CN101157904B - 一种β-葡聚糖酶的产生菌 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种β-葡聚糖酶的产生菌。β-葡聚糖酶的产生菌分类命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏登记号为：CGMCC No.2077。本发明的β-葡聚糖酶的产生菌所产葡聚糖酶最适pH6.0左右，最适温度为70℃，在温度50℃-70℃的范围内，酶活性变化不大，经60℃保温5小时，剩余酶活为20％，具有较好的耐热性能和研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种β-葡聚糖酶的产生菌。
背景技术
β-葡聚糖酶(β-glucanase)是一种结构性非淀粉多糖(NSP)是自然合成的多聚糖含量最多的糖类。由右旋葡萄糖(D型)以混合的β-(1，3)，β-(1，4)糖苷键随机排列的线性连接而成的葡萄糖聚合物。谷物类中所含有的β-葡聚糖有独特的分子结构，赋予了其独特的性质：以高分子量的形式溶于水，且形成溶液的黏度很高给工业生产带来了诸多的不便。如高分子量的大麦β-葡聚糖可引起麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难，得率降低，影响啤酒的稳定性和质量；以大麦等谷物做能量饲料，β-葡聚糖能引起畜禽胃液黏度增加，阻碍单胃动物对养份的吸收，谷物的饲价值降低。然而啤酒的制备工艺及饲料生产过程中添加β-葡聚糖酶，利用β-葡聚糖酶分解β-葡聚糖，就能够有效的改善β-葡聚糖所带来的负面影响。因此，近年来对β-葡聚糖酶的研究受到广泛的重视并取得了一定的进展，β-葡聚糖酶来源广泛，其中以细菌为主要酶源，在真菌，放线菌，藻类，软体动物和高等植物中也存在。
1942年，Hrmova等首次从燕麦中分离得到β-葡聚糖。20世纪90年代中期，M.Hahn和T.Keite通过质谱结合X-射线结晶体学的方法对β-葡聚糖酶进行了大量研究，其结果表明：β-葡聚糖酶为一反向平行的β-折叠体系，每出现一处折叠就剧增大量的蛋白质。β-葡聚糖酶也可由微生物产生，如细菌(芽孢杆菌)、真菌(曲霉、毛霉等)和瘤胃微生物等。微生物产β-葡聚糖酶系对β-葡聚糖多无特异性，只分解由β-1，2-，β-1，3-，β-1，4-和β-1，6-键构成的纤维素及昆布聚搪等。这些产酶菌广泛存在于青霉属、木霉属、曲霉属、镰刀菌属、毛霉属和纤维素诺卡氏菌属中，如娄地青霉和木素木霉等。而能特异分解β-葡聚糖的酶主要来源于芽孢杆菌属和曲霉属，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulars)、地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)和米曲霉(Aspergillusoryzae)，溶黄质厄氏菌(Qerskoviaxanthineolytica)。
β-葡聚糖酶最早应用于啤酒工业，国外一些酶制剂公司如丹麦Novo公司、荷兰Gist公司和美国Miles公司都推出自己的产品，这些产品有的是单纯含β-葡聚糖酶制剂，也有的产品是混合酶性质，如含有α-淀粉酶、β-淀粉酶和朊酶等等。我国在八十年代初，啤酒工业的糖化和酿造工艺中添加外源β-葡聚糖酶也逐渐为啤酒生产厂家所重视并且应用在啤酒的制备工艺中。β-葡聚糖酶的生产及研究，被列入“六五”和“七五”攻关项目的子专题，在获得工业化生产菌后，又列入国家“火炬计划”。
β-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效消除谷物β-葡聚糖在酿造和饲料工业中产生的负面影响，但热稳定性和酶活力普遍较低已成为影响β-葡聚糖酶应用效果的重要因素。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效的解决现阶段β-葡聚糖酶工业用酶热稳定性差的问题，耐热性能良好的β-葡聚糖酶的产生菌。
本发明的β-葡聚糖酶的产生菌分类命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏登记号为：CGMCC No.2077，保藏日期为：2007年6月8日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。其16S rRNA基因见基因序列表。
制备方法：
1、菌株的分离
采集小麦田中的土样直接涂布初筛培养基平板50℃培养3-5天，观察透明圈生长情况，选出H/C比值较大的菌株(H/C为透明圈直径H和菌落直径C之比)，分离得纯培养，得到产耐热β-葡聚糖酶菌株W-9(自命名)。
2、菌株的发酵
将种子培养液倒入装有250ml发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200转/分，37℃发酵2天，发酵液离心，上清液即为β-葡聚糖酶酶液，置于4℃保存。
本发明的β-葡聚糖酶的产生菌所产β-葡聚糖酶酶液的最适pH6.0左右，最适温度为70℃，在温度50℃-70℃的范围内，酶活性变化不大，经60℃下处理30min后，其酶活性没有明显变化；经60℃保温1小时，剩余酶活为70％，经60℃保温5小时，剩余酶活为20％，可以在酿酒工艺中所要求的温度60℃下更好的发挥作用。该酶的耐酸性能良好，在pH 5.0-6.5之间均有较高酶活，在pH6.0范围内处理1h后酶活性维持在70％以上。这使得该酶可以在饲料工艺中更好的应用。所以该菌株W-9具有较好的耐热性能和研究价值。
附图说明
