CN101508967B

CN101508967B - 一株耐碱芽孢杆菌菌株及其产生的果胶酶

Info

Publication number: CN101508967B
Application number: CN2009100256233A
Authority: CN
Inventors: 齐斌; 梅艳珍; 王立梅; 郑丽雪
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu Institute of Technology
Priority date: 2009-03-04
Filing date: 2009-03-04
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2029-03-04
Also published as: CN101508967A

Abstract

本发明以高浓度果胶作为唯一碳源从土壤中筛选到一株耐碱芽孢杆菌菌株，分类命名为Bacillus alcalophilus M29，保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO：M 209006；本发明还涉及耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29产生的果胶酶，具有较好的热稳定性(45～65℃)、底物耐受性和嗜碱性(8.5～11，最适pH值为10)，属于耐热嗜碱果胶酶；以及该耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29菌株在发酵制备果胶酶中的应用。

Description

一株耐碱芽孢杆菌菌株及其产生的果胶酶

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产耐热嗜碱果胶酶的耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29及其产生的耐热嗜碱果胶酶，本发明还涉及Bacillusalcalophilus M29在发酵生产果胶酶中的应用。

背景技术

果胶酶是指能分解果胶质的一类酶，碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2)是指在碱性范围内具有较高活性的一类果胶酶。自1972年日本学者KokiHorikoshi首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来(Hoondal G.S.，et al.Appl Microbiol Biotechnol，2002，59：409～418)，其应用研究越来越广泛。碱性果胶酶除了在植物病毒的纯化、纸浆漂白等方面得到应用以外，已成为棉织物预处理过程中至关重要的生物酶制剂。碱性果胶酶的使用将改变传统的碱精练工艺，不仅减少环境污染，节约大量的工艺用水，而且可提高棉纺织物的品质。碱性果胶酶应用领域，还包括造纸、环境和食品等领域。然而，由于碱性果胶酶高产菌极少，产酶成本较高，热稳定性较低，其工业化生产程度还很低，因此，选育高产菌株来提高其热稳定性、碱稳定性、提高碱性果胶酶产率、降低产酶成本是研究开发和应用碱性果胶酶的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有高产碱性果胶酶能力、较好的热稳定性的微生物菌株及其产生的果胶酶，并提供一种利用该菌株发酵生产碱性果胶酶的方法，使得该方法能成功应用于果胶酶的生产。

为解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案实现：

一、本发明以高浓度果胶作为唯一碳源从土壤中筛选到一株耐碱芽孢杆菌菌株，分类命名为Bacillus alcalophilus M29，保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO：M 209006。

(一)耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29的筛选及鉴定方法：

1、初筛

从自然界中采集土样约1500个，取3～4种土样各1g左右加入盛入有10mL筛选培养基的试管中，于55℃、200r·m^-1条件下富集培养三至四天后，转接于新鲜的筛选培养中，转接3～4次后，取少量培养液适当稀释，均匀涂布于筛选平板培养基上。培养18h后，观察菌落周围的透明圈，将有明显透明圈的菌种进化单离，并接种于肉汤平板培养基培养。

2、复筛

从肉汤培养基上刮取一环菌体，接种至装有发酵培养基的摇瓶中，55℃、200r·m^-1条件下培养18h后离心，将所得上清加入含2％聚半乳糖醛酸底物的碳酸钠缓冲液(pH10.0)中转化10h，转化液离心后的上清用于检测果胶酶活性，得到果胶酶活性最大的一株菌株，命名为M29。

3、菌株的鉴定

本发明将M29经生理生化实验鉴定，表明M29与芽孢杆菌Bacillus sp.相近，而16SrDNA序列分析鉴定表明与该序列相似度高于98％的菌株均为Bacillus属菌株，其中与菌株Bacillus alcalophilus属相似度为98.9％，证明为耐碱芽孢杆菌的一株新菌株。因此，最终将M29命名为Bacillus alcalophilus M29。

(二)耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29的形态特征：

本发明对Bacillus alcalophilus M29的生物特征进行了鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌，有芽孢形成。在碱性肉汤平板培养基中生长20小时后，菌落大小为2～2.5mm，生长温度范围是45～55℃，最适温度是50℃，生长pH是9.5～10.5，最适pH是10.0，其生理生化表现在，过氧化物酶试验阳性，在有氧条件下生长。

二、本发明所述的耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29产生的果胶酶，具有较好的热稳定性(45～65℃)、底物耐受性和嗜碱性(8.5～11，最适pH值为10)，属于耐热嗜碱果胶酶。

