CN106011113A - 一种海洋芽孢杆菌产生的β-葡聚糖酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种海洋芽孢杆菌产生的β‑葡聚糖酶及其制备方法，属于海洋微生物和酶制剂领域，所述β‑葡聚糖酶由海洋芽孢杆菌N6‑2产生，分子量为24kDa，本发明所述的β‑葡聚糖酶具有较高的酶活力，且热稳定性和pH稳定性较好，在酿酒工业、工业废水处理、功能性食品的开发及饲料应用方面具有广阔的开发潜力和应用前景。

Description

一种海洋芽孢杆菌产生的β-葡聚糖酶及其制备方法
技术领域
本发明属于海洋微生物和酶制剂领域，具体涉及一种海洋芽孢杆菌产生的β-葡聚糖酶及其制备方法。
背景技术
β-葡聚糖酶是一类能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶，可应用于啤酒生产中。大麦胚乳细胞壁的主要成分是β-葡聚糖，该酶能降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷链，使之降解为小分子，失去亲水性，降低粘性，从而疏松大麦胚乳细胞壁，提高大麦利用率，使麦芽汁粘度降低，大大缩短麦芽汁和啤酒的过滤时间，增加啤酒产量，改善啤酒的质量。在以大麦、小麦、黑麦、燕麦等谷物为畜禽的饲料中含有大量的β-葡聚糖，由于动物(少数反刍动物除外)体内没有消化β-葡聚糖的酶，β-葡聚糖作为一种非淀粉粘性多糖，在肠道内具有较高的粘度，阻止营养物质的吸收，降低了饲料的营养价值。β-葡聚糖酶应用于饲料中，大大提高了饲料的利用率。纤维寡糖具有调节肠道微生物菌群作用，是一种功能性寡糖，由于它不易使血糖浓度升高，可作为糖尿病患者的甜昧剂等。目前制备功能性寡糖的方法有酶水解法、酶合成转化法、酸水解法、碱转化法及化学合成法等。但酸水解法、化学合成法等工艺操作复杂、耗能大，产率低，难于实现生产规模化；而采用β-葡聚糖酶水解小麦秸秆生产功能性寡糖，操作工艺简便，可大大降低生产成本，提高小麦秸秆的利用率，减少生物质资源的浪费，减少由于秸秆焚烧带来的空气污染问题，具有较大的社会经济价值和环境价值。含有大量β-1,3-葡聚糖的酿酒酵母自溶性残渣多作为工业废物或以 低廉的价格作为饲料销售，造成了很大的资源浪费和环境污染。利用β-葡聚糖酶处理使葡聚糖水解为寡糖或还原糖，可提高其水溶性，且反应条件温和，无毒安全，避免了使用酸碱、机械等方法破壁带来的污染、产物失活等问题。谷氨酸菌体是一种单细胞蛋白，味精厂的发酵废液中含有大量的谷氨酸菌体，造成严重的环境污染且浪费了大量的蛋白质，利用蛋白酶和β-葡聚糖酶水解蛋白质，反应条件温和，能耗低，副反应少，可获得复合氨基酸水解液，又减少了化学法带来的环境污染问题。真菌细胞壁多糖主要由几丁质(甲壳质)、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等构成，β-葡聚糖酶可以水解真菌细胞壁，可以在生物防治中对植物病原真菌产生拮抗作用，在生物防治中具有重要的意义。孙维国等利用李氏木霉作为菌种，以微晶纤维素、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸铵和碳酸钙为原料，进行液体深层发酵生产β-葡聚糖酶，极大的降低了生产成本，产品主原料成本降低83.3％(申请公布号：CN101993865A)。江正强等利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TT-68(保藏编号为CGMCC No.3340)通过摇瓶发酵培养，产酶水平为430-3000U/mL；进行5L发酵罐扩大培养30h，酶活可达到2500-5000U/mL(申请公布号：CN101845423A)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种海洋芽孢杆菌产生的β-葡聚糖酶及其制备方法。
本发明还提供一种β-葡聚糖酶，该β-葡聚糖酶由海洋芽孢杆菌N6-2产生，分子量为24kDa；该海洋芽孢杆菌N6-2于2014年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586，保藏地址为中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，分类命名为Bacillus sp.N6-2。
进一步，所述海洋芽孢杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶的制备方法：海洋芽孢 杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；将上述培养后的菌株按2-6％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法粗提，获得10～30kDa组分，用硫酸铵沉淀法获得硫酸铵饱和浓度在30％-65％的组分，将30％-65％的组分过Q离子交换层析柱，将穿透峰Q1脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2所产生的β-葡聚糖酶。
进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，pH6.8-7.5。
进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％，牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，矿物油0.5-1‰，pH6.8-7.5。
