CN101550398A - 蜡状芽孢杆菌菌株的筛选及其碱性果胶酶的制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株，其16S rRNA基因具有序列表(1)列明的RNA序列，并且公开了这一菌株的筛选方法；本发明还公开了一种碱性果胶酶及其制备方法，以上述蜡状芽孢杆菌为出发菌株，进行种子培养和液体深层发酵，最终制得高酶活的碱性果胶酶，并对其部分酶学性质进行了分析。本发明所述的碱性果胶酶活性较高，并且成本低廉、发酵周期短，发酵工艺简便。所制得的碱性果胶酶可用于麻类脱胶和棉织物的精练工艺中，提高产品品质，降低环境污染。

Description

蜡状芽孢杆菌菌株的筛选及其碱性果胶酶的制备

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种蜡状芽孢杆菌菌株及其筛选方法，尤其涉及一种由蜡状芽孢杆菌为出发菌株制备的碱性果胶酶。

背景技术

随着人们环保意识的不断增强，绿色纺织品及环保工艺已成为纺织业可持续发展的重要基础。现在人们全程环保的观念将彻底改变以前仅要求末端治理的观念，而酶制剂作为一种高效、专一、具有环境亲和性的生物催化剂，其在纺织工业中的应用也将随之成为必然的趋势。以碱性果胶酶为技术关键的麻脱胶工艺和生物酶精炼工艺就是其中的研究热点之一，碱性果胶酶的使用将改变传统的棉麻等织物的处理工艺，不仅减少环境污染，而且在工艺过程中节约大量的工艺用水。

目前，纺织行业多采用传统的化学脱胶及印染工艺，依靠强酸、强碱对棉麻进行处理，由化学反应的性质决定，这个处理是激烈而强硬的，而且处理的力度也是难以控制的。一方面，强烈的化学作用在脱除纤维共生物的同时破坏了纺织品的纤维结构，使纤维强度受损，可纺性差，制成率低。另一方面，化学工艺法消耗大量的酸、碱等化工原料和能源。纺织工业所排废水碱度高、色泽深、BOD高、COD特别高等，已经造成了严重的环境污染。在当今人类重视生存环境，推崇“绿色工业”的大形势下，许多纺织企业都面临着生存危机。

果胶酶(pectinases)是一类能分解植物组织中的果胶质的酶系，果胶质是由D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物；碱性果胶酶则是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(Polygalacturonate lyase，PGL)。自1972年日本学者首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来，至今已经分离鉴定出几十种碱性果胶酶。日本专利特开昭51-149976公开了一种微生物进行苎麻脱胶的方法，指出真菌产生的果胶酶中含有纤维素酶，起作用的条件为酸性。因其脱胶效果不稳定，并造成纤维强度下降，工业上难于应用。申请号为CN85104284的中国发明专利申请公开了利用芽胞杆菌进行苎麻脱胶的方法，中国专利申请CN97109044.0公开了一株嗜碱芽胞杆菌并应用于苎麻脱胶，中国专利ZL 01106844.2公开了一株枯草芽胞杆菌CCTCC M200038并应用于苎麻脱胶。上述各专利所公开的内容，均涉及果胶酶的生产及其在纺织纤维脱胶方面的应用，但其中能用于工业化生产的为数不多。国外仅有诺维信等个别公司有碱性果胶酶在中国市场销售，但由于成本较高，至今没有得到广泛的应用，国内产业化进程更加缓慢。目前本行业人们广为关注的问题就是，如何才能得到一种碱性果胶酶的高产菌株，以便使碱性果胶酶生产实现工业化，降低成本，在产业上广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种碱性果胶酶高产菌株及其筛选方法，用以制备一种高酶活的碱性果胶酶，以便在产业上广泛应用。

本发明所采取的技术方案是，从苎麻厂的麻泥中分离得到一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株，其16S rRNA基因具有序列表(1)列明的RNA序列。其16S rRNA基因与蜡状芽孢杆菌同源性高达99％。

上述的蜡状芽孢杆菌菌株，其筛选方法是：

1.按常规方法从苎麻厂麻泥中的大量菌株中筛选目的菌株；

2.以果胶为唯一碳源进行富集培养，使不能产碱性果胶酶的菌株不能生长；

3.然后以果胶为唯一碳源的培养基进行平板筛选，排除一些与碱性果胶酶菌株共生的菌株；

4.再将选出的菌株点种在滴有1％十六烷基三甲基溴化铵的、含果胶培养基的筛选平板上，37℃培养24~28h，通过对比透明圈直径与菌落直径的大小初步确定产碱性果胶酶的菌株；

