CN108841742B - 一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株zh-1及其制备方法和应用 - Google Patents
一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株zh-1及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明具体涉及一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH‑1及其制备方法和应用,分类命名为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)ZH‑1,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M 2017659,用于降低氧化铝赤泥的pH值。本发明的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH‑1,在强碱性条件下具有很好的耐受能力,对赤泥碱性环境有很好的适应性;活性稳定,适应性强,培养成本低廉;可明显降低赤泥pH值,并且有利于赤泥团聚体颗粒的形成,有利于加速赤泥土壤化进程。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1及其制备方法和应用。
背景技术
赤泥是氧化铝生产过程中产生的最大工业固体废弃物,每生产1吨氧化铝将会产生1.0~1.8吨赤泥。赤泥处理是一个世界性难题。目前,我国90%以上氧化铝生产采用拜耳法工艺。我国拜耳法赤泥年排放量已超过7000万吨,其综合利用率不到5%。国内外大都采用筑坝湿法堆存法使其自然沉降,之后再回收滤液,但该法易出现滤液泄露污染环境事故,而且堆场中干燥的赤泥也会对环境产生危害,赤泥扬尘会使大气能见度降低,降尘使其周边土壤出现盐碱化。
赤泥碱性强、盐分含量高,污染物迁移风险大,自然碳化中和过程慢,堆场生态重建难,赤泥环境安全问题正严重威胁氧化铝工业可持续发展。氧化铝工业过程的赤泥减排和综合利用已成为世界性难题,迄今国际上尚无切实可行的赤泥规模化处置方法。
国内外有很多关于赤泥堆场土壤修复的研究,如加改良剂改良、土壤淋洗和客土改良覆盖等,这些方法虽可以修复赤泥堆场污染,但其操作性都不强,且容易造成二次污染。
现有对赤泥进行脱碱处理的专利,例如《微生物处理赤泥游离碱的工艺方法》(CN103693830 A),此方法是利用驯化的乳酸菌或铁硫杆菌酸性溶液,在一定条件下处理赤泥矿浆,压滤后得到含微生物溶液和经微生物处理的赤泥,以达到赤泥游离碱脱除的目的。但是,该方法需要一定的时间、压力、温度搅拌等条件。《一种赤泥柠檬酸脱碱工艺》(CN105170307A),该发明是将赤泥进行柠檬酸三级错流脱碱作业,在柠檬酸用量较低和低温条件下,脱除赤泥中的钠和钾,但是此种方法为化学法脱碱,工艺复杂,成本较高。
发明内容
针对上述已有技术存在的不足,本发明提供一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1及其制备方法和应用。本发明提供的一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1具有耐盐碱性强的特点,在赤泥环境中具有很强的适生性,活性稳定,适应性强,培养成本低廉,并可显著降低赤泥pH值,有利于赤泥团聚体颗粒的形成。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1,其特征在于,分类命名为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)ZH-1,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2017659,保藏日期为:2017年11月06日,保藏地址为:中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。
一种如上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的制备方法,其特征在于,所述方法步骤包括:
(1)取赤泥5g置于100mL液体培养基中,于温度为30℃、转速为175rpm·min-1的恒温振荡培养箱中避光振荡培养48h;所述液体培养基包括:酵母膏3.0g·L-1、葡萄糖5.0g·L-1、NaCl 50.0g·L-1以及水;
(2)制备100mL的与步骤(1)相同配置的液体培养基,取2mL经步骤(1)得到的混合液的上清液至液体培养基中,继续在温度为30℃、转速为175rpm·min-1的恒温振荡培养箱中培养48h;
(3)采用稀释涂布平板法将经步骤(2)得到的混合菌液分离筛选得到多个纯培养,将多个纯培养分别接种到与步骤(1)相同配置的液体培养基中,于温度为30℃、转速为175rpm·min-1的恒温振荡培养箱中继续培养48h;
(4)检测经步骤(3)得到的培养液的pH,将能够使培养液pH降低至6.0以下的菌株命名为ZH-1。
一种如上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1用于降低赤泥的pH。
根据上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述步骤包括:
