CN101528766A - 葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有葡聚糖酶例如，内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶活性或这些活性的组合的多肽，和编码所述多肽的多核苷酸。在一方面，所述葡聚糖酶活性是内切葡聚糖酶活性(例如，内切－1，4－β－D－葡聚糖4－葡聚糖水解酶活性)，并且包括水解在纤维素、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1，4－β－D－糖苷键，在混和的β－1，3葡聚糖如谷物β－D－葡聚糖或木质素葡聚糖和包含纤维素部分的其它植物材料中的β－1，4键。此外，还提供了设计新型酶的方法和使用它们的方法。在可选的方面，所述新型葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶在升高的或降低的pH和温度下具有增加的活性和稳定性，包括耐热性或热稳定性。

Description

葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
发明领域
【0001】本发明一般涉及用于食品和饲料组合物的酶；并且在可选的方面，提供了新型酶、编码这些酶的多核苷酸和这些多核苷酸和多肽的用途；并且在可选的方面，提供了多肽(例如酶、肽、抗体)，其具有葡聚糖酶活性，例如内切葡聚糖酶活性，例如催化内部内-β-1，4-和/或β-1，3-葡聚糖键的水解。一方面，内切葡聚糖酶活性(例如，内切1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)包括水解纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣聚糖中的1，4-和/或β-1，3-β-D-糖苷键，混合的β-1，3葡聚糖中的β-1，4键，例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维质部分的其它植物或有机材料中的β-1，4键。一方面，本发明的多肽具有葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性。
背景技术
【0002】内切葡聚糖酶(例如，内切-β-1，4-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4；内切-β-1，3(1)-葡聚糖酶，EC 3.2.1.6；内切-β-1，3-葡聚糖酶，EC 3.2.1.39)水解纤维素和葡聚糖中的内部β-1，4-和/或β-1，3-糖苷键，以产生较小分子量的葡萄糖和葡萄糖寡聚体。葡聚糖是由1，4-β-和/或1，3-糖苷-联接的D-吡喃型葡萄糖形成的多糖。内切葡聚糖酶具有可观的商业价值，被用在食品工业中如烘焙及水果和蔬菜加工、农业废物的分解、动物饲料的生产——例如单胃动物饲料如猪或禽类(例如鸡)饲料、纸浆和纸的生产、纺织品生产以及家用和工业清洁剂。通过真菌和细菌，生产内切葡聚糖酶。
【0003】β-葡聚糖是谷物主要的非淀粉多糖。取决于品种和生长条件，多糖的葡聚糖含量可显著变化。该多糖的物理化学性质是在氧化条件下产生粘性溶液或者甚至是凝胶。此外，葡聚糖具有高的水结合能力。所有这些特征给几个行业带来了问题，包括酿造、烘焙、动物营养。在酿造应用中，葡聚糖的存在导致麦芽汁过滤性和形成浑浊的问题。在烘焙应用中(尤其对于曲奇和脆饼)，葡聚糖可产生发粘面团，其难以进行机械加工和减小饼干尺寸。此外，这种碳水化合物参与烘焙产品的快速再水化，导致松脆性损失和缩短的货架期。对于谷物食物的单胃动物饲料应用，β-葡聚糖是消化道内容物的粘性的促成因素，并且从而负面影响饲料的可消化性和动物生长速率。对于反刍动物，这些β-葡聚糖代表纤维摄入的基本成分，而葡聚糖的更完全的消化将促进更高的饲料转化效率。期望的是动物饲料内切葡聚糖酶在动物胃中是有活性的。
【0004】内切葡聚糖酶对于消化在所有植物材料中发现的纤维素——β-1，4-联接葡聚糖——也是重要的。纤维素是自然界最丰富的多糖。消化纤维素的商业酶用于纸浆和纸工业、纺织品制造以及家用和工业清洁剂。
【0005】于此讨论的出版物被提供，仅仅因为它们的公开先于本申请的提交日期。于此没有什么可以被解释为承认本发明由于在先的发明而无权居先于这样的公开。
发明概述
【0006】一方面，本发明提供了含有本发明多肽(例如酶(例如葡聚糖酶)、肽、抗体)和/或多核苷酸的组合物(例如，饲料、药物、食品强化剂(食品补充剂)等)。这些组合物可以以各种形式加以配制，例如液体、喷剂、气溶胶、膜、胶束、脂质体、粉末、食物、饲料、添加剂、小粒、片剂、丸剂、凝胶、水凝胶、植入物或胶囊化形式。例如，本发明提供了包含本发明酶的饲料酶产品，例如用作单胃粗糙谷物饲料或食物，其中单胃动物包括禽类、猪类(swine)(猪(pig)、野猪(boar)和家养猪(hog))、绵羊、兔、鸟、马、单胃宠物和人类。一方面，包含本发明酶的饲养动物食物将增加包含酶的食品或饲料的食用价值。一方面，本发明的组合物(例如饲料、食物、药物、食品强化剂等等)可包含一种、两种、三种或更多种不同的本发明的多核苷酸；以及在一方面，本发明的组合物可包含本发明的酶与另一种本发明的多肽(例如酶、肽)或任何已知的酶的组合。
【0007】一方面，本发明的酶是耐热的和/或热稳定的；例如，在95℃2分钟后，本发明的酶能保留至少75％的剩余活性(例如葡聚糖酶活性)；以及另一方面，在95℃加热30分钟后，保留100％的活性。一方面，用于这些组合物的本发明的酶包括重组多肽，其表达在例如酵母(例如毕赤酵母属某些种(Pichia spp.)，酵母菌属某些种(Saccharomyces spp.))或细菌(例如假单胞菌属某些种(Pseudomonas spp.)，杆菌属某些种(Bacillus spp.))表达系统，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)表达系统中。
【0008】本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸，该核酸包含在至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500或更多残基的区域内与本发明的示例性核酸具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高或完全的(100％)序列同一性的核酸序列，例如：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22以及它们的变化(修饰)，如本文所述(见例如下面的表1和2)，并且所述序列包含至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多种或所有下列基于SEQ ID NO：1的变化：
在位置4至6的核苷酸是AAT或AAC，
在位置37至39的核苷酸是AAT或AAC，
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置169至171的核苷酸是GAT或GAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置181至183的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置184至186的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置187至189的核苷酸是CAT或CAC，
在位置187至189的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置205至207的核苷酸是CAT或CAC，
在位置205至207的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置205至207的核苷酸是TAT或TAC，
在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置211至213的核苷酸是GAA或GAG，
在位置211至213的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是CAA或CAG，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置211至213的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置220至222的核苷酸是GAA或GAG，
在位置220至222的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置220至222的核苷酸是ATG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置301至303的核苷酸是TAT或TAC，
在位置307至309的核苷酸是TGT或TGC，
在位置307至309的核苷酸是CAA或CAG，
在位置316至318的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置325至327的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置346至348的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置346至348的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置388至390的核苷酸是TAT或TAC，
在位置391至393的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置442至444的核苷酸是CAT或CAC，
在位置484至486的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置547至549的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置556至558的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置556至558的核苷酸是GAT或GAC，
在位置556至558的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置556至558的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置571至573的核苷酸是TGT或TGC，
在位置571至573的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置601至603的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置601至603的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置601至603的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置646至648的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置688至690的核苷酸是AAA或AAG，
在位置688至690的核苷酸是CAA或CAG，
在位置688至690的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置691至693的核苷酸是ATG，
在位置691至693的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置700至702的核苷酸是GAT或GAC，
在位置736至738的核苷酸是CAA或CAG，
在位置736至738的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TAT或TAC，
在位置784至786的核苷酸是CAT或CAC，
在位置784至786的核苷酸是ATG，
在位置784至786的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置784至786的核苷酸是CAA或CAG，
在位置808至810的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置811至813的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是TGT或TGC，
在位置826至828的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置829至831的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置868至870的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置892至894的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置892至894的核苷酸是AAT或AAC，
在位置892至894的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置892至894的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置892至894的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置898至900的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG，
在位置913至915的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置934至936的核苷酸是ATT、ATC或ATA，和/或
在位置943至945的核苷酸是ATT、ATC或ATA。
【0009】所有这些序列是本发明的示例性序列，具有“亲本”SEQ ID NO：1的具体残基变化，其概括(部分地)于下面的表1和2(实施例5中的表2)中。
【0010】一方面，本发明的核酸编码至少一种具有葡聚糖酶活性例如内切葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性或甘露聚糖酶活性的多肽或肽，或者本发明的核酸编码至少一种能够引起免疫反应的多肽或肽，例如能够引起对本发明的示例性多肽特异性的体液(抗体)或细胞免疫反应的表位。一方面，所述序列同一性通过运用了序列比较算法的分析或通过视觉观察来确定。
【0011】一方面，本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸，该核酸包含SEQID NO：1的核酸序列修饰，其中所述修饰包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多种或所有的下列变化，或可选地由这些数目的下列变化组成：
在位置4至6的核苷酸是AAT或AAC，
在位置37至39的核苷酸是AAT或AAC，
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置169至171的核苷酸是GAT或GAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置181至183的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置184至186的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置187至189的核苷酸是CAT或CAC，
在位置187至189的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置205至207的核苷酸是CAT或CAC，
在位置205至207的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置205至207的核苷酸是TAT或TAC，
在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置211至213的核苷酸是GAA或GAG，
在位置211至213的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是CAA或CAG，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置211至213的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置220至222的核苷酸是GAA或GAG，
在位置220至222的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置220至222的核苷酸是ATG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置301至303的核苷酸是TAT或TAC，
在位置307至309的核苷酸是TGT或TGC，
在位置307至309的核苷酸是CAA或CAG，
在位置316至318的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置325至327的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置346至348的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置346至348的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置388至390的核苷酸是TAT或TAC，
在位置391至393的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置442至444的核苷酸是CAT或CAC，
在位置484至486的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置547至549的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置556至558的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置556至558的核苷酸是GAT或GAC，
在位置556至558的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置556至558的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置571至573的核苷酸是TGT或TGC，
在位置571至573的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置601至603的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置601至603的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置601至603的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置646至648的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置688至690的核苷酸是AAA或AAG，
在位置688至690的核苷酸是CAA或CAG，
在位置688至690的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置691至693的核苷酸是ATG，
在位置691至693的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置700至702的核苷酸是GAT或GAC，
在位置736至738的核苷酸是CAA或CAG，
在位置736至738的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TAT或TAC，
在位置784至786的核苷酸是CAT或CAC，
在位置784至786的核苷酸是ATG，
在位置784至786的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置784至786的核苷酸是CAA或CAG，
在位置808至810的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置811至813的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是TGT或TGC，
在位置826至828的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置829至831的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置868至870的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置892至894的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置892至894的核苷酸是AAT或AAC，
在位置892至894的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置892至894的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置892至894的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置898至900的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG，
在位置913至915的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置934至936的核苷酸是ATT、ATC或ATA，和/或
在位置943至945的核苷酸是ATT、ATC或ATA。
【0012】所有这些序列是本发明的示例性序列，具有“亲本”SEQ ID NO：1的具体残基变化，其概括(部分地)于下面的表1和2(实施例5中的表2)中。
【0013】本发明的示例性核酸也包括编码本发明多肽的分离的、合成的或重组的核酸，例如具有如下所示序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：23，及其子序列和其变体，例如由本发明的核酸序列编码的多肽，包括于此所述的对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22的核酸序列修饰。一方面，该多肽具有葡聚糖酶活性，例如内切葡聚糖酶活性，例如催化内部的内-β-1，4-和/或β-1，3-葡聚糖键的水解，木聚糖酶活性和/或甘露聚糖酶活性。
【0014】一方面，序列比较算法是BLAST版本2.2.2算法，其中过滤设置(filtering setting)被设置为blastall-p blastp-d“nr pataa”-F F，并且所有其它选项被设置为默认值；或者是带有默认参数的FASTA版本3.0t78。
