CN105671022A - 一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体 - Google Patents

一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明将特基拉芽孢杆菌(Bacillus？terquilensis)CGX？5-1来源的1,3-1,4-β-葡聚糖酶的第40位的丝氨酸和43位的丝氨酸、46位的谷氨酸和205位的组氨酸通过迭代饱和突变的方法分别突变为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸和脯氨酸，最终获得四株单突变体和三株复合突变体。七株突变酶均表现出了更好的热稳定性，尤其是S40E/S43E/E46P/H205P突变酶具有极佳的热稳定性。这些突变酶和野生酶相比更有利于其在工业上的应用。

Description

一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体
技术领域
本发明涉及一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
β-葡聚糖是存在于禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖。其是由高达上千个β-D-葡萄糖残基通过β-1,3或β-1,4糖苷键线状排列而成，具有很高的分子量。其可以溶解于水中，形成的溶液黏度很高，这给啤酒行业及饲料行业带来了诸多不利。在啤酒工业的主要原料麦芽中含有大量β-葡聚糖，在麦汁中β-葡聚糖未能及时降解会导致麦汁黏度过大，造成过滤困难，延长麦醪过滤时间，降低浸出物含量，对于成品啤酒会影响其非生物稳定性。在纯生啤酒的生产过程时，过多β-葡聚糖的存在会造成滤膜的膜孔堵塞，导致过滤能力下降。在饲料行业中，大麦和小麦等饲料中含有大量的β-葡聚糖。无论在人的肠道还是动物的肠道内都不能将β-葡聚糖直接消化吸收，其必须经过酶降解后才能被利用，且β-葡聚糖会阻止饲料有效成分在动物肠道中内的吸收，降低了饲料中有效成分的转化率，是一种抗营养因子。与此同时，β-葡聚糖为微生物特别是致病菌的寄居繁殖提供了丰富的营养，造成大量有害微生物在动物肠道内繁殖，引起畜禽腹泻，同时会竞争性消耗大量物质而降低饲料利用率。
来源于特基拉芽孢杆菌(Bacillusterquilensis)CGX5-1的1,3-1,4-β-葡聚糖酶，简称β-葡聚糖酶。1,3-1,4-β-葡聚糖酶可以在3-O-吡喃葡萄糖位点专一性切割β-葡聚糖，最终产物为三糖和四糖。然而，现有的β-葡聚糖酶的热稳定性并不满足目前的工业应用。在啤酒行业麦汁糖化过程中温度是从48℃提高至78℃，而饲料行业中烘焙的温度也在65℃以上。而目前筛选得到的大部分野生1,3-1,4-β-葡聚糖酶的最适温度主要集中在45℃和55℃，而催化活性不高也是其不能推广使用的重要原因。而目前市场上几家酶制剂公司如诺维信、DMS研发生产的β-葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产β-葡聚糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且β-葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。因此，如果能够提高野生型1,3-1,4-β-葡聚糖酶的催化活性及热稳定性，获得高活性高热稳定的β-葡聚糖酶，那么就可以降低成本，推广其在工业上的应用。
为了提高1,3-1,4-β-葡聚糖酶的热稳定性，国内外已经对其已经进行了一系列研究。对β-葡聚糖酶的杂交结果显示，将浸麻芽孢杆菌(B.macerans)来源的前16个氨基酸替换为淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)来源的前16个氨基酸得到的杂交酶H(A16-M)和两者之间前12个氨基酸进行替换及删除TYR13形成的杂交酶H(A12-M)-△13在高温下有很好的稳定性。GLN1、THR2、SER5和PHE7位点的突变大幅度的降低了β-葡聚糖酶的热稳定性。这说明β-葡聚糖酶的N端对于该酶的热稳定性有重要的影响。而钙离子对于在高温下维持β-葡聚糖酶的稳定性也有重要作用。针对β-葡聚糖酶中多个赖氨酸进行定点突变研究发现当其中3个赖氨酸突变为丝氨酸得到的三突变酶(BglTM)的热稳定性和催化活力都有了一定程度的提升。在β-葡聚糖酶三维结构中添加N31C-T187C和P102C-N125C两个二硫键也提高了β-葡聚糖酶的热稳定性。但是目前得到的改造酶BglTM的热稳定性依旧不能适应工业应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，尤其是一种具有更高热稳定性的1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体。
所述1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示。分别是S40E、S43E、E46P、H205P、E46P/S43E、E46P/S43E/H205P、E46P/S43E/H205P/S40E。
所述S40E，是在亲本BglTM的基础上，将第40位的丝氨酸突变为谷氨酸而得到的。
所述S43E，是在亲本BglTM的基础上，将第43位的丝氨酸突变为谷氨酸而得到的。
所述E46P，是在亲本BglTM的基础上，将第46位的谷氨酸突变为脯氨酸而得到的。