本发明还提供一种β-葡聚糖酶的制备方法，其具体步骤为：
(1)菌株的发酵：
取海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；
将上述培养后的菌株按4％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品。
(2)超滤截留
取海洋芽孢杆菌N6-2发酵液，在8000rpm下离心，除掉菌体与部分杂质。依次用分子量为50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、3kDa的滤膜，截留发酵液， 获得10～30kDa的组分，调节pH值至7.0；
进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，pH6.8-7.5。
进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％，牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，矿物油0.5-1‰，pH6.8-7.5。
(3)硫酸铵沉淀法粗提
取步骤(2)所述的10～30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到30％，4℃静置2h，10000rpm离心，沉淀作为杂蛋白，遗弃；取上清液，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到65％，4℃静置2h，10000rpm，离心，弃上清，取沉淀；沉淀用50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液溶解，装入3kDa透析袋，置于相同缓冲液中透析，4h、8h、12h换一次缓冲液，既得到硫酸铵饱和浓度在30％-65％的组分。
(4)Q离子交换层析
取步骤(3)所述的硫酸铵饱和浓度30％-65％的组分，过Q离子交换层析柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，每次上样量为5-20mL，洗脱液为含1mol/L NaCl的上样Tris-HCl缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集穿透峰Q1，脱盐后真空冷冻干燥保存；
进一步，上述步骤(4)中的上样缓冲液优选为50mmol/L，pH7.96。
进一步，上述步骤(4)中每次上样量优选为5mL。
(5)CM离子交换层析
取步骤(4)中收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为 20-60mmol/L的pH6.0-9.0氢氧化钠甘氨酸缓冲液(NaOH-Glycine)，每次上样量为1-10mL洗脱液为含1mol/L NaCl的氢氧化钠甘氨酸上样缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2所产生的β-葡聚糖酶。
进一步，上述步骤(5)中的上样缓冲液优选为25mmol/L，pH9.0；
进一步，上述步骤(5)中每次上样量优选为2mL。
本发明还涉及该酶在工业中的应用，如酿酒工业，工业废水处理等。本发明还涉及该酶在食品行业中的应用，如魔芋等饮品的制备。本发明还涉及该酶在饲料方面的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明制取的β-葡聚糖酶纯度高，分子量明确，克服了以往制备方法中纯度不高的缺点，酶活力高，具有良好的热稳定性，在60℃水浴保温1h后酶活力保持在64.54％，在50℃水浴中保温1h后相对酶活力保持在87.12％，30-50℃范围内酶活力保持在80％以上，温度适用范围广，易存储。最适PH为6.0属于酸性酶，PH稳定性较好，PH＝4时相对酶活力为82.42％，PH＝11时相对酶活力为77.81％。最适PH范围与动物肠道PH范围吻合，在饲料方面具有广阔应用前景。MnCl2对β-葡聚糖酶的活性具有明显的促进作用，相对酶活可以达到155.45％。而CuCl2、CaCl2对β-葡聚糖酶的活性具有较弱的抑制作用相对酶活力分别为85.99％和95.47％，这与一般β-葡聚糖酶特性明显不同，特别适用于处理工业废水，如Mn2+含量比较高的谷氨酸发酵废液等。
附图说明
图1.海洋芽孢杆菌N6-2的系统发育树；
图2.SDS-PAGE检测该β-葡聚糖酶的纯度；
图3.海洋芽孢杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶质谱图；
图4.温度对酶活力的影响；
图5.温度对酶稳定性的影响；
图6.pH对酶活力的影响；
图7.pH对酶稳定性的影响；
图8.金属离子对酶活力的影响。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施例任何形式的限制。
实施例1菌株N6-2的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析
(1)形态特征
革兰氏染色结果显示，菌株N6-2为革兰氏阴性菌，且具有明显的芽孢，菌体形态呈现短杆棒状，多是有两个菌体相连。菌落特征为白色或者是乳黄白色，表面光滑，有突起。扫描电镜图片显示，菌株N6-2呈现短杆棒状，菌体表面光滑，两端呈现突起，部分刚分裂的菌体呈现大豆状，大部分菌体处于二分裂状态，两个菌体相连，且中间凹陷，连接处细长，菌体间有粘膜产生。单个菌体的大小为宽：0.9-1.5μm，长：1-3.7μm。