图1是本发明的菌株W9电镜照片(×15000)图；
图2是本发明的β-葡聚糖酶粗酶的标准曲线图；
图3是本发明的β-葡聚糖酶粗酶的pH曲线图；
图4是本发明的β-葡聚糖酶粗酶的温度曲线图；
图5是本发明的β-葡聚糖酶粗酶的pH耐受性曲线图；
图6是本发明的β-葡聚糖酶粗酶的温度耐受性曲线图；
本发明的微生物保藏日期为2007年6月8日，保藏单位简称CGMCC，保藏编号：CGMCC No.2077。
具体实施方式
实施例：
1、从(安宁)小麦土壤中分离得到菌株W9，直接涂布初筛培养基平板50℃培养3-5天，观察透明圈生长情况，选出H/C比值较大的菌株(H/C为透明圈直径H和菌落直径C之比)，分离得纯培养β-葡聚糖酶菌株W-9。所用筛选培养基：β-葡聚糖2.5，刚果红溶液8mL，琼脂2.0，PH自然。
2、菌株的鉴定
根据形态特征、培养特征，生理生化测定，16S rDNA序列分析进行系统的分类研究。
菌株W-9为革兰氏阳性芽孢杆菌，具有中生芽孢。在LB琼脂平板上菌落白色，边缘波状，呈不规则形，表面具有皱褶，不透明。W9生长温度范围是40～60℃，能水解淀粉、酪素、明胶，过氧化氢酶、卵磷脂酶、硝酸盐还原结果为阳性，形成吲哚、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶、酪氨酸分解结果为阴性。
W-9和其参照菌株Bacillus subtilis中某些菌株的16S rRNA序列相似性为99％。所以结合Bacillus subtilis的菌落特征、生理生化特性，确定菌株W9为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。菌株立体形态如图1所示。
3.菌株的发酵
将种子培养液倒入装有250ml发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200转/分，37℃发酵2天，发酵液离心，取上清液即为β-葡聚糖酶酶液，置于4℃保存。所用发酵培养基：燕麦1.5g，酵母膏0.5g，βH6.0，装液量20％。
4.酶活测定方法和粗酶酶学性质
4.1原理：在一定温度和PH条件下β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖，产生的还原糖可将3，5-二硝基水扬酸还原成橙色的氨基化合物，反应液颜色强度与酶活力大小成正比，而还原糖的生成量又与待测酶液的酶活力大小成正比。通过测定反应液的吸光度，从而算出待测液的β-葡聚糖酶活力。
4.2试剂和溶液：
①10.0mg/mLr葡萄糖溶液：取无水葡萄糖1.000g加水溶解后定容至100mL。
②0.05mol/l柠檬酸溶液盐酸性缓冲液：0.5mol/l的柠檬酸溶液：准确称取105.0g柠檬酸完全溶于800ml蒸馏水中，定容至1000ml，标记为A试液；0.5mol/l的柠檬酸三钠溶液：准确称取147.0g柠檬酸三钠完全溶于800ml蒸馏水中，定容至1000ml，标记为B试液。
③0.5mol/l的柠檬酸钠缓冲液：取600ml的A试液与1000ml的B试液充分混匀，标记为C试液。
④0.5mol/l的柠檬酸盐酸性缓冲液：取C试液1000ml加放到8000ml的蒸馏水中。用PH计检测其PH值，必要时用3mol/l的盐酸溶液或3mol/l的氢氧化钠溶液调PH值为4.80，再定容至1000ml，混匀后标记为0.05mol/l柠檬酸盐酸性缓冲液。同时标记PH为4.80，配制日期在4℃冰箱内保存。
⑤1.0％β-葡聚糖底物：精密称取β-葡聚糖1.000g加入适量的乙醇再加入100ml0.05mol/l的酸性缓冲液中，加热溶解直至β-葡聚糖完全溶解，待乙醇完全蒸发出后，用3mol/l盐酸溶液或3mol/l氢氧化钠溶液调PH值为4.80，再用0.05mol/l的酸性缓冲液定容在100ml的容量瓶中。标记为1.0％β-葡聚糖酸性溶液，同时标记PH为4.80，配制日期，并保存在4℃冰箱内。有效期为三天，使用前恢复到室温并摇匀。
⑥DNS试剂：溶解10.0g 3，5-二硝基水扬酸，16.0-氢氧化钠300.0g酒石酸钾钠于约700蒸馏水中，加热搅拌使完全溶解至澄清，放至常温并用蒸馏水定容至1000mL，置于棕色试剂瓶中，暗处保存一个星期后使用。
4.3测定步骤：
①标准曲线的绘制：取8支试管按下表加入试剂，稀释葡萄糖标准液，再加入3mlDNS试剂，充分混匀置沸水中煮5min，水浴冷却后，用0号试管作对归在540nm下测其他试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。标准曲线如图2所示。
②待测酶液的制备
(1)液体酶：用缓冲液稀释原酶液，使其吸光度(OD值)在0.20-0.25之间。
(2)固体酶：精密称取固体原酶粉1.000g溶于80ml蒸馏水中(稀释倍数≤100倍的直接用缓冲液溶解)，室温下磁力搅拌15min以上，用100ml容量瓶定容，离心后取清液用缓冲液稀释，使其吸光度在0.20-0.25之间。
③活力的测定
(1)取三支试管各加入0.5ml酸性(或中性)β-葡聚糖底物，与待测酶液一起在50℃水浴中预热5min。
(2)在第一，二支试管中加入0.5ml待测酶液。40℃水浴中反应15min。
(3)在三支试管中各加入3ml的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5ml的待测酶液。
(4)摇匀三支试管后，在沸水浴中煮5min。
(5)水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540nm条件下测第一，二支试管样的吸光度。吸光度以在0.20-0.25之间为宜，若不在此范围内可改变稀释倍数重做。