所述H205P，是在亲本BglTM的基础上，将第205位的组氨酸突变为脯氨酸而得到的。
所述E46P/S43E，是在突变体E46P的基础上，将第43位的丝氨酸突变为谷氨酸而得到的。
所述E46P/S43E/H205P，是在突变体E46P/S43E的基础上，将第205位的组氨酸突变为脯氨酸而得到的。
所述E46P/S43E/H205P/S40E，是在突变体E46P/S43E/H205P的基础上，将第40位的丝氨酸突变为谷氨酸而得到的。
本发明还要求保护含有编码所述突变体的基因的载体，以及表达所述突变体的基因工程菌。
所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，以pET28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
所述宿主，在本发明的一种实施方式中，为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了一种所述基因工程菌的构建方法。
本发明还要求保护所述突变体在食品、饲料领域的应用。
本发明的突变体命名，是以亲本氨基酸序列为基准，采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。比如S40E代表将位置40的氨基酸由亲本的丝氨酸S替换为谷氨酸E，又比如E46P/S43E/H205P/S40E代表第46位、第43位、第205位和第40位的氨基酸同时发生了突变，分别从谷氨酸、丝氨酸、组氨酸和丝氨酸突变为脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸和谷氨酸。
本发明的有益效果：本发明提供的几株β-葡聚糖酶突变体，与野生酶相比，其热稳定性有了大幅度提升。突变体S40E、S43E、E46P、H205P、E46P/S43E、E46P/S43E/H205P、E46P/S43E/H205P/S40E在70℃温浴1小时后剩余酶活力分别为14.8％、21.3％、26.7％、17.9％、34.3％、46.9％和59.4％，而野生酶经过同样处理后剩余酶活仅为6.3％(图1)。突变体E46P/S43E/H205P/S40E的最适温度和T50值分别为65℃和79.5℃，和野生酶相比分别提高了5℃和3.5℃。其在60℃和70℃下的半衰期分别达到126.4分钟和80.4分钟，分别是野生酶的2.14倍和2.89倍。突变体E46P/S43E/H205P/S40E的最适pH为pH6.0，和野生酶相比降低了0.5个pH，而突变体的催化性质和野生酶几乎相同。本发明的突变体，在保证催化活性的同时使得β-葡聚糖酶的热稳定性有所提高，更有利于在工业上的应用。
附图说明
图1：野生酶与7株β-葡聚糖酶突变体在70℃下处理1小时剩余酶活比较
图2：野生酶与β-葡聚糖酶突变体E46P/S43E/H205P/S40E的最适温度曲线
图3：野生酶与β-葡聚糖酶突变体E46P/S43E/H205P/S40E在60℃的半衰期比较
图4：野生酶与β-葡聚糖酶突变体E46P/S43E/H205P/S40E在70℃的半衰期比较
图5：野生酶与β-葡聚糖酶突变体E46P/S43E/H205P/S40E的T50值曲线比较
具体实施方式
实施例1β-葡聚糖酶的迭代饱和突变
在40、43、46和205四个位点进行迭代饱和突变并测定了突变体的热稳定性参数。以质粒pET28a(+)-BglTM(NiuC,ZhuL,ZhuP,LiQ.2015.Lysine-BasedSite-DirectedMutagenesisIncreasedRigidβ-SheetStructureandThermostabilityofMesophilic1,3–1,4-β-Glucanase.JournalofAgriculturalandFoodChemistry63:5249-5256)为模板，在40位、43位、46位和205位通过Quickchange的方法引入NNK简并密码子(N:Ade/Cyt/Gua/Thy；K:Gua/Thy)来替代目的氨基酸。
在40位引入NNK简并密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-cgtggcgggctaataacgtaNNKatgacgtcattgggtgaaatgc-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-gcatttcacccaatgacgtcatMNNtacgttattagcccgccacg-3’,大写字母为突变碱基；
在43位引入NNK简并密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-gctaataacgtatcaatgacgNNKttgggtgaaatgcgtttagcgctaa-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-ttagcgctaaacgcatttcacccaaMNNcgtcattgatacgttattagc-3’,大写字母为突变碱基；
在46位引入NNK简并密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-gtatcaatgacgtcattgggtNNKatgcgtttagcgctaacaagc-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-gcttgttagcgctaaacgcatMNNacccaatgacgtcattgatac-3’,大写字母为突变碱基；