【0015】本发明的另一方面是分离的、合成的或重组的核酸，其包含本发明核酸序列、与其基本相同的序列以及与其互补的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或更多个连续碱基，或由这些数目的连续碱基组成；以及一方面，核酸序列编码具有葡聚糖酶活性的蛋白质或肽。一方面，本发明的多肽或肽(其包括本发明核酸编码的蛋白质或肽)的葡聚糖酶活性包括内切葡聚糖酶活性，例如内切1，4-和/或1，3-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性。一方面，内切葡聚糖酶活性包括催化1，4-β-D-糖苷键的水解。一方面，葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶的活性包括内切-1，4-和/或1，3-β-内切葡聚糖酶活性或内切-β-1，4-葡聚糖酶活性。一方面，葡聚糖酶活性(例如内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)包括水解纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣聚糖中的1，4-β-D-糖苷键、混合的β-1，3葡聚糖中的β-1，4键，例如谷类β-D-葡聚糖以及含有纤维质部分的其它植物材料中的β-1，4键。
【0016】一方面，葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性包括水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖，以产生较小分子量的多糖或寡聚体。一方面，葡聚糖包括β-葡聚糖，例如水溶性β-葡聚糖。水溶性β-葡聚糖可构成面团或面包产品。
【0017】一方面，葡聚糖酶活性包括水解包含1，4-β-糖苷-联接的D-吡喃型葡萄糖的多糖。一方面，葡聚糖酶活性包括水解纤维素。一方面，葡聚糖酶活性包括水解在木材或纸浆或纸品中的纤维素。
【0018】一方面，葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶的活性包括催化在饮料或饲料中，例如动物饲料，如单胃动物饲料如猪或禽类(例如鸡)饲料，或食品中的葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖的水解。饮料、饲料或食品可包括基于谷类的动物饲料、麦芽汁或啤酒、水果或蔬菜。一方面，本发明提供了包含本发明多肽的食物、饲料(例如动物饲料，例如单胃动物饲料如猪或禽类饲料)、液体例如饮料(例如果汁或啤酒)或饮料前体(例如麦芽汁)。食品可以是面团或面包产品。饮料或饮料前体可以是果汁、啤酒或麦芽汁。一方面，本发明提供了通过用本发明的酶处理液体来澄清液体例如汁如果汁或啤酒的方法。
【0019】一方面，本发明提供了面团调理(dough conditioning)的方法，该方法包括在足以调理面团的条件下使面团或面包产品与本发明的至少一种多肽接触。一方面，本发明提供了饮料生产方法，该方法包括在足以降低饮料粘度的条件下，将本发明的至少一种多肽施用至饮料或饮料前体。
【0020】一方面，葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶的活性包括催化细胞例如植物细胞或微生物细胞中的葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚或其它多糖的水解。
【0021】一方面，所述分离的、合成的或重组的核酸编码具有葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性的多肽，其是热稳定的。例如，本发明的多肽，例如本发明的变体或进化的酶，例如表1和2(表2在实施例5中)所示的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23的具体变异，可以是热稳定的。根据本发明的热稳定多肽在包括如下温度范围的条件下能够保持结合和/或酶活性，例如葡聚糖酶——如内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约37℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃，或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。根据本发明的热稳定多肽在如下温度范围能够保持活性，例如葡聚糖酶——如内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃，或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。在某些实施方式中，根据本发明的热稳定多肽在约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高pH下，在上述温度范围内保持活性，例如葡聚糖酶——内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性。
【0022】另一方面，所述分离的、合成的或重组的核酸编码具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性的多肽，其是耐热的。例如，本发明的多肽，例如本发明的变体或进化的酶，例如表1和2(表2在实施例5中)所示的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23的具体变异，可以是耐热的或热活性的。根据本发明的耐热多肽在暴露于包括如下温度范围的条件之后能够保持结合和/或酶活性，例如葡聚糖酶——如内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。根据本发明的耐热多肽可以在暴露于如下温度范围之后保持活性，例如葡聚糖酶——如内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度。在某些实施方式中，根据本发明的耐热多肽在约pH 3.0、约pH 3.5、约pH 4.0、约pH 4.5、约pH 5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5、约pH 7.0、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9.0、约pH 9.5、约pH 10.0、约pH 10.5、约pH 11.0、约pH 11.5、约pH 12.0或更高pH下，在暴露于上述温度范围之后保持活性，例如葡聚糖酶——内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性。一方面，在暴露于pH 4.5、高于90℃至约95℃的温度范围后，多肽保持葡聚糖酶或其它活性。
【0023】本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸，其包括在严格条件下与包含本发明序列的核酸杂交的序列，所述本发明序列例如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22的序列或其片段或子序列；并且一方面，该序列具有至少一种或几种或所有对SEQ ID NO：1的序列修饰(或等价修饰)，如本文所述。一方面，该核酸编码具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性的多肽。该核酸的长度可以是至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或更多残基，或基因的全长或转录体的全长。一方面，严格条件包括洗涤步骤，包括在0.2×SSC中在大约65℃的温度洗涤大约15分钟。
【0024】本发明提供了核酸探针，其用于鉴定、分离、克隆、扩增或测序编码具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸，其中所述探针含有序列的至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多个连续碱基，所述序列包含本发明的序列或其片段或其子序列(其包括双链、正义和反义链，例如包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、AND SEQ ID NO：22完全互补的序列，和于此阐述的示例性修饰)，其中所述探针通过结合或杂交来鉴定核酸。该探针可以包含寡核苷酸，该寡核苷酸包含本发明序列的约10-100之间的连续碱基或其片段或子序列，例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个碱基或更多个碱基或在这些数目之间任何所期望的长度。
【0025】本发明提供了核酸探针，其用于鉴定编码具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶活性的多肽的核酸，其中所述探针包含这样的核酸或由这样的核酸组成，该核酸包含与本发明的核酸例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、AND SEQ ID NO：22或于此所述包含SEQ ID NO：1的序列修饰的核酸(例如SEQ ID NO：3)具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的(100％)序列同一性的至少约10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多残基的序列，其中序列同一性通过运用序列比较算法的分析(例如BLAST或FASTA)或通过视觉观察来确定。本发明另一方面是多核苷酸探针，用于分离或鉴定葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶基因，其具有与本发明的至少一个核酸序列相同或完全互补的序列。
【0026】本发明提供了扩增引物对，其用于扩增编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸，其中该引物对能够扩增含有本发明的序列或其片段或子序列的核酸。扩增引物序列对的一个或每一个成员可以包含寡核苷酸，该寡核苷酸包含该序列的至少大约10到50个或更多个连续碱基，或者该序列的大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多个连续碱基。
【0027】本发明提供了扩增引物对，其中所述引物对包含第一成员和第二成员，第一成员具有本发明核酸的大约前(5’)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或更多个残基所示的序列，第二成员含有第一成员的互补链的大约前(5’)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或更多个残基所示的序列。
【0028】本发明提供了通过扩增产生的编码葡聚糖酶的核酸，例如编码内切葡聚糖酶、编码木聚糖酶或编码甘露聚糖酶的核酸，所述扩增例如聚合酶链反应(PCR)，其使用本发明的扩增引物对。本发明提供了通过扩增产生的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，所述扩增例如聚合酶链反应(PCR)，其使用本发明的扩增引物对。本发明提供了通过扩增制备葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶——如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的方法，所述扩增例如聚合酶链反应(PCR)，其中使用本发明的扩增引物对。一方面，所述扩增引物对从文库例如基因文库诸如环境文库扩增核酸。
【0029】本发明提供了扩增核酸的方法，所述核酸编码具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶活性的多肽，所述方法包括用能扩增本发明的核酸序列或其片段或子序列的扩增引物序列对扩增模板核酸。
【0030】本发明提供了包含本发明的核酸或其子序列的表达盒。一方面，表达盒可以包含可操作地连接到启动子上的核酸。任选地，启动子可以是真菌、酵母、病毒、细菌、哺乳动物、植物、合成或杂交启动子。启动子可以是组成型启动子。另一方面，启动子可以是诱导型启动子。一方面，启动子可以是组织特异性启动子或环境调节型或发育调节型启动子。一方面，表达盒可以进一步包含植物或植物病毒表达载体。
【0031】本发明提供了克隆载体，其包含本发明的表达盒(例如载体)或本发明的核酸。克隆载体可以是病毒载体、质粒、噬菌体(phage)、噬粒、粘粒(cosmid)、fos-质粒(fosmid)、细菌噬菌体(bacteriophage)或人工染色体。病毒载体可以包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体。克隆载体可以包括细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬菌体P1衍生载体(bacteriophage P1-derived vector，PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)。
【0032】本发明提供了包含本发明的核酸或本发明的表达盒(例如载体)或本发明的克隆载体的转化细胞。一方面，转化细胞可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞。一方面，所述植物细胞可以来自任何植物，例如用于任何动物，包括反刍动物的草料和/或饲料的植物，或作为原料来源以产生能量或燃料的植物。特别感兴趣的植物可包括农作物植物和原料植物，例如：玉米、苜蓿、向日葵、油菜、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟米、大麦、水稻、松类、草类——如柳枝稷和芒(Miscanthus)、豆科作物——如豌豆、蚕豆和大豆、淀粉块茎/根——如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、美人蕉和甜菜等。
【0033】本发明提供了转基因非人动物，其包含本发明的核酸或本发明的表达盒(例如载体)。一方面，所述动物是小鼠、大鼠、山羊、兔、绵羊、猪、牛或任何哺乳动物。
【0034】本发明提供了包含本发明核酸或本发明表达盒(例如载体)的转基因植物。转基因植物可以是任何植物，但在一个实施方式中，所述植物用于任何动物的草料和/或饲料或作为原料以产生能量或燃料，例如：玉米、苜蓿、向日葵、油菜、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟米、大麦、水稻、松类、草类——如柳枝稷和芒(Miscanthus)、豆科作物——如豌豆、蚕豆和大豆、淀粉块茎/根——如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、美人蕉和甜菜等。
【0035】本发明提供了包含本发明核酸或本发明表达盒(例如载体)的转基因种子。转基因种子可以来自任何植物，但在一个实施方式中，所述植物用于任何动物的草料和/或饲料或作为原料以产生能量或燃料，例如：玉米、苜蓿、向日葵、油菜、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟米、大麦、水稻、松类、草类——如柳枝稷和芒(Miscanthus)、豆科作物——如豌豆、蚕豆和大豆、淀粉块茎/根——如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、美人蕉和甜菜等。
【0036】本发明提供了包含与本发明的核酸互补的核酸序列或能与本发明的核酸在严格条件下杂交的核酸序列的反义寡核苷酸。本发明提供了抑制葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶信息在细胞中翻译的方法，该方法包括给细胞施用反义寡核苷酸或在细胞中表达反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包括与本发明的核酸互补的核酸序列或能与本发明的核酸在严格条件下杂交的核酸序列。一方面，所述反义寡核苷酸的长度在约10至50、约20至60、约30至70、约40至80、约60至100或约50至150个碱基之间。
【0037】本发明提供了抑制葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶信息在细胞中翻译的方法，该方法包括给细胞施用反义寡核苷酸或在细胞中表达反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含与本发明的核酸互补的核酸序列或能与本发明的核酸在严格条件下杂交的核酸序列。本发明提供了含有本发明序列的子序列的双链抑制RNA(RNAi或RNA干扰)分子(包括小干扰性RNA，或siRNA，用于抑制转录，以及微RNA或miRNA，用于抑制翻译)。一方面，所述RNAi长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个双链核苷酸。本发明提供了抑制多肽、酶、蛋白质、肽——例如在细胞中的结构或结合蛋白表达的方法，该方法包括给细胞施用或在细胞中表达双链抑制RNA(iRNA，包括小干扰性RNA或siRNA，用于抑制转录，以及微RNA或miRNA，用于抑制翻译)，其中所述RNA含有本发明的序列的子序列。
【0038】本发明提供了分离的、合成的或重组的多肽，其包含在至少约25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350或更多个残基的区域内或者在多肽的全长区域内，与本发明的示例性多肽或肽具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的(100％)序列同一性的氨基酸序列，并且序列同一性通过运用序列比较算法的分析或通过视觉观察来确定。本发明的示例性多肽或肽序列包含SEQ ID NO：2及其子序列和其变体，其中一方面，本发明的示例性多肽序列包含SEQ ID NO：2上的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多个或所有下列氨基酸残基变化，或可选地由这些数目之变化组成：
在氨基酸位置2的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置13的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置57的丝氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置61的酪氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置62的丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置70的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置71的精氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置101的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置106的谷氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置109的谷氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置130的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置131的苯丙氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置148的谷氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置162的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置186的是赖氨酸天冬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置216的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置230的组氨酸是赖氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置234的谷氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置246的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置246的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置262的亮氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置270的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置271的苯丙氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置277的谷氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置290的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置300的赖氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置305的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置312的甘氨酸是异亮氨酸，和/或
在氨基酸位置315的丝氨酸是异亮氨酸。
【0039】所有这些序列是本发明示例性氨基酸序列，其具有对“亲本”SEQ IDNO：2的具体残基变化，概括于(部分地)下面的表1和2。示例性多肽或肽还包括长度为至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或更多个残基的片段，或酶或抗体的全长。本发明的示例性多肽或肽序列包括由本发明的核酸编码的序列。本发明的示例性多肽或肽序列包括由本发明的抗体特异性结合的多肽或肽，或能够引起免疫反应的序列，例如能够引起对本发明的示例性多肽特异的体液(抗体)或细胞免疫反应的表位。
【0040】一方面，本发明的多肽(例如酶、抗体或肽)具有至少一种葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶活性。一方面，内切葡聚糖酶活性包括内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性。一方面，内切葡聚糖酶活性包括催化1，4-β-D-糖苷键或1，3-β-D-糖苷键的水解。一方面，内切葡聚糖酶活性包括内切-1，4-β-内切葡聚糖酶活性或内切-β-1，4-葡聚糖酶活性，内切-1，3-β-内切葡聚糖酶活性或内切-β-1，3-葡聚糖酶活性。一方面，葡聚糖酶活性(例如内切-1，4和/或1，3-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)包括水解纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣聚糖中的1，4-β-D-糖苷键、混合的β-1，3葡聚糖中的β-1，4和/或1，3键，例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维质部分的其它植物材料中的β-1，4和/或1，3键。