三、本发明所述的耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29菌株在发酵制备果胶酶中的应用。其原理如下：

Bacillus alcalophilus M29菌株发酵制备果胶酶的方法：

将菌体在果胶为诱导剂的发酵液中发酵；将发酵液离心，得上清，即为碱性果胶酶。

利用Bacillus alcalophilus M29菌株发酵生产果胶酶时，可采用现有技术的所有利用芽孢杆菌的发酵生产果胶酶的方法，一般不必对特别限定。如发酵的碳源可选用糖类如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖，甜菜粕，桔皮；氮源可选用有机氮源或无机氮源，如有机氮源麦芽汁、酵母膏、蛋白胨，其中以酵母膏效果最佳，如无机氮源可用硫酸铵、硝酸铵、氯化铵；作为缓冲盐类，可用Na₂CO₃，NaHCO₃；钾盐可用磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，发酵液pH可为自然，一般可选8.5～11；菌种接种一般为5～20％，更好为10～15％；在150～300rpm转速搅动下，保持温度在45～55℃，发酵至果胶酶有大量积累，发酵时间一般为18～72h，优选24～48h。

本发明的有益效果在于筛选到的新菌株Bacillus alcalophilus M29能产生热稳定性和底物耐受性的果胶酶，有效避免高浓度底物对果胶酶的抑制作用，而利用Bacillusalcalophilus M29在果胶酶上的应用操作简单、稳定、重复性好，实现了耐热嗜碱果胶酶稳定、价廉地生产，有利于规模化生产。

附图说明

图1耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29所产碱性果胶酶酶的热稳定性

图2耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29所产碱性果胶酶酶的pH稳定性

本发明的微生物耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29的保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏登记号为CCTCCNO：M 209006。

具体实施方式

本发明中的碱性果胶酶活性的测定方法为：

1、碱性果胶酶活性测定：反应体系中包括粗酶稀释液(即发酵液稀释10倍)20μL，含0.2％聚半乳糖醛酸的碳酸钠缓冲液pH10.0，以无活性的酶液作为空白对照，以含底物的缓冲溶液的加入起动酶促反应；反应条件为55℃反应10min，用3mL 0.03mol/L的磷酸终止反应，在紫外检测波长235nm处测定其吸光度值。

2、酶活计算：

一个标准酶活单位(1U)定义为：在pH10，温度60℃条件下每分钟降解聚半乳糖醛酸钠产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

酶活计算：

式中，4600(L·mol^-1cm^-1)代表不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数。

实施例1

本实施例说明耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29筛选、鉴定程序。

筛选培养基(g·L^-1)：果胶30、酵母膏1、硝酸铵3，磷酸二氢钾6、碳酸钠10(单独灭菌)、七水硫酸镁0.5、，pH10.0；

筛选平板培养基(g·L^-1)：果胶20、蛋白胨5、酵母膏3、碳酸钠10(单独灭菌)、琼脂20，pH10.0；

发酵培养基(g·L^-1)：果胶5、蔗糖20、酵母膏1、碳酸钠10(单独灭菌)、玉米浆20mL(干重约4g)、磷酸二氢钾6、硫酸镁0.5，pH10.0；

肉汤平板培养基(g·L^-1)：蛋白胨10、牛肉膏5、氯化钠5、琼脂20，pH10.0。

1、初筛：

从江苏省各地随机中采集土样约1500个，取3～4种土样各1g左右加入盛入有10mL筛选培养基的试管中，于55℃、200r·m^-1条件下富集培养三至四天后，转接于新鲜的筛选培养中，转接3～4次后，取少量培养液适当稀释，均匀涂布于筛选平板培养基上。培养18h后，观察菌落周围的透明圈，将有明显透明圈的菌种进化单离，并接种于肉汤平板培养基培养。

2、复筛：

3、鉴定：

本发明将M29经生理生化鉴定，表明该菌株MH602与芽孢杆菌相似，而16SrDNA序列分析鉴定表明与该序列相似度高于98％的菌株均为Bacillus属菌株，其中与菌株Bacillus alcalophilus相似度为98.9％，证明为耐碱芽孢杆菌的一株新菌株。因此，最终将M29命名为Bacillus alcalophilus M29。

实施例2

本实验说明Bacillus alcalophilus M29的形态特征。

本发明对Bacillus fordii MH602的生物特征进行了鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌，有芽孢形成。在肉汤平板培养基中生长16小时后，菌落大小为2～2.5mm，生长温度范围是45～55℃，最适温度是50℃，生长pH是8.0～11，最适pH是10，其生理生化表现在，过氧化物酶试验阳性，在有氧条件下生长。