在205位引入NNK简并密码子的定点突变引物为：
正向引物：5’-ggtgtaaatccgctatacgctNNKtatgactgggtgcgctatacaa-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-ttgtatagcgcacccagtcataMNNagcgtatagcggatttacacc-3’,大写字母为突变碱基；
Quickchange法重叠延伸PCR具体实施条件如下：
PCR反应体系均为：2×PhantaMaxBuffer25μL，dNTPMix1μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA1μL，Max聚合酶1μL，双蒸水补齐至50μL；
PCR反应扩增条件：94℃预变性5min；随后进行94℃1min，56℃50s，72℃50s30个循环；最后保存在4℃。
在上述通过PCR扩增得到的片段中加入限制性内切酶DpnI，置于37℃金属浴中温浴30分钟进行酶切消化，将体系置于80℃金属浴中温浴30分钟灭酶。最后将酶切后的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
实施例2高热稳β-葡聚糖酶的诱导、表达及筛选
(1)β-葡聚糖酶的诱导及表达
从平板挑取单菌落接入含有250μLLB培养基(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)的96孔板中。每孔对应一特定转化子且在每块96孔板中均接种一野生型克隆作为阴性对照。将得到的96孔板置于摇床中于37℃，200rpm条件下培养11-12个小时。用排式移液器吸取20μL培养得到的菌液转移进入含250μL新鲜LB培养基的96孔板中，剩余的菌液置于4℃临时保藏。在37℃，200rpm条件下培养4小时后，在每个孔中分别加入终浓度为0.06mM和8mM的IPTG和α-乳糖并将培养温度降低至24℃继续培养6个小时。通过酶标仪测定所得菌液的OD600值后将96孔板置于离心机中于4℃下4000rpm离心10分钟，收集上清液，置于4℃保藏。在第一轮饱和突变后获得4个突变体文库后，以其中最优突变体作为模板，在热稳定性其次的位点进行第二轮饱和突变。依次类推，直到第四轮最后获得4个位点的最佳突变酶。
(2)高热稳β-葡聚糖酶的筛选
对β-葡聚糖酶的高通量筛选主要分为两轮进行。在第一轮中测定96孔板中诱导得到的突变体的催化活性。用排式移液器取20μL突变体上清液于一块新96孔板中，并加入40℃预热的蓝葡聚糖底物溶液(蓝葡聚糖底物与20mM磷酸缓冲液以1:19比例混合)80μL充分混合后置于40℃下温浴10分钟。在每孔中加入300μL沉淀液终止反应，利用离心机于4000rpm离心5分钟后，取上清在590nm处测定吸光度值。在这一轮中，催化活性远低于野生型酶的突变体中被首先排除。在第二轮中，以孔一一对应的原则采用排式移液器移取适量发酵得到的上清液至新的96孔板中，并将96孔板加热至70℃保温1小时后置于冰上降温。在热处理之后，采用上述酶活测定方法测定突变体的剩余酶活。突变体的相对酶活采用U剩余酶活/U原始酶活来表示。从中选取相对酶活值最高的突变株作为最优突变体，从4℃保藏的96孔板对应的孔中接取相对应突变体于新鲜LB培养基中进行培养并提取质粒进行测序，同时将对应菌株进行斜面保藏。
(3)突变体的表达与纯化
为了进一步验证所获得的突变体的催化性质和热稳定性和野生型酶相比有所提升，在平板上挑取含上述重组质粒的大肠杆菌单菌落于含100μg/mL硫酸卡纳霉素的LB液体培养基，37℃200rpm培养10-12h，按4％接种量转接至含100μg/mL硫酸卡纳霉素的TB液体培养基。重组菌在37℃200rpm培养至OD600约为1.0，加入0.06mM终浓度IPTG和和8mM终浓度α-乳糖诱导表达，并在24℃150rpm下培养6h。将表达后的菌液在4℃、9000rpm离心20min，弃菌体收集上清。将获得的上清液加入Ni-NTA亲和层析柱，上样后使用1×BindingBuffer洗脱直至吸光值平稳，分别加入50mM、100mM及250mM终浓度的咪唑溶液洗脱目的蛋白。通过酶活测定和SDS-PAGE分析，发现突变酶主要出现在100mM咪唑洗脱液中，且条带单一。将含有目的蛋白的洗脱液通过GEPD-10脱盐柱，使用20mM磷酸缓冲液(pH6.5)洗下目的蛋白。之后使用蛋白超滤离心管浓缩，从而得到纯酶。
实施例3酶活及蛋白浓度分析
(1)酶活测定方法：
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法及改良AZO测定方法相结合测定β-葡聚糖酶活力的方法：
酶活定义：1mL酶液在40℃和pH值为6.5条件下，每分钟水解β-葡聚糖生成相当于1μmol的葡萄糖还原物质的量为1个酶活力单位，以U/mL表示。
发酵清液酶活力测定：发酵液经过离心后，将上清液稀释适当倍数，测定其酶活力。
葡萄糖标准曲线的绘制：分别吸取1％葡萄糖标准溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，制成每毫升分别含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200μg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5mL于试管中，加入pH6.5磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液1.5mL，再加入DNS试剂3.0mL，于沸水浴中煮沸7min，取出后迅速冷却至室温后加入蒸馏水10mL，摇匀。以蒸馏水0.5mL代替葡萄糖稀标准液作为对照，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