5.挑选出来透明圈较大的菌落后，进行发酵培养，用酶活检测的方法来最终确定产碱性果胶酶的菌株。

其中：步骤4所述含果胶培养基的组成(g/L)：果胶6~10，蛋白胨6~10，牛肉膏8~12，磷酸氢二钾8~10，磷酸二氢钾2~5，氯化钠2~4，琼脂20~25。

一个标准酶活单位(lu)定义为：每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。采用不饱和半乳糖醛酸在235nm处的特征吸收来确定。

碱性果胶酶活性的测定：取一定量的发酵液，于4000r/min条件下离心10min，去沉淀，取上清夜，用去离子水稀释后，取20μl加入含0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH为9)，45℃反应15min，用3ml 0.03M的磷酸溶液终止反应，在分光光度计235nm处测定其吸光度值。也可以采用本领域已知的其他测定酶活性的方法进行测定。

一种碱性果胶酶的制备方法，按照制备酶制剂的常规步骤进行，其特征在于：

以上述蜡状芽孢杆菌为出发菌株，进行种子培养和液体深层发酵制得，其中：

所述的种子培养，其培养条件为37℃温度下培养12~15h；其种子培养基的pH为7.0，组成为(g/l)：蛋白胨20，牛肉膏8，葡萄糖10，磷酸氢二钾8，磷酸二氢钾3，硫酸镁3；

所述的液体深层发酵，其条件为：15T罐装液量为9T，调节搅拌转速和通气量，37℃温度下发酵24~28h；其发酵培养基的pH为7.0，组成为(g/l)：玉米浆20，豆粕粉30，玉米粉20，磷酸氢二钾8，磷酸二氢钾3，硫酸镁3，氯化钠5。

上述的碱性果胶酶的制备方法，其特征在于：所述液体深层发酵过程中，通气量为1∶(0.8~1)，搅拌转速为150~200rpm。

一种碱性果胶酶，以本发明所述蜡状芽孢杆菌为出发菌株，应用本发明所述碱性果胶酶的制备方法制得。

上述碱性果胶酶的发酵工艺中，通过调节搅拌转速和通气量来对溶氧浓度进行优化。通过增大通气量，提高发酵罐内截面流速，增加发酵液的气含量，增大气-液比表面积，利于氧的传递。但通过增加通气量以提高氧传递效率的作用效果是呈递减性的。还要通过改变转速来调整罐内溶氧，搅拌不仅可以把通入发酵液的空气分散成小气泡，从而增加气-液接触面积，还可以强化发酵液的湍流程度，提高氧的传递速率。本发明通过调整通气量和搅拌转速，通气量为1∶(0.8~1)，搅拌转速为150~200rpm时，发酵液酶活高达100lu/ml。

应用本发明的方法，发明人筛选到高产碱性果胶酶的芽孢杆菌菌株，其16S rRNA基因与蜡状芽孢杆菌同源性高达99％。本发明以所述蜡状芽孢杆菌为出发菌株，通过优化发酵工艺，提高发酵水平，最终制得高酶活的碱性果胶酶，并对其部分酶学性质进行了分析。

本发明使碱性果胶酶的生产得到工业化。本发明制得的碱性果胶酶活性较高，并且成本低廉、发酵周期短，发酵工艺简便。所制得的碱性果胶酶可用于麻类脱胶和棉织物的精练工艺中，有效的改变现有传统的化学处理工艺，提高产品品质，降低环境污染。

本发明所涉及的设备均为本行业惯常使用的设备。

本发明所使用的试剂均为本行业常用的市售产品。

本发明所使用的检测手段，除已特别介绍的外，均可应用本领域公知的、本行业惯用的方法。

序列表

本申请包含序列列表形式的信息，其附带于本申请并随本申请一起提交数据载体，数据载体的内容与本文相同并在本文中完整引入作为参考。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明。

本发明的发明人通过自主研发，筛选出碱性果胶酶的高产菌株，经基因序列分析确定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其16S rRNA基因与蜡状芽孢杆菌同源性高达99％。通过优化发酵工艺，提高发酵水平，使碱性果胶酶的生产得到工业化。本发明制得的碱性果胶酶活性较高，并且成本低廉、发酵周期短，发酵工艺简便。本发明还考察了纺织行业中常用化学物质H₂O₂对碱性果胶酶的影响。

