分81.02％。

2)影响煤矸石解离的四个主要因素为：解菌量，体系的培养时间，粒径大小，体系pH 值。先作藤黄微球菌GZU-Mi02、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌单因素实验，分别寻找各菌的最佳条件，再通过设计正交实验寻找藤黄微球菌GZU-Mi02、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌最佳解离煤矸石条件。

3)针对成分为1)煤矸石，用藤黄微球菌GZU-Mi02、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌解磷、解钾的比较实验。

4)取已破碎过指定目数的煤矸石，于控温搅拌器中，藤黄微球菌GZU-Mi02、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌菌液浓度控制在：5.5×10¹⁶-6.0×10¹⁶cfu/mL，三株细菌与煤矸石的用量比例为1:1,在连续搅拌下，喷撒菌液，搅拌均匀，每间隔2-3小时翻动一次，温度控制在不高于35℃，解离煤矸石数天。

5)分析藤黄微球菌GZU-Mi02、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌解离煤矸石后，煤矸石中的有效磷和速效钾含量，并与原始煤矸石对比。相关结果如表2.

6)从表2数据可看出，藤黄微球菌GZU-Mi02解磷、解钾效果均与优于巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌。

表1 PCR扩增反应体系和扩增反应条件

表2三株菌对煤矸石解磷、解钾正交设计实验结果

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一种藤黄微球菌及其应用

<130> 2017

<141> 2019-01-31

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1399

<212> DNA

<213> 藤黄微球菌(Micrococcus Luteus )

<400> 1

catgcaagtc gaacgatgaa gcccagcttg ctgggtggat tagtggcgaa cgggtgagta 60

acacgtgagt aacctgccct taactctggg ataagcctgg gaaactgggt ctaataccgg 120

ataggagcgc ctaccgcatg gtgggtgttg gaaagattta tcggttttgg atggactcgc 180

ggcctatcag cttgttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg 240

agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300

tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg 360

ccttcgggtt gtaaacctct ttcagtaggg aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaag 420

aagcaccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggtgcga gcgttatccg 480

gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg tctgtcgtga aagtccgggg 540

cttaaccccg gatctgcggt gggtacgggc agactagagt gcagtagggg agactggaat 600

tcctggtgta gcggtggaat gcgcagatat caggaggaac accgatggcg aaggcaggtc 660

tctgggctgt aactgacgct gaggagcgaa agcatgggga gcgaacagga ttagataccc 720

tggtagtcca tgccgtaaac gttgggcact aggtgtgggg accattccac ggtttccgcg 780

ccgcagctaa cgcattaagt gccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 840

ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgcgga ttaattcgat gcaacgcgaa 900

gaaccttacc aaggcttgac atgttcccga tcgccgtaga gatacggttt cccctttggg 960

gcgggttcac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020

cccgcaacga gcgcaaccct cgttccatgt tgccagcacg taatggtggg gactcatggg 1080

agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg aggacgacgt caaatcatca tgccccttat 1140

gtcttgggct tcacgcatgc tacaatggcc ggtacaatgg gttgcgatac tgtgaggtgg 1200

agctaatccc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag 1260

tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcaa cgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1320

acacaccgcc cgtcaagtca cgaaagttgg taacacccga agccggtggc ctaacccttg 1380

tggggggagc cgtcgaagg 1399

Claims

1.一种藤黄微球菌(Micrococcus Luteus )，其特征在于：所述菌株命名为藤黄微球菌GZU-Mi02，于2017年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO：M2017514。

2.用于解离煤矸石中的钾、磷的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的藤黄微球菌GZU-Mi02。

3.如权利要求2用于解离煤矸石中的钾、磷的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的藤黄微球菌GZU-Mi02。

4.一种解离煤矸石中的钾、磷的制品的制备方法，其特征在于：

采用权利要求1所述的藤黄微球菌GZU-Mi02作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。

5.一种用于解离煤矸石中的钾、磷的方法，其特征在于，在解离的过程中添加和/或使用权利要求2或3中任一项所述的制品。

6.一种用于解离煤矸石中的钾、磷的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的藤黄微球菌GZU-Mi02。

7.一种用于解离煤矸石中的钾、磷的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分是权利要求1所述的藤黄微球菌GZU-Mi02。

8.如权利要求6或7所述的菌剂，其特征在于，还包括用于制备菌剂的常规成分。

9.一种如权利要求1中所述的藤黄微球菌的应用，其特征在于：用于解离煤矸石中难溶的钾、磷。