【0041】本发明的另一方面提供了分离的、合成的或重组的多肽或肽，其包括本发明的多肽或肽序列、与其基本上相同的序列(包括于此所述的SEQ ID NO：2修饰的示例性序列)、与其互补的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个连续碱基，或由这些数目的连续碱基组成。该肽可以是例如免疫原性片段、表位、基序(例如结合位点)、信号序列、前原序列(prepro sequence)或催化结构域(CD)或活性位点。
【0042】本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸，该核酸包括编码本发明多肽(例如酶、抗体或肽)的序列，包括本发明的示例性序列，其具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶活性，其含有或不含有信号(前导)序列，其中所述核酸包含本发明的序列。信号(前导)序列可源自其它葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如本发明的纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，或源自其它葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶(不是本发明的)或非葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶等等，即，异源酶。本发明提供分离的、合成的或重组的核酸，该核酸包含编码具有葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的序列，其中所述序列不含有信号(前导)序列，并且所述核酸包含本发明的序列。
【0043】一方面，葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶的活性包括催化1，4-β-D-糖苷键或1，3-β-D-糖苷键的水解。一方面，内切葡聚糖酶活性包括内切-1，4-β-内切葡聚糖酶活性。一方面，内切葡聚糖酶活性包括水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖，以产生较小分子量的多糖或寡聚体。一方面，葡聚糖包括β-葡聚糖，例如水溶性β-葡聚糖。所述水溶性β-葡聚糖可构成面团或面包产品。一方面，葡聚糖酶活性包括水解包含1，4-β-糖苷-联接的D-吡喃型葡萄糖的多糖。一方面，葡聚糖酶活性包括水解纤维素。一方面，葡聚糖酶活性包括水解木材或纸浆或纸产品中的纤维素。
【0044】一方面，葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性包括催化葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖的水解或在饲料(例如动物饲料——例如单胃动物饲料如猪或禽类(例如鸡)饲料)或食品中其它碳水化合物的水解。饲料或食品可包括基于谷类的动物饲料、麦芽汁或啤酒、水果或蔬菜。
【0045】一方面，葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶活性包括催化葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或在细胞——例如植物细胞、真菌细胞或微生物(例如细菌)细胞中的其它碳水化合物的水解。
【0046】一方面，分离的、合成的或重组的多肽可以包含本发明的多肽，其缺少信号(前导)序列的全部或部分。一方面，所述分离的或重组的多肽可以包含本发明的多肽或由其组成，该多肽包含异源信号(前导)序列或由其组成，例如异源葡聚糖酶或甘露聚糖酶、木聚糖酶信号序列，或非葡聚糖酶(或纤维素酶)信号序列例如非内切葡聚糖酶、非甘露聚糖酶、非木聚糖酶、非淀粉酶、非黄原胶酶和/或非糖苷酶，例如非纤维二糖水解酶、非甘露聚糖酶和/或非β-葡糖苷酶的信号(前导)序列。
【0047】一方面，本发明提供了嵌合蛋白，其包括含有本发明的信号序列的第一结构域和至少第二结构域。蛋白可以是融合蛋白。第二结构域可以包括酶。该酶可以是葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶。
【0048】本发明提供了嵌合多肽，包含含有本发明的信号肽(SP)、前原序列和/或催化结构域(CD)的至少第一结构域以及含有异源多肽或肽的至少第二结构域，或由它们组成，其中所述异源多肽或肽不与所述信号肽(SP)、前原序列和/或催化结构域(CD)天然相关。一方面，所述异源多肽或肽不是葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶。所述异源多肽或肽可以在所述信号肽(SP)、前原序列和/或催化结构域(CD)的氨基端、羧基端或两端。
【0049】本发明提供了编码嵌合多肽的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述嵌合多肽包含含有本发明的信号肽(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)的至少第一结构域以及含有异源多肽或肽的至少第二结构域或由它们组成，其中所述异源多肽或肽不与所述信号肽(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)天然相关。
【0050】本发明提供分离的、合成的或重组的信号(前导)序列(例如，信号(前导)肽)，其包含本发明的多肽的(氨基端)残基1至14、1至15、1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、1至21、1至22、1至23、1至24、1至25、1至26、1至27、1至28、1至28、1至30、1至31、1至32、1至33、1至34、1至35、1至36、1至37、1至38、1至40、1至41、1至42、1至43或1至44所示的序列或由之组成，所述本发明的多肽例如本发明的示例性多肽，例如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23以及于此所述的其示例性序列修饰。
【0051】一方面，葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性，包括在约37℃每毫克蛋白约1到约1200单位，或每毫克蛋白约100到约1000单位的范围内的比活性。另一方面，葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性，包括每毫克蛋白从约100到约1000单位，或从约500到约750单位的比活性。可选地，葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性，包括在37℃每毫克蛋白从大约1到大约750单位，或每毫克蛋白大约500到大约1200单位的范围内的比活性。一方面，葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性，包括在37℃每毫克蛋白从大约1到大约500单位，或每毫克蛋白大约750到大约1000单位的范围内的比活性。另一方面，葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性，包括在37℃每毫克蛋白从大约1到大约250单位的范围内的比活性。可选地，葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性包括在37℃每毫克蛋白从大约1到大约100单位的范围内的比活性。另一方面，耐热性包括，在被加热到高温，例如在约0℃至约20℃、约20℃至约37℃、约37℃至约50℃、约50℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约80℃、约80℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约110℃或更高的温度之后，在37℃保持葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的比活性的至少一半。可选地，耐热性可以包括，在被加热到高温后，在37℃保持每毫克蛋白从大约1到大约1200单位，或每毫克蛋白大约500到大约1000单位的范围内的比活性。另一方面，耐热性可以包括在被加热到如上所述的高温后，在37℃保持每毫克蛋白从大约1到大约500单位范围内的比活性。
【0052】本发明提供了本发明的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述多肽包含至少一个糖基化位点。一方面，糖基化可以是N-联接糖基化和/或O-联接糖基化。一方面，多肽可以在酵母细胞，如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)或哺乳动物、昆虫、真菌或其它宿主细胞中被表达后被糖基化。
【0053】一方面，多肽可以在包括大约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH4.0、pH 3.5、pH 3.0或更小(更酸性)pH的条件下保持葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性。另一方面，多肽可以在包括大约pH 7、pH 7.5、pH8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱性)pH的条件下保持葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性。一方面，多肽可以在暴露于包括大约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更小(更酸性)pH的条件下保持葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性。另一方面，多肽可以在暴露于包括大约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12、pH 12.5或更大(更碱性)pH的条件下保持葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性。
【0054】本发明提供了包含本发明的多肽的蛋白制剂，其中该蛋白制剂包括液体、固体或凝胶。
【0055】本发明提供了包含本发明的多肽和第二蛋白或结构域的异二聚体。该异二聚体的第二成员可以是不同的聚糖酶，不同的酶或其它蛋白。一方面，第二结构域可以是多肽，异二聚体可以是融合蛋白。一方面，第二结构域可以是表位或标记(tag)。一方面，本发明提供包含本发明多肽(例如酶、肽)的同多聚体，包括但不限于：同二聚体、同三聚体、同四聚体、同五聚体和同六聚体。
【0056】本发明提供具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的固定化多肽，其中所述多肽包括本发明的多肽、由本发明的核酸编码的多肽、或含有本发明的多肽和第二结构域的多肽。一方面，多肽可以被固定在细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠子、凝胶、平板、阵列或毛细管上。
【0057】本发明提供包含本发明的固定化核酸的阵列。本发明提供包含本发明的抗体的阵列。
【0058】本发明提供分离的、合成的或重组的抗体，其与本发明的多肽或与由本发明的核酸编码的多肽特异性结合。所述抗体可以是单克隆或多克隆抗体。本发明提供包含本发明抗体的杂交瘤，所述抗体例如，与本发明的多肽或与由本发明的核酸编码的多肽特异性结合的抗体。
【0059】本发明提供了分离或鉴定具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供本发明的抗体；(b)提供包括多肽的样品；和(c)将步骤(b)的样品与步骤(a)的抗体在所述抗体能与所述多肽特异性结合的条件下接触，从而分离或鉴定具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽。
【0060】本发明提供了制备抗葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶抗体的方法，该方法包括以足以产生体液免疫应答的量向非人动物施用本发明的核酸或本发明的多肽或其子序列，由此制备抗葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶抗体。本发明提供了产生抗葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶体液或细胞免疫应答的方法，该方法包括以足以产生免疫应答的量向非人动物施用本发明的核酸或本发明的多肽或其子序列。
【0061】本发明提供了产生重组多肽的方法，包括如下步骤：(a)提供与启动子可操作地连接的本发明的核酸；和(b)在允许多肽表达的条件下表达步骤(a)的核酸，从而产生重组多肽。一方面，该方法可进一步包括用步骤(a)的核酸转化宿主细胞，随后表达步骤(a)的核酸，从而在转化细胞中产生重组多肽。
【0062】本发明提供了用于鉴定具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供本发明的多肽；或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的底物；和(c)将步骤(a)的多肽或其片段或其变体与步骤(b)的底物接触，并且检测底物量的降低或反应产物量的增加，其中底物量的降低或反应产物量的增加检测出具有葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽。
【0063】本发明提供了用于鉴定葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的底物的方法，包括如下步骤：(a)提供本发明的多肽；或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供测试底物；和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的测试底物接触，并且检测底物量的降低或反应产物量的增加，其中底物量的降低或反应产物量的增加检测出作为葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶底物的测试底物。
【0064】本发明提供了确定测试化合物是否与多肽特异性结合的方法，包括如下步骤：(a)在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或包括核酸的载体，其中所述核酸包括本发明的核酸，或提供本发明的多肽；(b)提供测试化合物；(c)将多肽与测试化合物接触；和(d)确定步骤(b)的测试化合物是否与多肽特异性结合。
【0065】本发明提供了用于鉴定葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的调节剂的方法，包括如下步骤：(a)提供本发明的多肽，或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供测试化合物；和(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的测试化合物接触，并测定葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性，其中在存在测试化合物的情况下测定的葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性——与不存在测试化合物的情况下的活性相比的变化，确定了该测试化合物调节葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性。一方面，葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性，可以通过提供葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶底物，并检测底物量的降低或反应产物量的增加，或底物量的增加或反应产物量的降低来测量。与没有测试化合物时底物或反应产物的量相比，有测试化合物时底物量的降低或反应产物量的增加鉴定出作为葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的激活剂的测试化合物。与没有测试化合物时底物或反应产物量相比，有测试化合物时底物量的增加或反应产物量的降低鉴定出作为葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的抑制剂的测试化合物。
【0066】本发明提供了计算机系统，该系统包括处理器和数据存储设备，其中所述数据存储设备上已经存储了本发明的多肽序列或核酸序列(例如由本发明的核酸编码的多肽)。一方面，计算机系统可以进一步包括序列比较算法和数据存储设备，其中数据存储设备上已经存储了至少一个参考序列。另一方面，序列比较算法包括可指出多态现象(多态性)的计算机程序。一方面，计算机系统可以进一步包括在所述序列中鉴定一个或多个特征的鉴定器(标识符，identifier)。本发明提供了计算机可读介质，其上已经存储了本发明的多肽序列或核酸序列。本发明提供了用于鉴定序列中的特征的方法，包括如下步骤：(a)使用可鉴定序列中的一个或多个特征的计算机程序读取序列，其中所述序列包括本发明的多肽序列或核酸序列；和(b)用所述计算机程序鉴定序列中的一个或多个特征。本发明提供了将第一序列与第二序列进行比较的方法，包括如下步骤：(a)通过使用可比较序列的计算机程序读取第一序列和第二序列，其中第一序列包括本发明的多肽序列或核酸序列；和(b)用所述计算机程序确定第一序列和第二序列之间的差异。确定第一序列和第二序列之间差异的步骤可以进一步包括鉴定多态性的步骤。一方面，该方法可以进一步包括可鉴定序列中的一个或多个特征的鉴定器。另一方面，该方法可以包括使用计算机程序读取第一序列，并鉴定该序列中的一个或多个特征。
【0067】本发明提供了从样品——例如环境样品中分离或回收核酸的方法，所述核酸编码具有葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽，该方法包括如下步骤：(a)提供用于扩增编码具有葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸的扩增引物序列对，其中所述引物对能扩增本发明的核酸；(b)从样品中分离核酸，或处理样品，以便样品中的核酸可达到与扩增引物对杂交；和(c)将步骤(b)的核酸与步骤(a)的扩增引物对结合，并从样品中扩增核酸，从而从样品中分离或回收编码具有葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸。扩增引物序列对的一个或每一成员可以包含寡核苷酸，该寡核苷酸包含至少大约10到50个连续碱基。一方面，所述扩增引物序列对是本发明的扩增对。在本发明的一个实施方式中，样品是环境样品，例如包括水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品。一方面，生物样品可以来源于细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
【0068】本发明提供了从样品——例如环境样品中分离或回收核酸的方法，所述核酸编码具有葡聚糖酶活性、甘露聚糖酶活性、木聚糖酶活性、淀粉酶活性、黄原胶酶活性和/或糖苷酶活性，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽，该方法包括如下步骤：(a)提供包含本发明的核酸或其子序列的多核苷酸探针；(b)从样品分离核酸，或处理样品，以便样品中的核酸可达到与步骤(a)的多核苷酸探针杂交；(c)将步骤(b)分离的、合成的核酸或处理的样品与步骤(a)的多核苷酸探针结合；和(d)分离与步骤(a)的多核苷酸探针特异性杂交的核酸，从而从样品中分离或回收编码具有葡聚糖酶活性、甘露聚糖酶活性、木聚糖酶活性、淀粉酶活性、黄原胶酶活性和/或糖苷酶活性，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸。在本发明的一个实施方式中，样品是环境样品，例如包括水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品。一方面，生物样品可以来源于细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
【0069】本发明提供了产生编码具有葡聚糖酶活性、甘露聚糖酶活性、木聚糖酶活性、淀粉酶活性、黄原胶酶活性和/或糖苷酶活性，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸变体的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供包括本发明的核酸的模板核酸；和(b)在模板序列中修饰、删除或添加一个或多个核苷酸，或进行修饰、删除和添加的组合，以产生模板核酸的变体。一方面，该方法可以进一步包括表达变体核酸，以产生变异的葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶多肽。修饰、添加或删除通过包括如下方法的方法来引入：易错PCR、改组(重排，shuffling)、寡核苷酸诱导的定向突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变(recursive ensemble mutagenesis)、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)或其组合。另一方面，修饰、添加或删除通过包括如下方法的方法引入：重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双重诱变(gappedduplex mutagenesis)、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成及其组合。
【0070】一方面，该方法可以被反复重复，直到产生与模板核酸编码的多肽相比具有改变的或不同的活性或者改变的或不同的稳定性的葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。一方面，变异的葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶多肽是耐热的，在暴露于升高的温度之后可以保留一些活性。另一方面，与模板核酸编码的葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶相比，变异的葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶多肽具有增加的糖基化。可选择地，所述变异的多肽，在高温下具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性，其中由模板核酸编码的酶在高温下没有活性。一方面，该方法可以被反复重复，直到产生具有与模板核酸的密码子使用有所不同的密码子使用的葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶编码序列。另一方面，该方法可以被反复重复，直到产生具有比模板核酸的信息表达或稳定性更高或更低水平的信息表达或稳定性的葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶基因。