样品酶活测定：精确吸取待测稀释酶液0.5mL(每个样品3支平行试管)，及pH6.5磷酸二氢钠－磷酸氢二钠缓冲液1.0mL，置于40℃水浴预热5min，加入经预热的1.0％β-葡聚糖溶液0.5mL，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min，立即加入3.0mlDNS液终止反应，然后置于沸水浴中7min，取出迅速冷却后加入10mL去离子水，摇匀后，测定550nm下的反应液的吸光值。同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测稀释酶液0.5mL，加入1.0mLpH5.0磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液，然后先加入3.0mLDNS液使酶失活，40℃水浴预热，再加入同样经预热的1.0％β-葡聚糖溶液0.5mL，40℃水浴10min，然后置于沸水浴中7min，以后步骤同于样品测定，由样品测定时得到吸光值，根据标准曲线即可得到相应的酶活力单位。
(2)蛋白浓度测定：
Bradford法测定溶液中蛋白浓度的方法：
取200μL待测样品加入2mLBradford试剂，混匀后迅速在595nm下测定吸光值，空白为pH6.5磷酸盐缓冲液。每组样品三个平行，所得吸光值对照标准曲线方程y＝0.0042x+0.0082可得溶液中的蛋白浓度。
(3)催化性质比较：实验结果列于表1、图1。将野生酶制品和E46P/S43E/H205P/S40E突变体相比，可以发现，突变酶的比活力和野生酶相比相差不大，仅有小量提升。而突变体的Km值、Kcat值和Kcat/Km值和几乎和野生酶相同。
表1野生酶与β-葡聚糖酶E46P/S43E/H205P/S40E突变体的催化性质比较
实施例4野生酶和突变酶的热稳定性
(1)野生酶和突变酶的最适温度测定方法：
取获得的酶制品100μL，分别于不同温度(35、40、45、50、55、，60、65、70℃)测定酶活力。以酶活最大值作为100％相对酶活，其他温度下的酶活值除以最大值所得百分数即为该温度下的相对酶活。从图2可以看出，野生酶的最适温度为60℃，而E46P/S43E/H205P/S40E突变体的最适温度为65℃。
(2)野生酶与突变酶在60℃和70℃的半衰期测定方法：
取获得的酶制品2mL，分别于60℃和70℃处理不同时间(10-150min)，立即取出置于冰上冷却10min，将处理液稀释合理倍数后取100μL测定β-葡聚糖酶活力。以处理前发酵液酶活值作为100％相对酶活，不同处理时间下的酶活值除以最大值所得百分数即为该条件下的相对酶活。从图3和图4可以看出E46P/S43E/H205P/S40E突变体在60℃下和70℃下的半衰期分别为126.4分钟和80.4分钟，而野生酶在60℃下和70℃下的半衰期测定则分别为59分钟和27.8分钟。
(3)野生酶与突变酶的T50值测定方法：
取获得的酶制品2mL，分别于不同温度(40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)处理15min，立即取出置于冰上冷却10min，取100μL测定β葡聚糖酶活力。以酶活最大值作为100％相对酶活，其他温度下的酶活值除以最大值所得百分数即为该温度下的相对酶活。T50值定义为经过上述处理酶活降低至初始酶活一半时的温度。从图5可以看出，突变酶的失活曲线均比野生酶缓和。野生酶的T50值为76℃而E46P/S43E/H205P/S40E突变体的T50值为79.5℃。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列：a)如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示；b)或在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有1,3-1,4-β-葡聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述核苷酸序列的载体或细胞。
4.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
5.根据权利要4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pET28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.一种获得权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，将编码突变体的基因片断连接至原核表达载体并转化大肠杆菌进行表达。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，是以亲本1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因为模板，采用迭代饱和突变的方法进行突变，获得编码突变体的基因片段。
9.权利要求1所述突变体在食品、饲料领域的应用。
10.权利要求1所述突变体在降低麦汁黏度中的应用。
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