(1)将耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1接种到液体培养基中培养,得到耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液;
(2)配置产酸培养基,加入NaOH溶液调节产酸培养基pH,吸取经步骤(1)得到的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液,接种于产酸培养基中培养;
(3)将经步骤(2)得到的菌液加入到与步骤(2)相同配置的产酸培养基中得到稀释菌液,将稀释菌液与赤泥混合,然后将混合物置于生化培养箱中培养。
根据上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述液体培养基按照如下方法配置:将酵母膏、葡萄糖、NaCl和水混合,得到液体培养基。
根据上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述酵母膏在所述液体培养基中的浓度为3.0g·L-1,所述葡萄糖在所述液体培养基中的浓度为5.0g·L-1,所述NaCl在所述液体培养基中的浓度为50.0g·L-1。
根据上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述产酸培养基按照如下方法配置:将葡萄糖、酵母膏、可溶性淀粉、磷酸二氢钾、氯化镁和水混合,得到产酸培养基。
根据上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述葡萄糖在所述产酸培养基中的浓度为2-8g·L-1,所述酵母膏在所述产酸培养基中的浓度为2-4g·L-1,所述可溶性淀粉在所述产酸培养基中的浓度为1-2g·L-1,所述磷酸二氢钾在所述产酸培养基中的浓度为0.3-0.7g·L-1,所述氯化镁在所述产酸培养基中的浓度为0.3-0.7g·L-1。
根据上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,具体步骤包括:
(1)将耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1接种到液体培养基中,然后置于恒温振荡培养箱中培养48h-72h,得到耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液;所述液体培养基包括:酵母膏3.0g·L-1,葡萄糖5.0g·L-1,NaCl 50.0g·L-1和水;所述恒温振荡培养箱中的培养条件为温度30℃,转速为175rpm·min-1;
(2)配置产酸培养基,加入NaOH溶液调节产酸培养基pH至11.5~12.5,吸取经步骤(1)得到的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液,接种于产酸培养基中,耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液的加入量按质量比计为产酸培养基加入量的1%~3%,然后置于恒温振荡培养箱中培养48h~120h;所述产酸培养基包括:葡萄糖2-8g·L-1,酵母膏2-4g·L-1,可溶性淀粉1-2g·L-1,磷酸二氢钾0.3-0.7g·L-1,氯化镁0.3-0.7g·L-1和水;
(3)将经步骤(2)得到的菌液加入到与步骤(2)相同配置的产酸培养基中得到稀释菌液,经步骤(2)得到的菌液加入量按质量比计为产酸培养基加入量的10%~20%,将稀释菌液与赤泥按质量比5:1-1:1混合,然后将混合物置于生化培养箱中培养4~28天,温度为30℃~38℃。
根据上述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述步骤(2)NaOH溶液浓度为5%~30%。
本发明的有益技术效果,本发明提供了一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1及其制备方法和应用,具有以下优点:
1)本发明的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1,在强碱性条件下具有很好的耐受能力,对赤泥碱性环境有很好的适应性;
2)本发明的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1生长速率较快,活性稳定,适应性强,培养成本低廉;
3)本发明的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1可明显降低赤泥pH值,并且有利于赤泥团聚体颗粒的形成,有利于加速赤泥土壤化进程,赤泥pH值降低至7.5-8.8;赤泥中>2mm的团聚体颗粒由0.85%增长至51%-67%。
附图说明
图1为本发明的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1系统发育树状图。