【0071】本发明提供了在编码具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸中修饰密码子以增加其在宿主细胞中的表达的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供编码具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶、(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的本发明的核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中非优选或较不优选的密码子，用优选的或中度使用(neutrally used)的密码子来代替之，所述优选或中度使用的密码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸，其中优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子，非优选或较不优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰核酸以增加其在宿主细胞中的表达。
【0072】本发明提供了在编码具有葡聚糖酶、甘露聚糖酶、(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸中修饰密码子的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供本发明的核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中的密码子，并用不同的密码子来代替，所述不同的密码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸，从而修饰在编码葡聚糖酶、甘露聚糖酶、(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的核酸中的密码子。
【0073】本发明提供了在编码具有葡聚糖酶、甘露聚糖酶、(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸中修饰密码子以增加其在宿主细胞中的表达的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供编码葡聚糖酶、甘露聚糖酶、(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶多肽的本发明核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中的非优选或较不优选密码子，并用优选的或中度使用的密码子来代替之，所述优选或中度使用的密码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸，其中优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子，非优选或较不优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰核酸以增加其在宿主细胞中的表达。
【0074】本发明提供了在编码具有葡聚糖酶、甘露聚糖酶、(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽的核酸中修饰密码子以降低其在宿主细胞中的表达的方法，该方法包括如下步骤：(a)提供本发明的核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中的至少一个优选密码子，并用非优选的或较不优选的密码子来代替，所述非优选或较不优选的密码子与被代替的密码子编码相同的氨基酸，其中优选密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子，非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰核酸以降低其在宿主细胞中的表达。一方面，宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
【0075】本发明提供了用于产生核酸文库的方法，所述核酸文库编码一系列被修饰的葡聚糖酶、甘露聚糖酶、(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性位点(催化结构域(CD))或底物结合位点，其中被修饰的活性位点或底物结合位点来源于第一核酸，所述第一核酸包含编码第一活性位点或第一底物结合位点的序列，该方法包括如下步骤：(a)提供第一核酸，其编码第一活性位点或第一底物结合位点，其中所述第一核酸序列包含在严格条件下与本发明的核酸杂交的序列，所述核酸编码葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性位点或葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶底物结合位点；(b)提供一组诱变寡核苷酸，其在第一核酸的多个目标密码子处编码天然发生的氨基酸变体；和(c)使用该组诱变寡核苷酸，产生一组编码活性位点或编码底物结合位点的变体核酸，其在被诱变的每一氨基酸密码子处编码一定范围的氨基酸变异，从而产生编码多个被修饰的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性位点或底物结合位点的核酸文库。一方面，该方法包括通过包括如下方法的方法诱变步骤(a)的第一核酸：优化的定向进化系统、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)、易错PCR、改组、寡核苷酸诱导的定向突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配、合成连接重装配(SLR)及其组合。另一方面，该方法包括通过包括如下方法的方法诱变步骤(a)的第一核酸或变体：重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成及其组合。
【0076】本发明提供了产生小分子的方法，包括如下步骤：(a)提供多个能合成或修饰小分子的生物合成酶，其中这些酶中的一种酶包括由本发明的核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；(b)为步骤(a)的至少一种酶提供底物；和(c)将步骤(b)的底物与这些酶在能促进多个生物催化反应的条件下通过一系列生物催化反应进行反应，以产生小分子。本发明提供了修饰小分子的方法，包括如下步骤：(a)提供葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，其中该酶包括本发明的多肽，或由本发明的核酸编码的多肽，或其子序列；(b)提供小分子；和(c)将步骤(b)的小分子与步骤(a)的酶在能促进由葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶催化的酶促反应的条件下进行反应，从而通过葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶酶促反应修饰小分子。一方面，该方法可以包括步骤(a)的酶的多个小分子底物，从而产生通过由葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶催化的至少一种酶促反应产生的被修饰小分子的文库。一方面，该方法可以包括多种其它的酶，在有助于这些酶的多个生物催化反应的条件下使用，以形成由多个酶促反应产生的被修饰小分子的文库。另一方面，该方法可以进一步包括测试该文库以确定该文库中是否存在表现出期望活性的特定被修饰小分子的步骤。测试该文库的步骤可以进一步包括系统地去除所有但保留一个用于产生文库中多个被修饰小分子中的一部分的生物催化反应，方法是通过测试被修饰小分子的所述部分中存在或不存在具有期望活性的特定被修饰小分子，并鉴定出产生具有期望活性的特定修饰小分子的至少一个特定生物催化反应。
【0077】本发明提供了确定葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的功能片段的方法，包括如下步骤：(a)提供葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，其中该酶包括本发明的多肽或由本发明的核酸编码的多肽、或其子序列；和(b)从步骤(a)的序列删除多个氨基酸残基，并测试剩余的子序列的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性，从而确定葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的功能片段。一方面，葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶活性通过提供葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶底物并检测底物量的减少或反应产物量的增加来测量。
【0078】本发明提供了通过使用实时代谢流(real-time metabolic flux)分析进行新的或修饰的表型的全细胞工程改造的方法，该方法包括如下步骤：(a)通过修饰细胞的遗传组成产生修饰的细胞，其中所述遗传组成通过将本发明的核酸加入到细胞来修饰；(b)培养修饰的细胞以产生多个修饰的细胞；(c)通过实时监控步骤(b)的细胞培养物来测量该细胞的至少一个代谢参数；和(d)分析步骤(c)的数据，以确定被测量的参数是否与在类似条件下未修饰细胞中的参照测量值不同，从而使用实时代谢流量分析鉴定细胞中的工程改造的表型。一方面，细胞的遗传组成可以通过包括在细胞中序列的删除或序列的修饰，或敲除基因的表达的方法来修饰。一方面，该方法可以进一步包括选择含有新工程改造的表现型的细胞。另一方面，该方法可以包括培养被选择的细胞，从而产生包含新工程改造的表型的新细胞株。
【0079】本发明提供了增加葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的多肽的耐热性或热稳定性的方法，该方法包括糖基化葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶多肽，其中该多肽包括本发明的多肽或由本发明的核酸序列编码的多肽的至少25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250或更多个连续氨基酸，从而增加葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶多肽的耐热性或热稳定性。一方面，葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的比活性可以在大于大约37℃到大约95℃或大约0℃到大约37℃的温度范围内是热稳定的或耐热的。
【0080】本发明提供了在细胞中过量表达重组葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的多肽的方法，该方法包括表达含有核酸的载体，该核酸包括本发明的核酸或本发明的核酸序列，其中序列同一性通过使用序列比较算法的分析或通过视觉观察来确定，其中过量表达通过使用高活性启动子、双顺反子(dicistronic)载体或通过该载体的基因扩增来实现。
【0081】本发明提供了产生转基因植物的方法，该方法包括如下步骤：(a)将异源核酸序列引入细胞中，其中异源核酸序列包括本发明的核酸序列，从而产生转化的植物细胞；和(b)从转化的细胞产生转基因植物。
【0082】本发明提供了在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，该方法包括如下步骤：(a)用与启动子可操作地连接的异源核酸序列转化植物细胞，其中异源核酸序列包括本发明的核酸；(b)在异源核酸序列可在植物细胞中表达的条件下培养所述植物。本发明提供了在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，该方法包括如下步骤：(a)用与启动子可操作地连接的的异源核酸序列转化植物细胞，其中异源核酸序列包括本发明的序列；(b)在异源核酸序列可在植物细胞中表达的条件下培养所述植物。
【0083】本发明提供水解、分解或破坏包括葡聚糖的组合物的方法，该方法包括下列步骤：(a)提供具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或本发明的核酸编码的多肽；(b)提供包括葡聚糖的组合物；和(c)在葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶水解、分解或破坏包含葡聚糖的组合物的条件下，将步骤(b)的组合物与步骤(a)的多肽接触。一方面，所述组合物包括植物细胞、细菌细胞酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。
【0084】因此，所述组合物可包括任何植物或植物部分，任何含有葡聚糖、甘露聚糖、木糖葡聚糖或木聚糖的食品或饲料，废物产品等。本发明提供液化或去除含有葡聚糖的组合物的方法，该方法包括下列步骤：(a)提供具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供含有葡聚糖的组合物；和(c)在葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶去除、软化或液化含有葡聚糖的组合物的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。
【0085】本发明提供了包含本发明多肽或本发明核酸编码的多肽的洗涤剂组合物，其中多肽具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性。葡聚糖酶可以是非表面活性的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；或表面活性的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可被配制成不含水的液体组合物、铸型固体、颗粒形式、微粒形式、压缩片剂、凝胶形式、糊剂或浆液的形式。本发明提供了洗涤物体的方法，该方法包括下列步骤：(a)提供具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或由本发明的核酸编码的多肽；(b)提供物体；和(c)在组合物可洗涤物体的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的物体接触。
【0086】本发明提供了纺织品或织物，包括例如线，其包含本发明的多肽，或本发明的核酸编码的多肽。一方面，所述纺织品或织物包括含有葡聚糖的纤维。本发明提供了处理纺织品或织物的方法(例如从组合物上去除污物)，该方法包括下列步骤：(a)提供组合物，其包含具有葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或本发明的核酸编码的多肽；(b)提供包含葡聚糖的纺织品或织物；和(c)在葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以处理纺织品或织物(例如去除污物)的条件下，将步骤(b)的组合物与步骤(a)的多肽接触。本发明提供了改进织物饰面(finish)的方法，该方法包括下列步骤：(a)提供组合物，其包含具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或本发明的核酸编码的多肽；(b)提供织物；和(c)在多肽可以处理织物从而改进织物饰面的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的织物接触。一方面，所述织物是毛料或丝绸。
【0087】本发明提供饲料，包括动物饲料，例如单胃动物例如猪或禽类(例如鸡)饲料或食物，其包含本发明的多肽或本发明的核酸编码的多肽。本发明提供了在动物食用之前，在饲料或食物中水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖，或其它多糖的方法，该方法包括下列步骤：(a)获得饲料原料，其包含本发明的葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，或本发明的核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；和(b)添加步骤(a)的多肽至饲料或食物原料，加入的量足以在足够长的时间内水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖，或其它多糖并且形成处理的食品或饲料，从而在动物食用之前，在食品或饲料中水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖。一方面，本发明提供在动物食用之后，在食品或饲料中水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖的方法，该方法包括下列步骤：(a)获得饲料原料，其包含本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，或本发明的核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；(b)添加步骤(a)的多肽至饲料或食物原料；和(c)将饲料或食物原料施用给动物，其中在食用后，葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶引起在动物消化道内的饲料或食物中葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖的水解。食品或饲料(例如动物饲料，包括单胃动物例如猪或禽类(例如鸡)饲料)可以是例如谷类、谷物、玉米等等。
【0088】另一方面，本发明提供通过用本发明的葡聚糖酶处理组合物或在组合物中包含本发明的葡聚糖酶，来降低组合物中，例如在食品或饲料(例如动物饲料，例如单胃动物例如禽类(例如鸡)饲料)中的葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖粘性的方法。食品或饲料可包括大麦或小麦，例如用于高大麦或高小麦膳食的食品或饲料，如在单胃动物膳食中，包括其在禽类(例如鸡)或猪膳食中的使用。一方面，本发明提供了通过喂给动物(例如鸟类，诸如任何家禽)用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶处理的食品或饲料或包含这些酶的食品或饲料，最小化湿滴(wet dropping)的方法。一方面，本发明提供了通过喂给动物(例如鸟类，诸如家禽，例如鸡)用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶处理的或包含这些酶的食品或饲料，来增加生长速度和/或饲料转化的方法。一方面，本发明提供了通过喂给动物(例如鸟类，诸如家禽，例如鸡)用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶处理的或包含这些酶的食品或饲料，来减少排泄物的方法。本发明的食品或饲料包含食品强化剂和食物添加剂，无论对动物或人。
【0089】本发明提供了动物(例如家禽，例如鸡)或人的食品、饲料、食物添加物或补充物和/或营养补充物，其包含本发明的多肽，例如本发明的核酸编码的多肽。一方面，食品、饲料、食物添加物或补充物和/或营养补充物中的多肽可以被糖基化。食品、饲料、食物添加物或补充物和/或营养补充物可包括任何可食用植物，包括用于任何动物，包括反刍动物的草料和/或饲料的任何植物原料，例如干草、玉米(例如青贮)、水稻、粟米、大豆、小麦、荞麦、大麦、紫花苜蓿、黑麦、一年生草(包含饲草高粱、苏丹草、费尔德草原的草(veldt grass)、绿毛蒺藜草等)等等。本发明的食品、饲料、食物添加物或补充物和/或营养补充物还可以是食品、饲料或草料原料的一部分，或者可以添加至食品、饲料或草料原料，例如反刍动物，包括山羊、绵羊、牛/奶牛、野牛和骆驼等等的食品、饲料或草料原料。本发明的酶可被添加至、混合至或喷洒至草料原料、食品或饲料，参见例如美国专利号4,627,338；可选地，本发明的食品、饲料或草料原料可包括表达一种或多种本发明的酶的转基因植物原料。
【0090】本发明提供了可食用的酶输送基质，其含有本发明的多肽，例如，由本发明的核酸编码的多肽。一方面，该输送基质包括丸剂，其包含本发明的酶，例如包含本发明的耐热或热稳定酶的丸剂。一方面，多肽可被糖基化(其在一方面可以使得酶更耐热或更热稳定)。一方面，葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性是耐热的。另一方面，葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性是热稳定的。
【0091】本发明提供了含有本发明的多肽的食品、饲料(例如动物饲料，例如单胃动物饲料，例如猪或禽类(例如鸡)饲料)或营养补充物。本发明提供了将葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶用作动物膳食中的营养补充物的方法，所述方法包括：制备含有葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的营养补充物，所述酶包含本发明多肽的至少25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250或更多个连续氨基酸；以及向动物施用所述营养补充物用以增加包含在被动物摄取的饲料或食品中的葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖的利用。动物可以是人、反刍动物或单胃动物。例如，动物可以是任何禽类或鸟类，例如鸡；或猪类，其包括家养猪(hog)、猪(pig)等等。通过在例如细菌、酵母、植物、昆虫、真菌和动物的生物体中表达编码葡聚糖酶的多核苷酸，可以制备葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。用于表达本发明的多肽的示例性生物可以是粟酒裂殖酵母(S.pombe)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母属某种(Pichia sp.)例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，大肠杆菌(E.coli.)、链霉菌属某种(Streptomyces sp.)、杆菌属某种(Bacillus sp.)和乳酸杆菌属某种(Lactobacillus sp.)。