实施例1

将麻泥溶于水，过滤后取清夜稀释，按常规方法以果胶为唯一碳源进行富集培养，使不能产碱性果胶酶的菌株不能生长，然后以果胶为唯一碳源的培养基进行平板筛选，排除一些与碱性果胶酶菌株共生的菌株；再将选出的菌株均匀点种在滴有1％十六烷基三甲基溴化铵的、含果胶培养基的筛选平板上，将其一一标记，37℃培养24~28h，如有透明圈，比较各自透明圈直径与菌落直径之比的大小，选择大者进行发酵培养，用酶活检测的方法最终确定产碱性果胶酶的菌株。选出的菌株经基因序列分析确定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其16S rRNA基因与蜡状芽孢杆菌同源性高达99％，可以保藏在-70℃的甘油管中。

其中：含果胶培养基的组成为(g/L)：果胶6~10，蛋白胨6~10，牛肉膏8~12，磷酸氢二钾8~10，磷酸二氢钾2~5，氯化钠2~4，琼脂20~25。

实施例2

将实施例1得到的菌种转接到种子培养基中，种子培养基装液量为1L的三角瓶中装300ml种子培养基，经37℃，200rpm的回转式摇床培养12h后，转接到装有100L种子培养基的一级种子罐中，在37℃，180rpm，通气量为1∶0.8的条件下发酵培养12h；使种子扩增后，再转入1.5T的二级种子罐中，培养条件同一级种子罐，使种子量进一步扩增。将大量的二级种子转接到装有9T发酵培养基的15T发酵罐中，前期通气量为1∶1，转速为150rpm，12h后调整通气量为1∶0.8，转速为200rpm，发酵周期为26h。经测定，发酵最终酶活为100lu/ml。其中：

种子培养基的pH为7.0，组成为(g/l)：蛋白胨20，牛肉膏8，葡萄糖10，磷酸氢二钾8，磷酸二氢钾3，硫酸镁3；

发酵培养基的pH为7.0，组成为(g/l)：玉米浆20，豆粕粉30，玉米粉20，磷酸氢二钾8，磷酸二氢钾3，硫酸镁3，氯化钠5。

实施例3

本实施例的操作步骤、投料、使用设备均与实施例2相同，不同之处在于：种子培养进行15h；在整个发酵培养过程中，控制通气量为1∶0.8，搅拌转速为200rpm，发酵周期为28h。经测定，发酵最终酶活为100lu/ml.

实施例4

本实施例的操作步骤、投料、使用设备均与实施例2相同，不同之处在于：种子培养进行14h；在整个发酵培养过程中，控制通气量为1∶1，搅拌转速为150rpm，发酵周期为24h。经测定，发酵最终酶活为100lu/ml.

实施例5

本实施例的操作步骤、投料、使用设备均与实施例2相同，不同之处在于：种子培养进行13h；在整个发酵培养过程中，控制通气量为1∶0.9，搅拌转速为180rpm，发酵周期为25h。经测定，发酵最终酶活为100lu/ml.

实施例6

H₂O₂对碱性果胶酶的影响

本实验主要是考察pH为7、pH为9，55℃自然条件下保存的碱性果胶酶的耐H₂O₂情况。实验中使用的市售H₂O₂的质量浓度为27.5％，各实验组所添加的H₂O₂浓度分别为10、30和60g/L；对照组未添加。所得数据列入表1和表2。

	1h	3h
			对照	94	88
10g/L	96	88
			30g/L	94	78
60g/L	97	65

表1pH为7、55℃条件下，碱性果胶酶耐H₂O₂的情况(相对酶活)。

	1h	3h
			对照	89	63
10g/L	84	59
			30g/L	81	32
60g/L	79	15

表2pH为9、55℃条件下，碱性果胶酶耐H₂O₂的情况(相对酶活)。

根据表1和表2所列数据可以看出，一定温度下，本发明的碱性果胶酶在H₂O₂存在的条件下，酶活损失较小，适合在经常使用化学物质H₂O₂的纺织行业中应用。

序列表

<110>青岛康地恩生物科技有限公司

<120>蜡状芽孢杆菌菌株的筛选及其碱性果胶酶的制备

<160>1

<170>

<210>1

<211>1465

<212>RNA

<213>蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

<400>1

ACGCTGGCGG CGTGCCTAAT ACATGCAAGT CGAGCGAATG GATTAAGAGC TTGCTCTTAT   60

GAAGTTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TGGGTAACCT GCCCATAAGA CTGGGATAAC  120

TCCGGGAAAC CGGGGCTAAT ACCGGATAAC ATTTTGAACC GCATGGTTCG AAATTGAAAG  180

GCGGCTTCGG CTGTCACTTA TGGATGGACC CGCGTCGCAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAAC  240

GGCTCACCAA GGCAACGATG CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GATCGGCCAC ACTGGGACTG  300

AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA TCTTCCGCAA TGGACGAAAG  360