④酶活力的计算：
酶活力(IU/ml或IU/g)：(葡萄糖等量值/180/10/0.5)*n
式中：180指葡萄糖从微克量换算成微克分子数
15指待测液与底物的反应时间
0.5指与底物反应的稀释倍数
n指原酶液(或固体原酶)的稀释倍数
4.4粗酶酶学性质
①W-9菌株产β-葡聚糖酶的最适作用pH为6，如图3所示。
②W-9菌株产β-葡聚糖酶的最适作用温度为70℃，如图4所示。
③W-9菌株产β-葡聚糖酶有良好的pH耐受性，在pH 5.0-6.5之间均有较高酶活，在pH6.0范围内处理1h后酶活性维持在70％以上，如图5所示。
④在温度50℃-70℃的范围内，酶活性变化不大，经60℃下处理30min后，其酶活性没有明显变化；经60℃保温1小时，剩余酶活为70％，经60℃保温5小时，剩余酶活为20％。如图6所示。
基因序列表
该菌株的16S rRNA基因为：
1 GCTATACATG CAGTCGAGCG GACAGATGGG AGCTTGCTCC CTGATGTTAG CGGCGGACGG GTGAGTAACA 70
CGTGGGTAAC CTGCCTGTAA GACTGGGATA ACTCCGGGAA ACCGGGGCTA ATACCGGATG GTTGTTTGAA 141
CCGCATGGTT CAAACAT AA AGGTGGCTTN GGCTACCACT TACAGATGGA CCCGCGGCGC ATTAGCTAGT 211
TGGTGAGGTA ACGGCTCACC AAGGCNACGA TGCGTAGCCG ACCTGAGAGG GTGATCGGCC ACACTGGGAC 281
TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTAGGG AATCTTCCGC AATGGACGAA AGTCTGACGG 351
AGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGTTTTC GGATCGTAAA GCTCTGTTGT TAGGGAAGAA CAAGTACCGT 421
TCGAATAGGG CGGTACCTTG ACGGTACCTA ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT 491
AATACGTAGG TGGCAAGCGT TGTCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGGGCTCG CAGGCGGTTT CTTAAGTCTG 561
ATGTGAAAGC CCCCGGCTCA ACCGGGGAGG GTCATTGGAA ACTGGGGAAC TTGAGTGCAG AAGAGGAGAG 631
TGGAATTCCA CGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGAGATGTGG AGGAACACCA GTGGCGAAGG CGACTCTCTG 701
GTCTGTAACT GACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC 771
GTAAACGATG AGTGCTAAGT GTTAGGGGGT TTCCGCCCCT TAGTGCTGCA GCTAACGCAT TAAGCACTCC 841
GCCTGGGGAG TACGGTCGCA AGACTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT 911
GTGGTTTAAT TCGAAGCAAC GCGAAGAACC TTACCAGGTC TTGACATCCT CTGACAATCC TAGAGATAGG 981
ACGTCCCCTT CGGGGGCAGA GTGACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT 1051
TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTGATC TTAGTTGCCA GCATTCAGTT GGGCACTCTA AGGTGACTGC 1121
CGGTGACAAA CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACG 1191
TGCTACAATG GACAGAACAA AGGGCAGCGA AACCGCGAGG TTAAGCCAAT CCCACAAATC TGTTCTCAGT 1261
TCGGATCGCA GTCTGCAACT CGACTGCGTG AAGCTGGAAT CGCTAGTAAT CGCGGATCAG CATGCCGCGG 1331
TGAATACGTT CCCGGGCCTT GTACACACCG CCCGTCACAC CACGAGAGTT TGTAACACCC GAAGTCGGTG 1401
AGGTAACCTT TTAGGAGCCA GCCGCCGAAG GTGGGACAGA TGATTGGGGT GAAGTCGTAA CAAG。
Claims (1)
1.一种β-葡聚糖酶的产生菌，其特征在于β-葡聚糖酶的产生菌分类命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏登记号为：CGMCC No.2077。
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