【0092】本发明提供了可食用的酶输送基质，其包含热稳定的重组葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，如本发明的多肽。本发明提供了向动物(人、反刍动物、单胃动物、鸟类例如鸡)输送葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶补充物的方法，所述方法包括制备丸剂形式的可食用的酶输送基质，其包含粒状可食用载体以及热稳定的分离的、合成的或重组的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，其中所述丸剂容易将包含在其中的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶分散入含水介质中，以及向所述动物施用该可食用酶输送基质。重组葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，可以包括本发明的多肽。颗粒状可食用载体可包含选自如下的载体：谷物胚芽，无油谷物胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、大豆壳、向日葵花籽粕和次粉(wheat midd)。可食用载体可包含无油谷物胚芽。葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可被糖基化，以在压丸条件下提供热稳定性。该输送基质可以通过对含有谷物胚芽和葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的混合物进行压丸而形成。压丸条件可包括蒸汽的应用。压丸条件可包括应用超过约80℃的温度约5分钟，而该酶保持每毫克酶至少大约350到大约900单位的比活性。
【0093】本发明提供了改善乳制品质地和风味的方法，该方法包括下列步骤：(a)提供本发明具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽，或本发明核酸编码的葡聚糖酶；(b)提供乳制品；和(c)将步骤(a)的多肽和步骤(b)的乳制品在其中所述葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以改善所述乳制品的质地和风味的条件下接触。一方面，乳制品包括奶酪或酸奶酪。本发明提供了包含本发明的或由本发明核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的乳制品。
【0094】本发明提供了改善从富油植物原料提取油的方法，该方法包括下列步骤：(a)提供本发明具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽，或本发明的核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；(b)提供富油植物原料；和(c)将步骤(a)的多肽与富油植物原料接触。一方面，富油植物原料包括富油种子。所述油可以是大豆油、橄榄油、菜籽油(油菜)或葵花油等等。
【0095】一方面，本发明提供了使用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶来产生可以转化成燃料乙醇的可发酵糖的方法。一方面，本发明提供了燃料，其包含一种或多种本发明的具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽，或本发明的核酸编码的葡聚糖酶。一方面，本发明的酶用于催化纤维素和半纤维素的水解。纤维素的降解可用于将植物生物质转化成燃料和化学物。参见例如Kohlmann(1996)Adv.Space Res.18：251-265；Perez(2002)Int Microbiol.5：53-63。
【0096】另一方面，包含于此所述的酶的植物原料可以用于生产燃料或能量的工业方法中。在植物中表达的酶可以被添加、混合或喷洒至原料材料。可选地，所述酶可直接在原料材料中表达。在一个实施方式中，表达酶的植物原料可以被磨碎、碾碎、加热等处理，用以破坏含有酶的植物细胞或器官的物理完整性，从而释放酶以与底物接触。植物原料任选的——示例性——来源包括但不限于：玉米、紫花苜蓿、向日葵、油菜、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟米、大麦、水稻、松类、草类，如柳枝稷和芒(Miscanthus)、豆科作物，如豌豆、蚕豆和大豆、淀粉块茎/根，如马铃薯、甘薯、木薯、芋头、美人蕉和甜菜等。
【0097】本发明提供了用于制备水果汁或蔬菜汁、糖浆、浓汤或提取物的方法，该方法包括下列步骤：(a)提供具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或本发明的核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；(b)提供包含水果或蔬菜原料的组合物或液体；和(c)将步骤(a)的多肽与组合物接触，从而制备水果或蔬菜汁、糖浆、浓汤或提取物。
【0098】本发明提供了包含本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，或本发明的核酸编码的多肽的纸或纸产品或纸浆。本发明提供了用于处理纸以及纸浆或木浆的方法，该方法包括下列步骤：(a)提供具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或本发明的核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；(b)提供包括纸以及纸浆或木浆的组合物；和(c)在其中葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶能处理纸以及纸浆或木浆的条件下，将步骤(a)的多肽与步骤(b)的组合物接触。一方面，药物组合物作为消化助剂或抗微生物(例如抗沙门氏菌(Salmonella))剂。一方面，处理是预防疾病的。一方面，本发明提供口腔护理产品，其包含具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或本发明的核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。口腔护理产品可包括牙膏、牙科用乳膏、凝胶或牙粉、牙产品(odontic)、漱口水、刷牙前或刷牙后的漱口制剂、口香糖、止咳糖或糖果。本发明提供隐形眼镜清洗组合物，其包含具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明的多肽，或本发明的核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。
【0099】一方面，本发明提供了从动物消除包含葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖的微生物或保护动物免于所述微生物的方法，该方法包括施用本发明的多肽。所述微生物可以是包含葡聚糖的细菌，例如沙门氏菌(Salmonella)。
【0100】本发明的另一方面是制造本发明的多肽的方法。该方法包括将编码多肽的核酸引入宿主细胞，其中所述核酸被可操作地连接至启动子，并且在允许核酸表达的条件下培养宿主细胞。本发明的另一方面是制造具有在本发明的氨基酸序列中描述的序列的至少10个氨基酸的多肽的方法。该方法包括将编码多肽的核酸引入宿主细胞，其中所述核酸被可操作地连接至启动子，并且在允许核酸表达的条件下培养宿主细胞，从而产生多肽。
【0101】本发明的另一方面是产生变体的方法，该方法包含获得核酸，所述核酸具有本发明的序列，与其基本相同序列，与本发明的序列互补的序列，包括前述序列的至少30个连续核苷酸的片段；并且将序列中的一个或多个核苷酸改变至其它核苷酸、删除序列中的一个或多个核苷酸、或向序列添加一个或多个核苷酸。
【0102】本发明的另一方面是计算机可读介质，其上存储了本发明的核酸序列或多肽序列。本发明的另一方面是计算机系统，包括处理器和数据存储设备，其中所述数据存储设备上已经存储了本发明的核酸序列或多肽序列。本发明的另一方面是用于比较第一序列与参考序列的方法，其中所述第一序列是本发明的核酸序列或多肽序列。该方法包括通过使用比较序列的计算机程序读取第一序列和参考序列；和使用计算机程序确定第一序列与参考序列的差别。本发明的另一方面是用于鉴定本发明的核酸序列或多肽序列特征的方法，包括通过使用鉴定序列特征的计算机程序读取所述序列；和使用计算机程序鉴定序列特征。
【0103】而本发明的另一方面是催化多聚糖或其衍生物分解的方法，包括在促进葡聚糖分解的条件下，将含有葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖或其衍生物的样品与本发明的多肽接触的步骤。
【0104】本发明的另一方面是用于鉴定本发明多肽的片段或变体的分析，其中所述片段或变体保持本发明的多肽(例如酶或抗体)——包括本发明的示例性序列的酶功能(例如葡聚糖酶活性)。分析包括在允许多肽片段或变体发挥功能的条件下，将本发明的多肽与底物分子接触，并检测底物水平的降低或多肽与底物之间特定反应产物水平的增加，从而鉴定这些序列的片段或变体。
【0105】还在其它方面，本发明提供了包含具有本发明氨基酸序列的多肽的蛋白制备物，其中所述蛋白制备物是液体。本发明的还另一方面提供了包含具有本发明氨基酸序列的多肽的蛋白制备物，其中所述蛋白制备物是固体。
【0106】而本发明的另一方面提供了用于修饰小分子的方法，该方法包括将至少一种本发明的多肽与至少一种小分子混合，通过至少一种生物催化反应产生至少一种修饰的小分子的步骤，其中所述至少一种多肽具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性。
【0107】本发明的另一方面是编码具有葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的本发明多肽的序列的克隆载体。本发明的另一方面是包含编码本发明多肽的序列的宿主细胞。而在其它方面，本发明提供了能够在包含本发明的核酸或编码本发明多核苷酸的核酸的宿主细胞内复制的表达载体。
【0108】另一方面，本发明提供了面团调理的方法，该方法包括在足以调理面团的条件下，将面团与至少一种本发明的多肽接触。本发明的另一方面是饮料生产的方法，该方法包括在足以降低麦芽汁或啤酒的粘度或增加饮料透明度(例如澄清)的条件下，施用至少一种本发明的多肽。
【0109】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶用于在动物饲料(例如人、反刍动物、单胃动物、鸟类例如鸡的饲料)中分解高分子量葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖、或其它多糖。添加本发明的酶通过改善可消化性来刺激生长速度，还改善动物垃圾的质量。葡聚糖酶通过胃肠道发挥功能，来降低肠粘度和增加胰腺酶的扩散。另外，本发明的酶可用于处理饲料谷物的胚乳细胞壁和植物蛋白。本发明的一方面，本发明的新型酶被施用给动物，用于提高食物中葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖的利用。本发明酶的这种活性可用于分解不可溶的细胞壁原料，释出细胞壁内的营养，其随后可被动物利用。它还将半纤维素转化成营养糖，以使之前被俘获在细胞壁内的营养释放。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可产生可以是反刍动物微生物区系营养源的化合物。
【0110】本发明的另一方面提供了利用葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶作为动物膳食中食品或饲料添加剂或营养补充物的方法，该方法包括制备营养补充物，该营养补充物含有本发明的重组葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶酶，或其酶活性子序列，例如包含本发明氨基酸序列的至少三十、40、50、60、70、80、90或100或更多个连续氨基酸的子序列；以及将所述食品或饲料添加剂或营养补充物施用给动物来提高包含在被动物摄取的食品中的葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖的利用。
【0111】本发明的另一方面，提供了递送葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶补充物至动物的方法，其中该方法包括制备丸剂形式的可食用酶递送基质，其包含颗粒状可食用载体和热稳定重组或合成的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，其中所述颗粒容易将其中含有的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶分散至含水介质中；以及将可食用酶递送基质施用给动物。颗粒状可食用载体可包含选自如下的载体：谷物胚芽，无油谷物胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、大豆壳、向日葵花籽粕和次粉。葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可具有本发明的氨基酸序列。
【0112】本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸，其中所述核酸编码至少一种具有葡聚糖酶活性的多肽，或编码能够产生特异性结合至具有SEQ ID NO：2序列的多肽的抗体的多肽或肽，所述序列包含下列基于SEQ ID NO：1的变化：
(A)在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，以及在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG；
(B)在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，以及在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG；
(C)在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，以及在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT；
(D)在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，以及在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG；
(E)在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，以及在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG；
(F)在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，以及在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG；
(G)在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，以及在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG；
(H)SEQ ID NO：1的位置112至114的等同位置的核苷酸被改变为TAT或TAC，SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，SEQ IDNO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，以及SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG；
(I)SEQ ID NO：1的位置112至114的等同位置的核苷酸被改变为TAT或TAC，SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ IDNO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，以及SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG；
(J)SEQ ID NO：1的位置112至114的等同位置的核苷酸被改变为TAT或TAC，SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ IDNO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，以及SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT；
(K)SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ IDNO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，以及SEQ ID NO：1的位置901至903的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG；
(L)SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，SEQ ID NO：1的位置211至213的等同位置的核苷酸被改变为TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，SEQ IDNO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，以及SEQ ID NO：1的位置901至903的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG；
(M)SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，SEQ ID NO：1的位置208至210的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，SEQ ID NO：1的位置211至213的等同位置的核苷酸被改变为TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，SEQ IDNO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，以及SEQ ID NO：1的位置901至903的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG；或
(N)SEQ ID NO：1的位置112至114的等同位置的核苷酸被改变为TAT或TAC，SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，SEQ IDNO：1的位置211至213的等同位置的核苷酸被改变为TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，SEQ ID NO：1的位置691至693的等同位置的核苷酸被改变为ATT、ATC或ATA，SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，以及SEQ ID NO：1的位置901至903的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG；
【0113】本发明提供了分离的、合成的或重组的具有葡聚糖酶活性的多肽，或这样的多肽或肽——该多肽或肽能够产生特异性结合至具有SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23序列的多肽的抗体，所述序列包括下列基于SEQ ID NO：2的变化：
(A)在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，以及在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸；
(B)在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，以及在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸；
(C)在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，以及在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸；
(D)在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，和在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺；
(E)在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，在位置297的苏氨酸是脯氨酸，以及在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺；
(F)在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，在氨基酸位置70的天冬氨酸是脯氨酸，在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，以及在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺；
(G)在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，在氨基酸位置231的亮氨酸是缬氨酸，在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，以及在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺；
(H)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的氨基酸被改变为酪氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸以及甲硫氨酸276丙氨酸；
(J)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的氨基酸被改变为酪氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，以及在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸；
(K)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的氨基酸被改变为酪氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，以及在等同SEQID NO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸；
(L)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，在等同SEQID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，以及在等同SEQID NO：2氨基酸位置301苏氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺；
(M)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，在等同SEQID NO：2氨基酸位置71精氨酸的氨基酸被改变为丝氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，在等同SEQ IDNO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，以及在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置301苏氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺；