(2)生理生化反应特征
由于该菌为革兰氏阴性菌，故可以用API 20E细菌鉴定系统进行生理生化分析。结果见表1。
表1.菌株N6-2的生理生化鉴定结果
注：“-”表阴性；“+”表示阳性
API 20E结果显示阳性：柠檬酸钠利用、色氨酸水解、Kohn明胶水解、发酵利用阳性：蔗糖产酸，氧化酶反应。
(3)16S rDNA序列分析
吸取1.5mL的处于对数生长期的N6-2菌液，4℃，10000rpm，离心10min。弃上清液，加入400μL的TE缓冲液，用枪头将沉淀吹打均匀，加入10μL的溶菌酶，混合均匀，置于37℃水浴中90min，4℃，10000rpm，离心10min，保留上清即为DNA溶液。
采用16S rDNA通用引物，由上海生工生物工程合成。正向引物：27F5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’，反向引物：1492R 5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’；16S rDNA序列的PCR条件是：95℃预变性5min；95℃变性40s，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环30次，72℃延伸10min。 PCR反应体系是：反应体系：25μL，模板DNA：0.5μL，上游引物：2μL，下游引物：2μL，10X easy tap buffer：5μL，dNTP：4μL，Easy tap DNA polymerase：0.5μL，双蒸水：11μL。
用1.5％的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，以D2000Marker为标准分子量对照试剂。菌株N6-2的16S rDNA PCR产物送到北京华大基因进行测序。序列见SEQ1，测得菌株N6-2的16S rDNA序列长度为1409bp。
将菌株N6-2的16S rDNA序列在NCBI的核酸数据库中通过BLAST进行分析。通过MEGA6软件Neighbor-joining选项绘制发育树：BLAST重复1000次，选择模型核酸p-distance，得到结果如图1所示。
下载与实验菌株亲缘关系较近的序列，用BioEdit软件进行多序列对比，与菌株N6-2的16S rDNA序列(1409bp)相似性比较高的菌株为Bacillus safensis strain FO-036b(T)(99.72％)、Bacillus pumilus ATCC 7061(T)(99.65％)、Bacillus altitudinis 41KF2b(T)(99.29％)通过《常见细菌系统鉴定手册》，可以确定为芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，且相似性最高的是沙福芽孢杆菌，可能是属于沙福芽孢杆菌的变种，是一种新的芽孢杆菌的变种，命名为Bacillus sp.N6-2。该图也证明了Bacillus sp.N6-2的系统学地位。
实施例2海洋芽孢杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶的分离纯化
(1)菌株的发酵：
取海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在28℃的摇床中150rpm，培养28h；将上述培养后的菌株按4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，28℃，150rpm摇床培养80h；取菌株发酵液，离心，去掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在7.0，即为粗制发酵样品。
(2)超滤截留：
取海洋芽孢杆菌N6-2发酵液，在8000rpm下离心，除掉菌体与部分杂质。依次用分子量为50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、3kDa的滤膜，截留发酵液，将发酵液分成3～5kDa、5～10kDa、10～30kDa、30～50kDa的组分，电泳检测。
(3)硫酸铵沉淀法浓缩：
取步骤(2)所述的10～30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到30％，4℃静置2h,10000rpm,离心10min,沉淀作为杂蛋白，遗弃，取上清取，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到65％，4℃静置2h，10000rpm，离心10min，取沉淀，弃上清。沉淀用50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液溶解，装入3kDa透析袋，置于相同缓冲液中透析，4h，8h，12h换一次等浓度缓冲液，既获得硫酸铵饱和浓度在30％-65％的组分。
(4)离子交换色谱法提取β-葡聚糖酶
1.Q离子交换层析
取步骤(3)所述的硫酸铵饱和浓度30％-65％的组分，过Q离子交换层析柱，上样缓冲液为50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，每次上样量为5mL，洗脱液为含1mol/L NaCl的Tris-HCl上样缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集各峰，将穿透Q1组分脱盐后真空冷冻干燥保存；
2.CM离子交换层析