TCTGACGGAG CAACGCCGCG TGAGTGATGA AGGCTTTCGG GTCGTAAAAC TCTGTTGTTA  420

GGGAAGAACA AGTGCTAGTT GAATAAGCTG GCACCTTGAC GGTACCTAAC CAGAAAGCCA  480

CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGTG GCAAGCGTTA TCCGGAATTA  540

TTGGGCGTAA AGCGCGCGCA GGTGGTTTCT TAAGTCTGAT GTGAAAGCCC ACGGCTCAAC  600

CGTGGAGGGT CATTGGAAAC TGGGAGACTT GAGTGCAGAA GAGGAAAGTG GAATTCCATG  660

TGTAGCGGTG AAATGCGTAG AGATATGGAG GAACACCAGT GGCGAAGGCG ACTTTCTGGT  720

CTGTAACTGA CACTGAGGCG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG  780

TCCACGCCGT AAACGATGAG TGCTAAGTGT TAGAGGGTTT CCGCCCTTTA GTGCTGAAGT   840

TAACGCATTA AGCACTCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTGAAACTC AAAGGAATTG   900

ACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT GGTTTAATTC GAAGCAACGC GAAGAACCTT   960

ACCAGGTCTT GACATCCTCT GAAAACCCTA GAGATAGGGC TTCTCCTTCG GGAGCAGAGT  1020

GACAGGTGGT GCATGGTTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA  1080

CGAGCGCAAC CCTTGATCTT AGTTGCCATC ATTAAGTTGG GCACTCTAAG GTGACTGCCG  1140

GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC ATGCCCCTTA TGACCTGGGC  1200

TACACACGTG CTACAATGGA CGGTACAAAG AGCTGCAAGA CCGCGAGGTG GAGCTAATCT  1260

CATAAAACCG TTCTCAGTTC GGATTGTAGG CTGCAACTCG CCTACATGAA GCTGGAATCG  1320

CTAGTAATCG CGGATCAGCA TGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC  1380

CGTCACACCA CGAGAGTTTG TAACACCCGA AGTCGGTGGG GTAACCTTTT TGGAGCCAGC  1440

CGCCTAAGGT GGGACAGATG ATGGG                                        1465

Claims (7)

1、一种蜡状芽孢杆菌菌株的筛选方法，包括下列步骤：

a.按常规方法从苎麻厂麻泥中筛选目的菌株；

b.以果胶为唯一碳源进行富集培养，使不产碱性果胶酶的菌株不能生长；

c.然后以果胶为唯一碳源的培养基进行平板筛选，排除一些与碱性果胶酶菌株共生的菌株；

d.将选出的菌株点种在滴有1％十六烷基三甲基溴化铵的、含果胶培养基的筛选平板上，37℃培养24~28h，通过对比透明圈直径与菌落直径的大小初步确定产碱性果胶酶的菌株；

e.挑选出透明圈较大的菌落，进行发酵培养，用酶活检测的方法最终确定产碱性果胶酶的菌株。

2、根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：步骤d所述含果胶培养基以g/L为单位的组成为：果胶6~10，蛋白胨6~10，牛肉膏8~12，磷酸氢二钾8~10，磷酸二氢钾2~5，氯化钠2~4，琼脂20~25。

3、一种其16S rRNA基因具有序列表1所列RNA序列的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株。

4、一种碱性果胶酶的制备方法，按照从菌种出发制备酶制剂的常规步骤进行，其特征在于：以权利要求3所述蜡状芽孢杆菌为出发菌株，经过种子培养和液体深层发酵进行制备。

5、根据权利要求4所述碱性果胶酶的制备方法，其特征在于：

所述种子培养，其培养条件为37℃温度下培养12~15h；其种子培养基的pH为7.0，以g/l为单位的组成为：蛋白胨20，牛肉膏8，葡萄糖10，磷酸氢二钾8，磷酸二氢钾3，硫酸镁3；

所述液体深层发酵，其发酵条件为：15T罐装液量为9T，调节搅拌转速和通气量，37℃温度下发酵24~28h；其发酵培养基的pH为7.0，以g/l为单位的组成为：玉米浆20，豆粕粉30，玉米粉20，磷酸氢二钾8，磷酸二氢钾3，硫酸镁3，氯化钠5。

6、根据权利要求5所述碱性果胶酶的制备方法，其特征在于：在所述的液体深层发酵过程中，通气量为1∶(0.8~1)，搅拌转速为150~200rpm。

7、一种碱性果胶酶，根据权利要求4、5或6任一项所述的制备方法制得。