(N)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，在等同SEQID NO：2氨基酸位置70天冬氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置71精氨酸的氨基酸被改变为丝氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，在等同SEQ IDNO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，以及在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置301苏氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺；
(O)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的氨基酸被改变为酪氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，在等同SEQID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置71精氨酸的氨基酸被改变为丝氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置231亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，在等同SEQ IDNO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，以及在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置301苏氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺。
【0114】本发明提供了本发明的分离的、合成的或重组的核酸(包含本发明编码葡聚糖酶的核酸)，其中在隐蔽性转录起始位点中的核苷酸残基被修饰以消除大部分或所有截短转录体的产生。一方面，在隐蔽性转录起始位点中的核苷酸残基修饰包括核糖体结合位点(RBS)的改变，例如在隐蔽性转录起始位点中的核苷酸残基修饰包括在SEQ ID NO：3的残基77至106中的下列修饰：
ATGAGGGCGACTGGGGAGTCGTGATAAAAG，或等同修饰。
【0115】本发明提供了本发明的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述多肽进一步包括信号序列(前导肽)和酶之间的附加氨基酸残基；和一方面，附加氨基酸残基包括Glu-Ala，例如附加氨基酸残基Glu-Ala加入在SEQ ID NO：2的残基XX和YY之间，例如附加氨基酸残基Glu-Ala加入在SEQ ID NO：2的残基K-R之间，如下所示：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRGVDPFERNKILGRGINI(来自SEQ IDNO：2)。
在钻井(Drilling)和工业过程中使用聚合物降解酶
【0116】本发明提供了在油、气和相关钻井过程以及油和气井洗涤和/或压裂过程中，使用聚合物降解酶，例如多糖降解酶的组合物和方法。
【0117】本发明提供了这样的组合物和方法，其使用聚合物降解酶来改变多糖增稠剂(例如瓜尔胶)的流变性质，例如，作为对凝胶和絮凝物、粘合剂、润滑剂中的多糖进行改性的酶，作为膜性质的改性剂，并具有作为这些组合物中流变参数调节剂的功能。
【0118】一方面，聚合物降解酶，例如多糖(例如淀粉)降解酶，用于实施本发明，包括任何淀粉酶、葡聚糖酶、黄原胶酶、糖苷酶和/或纤维素酶，其包括于此所述的酶和/或其它酶的“混合物”(“cocktail”)。一方面，由本发明的组合物(包含酶的混合物)和方法降解的聚合物包括木质素、淀粉、纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、瓜尔胶、衍生的瓜尔胶、角豆胶、β-葡聚糖和β-葡聚糖衍生物、黄原胶、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆或黄原胶聚合物或其衍生物，例如瓜尔硼酸盐和/或其组合。
【0119】在一个实施方式中，本发明提供了包含使用酶的混合物(“混合物(cocktail)”)的方法，所述酶混合物包括至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多种或所有选自如下的酶：木质素降解酶、α淀粉酶、β淀粉酶、葡糖淀粉酶、糊精酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、漆酶、木质素过氧化物酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、黄原胶裂解酶、黄原胶解聚酶、支链淀粉酶、地衣多糖酶、茯苓聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、蛋白质酶、肌醇六磷酸酶、肽酶和触酶。
【0120】例如，在一个实施方式中，使用酶的混合物(“混合物(cocktail)”)的本发明方法用于降解瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆、瓜尔胶、瓜尔胶粉末、瓜尔豆种子的木质化外皮或固化的瓜尔胶；以及一方面，该方法包括提供聚合物降解酶的混合物，其中至少一种酶是聚合物降解酶，并且任选地，所述聚合物降解酶是木质素降解酶、木质素过氧化物酶、多糖降解酶、蛋白质降解酶、淀粉酶、黄原胶酶、葡聚糖酶、蛋白酶、糖苷酶和/或纤维素酶；并且将酶的聚合物降解混合物添加至瓜尔胶、瓜尔胶粉末、瓜尔豆种子的木质化外皮或固化的瓜尔胶，添加的量足以降解瓜尔胶、瓜尔胶粉末、瓜尔豆种子的木质化外皮或固化的瓜尔胶。
【0121】在另一个实施方式中，本发明提供了使用酶的混合物(“混合物(cocktail)”)用于钻井或油和气井洗涤和/或压裂方法的方法；并且一方面，混合物(“混合物(cocktail)”)包括聚合物降解酶，并且任选地，至少一种聚合物降解酶是木质素降解酶、木质素过氧化物酶、多糖降解酶、蛋白质降解酶、淀粉酶、黄原胶酶、葡聚糖酶、蛋白酶、糖苷酶和/或纤维素酶；并且将酶的聚合物降解混合物添加至瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆、瓜尔胶、瓜尔胶粉末、瓜尔豆种子的木质化外皮或固化的瓜尔胶，添加量足以降解瓜尔胶、瓜尔胶粉末、瓜尔豆种子的木质化外皮或固化的瓜尔胶。一方面，被降解的聚合物包括木质素、淀粉、纤维素、瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆或黄原胶聚合物或其衍生物，如瓜尔豆硼酸盐，和/或其组合。
【0122】一方面，本发明的组合物和方法用于降解聚集在油和/或气井的井筒壁上的“泥饼”(也称为“滤饼”)，通过在油井钻井流体以及油和气井洗涤和/或压裂过程中夹带聚合物降解酶例如多糖(例如淀粉)降解酶，并且通过pH调节引发它们的作用来实现。一方面，被降解的聚合物包括木质素、淀粉、纤维素、瓜尔豆或黄原胶。
【0123】在一个实施方式中，本发明提供了将聚合物降解酶(参见下文)夹带入用于油和气钻井操作的钻井流体和/或油和气井洗涤和/或压裂流体中。一方面，通过用酸溶液处理沉积在岩层中的固体残留物(泥饼或滤饼)来引发聚合物降解酶的活性。
【0124】在可选实施方式中，实施本发明的组合物和方法的优点可以是：a)提供在泥饼(也称为“滤饼”)内更好的酶分布，这将导致更加均匀有效地去除泥饼，b)通过消除独立的酶递送步骤来简化操作(酶包括在钻井流体制剂和/或用于油和气井洗涤和/或压裂的流体中)，和c)由于酶不用酸性流体配制，消除了对缓冲盐的需要。
【0125】在可选实施方式中，聚合物降解酶，其包括淀粉酶、葡聚糖酶、黄原胶酶、糖苷酶、任何淀粉降解酶、任何纤维素酶和/或蛋白酶，例如于此所述的，被添加至在油和气井钻井操作或油和气井洗涤和/或压裂过程中使用的钻井流体和/或油和气井洗涤和/或压裂流体中。这些流体可含有淀粉作为增稠剂，并且可以被配制为相对高的碱度(pH＝9-9.5)。由于所述流体的碱度(在该实施方式中)，酸性至中性的酶在流体以及流体失去水后在岩层表面形成的泥饼(“滤饼”)中保持无活性状态。为了激活酶，可用酸性溶液洗涤泥饼。所述酸将中和泥饼的碱度，并提供激发对淀粉或其它聚合物的酶活性和水解功能的酸性环境。在该可选实施方式中，“酸洗涤”是必要的步骤，并且可在钻井操作和/或井清洗操作(包括油和气井洗涤和/或压裂过程)期间应用，以从岩层上去除碳酸钙沉积物。一旦被(酸性环境)激活，酶降解淀粉或其它聚合物，并且将从井筒去除泥饼。
【0126】在一项操作中，该井筒“洗涤”是钻井操作和/或油和气井洗涤和/或压裂操作的最后步骤，并且通过实施本发明组合物和方法进行的泥饼(“滤饼”)的完全降解可使井具有最佳生产率。
【0127】一方面，用于实施本发明的聚合物降解酶包括任何淀粉酶、黄原胶酶、糖苷酶、葡聚糖酶、蛋白酶和/或纤维素酶，其包括使用这些酶和其它酶的混合或“混合物(cocktails)”。
【0128】本发明的组合物和方法包括使用分离的、合成的或重组的核酸，该核酸包含在至少大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500或更多残基的区域内，与用于实施本发明的示例性核酸具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或更多或完全的(100％)序列同一性的核酸序列，所述用于实施本发明的示例性核酸包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22；以及SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22的示例性变体；其中这些核酸编码至少一种具有淀粉酶活性(特别是基于示例性SEQ ID NO：14的种类)，和/或糖苷酶或纤维素酶活性，例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性(特别是基于示例性SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：1所述变体(包括SEQ ID NO：3)，和/或SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ IDNO：22的种类)和/或黄原胶酶活性的多肽。一方面，所述序列同一性通过运用了序列比较算法的分析或通过视觉观察来确定。
【0129】用于实施本发明组合物和方法的核酸可编码具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23的氨基酸序列的多肽；和SEQ ID NO：1的示例性核酸变体例如SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23分别的示例性氨基酸变体)。一方面，这些多肽具有淀粉酶活性(特别是基于示例性SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的种类)和/或糖苷酶或纤维素酶活性，例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性(特别是基于示例性SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ IDNO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ ID NO：13(由SEQ IDNO：12编码)、SEQ ID NO：17(由SEQ ID NO：16编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ IDNO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQID NO：22编码)的种类)和/或黄原胶酶活性。
【0130】本发明的组合物和方法包括使用分离的、合成的或重组的多肽，所述多肽具有淀粉酶活性(特别是基于示例性SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的种类)，和/或糖苷酶或纤维素酶活性，例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性(特别是基于示例性SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ IDNO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：17(由SEQ ID NO：16编码)、SEQ IDNO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)的种类)和/或黄原胶酶活性。
【0131】在一个实施方式中，用于本发明实践的多肽——无论单独或以本发明的(“混合物”)，包括能催化包含葡萄糖单体的多糖例如淀粉(由1，4-α或1，6-α键连接的葡萄糖单体的聚合物)水解的淀粉酶。一方面，多肽具有淀粉酶活性，例如α淀粉酶活性、内切淀粉酶活性或葡糖淀粉酶活性；于此使用的术语“淀粉酶”还包括催化多糖例如淀粉水解的酶活性。用于实施本发明的淀粉酶包括具有α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性、外切淀粉酶活性、葡聚糖α-麦芽四糖水解酶活性、麦芽糖酶活性、异麦芽糖酶活性、葡聚糖1，4α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶活性、蔗糖酶活性或琼脂糖酶活性(例如β-琼脂糖酶活性)的多肽。例如，用于实践的淀粉酶包括具有α-淀粉酶活性的多肽，包括水解淀粉中的内α-1，4-糖苷键产生较小分子量的麦芽糊精的能力。一方面，所述α-淀粉酶活性包括随机水解淀粉中的内α-1，4-糖苷键。用于实践的淀粉酶包括具有葡糖淀粉酶活性的多肽，例如水解由α-1，4-和α-1，6-糖苷键连接的葡萄糖聚合物的能力。一方面，用于实践的淀粉酶包括具有葡糖淀粉酶活性的多肽，其水解内α-1，4-糖苷键以产生较小分子量的麦芽糊精。用于实践的淀粉酶包括具有葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶活性，或1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性的多肽，1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶通常称为葡糖淀粉酶，也称为淀粉葡糖苷酶和γ-淀粉酶，其在一方面，从1，4-α-、1，6-α-和1，3-α-联接的葡聚糖释放β-D-葡萄糖。用于实践的淀粉酶包括具有外切淀粉酶活性的多肽。
【0132】本发明包含酶的组合物可包含一种于此描述的多糖降解酶，或可包含一种、两种、三种、四种或更多种于此描述的任何多糖降解多肽的混合物(“混合物(cocktail)”)，包括基于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2示例性变体、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23的种类。用于实践本发明的组合物可包含一种、两种、三种、或更多种于此描述的多肽，包括基于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：2示例性变体、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ IDNO：23的种类，和其它酶的任何组合，所述其它酶例如色氨酸酶或酪氨酸脱羧酶、漆酶、触酶、漆酶、其它纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-漆酶、淀粉葡糖苷酶、其它葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂肪酶、磷酸脂酶、脂肪氧化酶、β-漆酶秒、内切-β-1，3(4)-漆酶、角质酶、过氧化物酶、淀粉酶、黄原胶酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯树胶酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木漆酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、肽酶、蛋白质酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、其它纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。
【0133】本发明提供了用于改性或调节多糖增稠剂；凝胶、絮凝物、粘合剂或润滑剂中的多糖增稠剂；或膜中的多糖的流变性质，以对膜性质进行改性的方法，该方法包括：
(I)提供至少一种聚合物降解(“聚合物破坏”)酶，其包括
(a)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在至少大约20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多残基的区域内，与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22，和/或SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、EQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22的示例性变体具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或完全的序列同一性，其中所述核酸序列编码至少一种具有聚合物降解活性或淀粉酶、黄原胶酶、葡聚糖酶、蛋白酶和/或糖苷酶或纤维素酶活性的多肽，
以及任选地，所述序列同一性通过运用了序列比较算法的分析或通过视觉观察来确定；或
(b)核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22，和/或SEQ ID NO：1示例性变体的核酸杂交，其中所述核酸编码具有聚合物降解活性或淀粉酶、黄原胶酶、葡聚糖酶、蛋白酶和/或糖苷酶或纤维素酶活性的多肽，并且严格条件包括洗涤步骤，包括在0.2×SSC中在大约65℃的温度洗涤大约15分钟，
以及任选地，该核酸的长度至少约20、30、40、50、60、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多残基，或基因或转录体的全长；
(c)多肽，其具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23，以及SEQID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23的示例性变体的序列；或
(d)分离的、合成的或重组的多肽，其具有聚合物降解活性，或淀粉酶、黄原胶酶、葡聚糖酶、蛋白酶和/或糖苷酶或纤维素酶活性，并且具有在至少大约20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、150、200、250、300或更多残基的区域内，与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23，以及SEQ ID NO：2、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23的示例性变体具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或100％序列同一性的氨基酸序列，
其中任选地，所述序列同一性通过运用了序列比较算法的分析或通过视觉观察来确定，以及任选地，序列比较算法是BLAST 2.2.2版本算法，其中过滤设置(filteringsetting)被设置为blastall-p blastp-d“nr pataa”-F F，并且所有其它选项被设置为默认值。
(e)多肽，其具有(a)至(d)的氨基酸序列，并且保持酶活性和包括至少一个氨基酸残基保守置换，
其中任选地保守置换包括用另一个脂肪族氨基酸代替脂肪族氨基酸；用苏氨酸代替丝氨酸或反之亦然；用另一个酸性残基代替酸性残基；用另一个带有酰胺基的残基代替带有酰胺基的残基；用另一个碱性残基交换碱性残基；或用另一个芳香族残基代替芳香组残基，或其组合，
和任选地所述脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成的等同物；酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等同物；包括酰胺基的残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等同物；碱性残基包括赖氨酸、精氨酸或其合成的等同物；或芳香族残基包括苯丙氨酸、酪氨酸或其合成的等同物；以及
(II)将所述酶添加至多糖增稠剂；凝胶、絮凝物、粘合剂或润滑剂中的多糖增稠剂；或膜中的多糖，从而调节或改性凝胶、絮凝物、粘合剂、润滑剂或膜的性质。
本发明的一个或多个方面的细节如附图和下面的描述所示。本发明的其它特征、目标和优点将通过阅读说明书和附图以及权利要求而更加清楚。
此处引述的所有出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏物均被特意地引入，以作为参考，用于所有目的。
附图简述
【0134】下面的附图是本发明的各方面的例证性说明，而不意图限制权利要求书所包括的本发明的范围。
【0135】图1是一个计算机系统的框图。
【0136】图2是一个流程图，该图示意性说明了用于将新核苷酸或蛋白序列与序列数据库进行比较以确定该新序列与数据库中序列之间的同源性水平的过程的一个方面。
【0137】图3是一个流程图，该图示意性说明了在计算机中确定两个序列是否同源的过程的一个方面。
【0138】图4是一个流程图，该图示意性说明了检测序列中特征的存在的鉴定过程300的一个方面。
【0139】图5是一个表，该表概括了在各种条件下，几种本发明示例性酶的相关活性。
【0140】图6是示例性数据组(“样品数据”)以图形数据进行的说明，其以“标准曲线”例证性说明，如实施例3所述。
【0141】图7例证性说明了葡聚糖酶活性分析结果，显示了由SEQ ID NO：2编码的本发明示例性葡聚糖酶的温度曲线，如实施例4所述，见下文。
【0142】图8例证性说明了葡聚糖酶活性分析结果，显示了由SEQ ID NO：2编码的本发明示例性葡聚糖酶的半衰期测定，如实施例4所述，见下文。
【0143】图9例证性说明了显示本发明的示例性变体热耐受性的数据，其中测定并比较了纯化的亲本“野生型”SEQ ID NO：2和7X变体的活性，如实施例5所述，见下文。
【0144】图10例证性说明了表明本发明的示例性变体热耐受性的数据，其中测定并比较了纯化的亲本“野生型”SEQ ID NO：2和7X变体的活性，如实施例5所述，见下文。
【0145】图11例证性说明了使用未修饰“野生型”(wild type，WT)和本发明的示例性修饰(变体)转录体产生的凝胶大小转录体的照片，来显示RBS和第二起始位点改变对葡聚糖酶转录表达的影响，如实施例6所述，见下文。
【0146】图12例证性说明了在粒化温度的范围内，本发明的这两种酶的热稳定性，如实施例8所述，见下文。