取收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为25mmol/L的pH9.0氢氧化钠甘氨酸缓冲液(NaOH-Glycine)，每次上样量2mL，洗脱液为含1mol/L NaCl的氢氧化钠甘氨酸上样缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集各峰，将穿透峰C1组分脱盐后真空冷冻干燥保 存，即为海洋芽孢杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶。
实施例3海洋芽孢杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶的纯度检测
1.Protein-PAK TM 60疏水性的蛋白分析柱检测纯度
取经CM柱收集的穿透峰C1，过Protein-PAK TM 60疏水性蛋白分析柱，上样量为1μL，流动相为水，峰图结果显示为单一峰。
2.SDS-PAGE电泳检测β-葡聚糖酶的纯度
基于现有SDS-PAGE技术，将超滤膜截留(1号样品)、硫酸铵沉淀30％-65％(2号样品)、CM离子交换峰C1(3，4号样品)、Q离子交换穿透峰Q1(5号样品)进行12％的SDS-PAGE凝胶电泳检测。红框显示就是海洋芽孢杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶。见图2。
实施例4ESI质谱检测β-葡聚糖酶的分子量
将穿透峰C1水溶液通过ColeParmer 74900注射泵打入ESI-MS进行分析。(此实验由中国科学院青岛生物能源与过程研究所协助完成)检测结果显示海洋芽孢杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶的分子量是24kDa。见图3。
实施例5β-葡聚糖酶活性测定
1.酶活力单位定义(U/mL):在40℃和pH6.0条件下,1min从β-葡聚糖溶液中分解产生1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位。
2.葡萄糖标准曲线的绘制:配制0、0.5、1、2、3、4、5、6、7mg/mL的葡萄糖溶液，向每只试管中加入1.7mL的葡萄糖溶液，在每支试管中加入3mL DNS试剂,于沸水中煮10min。每管中加蒸馏水定容到25mL混匀,用空白管调零点,于550nm处进行比色测定,记录OD550,以葡萄糖(mg)为横坐标,以OD550为纵坐标绘制出标准曲线。
2.酶活力测定体系:设置1个空白组，1个反应组,向反应组试管中加入 1.5mL10mg/mL的β-葡聚糖溶液,40℃水浴预热5min，加入0.2mL适当稀释后的酶液,空白组加入1.5mL10mg/mL的β-葡聚糖溶液,40℃水浴预热5min后加入0.2mL适当稀释后灭活酶液。40℃水浴反应15min后加入3mL DNS试剂终止反应,于沸水中煮10min。每管中加蒸馏水定容到25mL混匀,以空白调零,在550nm处进行比色测定。
3.实验测得该β-葡聚糖酶的酶活力为：13.3U/mL。
实施例6β-葡聚糖酶特性研究
1.最适温度：在试管中加入1.5mL 1.0％的pH＝6.0的β-葡聚糖底物，然后加入适当稀释后的酶液200μL分别在20、30、40、50、60、70、80、90℃水浴条件下反应15.0min测定酶活。结果见图4，该酶最适温度为40℃。
2.热稳定性：酶液分别在0、30、40、45、50、60、65、70、75、80℃水浴中保温60min立即冰浴，分别取β-葡聚糖底物1.5mL，加入经不同温度处理后的酶液200μL,40℃水浴15min，测定酶活。结果见图5，该酶在60℃以下具有良好的热稳定性。60℃时酶活力保持在64.54％，在50℃时相对酶活力保持在87.12％。
3.最适pH：配置pH为2、3、4、5、6、7、8的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液和pH为9的氢氧化钠-甘氨酸缓冲液，并用上述缓冲液分别配1.0％的β-葡聚糖溶液，取底物1.5mL,适当稀释后的酶液200μL，分别在40℃水浴条件下反应15.0min测定酶活。结果见图6，该酶的最适pH为6。
4.pH稳定性：配置pH为2、3、4、5、6、7、8的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液和pH为9、10、11、12的氢氧化钠-甘氨酸缓冲液，用上述不同的pH缓冲液在室温条件下处理酶1h，取β-葡聚糖底物1.5mL，加入经上述缓冲液处理后的酶液200μL，分别在40℃水浴条件下反应15.0min测定酶活。结果见图7， 该酶在pH＝4-11之间具有良好的pH稳定性。pH＝4时相对酶活力为82.42％，pH＝11时相对酶活力为77.81％。
5.金属离子的影响：在试管中加入1.5ml 1.0％的β-葡聚糖底物(pH＝6.0)，分别加入200μL含50.0mmol/L化合物的酶液使各反应体系中各化合物终浓度分别为5.8mmol/L，40℃水浴下反应15.0min，以蒸馏水作对照测定各金属离子对β-葡聚糖酶活的影响。由图8可以看出MnCl2对β-葡聚糖酶的活性具有明显的促进作用，相对酶活可以达到155.45％。而CuCl2、CaCl2对β-葡聚糖酶的活性具有较弱的抑制作用相对酶活力分别为85.99％和95.47％。而HgCl2抑制作用最强，明显抑制β-葡聚糖酶的酶活。ZnCl2、FeCl3具有一定的抑制作用相对酶活力分别为54.52％和21.24％。
综上所述，该β-葡聚糖酶具有较高的酶活力，且热稳定性和pH稳定性较好，在酿酒工业、工业废水处理、功能性食品的开发及饲料应用方面具有广阔的开发潜力和应用前景。