实施例3

本实施例说明耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29产生的果胶酶的热稳定性。

果胶酶的发酵方法：

发酵培养基(g/L)：果胶5、蔗糖20、酵母膏1、碳酸钠10(单独灭菌)、玉米浆20mL(干重约4g)、磷酸二氢钾6、硫酸镁0.5，pH10.0。于121℃灭菌20min。将肉汤培养基上的菌种接种于发酵培养基，在55℃，200rpm发酵培养18～22h后，于8000rpm离心10min，上清液即果胶酶粗酶液。

将果胶酶液分装于不同的反应管中，于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃保温一小时后，取20μL不同时间保温后的果胶酶液，加入底物20g·L^-1聚半乳糖醛酸，于55℃转化10min，用3mL 0.03mol/L的磷酸终止反应，测定转化液中的碱性果胶酶活性，在235nm紫外波长处测定其吸光度值。以不经保温处理所测的果胶酶液酶活为相对酶活。

如图1所示，耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29产生的果胶酶在70℃以下均有活性。在55℃时酶活均较稳定。超过65℃，果胶酶活性明显下降。耐碱芽孢杆菌Bacillusalcalophilus M29产生的果胶酶相对于已报道的相关酶具有较好的热稳定性。

实施例4

本实施例说明耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29产生的果胶酶的底物耐受性。

反应体系中过高的底物及产物浓度往往对酶活性有抑制作用。将实施例3中制备的果胶酶液分装于不同的反应管中，加入不同浓度底物聚半乳糖醛酸，于55℃转化10min，用3mL 0.03mol/L的磷酸终止反应，测定转化液中的不饱和半乳糖醛酸含量来测定果胶酶活性。当底物浓度不超过30g·L^-1时，不饱和半乳糖醛酸生成量几乎成比例上升，而底物浓度为30～40g·L^-1时，不饱和半乳糖醛酸生成量尽管未成比例上升，但仍呈上升趋势，说明在40g·L^-1的底物浓度范围内，底物对果胶酶无明显抑制作用。

实施例5

本实施例说明耐碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus M29产生的果胶酶的适宜pH的实验方法：

配制以下pH梯度缓冲液：

0.05mol/L Na₂HPO₄-NaOH缓冲液(pH5.8～8.0)；

0.2mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.0～10.5)；

0.1mol/LKH₂PO₄-NaOH缓冲液(pH11.0～11.9)；

将聚半乳糖醛酸(PGA)溶解于不同pH的缓冲液中，配制成0.2％的PGA溶液。

取稀释10倍后的实施例3中制备的果胶酶液20μL，加入2mL含0.2％的PGA缓冲液，以无活性的酶液作为空白对照，在55℃反应15min，用3mL 0.03mol/I.的磷酸终止反应，在235nm紫外波长处测定其吸光度值。图2证明，该果胶酶在pH值为碱性时酶活相对高，故该果胶酶为碱性果胶酶。

Claims

1.一株耐碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)菌株，分类命名为Bacillusalcalophilus M29，保藏日期为2009年1月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO：M 209006。

2.根据权利要求1所述的耐碱芽孢杆菌菌株Bacillus alcalophilus M29所产生的果胶酶，其特征在于所述的果胶酶的发酵方法为：发酵培养基以g/L的单位表示为：果胶5、蔗糖20、酵母膏1、单独灭菌的碳酸钠10、干重为4g的玉米浆20mL、磷酸二氢钾6、硫酸镁0.5，pH 10.0；于121℃灭菌20min；将肉汤培养基上的菌种接种于发酵培养基，在55℃，200rpm发酵培养18～22h后，于8000rpm离心10min，上清液即果胶酶粗酶液。

3.根据权利要求2所述的耐碱芽孢杆菌菌株Bacillus alcalophilus M29所产生的果胶酶，其特征在于所述的果胶酶为耐热嗜碱果胶酶。

4.根据权利要求1所述的耐碱芽孢杆菌菌株Bacillus alcalophilus M29在发酵制备果胶酶中的应用，其特征在于应用方法为：发酵培养基以g/L的单位表示为：果胶5、蔗糖20、酵母膏1、单独灭菌的碳酸钠10、干重为4g的玉米浆20mL、磷酸二氢钾6、硫酸镁0.5，pH 10.0；于121℃灭菌20min；将肉汤培养基上的菌种接种于发酵培养基，在55℃，200rpm发酵培养18～22h后，于8000rpm离心10min，上清液即果胶酶粗酶液。