【0147】图13，两个密码子被插入至SEQ ID NO：2酶(葡聚糖酶)编码序列的第二(2nd密码子)和α因子信号序列(前导序列)之间，如实施例9所述，见下文。
【0148】图14A例证性说明了命名为“12X-6”和“13X-1”的本发明的毕赤酵母(Pichia)表达的葡聚糖酶的N-末端测序结果；图14A例证性说明了SDS-PAGE凝胶的放射显影图，显示了由不一致信号加工引起的葡聚糖酶双条带；图14B例证性说明了SDS-PAGE凝胶的放射显影图，显示了SDS-PAGE凝胶37kDa条带所代表的蛋白，该条带被切割并测序，如实施例9所述，见下文。
【0149】在不同的附图中同样的标记符号表示同样的要素。
发明详述
【0150】本发明提供了多肽，编码它们的多核苷酸以及制备和使用它们的方法，所述多肽包括SEQ ID NO：2，由例如SEQ ID NO：1编码、SEQ ID NO：7(由SEQ IDNO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ IDNO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，以及如本文所述的对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的具体修饰。本发明多肽的酶活性包括具有水解酶活性例如葡聚糖酶活性的多肽，例如，能够水解存在于葡聚糖中的糖苷键例如催化内β-1，4-糖苷键水解的多肽。本发明的多肽和肽(包括酶和抗体)的酶活性包括具有葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性的多肽。所述多肽和肽(包括酶和抗体)可用于制造和/或加工食品、饲料(例如用于人、反刍动物、单胃动物、鸟类例如鸡)、饮料、营养补充物、纺织品、洗涤剂等等。本发明的多肽和肽(包括酶和抗体)可以用于药物组合物和食用助剂。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶在食品加工、烘焙、动物饲料或食品、饮料、洗涤剂、浆加工和纸加工中有用。
产生和操作核酸
【0151】本发明了提供分离的、重组的和合成的核酸，其包括本发明的示例性核酸，例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22，以及具有如本文所述的具体修饰的序列，和与示例性核酸具有序列同一性的序列；编码本发明多肽的核酸，例如在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23示出的示例性氨基酸序列和具有如本文所述的具体修饰的序列。
【0152】本发明的示例性核酸包括为SEQ ID NO：2的序列变异的多肽，如下面表1(和表2，参见实施例5)中列出(概括)的。在该表1中，“起始密码子”是指如在“亲本”序列SEQ ID NO：1中的密码子，以及“起始氨基酸”是指如在“亲本”多肽SEQID NO：2中的氨基酸残基：
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Figure A20078003687101171
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【0153】本发明还提供了表达盒，例如含有本发明的核酸的表达载体，其包括编码本发明多肽的多核苷酸。本发明还包括使用本发明的核酸发现新的葡聚糖酶序列的方法。本发明还包括使用本发明的核酸抑制葡聚糖酶基因、转录体和多肽表达的方法。还提供了修饰本发明的核酸的方法，通过例如合成连接重装配、优化的定向进化系统和/或饱和诱变进行。
【0154】本发明的核酸可以通过，例如cDNA文库的克隆和表达、通过PCR进行的信息或基因组DNA扩增以及类似的技术来制备、分离和/或操作。于此使用的短语“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或者寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸中任意一种的片段，或者基因组的或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链，并且可以代表正义链或反义链，还包括肽核酸(PNA)或者天然或合成来源的任何DNA样或RNA样的物质。短语“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或者寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸中任意一种的片段，或者基因组的或合成来源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、iRNA)，它们可以是单链或双链，并且可以代表正义链或反义链，还包括肽核酸(PNA)或者天然或合成来源的任何DNA样或RNA样的物质，例如包括iRNA、核糖核蛋白(例如双链iRNA，例如iRNPs、siRNA或miRNA)。该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，例如寡核苷酸。该术语也包括具有合成骨架的核酸样结构，例如参见Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144：189-197；Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：153-156。“寡核苷酸”或者包括单链的多脱氧核苷酸，或者包括两个互补的多脱氧核苷酸链，它们可以是化学合成的。这样的合成的寡核苷酸没有5’磷酸，因此如果不在存在激酶的情况下采用ATP添加磷酸，该合成寡核苷酸便不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸可以连接到没有被去磷酸化的片段上。
【0155】特定多肽或蛋白的“编码序列”或编码特定多肽或蛋白的“核苷酸序列”是这样的核酸序列，其当置于合适的调节序列的调控下时被转录和翻译成多肽或蛋白质。术语“基因”意指在产生多肽链中所涉及的DNA片段；其包括编码区之前的区域和之后的区域(前导区(leader)和尾区(trailer))，以及在适用的情况下，可以包括各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。正如此处所用，“可操作地连接”是指两个或更多个核酸(例如DNA)片段之间的功能关系。通常地，“可操作地连接”可以指转录调控序列与被转录序列的功能关系。例如，如果启动子刺激或调节编码序列例如本发明的核酸在适当的宿主细胞或其它表达系统中的转录，那么该启动子便是可操作地连接到编码序列。通常，可操作地连接到被转录序列的启动子转录调控序列与被转录序列是物理上相邻的，即它们是顺式作用。然而，一些转录调控序列，如增强子，不需要与编码序列物理相邻或者位于与编码序列接近的位置，但这些转录调控序列仍能增强编码序列的转录。
【0156】在本发明方法的实践中，同源基因可以通过操纵模板核酸加以修饰，如同在文中所描述的。本发明可以与本技术领域已知的任何方法或程序或设备一起实践，这些方法、程序或设备在科学和专利文献中有充分的描述。
【0157】该分离的核酸可以包含DNA，包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。可选地，该分离的核酸包含RNA。本发明分离的核酸用于制备本发明的多肽或其片段。这些核酸的编码序列可以与本发明的核酸之一的编码序列之一相同或者可以是不同，这是遗传密码子的冗余性或简并性的结果。遗传密码子对于本领域技术人员是熟知的，并可以例如在B.Lewin，Genes VI，Oxford University Press，1997的第214页上得到。
【0158】编码本发明其中一个多肽的分离的核酸包括但不限于：仅本发明的核酸的编码序列和另外的编码序列，例如前导序列或蛋白原序列(proproteinsequences)，以及非编码序列，例如内含子，或编码序列的5′和/或3′非编码序列。因此，如在本发明中所使用，术语“编码多肽的多核苷酸”包括多核苷酸，其包括多肽的编码序列以及包含另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
【0159】可选地，使用常规技术，例如定点诱变或本领域技术人员熟悉的其它技术，本发明的核酸序列可被诱变，以将沉默改变引入本发明的多核苷酸。如本文所使用，“沉默改变(silent changes)”包括，例如不改变由所述多核苷酸编码的氨基酸序列的改变。这样的改变可能是期望的，以通过引入在宿主微生物中频繁发生的密码子或密码子对而增加由宿主产生多肽的水平，该宿主含有编码所述多肽的载体。
【0160】本发明还涉及具有核苷酸改变的多核苷酸，所述核苷酸改变在本发明的多肽中导致氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短。使用技术例如定点诱变、随机化学诱变、外切核酸酶III删除和其它重组DNA技术，可以导入这样的核苷酸改变。可选地，这样的核苷酸改变可以是天然存在的等位基因变体，其通过鉴定在本文所提供的高严格条件、中度严格条件或低严格条件下特异性杂交到本发明探针的核酸而分离出，所述本发明探针为含有本发明的序列(包含其互补序列)之一的至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500或更多个连续碱基的序列。
一般技术
【0161】用于实践本发明的核酸，不管是RNA、iRNA(例如siRNA、miRNA)、反义核酸、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体，都可以从多种来源分离、进行遗传工程改造、扩增和/或表达/重组产生。从这些核酸产生的重组多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)可以被单独地分离或克隆，并且可测试其期望活性。可以使用任何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
【0162】可选地，这些核酸可以通过熟知的化学合成技术体外合成，正如例如在Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利4,458,066中所描述的。
【0163】用于操纵核酸的技术，例如亚克隆、标记探针(例如使用Klenow聚合酶的随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交以及类似的技术在科学和专利文献中有充分的描述，例如参见Sambrook编著，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(2ND ED.)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel编著，JohnWiley & Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITHNUCLEIC ACID PROBES，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
【0164】获得和操纵用于实践本发明的方法的核酸的另一个有用方法是从基因组样品中克隆，并且如果期望的话，筛选和再克隆插入物，插入物可以分离或扩增自例如基因组克隆或cDNA克隆。用于本发明的方法中的核酸的来源包括基因组或cDNA文库，所述文库可以包含在例如哺乳动物人工染色体(MACs)，例如参见美国专利5,721,118；6,025,155；人类人工染色体，例如参见Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15：333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体，例如参见Woon(1998)Genomics 50：306-316；P1来源的载体(PACs)，例如参见Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；粘粒、重组病毒、噬菌体或质粒中。
【0165】正如此处所用，术语“重组的”是指与“骨架”核酸相邻的核酸，这些核酸在其天然环境中与该“骨架”核酸是不相邻的。在某些方面，为了被富集，核酸表现为在核酸骨架分子——例如重组骨架分子——群体中有约1％、2％、3％、4％、5％、6％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、30％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多数量的核酸插入物。“骨架分子”包括核酸，如表达载体、自主复制核酸、病毒、整合核酸，以及用于维持或操纵感兴趣的核酸插入物的其它载体或核酸。
【0166】一方面，编码本发明的多肽的核酸与能指导翻译出的多肽或其片段的分泌的前导序列以适当的位置关系进行装配。本发明提供了融合蛋白和编码这些融合蛋白的核酸。本发明的多肽可以被融合到异源肽或多肽上，如N-末端鉴定肽，其给予了期望的特性，如增加的稳定性或简化的纯化特性。本发明的肽和多肽也可以作为融合蛋白被合成和表达，其中所述融合蛋白中连接有一个或多个额外的结构域，例如用于产生免疫原性更强的肽、以便更易于分离重组合成的肽、以便鉴定和分离抗体和表达抗体的B细胞，等等。有利于检测和纯化的结构域包括，例如金属螯合肽，如多组氨酸标记和组氨酸-色氨酸模块，其允许在固定的金属上纯化，还包括蛋白A结构域，其允许在固定的免疫球蛋白上纯化，还包括在FLAGS延伸/亲和纯化系统中所使用的结构域(Immunex Corp，Seattle WA)。在纯化结构域和含有基序的肽或多肽之间包含可切裂的连接子序列有助于纯化，这样的连接子序列例如Xa因子或肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)。例如，表达载体可以包括编码表位的核酸序列，其连接到六组氨酸残基上，还连接有硫氧还蛋白和肠激酶切割位点(例如参见Williams(1995)Biochemistry 34：1787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12：404-414)。组氨酸残基有助于检测和纯化，而肠激酶切割位点提供了将表位与融合蛋白的剩余部分纯化分离开的手段。关于编码融合蛋白的载体的技术以及融合蛋白的应用在科学和专利文献中进行了充分的描述，例如参见Kroll(1993)DNA Cell.Biol.，12：441-53。
【0167】术语“饱和诱变”或“基因位点饱和诱变”或“GSSM”包括使用简并寡核苷酸引物将点突变引入多核苷酸的方法，如在下面所详细描述的。术语“优化的定向进化系统”或“优化的定向进化”包括用于重新装配相关的核酸序列的片段的方法，所述的相关核酸序列例如相关的基因，下面对其进行了详细解释。术语“合成连接重装配”或“SLR”包括以非随机方式连接寡核苷酸片段的方法，下面进行了详细解释。
转录和翻译控制序列
【0168】本发明提供了可操作地连接到一个或多个表达(例如转录或翻译)控制序列上的本发明的核酸(例如DNA)序列，所述控制序列例如启动子或增强子，它们指导或调节RNA合成/表达。表达控制序列可以在表达载体中。示例性的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。示例性的真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR启动子以及鼠金属硫蛋白I启动子。
【0169】如本文所使用，术语“启动子”包括能够驱动编码序列在细胞中转录的所有序列。因此，在本发明的构建物中所用的启动子包括顺式作用转录控制元件和调节序列，它们涉及调节或调控基因转录的时间选择(定时)和/或速率。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5’和3’非翻译区或内含子序列，它们均涉及转录的调节。这些顺式作用序列通常与蛋白或其它生物分子互相作用来执行(打开/关闭、调节、调控等等)转录。“组成型”启动子是那些在大部分环境条件和发育状态或细胞分化状态下持续地驱动表达的启动子。“诱导型”或“可调控型”启动子在环境条件或发育条件的影响下指导本发明的核酸的表达。可以通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括无氧条件、增高的温度、干旱或光的存在。“组织特异性”启动子是仅仅在特定细胞或组织或器官中有活性的转录控制元件，例如在植物或动物的特定细胞或组织或器官中有活性。组织特异性调节可以通过某些内在因子来实现，这些内在因子确保编码对给定组织特异的蛋白的基因被表达。这样的因子已知存在于哺乳动物和植物中，以便允许特异性组织的发育。
【0170】适合于在细菌中表达多肽的启动子包括大肠杆菌(E.coli)lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子和λPL启动子、来自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)的操纵子的启动子以及酸性磷酸酶启动子。真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热激启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTRs、以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。也可以使用已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。适合于在细菌中表达多肽或其片段的启动子包括大肠杆菌lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、λPR启动子和λPL启动子、来自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)的操纵子的启动子、以及酸性磷酸酶启动子。真菌启动子包括α-因子启动子。真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热激启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTRs以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。也可以使用已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的任何启动子。
植物表达盒
【0171】本发明提供了可以任何方式在植物中表达的表达盒。本发明还提供了以任何方式表达本发明的酶的植物或种子。
【0172】术语“植物”包括全植物、植物部分(例如叶、茎、花、根等等)、植物原生质体、种子和植物细胞以及它们的后代。可以用于本发明的方法中的植物的种类很广泛，广泛至能用转化技术进行处理的高等植物，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)，以及裸子植物。它们包括各种倍数性水平的植物，包括多倍体、二倍体、单倍体和半合子植物。正如此处所用，术语“转基因植物”包括异源核酸序列已经被插入到其中的植物或植物细胞，所述异源核酸序列例如本发明的核酸和各种重组构建物(例如表达盒)。
编码序列和相邻序列的修饰
【0173】来自异源来源的基因在植物中的转基因表达可涉及这些基因的修饰，以实现和最优化它们在植物中的表达。特别地，编码单独的酶但由在天然微生物中相同转录体编码的细菌ORFs在植物中在单独的转录体上被最佳表达。为实现该目的，每个微生物ORF被单独分离并且克隆在表达盒中，该表达盒在ORF的5’末端提供植物启动子序列和在ORF的3’末端提供植物转录终止子。所分离的ORF序列优选地包括起始ATG密码子和终止STOP密码子，但可以包含起始ATG和STOP密码子以外的另外的序列。另外，ORF可以被截短，但仍保持所需的活性；对于特别长的ORFs，保持活性的截短的形式可优选用于在转基因生物中表达。对于“植物启动子”和“植物转录终止子”，其意图是指可在植物细胞内操作的启动子和转录终止子。这包括可来自非植物来源例如病毒(例子是花椰菜花叶病毒(Cauliflower MosaicVirus))的启动子和转录终止子。
【0174】在某些情况下，不需要对ORF编码序列和相邻序列的修饰。它足以分离含有感兴趣的ORF的片段和将它插入至植物启动子的下游。例如Gaffney等(Science 261：754-756(1993))已经在转基因植物中在CaMV启动子和CaMV tml终止子控制下成功表达假单胞菌(Pseudomonas)nahG基因，而没有对编码序列进行修饰并带有在假单胞菌基因的ATG上游仍附着的核苷酸，并且STOP密码子下游的核苷酸仍附着至nahG ORF。优选地，稍微相邻的微生物序列将保留附着至ATG上游和STOP密码子下游。在实践中，这种构建可依赖于限制性位点的可用性。
【0175】在其它情况下，来自微生物来源的基因表达可提出表达问题。这些问题已在本领域中充分描述，并对于来自某些来源例如杆菌(Bacillus)的基因特别常见。这些问题可适用于本发明的核苷酸序列，并且对这些基因的修饰可以使用本领域现在熟知的技术来进行。可能会遇到下列问题：
密码子使用
【0176】在植物中的优选密码子使用不同于在某些微生物中的优选密码子使用。在克隆的微生物ORF中的密码子使用与植物基因中(以及特别是来自目标植物的基因)使用的比较，将能够鉴定ORF中应优选地被改变的密码子。通常地，植物进化趋向于在单子叶植物第三个碱基位置强优选核苷酸C和G，而双子叶植物通常在这个位置使用核苷酸A或T。通过修饰基因以整合用于具体目标转基因物种的优选密码子使用，将可克服许多如下所述的GC/AT含量和不规则剪接的问题。
GC/AT含量
【0177】植物基因通常具有多于35％的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列可在植物中引起几个问题。首先，ATTTA基序被认为导致信息不稳定并且在许多短寿mRNA的3’末端发现。其次，在信息中不适当位置的多聚腺嘌呤信号例如AATAAA的出现被认为导致转录的过早截短。另外，单子叶植物可识别作为剪接位点的AT富含序列(见下文)。
临近起始甲硫氨酸的序列
【0178】植物不同于微生物，在于它们的信息不含有确定的核糖体结合位点。更确切地，据认为核糖体连接至信息的5’末端并且扫描第一个可用的ATG，在此处开始翻译。然而，据认为优选临近ATG的某个核苷酸并且微生物基因的表达可以通过在ATG包含真核生物共有翻译起始子来增强。Clontech(1993/1994目录，210页，通过引用引入本文)已提出一个作为共有翻译起始子用于在植物中表达大肠杆菌(E.coli)uidA基因的序列。此外，Joshi(N.A.R.15：6643-6653(1987)，通过引用引入本文)已比较许多临近ATG的植物序列并提出另一个共有序列。当在植物中表达微生物ORFs遇到困难的情况下，在起始ATG包含这些序列之一可改善翻译。在这些情况下，所述共有序列最后三个核苷酸可能不适于包含在所修饰的序列中，原因在于它们第二个AA残基的修饰。临近起始甲硫氨酸的优选的序列在不同植物物种之间可不同。对14个位于GenBank数据库的玉米基因的调查提供下列结果：
14个玉米基因中在起始ATG之前的位置：
  -10   -9   -8   -7   -6   -5   -4   -3   -2   -1
  C   3   8   4   6   2   5   6   0   10   7
  T   3   0   3   4   3   2   1   1   1   0
  A   2   3   1   4   3   2   3   7   2   3
  G   6   3   6   0   6   5   4   6   1   5