分类命名为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)ZH-1,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2017659,保藏日期为:2017年11月06日,保藏地址为:中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。该培养物于2017年11月20日经保藏中心检测结果为存活。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
取河南省荥阳市高山镇的堆场赤泥5g置于100mL液体培养基(酵母膏3.0g·L-1、葡萄糖5.0g·L-1、NaCl 50.0g·L-1以及水)中,即酵母膏在液体培养基中的浓度为3.0g·L-1(克/升),葡萄糖在液体培养基中的浓度为5.0g·L-1,NaCl(氯化钠)在液体培养基中的浓度为50.0g·L-1,于温度为30℃、转速为175rpm·min-1的恒温振荡培养箱中避光振荡培养48h得到混合液,取2mL该混合液的上清液至新配置的100mL液体培养基(酵母膏3.0g·L-1、葡萄糖5.0g·L-1、NaCl 50.0g·L-1以及水)中,继续在培养条件为温度为30℃、转速为175rpm·min-1的恒温振荡培养箱中培养48h得到混合菌液;然后采用稀释涂布平板法将混合菌液分离筛选得到多个纯培养,将多个纯培养分别接种到100ml液体培养基(酵母膏3.0g·L-1、葡萄糖5.0g·L-1、NaCl 50.0g·L-1以及水)中,置于恒温振荡培养箱中,在温度为30℃,转速为175rpm·min-1的条件下继续培养48h得到培养液,通过检测培养液pH,筛选出一株能够使培养液pH降低至6.0以下的菌株,并命名为ZH-1。菌株ZH-1经金斯瑞生物科技有限公司16SrRNA测序,鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.),分类命名为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)ZH-1,已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2017659,保藏日期为:2017年11月06日,保藏地址为:中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心,并证明存活;该耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1用于降低赤泥的pH值。
稀释涂布平板法的具体过程为:吸取混合菌液0.1毫升,加入到0.9毫升的无菌水中,标记为10-1;依次以同样的方式稀释到10-5及10-6作为涂布液。吸取200微升10-5及10-6的涂布液均匀涂布到固体平板,至于30℃静置培养箱培养48小时,根据菌落形态及颜色选取不同的单菌落,利用接种针将各个单菌落接种于新鲜的固体平板并进一步纯化,从而得到多个纯培养。
鉴定:将分离得到的菌株的16S rRNA通过PCR扩增测序。菌株ZH-1的16SrRNA基因序列的Genebank登陆号为MG385861.1,具体序列见SEQ ID NO:1。将得到的序列与Genebank上的相关16S rRNA序列进行比对。与Genebank公开的相应菌株序列用Cluster X方法进行比对。基于1000个重复的抽样分析,使用MEGA 4.0。按邻接法构建系统树。构建得到的16SrRNA系统发育树如图1所示。目标菌株与Bacillus sp.KSM-K38(AB044748.1)相似性达99%,因此,菌株ZH-1被界定为芽孢杆菌属Bacillus sp.。
形态特征:耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1革兰氏阳性,为杆状,固体LB培养基上培养48小时后,菌落表面光滑、不透明、边缘整齐、淡黄色。
具体应用步骤包括:
(1)将保存的耐盐碱芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)ZH-1接种到液体培养基中培养,得到耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液;具体步骤为:用接种针挑取耐盐碱芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)ZH-1单菌落,并在无菌状态下将其接种至100ml液体培养基(酵母膏3.0g·L-1、葡萄糖5.0g·L-1、NaCl 50.0g·L-1以及水)中,然后置于恒温振荡培养箱中,在温度30℃,转速为175rpm·min-1振荡培养48h-72h,得到耐盐碱芽孢杆菌属菌株(Bacillussp.)ZH-1菌液;
(2)配置产酸培养基:将葡萄糖、酵母膏、可溶性淀粉、磷酸二氢钾、氯化镁与水混合,得到产酸培养基,其中,葡萄糖在该产酸培养基中的浓度为2-8g·L-1,酵母膏在该产酸培养基中的浓度为2-4g·L-1,可溶性淀粉在该产酸培养基中的浓度为1-2g·L-1,磷酸二氢钾在该产酸培养基中的浓度为0.3-0.7g·L-1,氯化镁在该产酸培养基中的浓度为0.3-0.7g·L-1;
(3)将经步骤(2)得到的产酸培养基进行灭菌,并利用浓度为5%-30%NaOH(氢氧化钠)溶液调节经步骤(2)得到的产酸培养基pH至11.5-12.5,吸取经步骤(1)得到的耐盐碱芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)ZH-1菌液,接种于产酸培养基中,耐盐碱芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)ZH-1菌液的加入量按质量比计为产酸培养基加入量的1%~3%,置于恒温振荡培养箱中,在30℃、175rpm·min-1条件下培养48h~120h,该产酸培养基pH降低至5.6-8.9;