Claims (9)

1.一种β-葡聚糖酶，其特征在于所述β-葡聚糖酶由海洋芽孢杆菌N6-2产生，分子量为24kDa，所述的海洋芽孢杆菌N6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2014586，所述β-葡聚糖酶的制备方法：将海洋芽孢杆菌N6-2菌株接种于含有种子培养基的试管中，在15-36℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；将上述培养后的菌株按2-6％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法粗提，获得10～30kDa组分，用硫酸铵沉淀法获得硫酸铵饱和浓度在30％-65％(g/ml)的组分，将30％-65％(g/ml)的组分过Q离子交换层析柱，将穿透峰Q1脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2所产生的β-葡聚糖酶。
2.根据权利要求1所述β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的种子培养基的成分及质量体积比：牛肉膏0.2-0.8％、蛋白胨1-2％、氯化钠0.3-1％，pH6.8-7.5。
3.根据权利要求1所述β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％(质量体积比)、牛肉膏0.2-0.8％(质量体积比)、蛋白胨1-2％(质量体积比)、氯化钠0.3-1％(质量体积比)，矿物油0.5-1‰(v/v)，pH6.8-7.5。
4.权利要求1所述β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于它的具体步骤为：
(1)菌株的发酵：
取海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36℃的摇床中100-300rpm，培养25-30h；
将上述培养后的菌株按4％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品。
(2)超滤截留
取海洋芽孢杆菌N6-2发酵液，在8000rpm下离心，除掉菌体与部分杂质。依次用分子量为50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、3kDa的滤膜，截留发酵液，获得10～30kDa的组分，调节pH值至7.0；
所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％(质量体积比)，蛋白胨1-2％(质量体积比)，氯化钠0.3-1％(质量体积比)，pH6.8-7.5。
所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％(质量体积比)，牛肉膏0.2-0.8％(质量体积比)，蛋白胨1-2％(质量体积比)，氯化钠0.3-1％(质量体积比)，矿物油0.5-1‰(v/v)，pH6.8-7.5。
(3)硫酸铵沉淀法粗提
取步骤(2)所述的10～30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到30％(g/ml)，4℃静置2h，10000rpm离心，沉淀作为杂蛋白，遗弃；取上清取，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到65％(g/ml)，4℃静置2h，10000rpm，离心，弃上清，取沉淀；沉淀用50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液溶解，装入3kDa透析袋，置于相同缓冲液中透析，4h、8h、12h换一次缓冲液，既得到硫酸铵饱和浓度在30％-65％(g/ml)的组分。
(4)Q离子交换层析
取步骤(3)所述的硫酸铵饱和浓度30％-65％(g/ml)的组分，过Q离子交换层析柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，每次上样量为5-20mL，洗脱液为含1mol/L NaCl的上样Tris-HCl缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集穿透峰Q1，脱盐后真空冷冻干燥保存；
上述步骤中的上样缓冲液为50mmol/L，pH7.96。
上述步骤中每次上样量为5mL。
(5)CM离子交换层析
取步骤(4)中收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-9.0氢氧化钠甘氨酸缓冲液,每次上样量为1-10mL洗脱液为含1mol/L NaCl的氢氧化钠甘氨酸上样缓冲液，洗脱液以100％(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2所产生的β-葡聚糖酶。
上述步骤中的上样缓冲液为25mmol/L，pH9.0；
上述步骤中每次上样量为2mL。
5.权利要求1所述β-葡聚糖酶在工业中的应用。
6.权利要求1所述β-葡聚糖酶在酿酒工业和工业废水处理中的应用。
7.权利要求1所述β-葡聚糖酶在食品行业中的应用。
8.权利要求1所述β-葡聚糖酶在制备魔芋等饮品中的应用。
9.权利要求1所述β-葡聚糖酶在饲料加工中的应用。
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