(4)将经步骤(3)得到(即培养至对数期)的菌液加入到新的产酸培养基中得到稀释菌液,该新的产酸培养基与步骤(2)的产酸培养基配置相同,经步骤(3)得到的菌液加入量按质量比计为新的产酸培养基加入量的10%~20%,将稀释菌液与赤泥按质量比5:1-1:1混合,将混合物置于生化培养箱中培养4-28天,温度为30℃-38℃,赤泥pH值降低至7.5-8.8,赤泥中>2mm的团聚体颗粒由0.85%增长至51%-67%。
表1拜耳法赤泥的化学成分
实施例1
(1)用接种针挑取耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1单菌落,并在无菌状态下将其接种至100mL液体培养基(酵母膏3.0g·L-1、葡萄糖5.0g·L-1、NaCl 50.0g·L-1以及水)中,然后置于恒温振荡培养箱中,在温度30℃,转速为175rpm·min-1振荡培养48h得到耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液;
(2)配置产酸培养基(葡萄糖5.0g·L-1、酵母膏3.0g·L-1、可溶性淀粉1.5g·L-1、磷酸二氢钾0.7g·L-1、氯化镁0.3g·L-1、余量为水)并进行灭菌,加浓度为5%NaOH溶液调节产酸培养基pH至11.5,将4g经步骤(1)得到的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液接入到400g产酸培养基中,置于恒温振荡培养箱中,在30℃、175rpm·min-1条件下震动培养80h,该产酸培养基pH降低至7.4。
(3)配置新的产酸培养基(葡萄糖5.0g·L-1、酵母膏3.0g·L-1、可溶性淀粉1.5g·L-1、磷酸二氢钾0.7g·L-1、氯化镁0.3g·L-1、余量为水),将90g经步骤(2)培养得到的菌液加入到600g新配置的产酸培养基中得到稀释菌液,取300g稀释菌液与100g赤泥混合,赤泥pH为11.57,将混合物置于生化培养箱中培养16天,温度为38℃,赤泥pH值降低至8.2,赤泥中>2mm的团聚体颗粒由0.85%增长至59%。
实施例2
(1)配置产酸培养基(葡萄糖2.0g·L-1、酵母膏4.0g·L-1、可溶性淀粉2.0g·L-1、磷酸二氢钾0.5g·L-1、氯化镁0.7g·L-1、余量为水)并进行灭菌,加浓度为30%NaOH溶液调节产酸培养基pH至12.5,将12g耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液加入到400g产酸培养基中,置于恒温振荡培养箱中,在30℃、175rpm·min-1条件下震动培养120h,该产酸培养基pH降低至5.6;
(2)按步骤(1)配置新的产酸培养基(葡萄糖2.0g·L-1、酵母膏4.0g·L-1、可溶性淀粉2.0g·L-1、磷酸二氢钾0.5g·L-1、氯化镁0.7g·L-1、余量为水),将40g经步骤(1)培养得到的菌液加入到400g新配置的产酸培养基中得到稀释菌液,取200g稀释菌液与200g赤泥混合,赤泥pH为11.57,将混合物置于生化培养箱中培养4天,温度为34℃,赤泥pH降低至8.8,赤泥中>2mm的团聚体颗粒由0.85%增长至51%。
实施例3
(1)配置产酸培养基(葡萄糖8.0g·L-1、酵母膏2.0g·L-1、可溶性淀粉1.0g·L-1、磷酸二氢钾0.3g·L-1、氯化镁0.5g·L-1、余量为水)并进行灭菌,加浓度为18%NaOH溶液调节产酸培养基pH至12.0,将8g耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液接种到400g产酸培养基中,置于恒温振荡培养箱中,在30℃、175rpm·min-1条件下震动培养48h,该产酸培养基pH降低至8.9;
(2)配置新的产酸培养基(葡萄糖8.0g·L-1、酵母膏2.0g·L-1、可溶性淀粉1.0g·L-1、磷酸二氢钾0.3g·L-1、氯化镁0.5g·L-1、余量为水),将200g经步骤(1)培养得到的菌液加入到1000g新配置的产酸培养基中得到稀释菌液,取500g稀释菌液与100g赤泥混合,赤泥pH为11.57,将混合物置于生化培养箱中培养28天,温度为30℃,赤泥pH降低至7.5,赤泥中>2mm的团聚体颗粒由0.85%增长至67%。
以上所述的仅是本发明的较佳实施例,并不局限发明。应当指出对于本领域的普通技术人员来说,在本发明所提供的技术启示下,还可以做出其它等同改进,均可以实现本发明的目的,都应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国铝业股份有限公司
<120> 一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1437
<212> RNA
<213> 芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)
<400> TGCAAGTCGAGCGCAGGAAGCATCACGATCTCTTCGGAGTGAATGATGTGGAATGAGCG
GCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCTGTAGACTGGGATAACTTCGGGAA
ACCGAAGCTAATACCGGATAATCAAAGGAACCGCATGGTTCCCTTGTAAAAGTTGGGT
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Claims (9)
1.一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1,其特征在于,分类命名为芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.) ZH-1,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2017659,保藏日期为:2017年11月06日,保藏地址为:中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。
2.一种如权利要求1所述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1用于降低赤泥的pH。
3.根据权利要求2所述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1接种到液体培养基中培养,得到耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液;
(2)配置产酸培养基,加入NaOH溶液调节产酸培养基pH,吸取经步骤(1)得到的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液,接种于产酸培养基中培养;
(3)将经步骤(2)得到的菌液加入到与步骤(2)相同配置的产酸培养基中得到稀释菌液,将稀释菌液与赤泥混合,然后将混合物置于生化培养箱中培养。
4.根据权利要求3所述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述液体培养基按照如下方法配置:将酵母膏、葡萄糖、NaCl和水混合,得到液体培养基。
5.根据权利要求4所述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述酵母膏在所述液体培养基中的浓度为 3.0g∙L-1,所述葡萄糖在所述液体培养基中的浓度为 5.0g∙L-1,所述NaCl在所述液体培养基中的浓度为 50.0g∙L-1。
6.根据权利要求3所述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述产酸培养基按照如下方法配置:将葡萄糖、酵母膏、可溶性淀粉、磷酸二氢钾、氯化镁和水混合,得到产酸培养基。
7.根据权利要求6所述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述葡萄糖在所述产酸培养基中的浓度为2-8g∙L-1,所述酵母膏在所述产酸培养基中的浓度为2-4g∙L-1,所述可溶性淀粉在所述产酸培养基中的浓度为1-2g∙L-1,所述磷酸二氢钾在所述产酸培养基中的浓度为0.3-0.7g∙L-1,所述氯化镁在所述产酸培养基中的浓度为0.3-0.7g∙L-1。
8.根据权利要求3所述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,具体步骤包括:
(1)将耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1接种到液体培养基中,然后置于恒温振荡培养箱中培养48h-72h,得到耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液;所述液体培养基包括:酵母膏3.0g∙L-1,葡萄糖 5.0g∙L-1, NaCl 50.0g∙L-1和水;所述恒温振荡培养箱中的培养条件为温度30℃,转速为175 rpm∙min-1;
(2)配置产酸培养基,加入NaOH溶液调节产酸培养基pH至11.5~12.5,吸取经步骤(1)得到的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液,接种于产酸培养基中,耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1菌液的加入量按质量比计为产酸培养基加入量的1%~3%,然后置于恒温振荡培养箱中培养48h~120h;所述产酸培养基包括:葡萄糖2-8g∙L-1,酵母膏2-4g∙L-1,可溶性淀粉1-2g∙L-1,磷酸二氢钾0.3-0.7g∙L-1,氯化镁0.3-0.7g∙L-1和水;
(3)将经步骤(2)得到的菌液加入到与步骤(2)相同配置的产酸培养基中得到稀释菌液,经步骤(2)得到的菌液加入量按质量比计为产酸培养基加入量的10%~20%,将稀释菌液与赤泥按质量比5:1-1:1混合,然后将混合物置于生化培养箱中培养4~28天,温度为30℃~38℃。
9.根据权利要求8所述的耐盐碱芽孢杆菌属菌株ZH-1的应用,其特征在于,所述步骤(2)NaOH溶液浓度为5%~30%。
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