该分析可以对所期望的植物物种进行，该植物物种中正整合入核苷酸序列，并且邻近ATG的序列被修饰以整合入优选的核苷酸。
去除不合理剪接位点
【0179】克隆自非植物来源以及未被最优化用于植物中表达的基因还可含有在植物中作为5’或3’剪接位点被识别的基序，并被切割，从而产生截短的或删除的信息。可以使用本领域熟知的技术去除这些位点。
【0180】修饰编码序列和相邻序列的技术是本领域熟知的。在微生物ORF的起始表达低，并被认为适合对如上所述的序列做出改造的情况下，则可根据本领域熟知的方法完成合成基因的构建。这些方法是，例如，在公布的专利公开EP 0 385 962(授予Monsanto)、EP 0 359 472(授予Lubrizol)和WO 93/07278(授予Ciba-Geigy)中描述的，其全部通过引用引入本文。在大部分情况下，使用瞬时分析方案(其是本领域熟知的)在基因构建物转移至转基因植物之前分析基因构建物的表达是优选的。
植物启动子
【0181】本发明的组合物可包含在感兴趣的植物中用于转化和表达的核酸序列。所述核酸序列可存在于DNA构建物或表达盒中。于本文使用的“表达盒”指能够指导具体的核苷酸序列在适合的宿主细胞中表达的核酸分子，表达盒包括可操作地连接至感兴趣核苷酸序列的启动子，而感兴趣核苷酸序列被可操作地连接至终止信号。它还通常包括核苷酸序列的正确翻译所需的序列。编码区通常编码感兴趣的蛋白，还可在正义或反义方向编码感兴趣的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译RNA。包括感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意思是它的至少一种组分相对于它的至少一种其它组分是异源的。表达盒还可以是天然发生的，但已经以重组形式获得用于异源表达。但是，典型地，表达盒对于宿主是异源的，例如，表达盒的特定DNA序列不在宿主细胞中天然发生，必须已经通过转化事件被引入至宿主细胞或宿主细胞的祖先。表达盒中核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，其中只有当宿主细胞暴露于某些特定的外部刺激时，诱导型启动子才启动转录。另外，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段是特异的。
【0182】本发明包括具有能够表达多核苷酸的表达盒的植物的转化。所述表达盒在5′-3′的转录方向包含转录和翻译起始区(例如启动子)和感兴趣的多核苷酸。所述表达盒可任选地包括在植物中具有功能性的转录和翻译终止区(例如终止区)。在某些实施方式中，所述表达盒包括可选择的标记基因，以允许选择稳定的转录体。本发明的表达构建物还可包括前导序列和/或允许诱导型表达感兴趣多核苷酸的序列。参见Guo等(2003)Plant J.34：383-92和Chen等(2003)Plant J.36：731-40，其作为允许诱导型表达的序列的例子。
【0183】表达构建物的调节序列被可操作地连接至感兴趣的多核苷酸。“可操作地连接”指在启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并调节相应于第二序列的DNA序列的转录。通常地，可操作地连接意思是指被连接的核苷酸序列是相邻的。
【0184】能够驱动在感兴趣植物中表达的任何启动子可用于本发明的实践。所述启动子对植物宿主可以是天然的或类似的或外来的或异源的。术语“异源”和“外源”在本文使用时指核酸序列(例如DNA或RNA序列)或基因，是指源自对特定宿主细胞是外来的来源的序列或，如果来自相同来源，则从它的原始形式修饰而来。因此，宿主细胞中的异源基因包括对特定宿主细胞是内源但已被修饰的基因。该术语还包括天然发生的DNA序列的非天然发生的多个拷贝。因此，该术语是指这样的DNA片段，其对于细胞是外来的或异源的，或对于细胞是同源但处于在宿主细胞核酸中该元件通常不被发现的位置。表达外源DNA片段以产生外源多肽。
【0185】“同源”核酸(例如DNA)序列是这样的核酸(例如DNA或RNA)序列，其与被引入的宿主细胞天然相关。
【0186】待被包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于：效率、可选择性、可诱导性、所期望的表达水平和细胞或组织优选表达。对本领域普通技术人员来说，通过相对于要表达的序列合适地选择和定位启动子和其它调节区域来调节该序列的表达是常规事情。
【0187】某些合适的启动子仅仅或主要在某些细胞类型中起始转录。因此，如本文使用的，细胞类型或组织优选启动子是优选地在靶组织中驱动表达的启动子，但是还可在其它细胞类型或组织中引起某些表达。用于鉴别和表征植物基因组DNA的启动子区的方法包括例如在下列参考文献描述的方法：Jordano等，Plant Cell，1：855-866(1989)；Bustos等，Plant Cell，1：839-854(1989)；Green等，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier等，Plant Cell，3，309-316(1991)；和Zhang等，Plant Physiology110：1069-1079(1996)。
【0188】在植物中几种组织优选的调节基因和/或启动子已报道。一些报道的组织优选的基因包括编码种子贮藏蛋白(例如油菜籽蛋白、十字花科蛋白(cruciferin)、β-伴大豆球蛋白、以及菜豆蛋白、醇溶谷蛋白、谷蛋白、球蛋白和玉米醇溶蛋白)、玉米醇溶蛋白或油体蛋白(例如油质蛋白)的基因，或涉及脂肪酸生物合成(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fatty acid desatureses，fad2-1))的基因，以及其它在胚芽发育过程中表达的基因(例如Bce4，参见例如EP255378和Kridl等(1991)Seed Science Research，1：209)。组织特异启动子的例子——其已经被描述——包括植物凝集素(Vodkin，Prog.Clin.Biol.Res.，138；87(1983)；Lindstrom等，(1990)Der.Genet.，11：160)、玉米醇脱氢酶1(Dennis等，Nucleic AcidRes.，12：3983(1984))、玉米集光复合体(参见例如Simpson，(1986)Science，233：34；Bansal(1992(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3654)、玉米热休克蛋白(参见例如Odell等，(1985)Nature，313：810)、豌豆小亚基RuBP羧化酶(参见例如Poulsen等，(1986)Mol.Gen.Genet.，205：193-200；Cashmore等，(1983)Gen.Eng.of Plant，Plenum Press，New York，29-38)、Ti质粒甘露氨酸合成酶(参见例如Langridge等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3219-3223)、Ti质粒胭脂氨酸合成酶(Langridge等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3219-3223)、矮牵牛花查耳酮异构酶(参见例如vanTunen(1988(EMBO J.7：1257)、豆甘氨酸富含蛋白1(参见例如Keller(1989)Genes Dev.3：1639)、截短的CaMV 35s(参见例如Odell(1985)Nature 313：810)、马铃薯patatin(参见例如Wenzler(1989)Plant Mol.Biol.13：347)、根细胞(参见例如Yamamoto(1990)Nucleic Acid Res.18：7449)、玉米醇溶蛋白(参见例如Reina(1990)Nucleic Acid Res.18：6425；Lopes等(1995)Mol.Gen.Genet.247：603-613；Kriz(1987)Mol.Gen.Genet.207：90；Wandelt(1989)Nucleic Acid Res.，17：2354；Langridge(1983)Cell，34：1015；Reina(1990)Nucleic Acid Res.，18：7449)、ADP-gpp启动子(参见例如美国专利号7,102,057)、球蛋白-1(参见例如Belanger(1991)Genetics 129：863)、α-球蛋白(Sunilkumar等(2002)，Transgenic Res.11：347-359)、α-微管蛋白、cab(参见例如Sullivan(1989)Mol.Gen.Genet.，215：431)、PEPCase(参见例如Hudspeth和Grula，(1989)Plant Molec.Biol.，12：579-589)、R基因复合体相关启动子(R gene complex-associated promoter)(Chandler等，(1989)Plant Cell，1：1175)、豌豆球蛋白启动子(Czako等，(1992)Mol.Gen.Genet.，235：33；美国专利号5,625,136)、GTL1启动子(Takaiwa等(1991)Plant Mol.Biol.16(1)，49-58)、查耳酮合酶启动子(Franken等，(1991)EMBO J.，10：2605)、GY1启动子(Sims和Goldburg(1989)Nuc.Acid Res.17(11)4368)等等，所有文献通过引用引入本文。
【0189】在U.S.4,943,674中讨论了一种类型的水果-优选的启动子，其在水果发育时或发育期间不表达，至少直到成熟开始，所述公开通过引用引入于本文。聚半乳糖醛酸酶基因的启动子在水果成熟中具有活性。所述聚半乳糖醛酸酶基因在美国专利号4,535,060、美国专利号4,769,061、美国专利号4,801,590和美国专利号5,107,065中描述，所述公开通过引用引入本文。
【0190】组织-优选的启动子的其它例子包括那些在叶子遭到损害之后(例如，遭到咀嚼式昆虫损害)在叶细胞中、在块茎(例如patatin基因启动子)和在纤维细胞(发育调节纤维细胞蛋白的例子是E6(John和Crow(1992)PNAS 89：5769-5773)中指导表达的启动子。E6基因在纤维中是最具活性的，尽管在叶、胚珠和花中发现低水平的转录体。
【0191】在光合组织中具有活性以在绿色组织例如叶和茎中驱动转录的启动子，当它们仅仅或主要在这些组织中驱动表达时是合适的。可选地，所述启动子可在整个植物中进行组成型表达，或对于绿色组织进行差异表达，或对于发生表达的绿色组织的发育阶段进行差异表达，或响应于外部刺激而表达。
【0192】这种启动子的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，例如美洲落叶松(eastern larch)(Larix laricina)的RbcS启动子、松树cab6启动子(Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35：773-778)、小麦的Cab-1基因启动子(Fejes等(1990)Plant Mol.Biol.15：921-932)、菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedt等(1994)Plant Physiol.104：997-1006))、水稻的cab1R启动子(Luan等(1992)Plant Cell 4：971-981)、玉米的丙酮酸正磷酸盐二激酶(pyruvate orthophosphatedikinase，PPDK)启动子(Matsuoka等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：9586-9590)、烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等(1997)Plant Mol.Biol.33：245-255)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)SUC2蔗糖-H+同向转运体启动子(Truernit等(1995)Planta196：564-570)和菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbc)。其它在茎、叶和绿色组织中驱动转录的启动子在美国专利公开号2007/0006346中描述，其通过引用全部引入本文。
【0193】一些“组织优选的”启动子的组织特异性可能不是绝对的，并且可以用报告基因测试，例如Gus或绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白。还可通过不同组织优选的启动子的组合，用“渗漏”(“leaky”)表达实现组织优选的表达。其它组织优选的启动子可以由本领域普通技术人员分离(参见U.S.5,589,379)。
【0194】一方面，因暴露于植物激素——例如植物生长素而被诱导的植物启动子用于表达本发明的核酸。例如，本发明可使用大豆(Glycine max L.)中的植物生长素应答元件E1启动子片段(AuxREs)(Liu(1997)Plant Physiol.115：397-407)、植物生长素应答拟南芥GST6启动子(也对水杨酸和过氧化氢产生应答)(Chen(1996)Plant J.10：955-966)、烟草的植物生长素诱导型parC启动子(Sakai(1996)37：906-913)、植物生物素应答元件(Streit(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10：933-937)以及对应激激素脱落酸产生应答的启动子(Sheen(1996)Science274：1900-1902)。
【0195】本发明的核酸还可被可操作地连接至因暴露于可用于植物的化学试剂而诱导的植物启动子，所述化学试剂诸如除草剂或抗生素。例如，在化学配体——包括乙醇——存在下被激活的基因表达系统，例如可以在WO 96/27673、WO93/01294、WO 94/03619和WO 02/061102中发现，所有通过引用引入本文。可使用被苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子(De Veylder(1997)Plant CellPhysiol.38：568-577)；应用不同的除草剂安全剂诱导不同的基因表达模式，包括在根、水囊和茎端分生组织中的表达。编码序列可以在例如四环素-诱导型启动子——例如对于含有Avena sativa L.(燕麦)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物所述的(Masgrau(1997)Plant J.11：465-473)、雌激素——例如蜕皮激素受体(WO 01/52620)或水杨酸应答元件(Stange(1997)Plant J.11：1315-1324)的控制下。通过使用化学(例如激素或杀虫剂)诱导的启动子，即对可以在田野中应用于转基因植物的化学品产生应答的启动子，本发明多肽的表达可以在植物发育的特定阶段被诱导。
【0196】一些已被描述的组成型启动子的例子包括水稻肌动蛋白1(Wang等(1992)Mol.Cell.Biol.，12：3399；美国专利号5,641,876)、其它肌动蛋白同工型(McElroy等(1990)Plant Cell 2：163-171和McElroy等(1991)Mol.Gen.Genet.231：150-160)、CaMV 35S(Odell等(1985)Nature，313：810)、CaMV 19S(Lawton等(1987)Plant Mol.Biol.9：315-324；美国专利号5,639,949)、nos(Ebert等(1987)PNAS USA 84：5745-5749)、Adh(Walker等(1987)PNAS USA 84：6624-6628)、蔗糖合成酶(Yang和Russell(1990)PNAS USA 87：4144-4148)和泛素启动子(例如向日葵-Binet等(1991)Plant Science 79：87-94；玉米-Christensen等(1989)PlantMolec.Biol.12：619-632和拟南芥-Callis等，J.Biol.Chem.(1990)265：12486-12493；以及Norris等，Plant Mol.Biol.(1993)21：895-906。
【0197】各种转录终止子可用于表达盒。这些转录终止子负责转基因和正确的mRNA多聚腺苷酸化作用外的转录终止。该终止区可以对于转录起始区是天然的，可对于感兴趣的可操作连接的DNA序列是天然的，可对于植物宿主是天然的，或可获自另外的来源(即，对启动子、感兴趣的DNA序列、植物宿主或其任何组合是外来的或异源的)。适合的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶基因终止子以及豌豆rbcs E9终止子。这些转录终止子可用于单子叶植物和双子叶植物。另外，可使用基因的天然转录终止子。
【0198】已发现许多序列增强来自转录单位的基因表达，并且这些序列与本发明的基因联合用于增加它们在转基因植物中的表达。例如，已显示用各种内含子序列来增强表达，特别是在单子叶细胞中。例如，已经发现当被引入玉米细胞时，在同源启动子下，玉米Adhl基因的内含子显著增强野生型基因的表达。还众所周知的是，许多源自病毒的非翻译前导序列增强表达，并且这些内含子在双子叶细胞中特别有效。具体地，来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米退绿斑驳病毒(MCMV)和紫花苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已显示有效增强表达(例如Gallie等Nucl.Acids Res.15：8693-8711(1987)；Skuzeski等Plant Molec.Biol.15：65-79(1990))。
细胞内基因产物的靶向
【0199】在植物中已知的用于靶向基因产物的任何机制可用于实践本发明，并且控制这些机制发挥功能的序列已经被详细表征。已被表征为引起基因产物靶向至其它细胞区室的序列也可用于实践本发明。负责将感兴趣蛋白靶向至任何细胞区室——例如植物的液泡、线粒体、过氧化物酶体、蛋白体、内质网、叶绿体、淀粉颗粒、造粉体、质外体或细胞壁(例如Unger等，Plant Molec.Biol.13：411-418(1989)；Rogers等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6512-651；美国专利号7,102,057；WO 2005/096704，所有文献通过引用引入于此)的氨基端序列可以用于实践本发明。一方面，信号序列是waxy的N-末端信号序列、γ-玉米醇溶蛋白的N-末端信号序列、淀粉结合结构域、C-末端淀粉结合结构域、叶绿体靶向序列——其将成熟蛋白质输入至叶绿体(Comai等(1988)J.Biol.Chem.263：15104-15109；van den Broeck等(1985)Nature 313：358-363；美国专利号5,639,949)或糊粉细胞的分泌信号序列(Koehler和Ho，Plant Cell 2：769-783(1990))。另外，氨基末端序列与羧基末端序列一起负责基因产物的液泡靶向(Shinshi等(1990)Plant Molec.Biol.14：357-368)，可用于本发明实践。
【0200】一方面，选择的信号序列可包括已知的切割位点，并且构建的融合物应考虑在切割位点之后的任何氨基酸，其是切割所需的。在某些实施方式中，这种要求可以通过在切割位点和转基因ATG之间加入少量的氨基酸来实现，或可选地，替代转基因序列中的一些氨基酸。这些构建技术是本领域熟知的，并且可以相等地应用于任何细胞区室。上述的细胞靶向机制不但可以与它们的同源启动子，而且可以与异源启动子一起利用，以便在启动子的转录调节下实现特异性的细胞靶向目标，所述启动子具有不同于衍生出靶向信号的启动子的表达模式。
载体和克隆载体
【0201】本发明提供了包含本发明的核酸例如编码本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的序列的载体，包括克隆和表达载体，或任何克隆载体。本发明的表达载体和克隆载体可以包括病毒颗粒、重组病毒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒(phagemids)、粘粒、fos-质粒(fosmids)、细菌人工染色体、病毒DNA(例如疫苗、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和SV40的衍生物)、P1衍生的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和任何别的对感兴趣的特定宿主(例如假单胞菌、杆菌、曲霉和酵母)有特异性的载体。本发明的载体可以包括染色体、非染色体和合成的DNA序列。大量的合适的载体对于本领域技术人员都是已知的，并且可以商业获得。示例性的载体包括：细菌：pQE载体(Qiagen)、pBluescript质粒、pNH载体、λ-ZAP载体(Stratagene)；ptrc99a、PKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核细胞载体：PXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。然而，也可以使用任何其它质粒或其它载体，只要它们可以在宿主中复制和存活。可以在本发明中使用低拷贝数或高拷贝数的载体。
【0202】“质粒”可以商购得到，在不受限制的基础上可以公开获得，或可以根据已公开的方法由可获得的质粒来构建。与本文描述的那些质粒等价的质粒在本技术领域是已知的，并且对于普通技术人员是显而易见的。本文的起始质粒是可以商购得到，在不受限制的基础上可以公开获得，或可以根据已公开的方法由可获得的质粒构建。另外，与本文描述的那些质粒等价的质粒在本技术领域是已知的，并且对于普通技术人员是显而易见的。
【0203】表达载体可以包括启动子、用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也可以包括用于扩增表达的合适序列。哺乳动物表达载体可以包括复制起点、任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、5’侧翼非转录序列。在一些方面，衍生于SV40剪接子和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供所需要的非转录遗传元件。
【0204】一方面，本发明提供“表达盒”，其包括本发明的序列，例如“表达盒”可包括能影响核酸，例如结构基因(即蛋白编码序列，例如本发明的葡聚糖酶)在与这样的序列相容的宿主中表达的核苷酸序列。表达盒包括至少一个与多肽编码序列可操作地连接的启动子；并且任选地，可以与其它序列例如转录终止信号序列可操作地连接。也可以使用其它的在实现表达的方面必需的或有用的因子，例如增强子。因此，表达盒也包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体，以及类似物。“载体”包括可以感染、转染、短暂或永久地转导细胞的核酸。应该认识到，载体可以是裸核酸、或与蛋白或脂质复合的核酸。该载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白，和/或膜(例如细胞膜、病毒脂质包膜等等)。载体包括但不限于复制子(例如RNA复制子、细菌噬菌体)，DNA片段可以连接到这些复制子上从而可被复制。因此，载体包括但不限于RNA、自主复制环状或线状DNA或RNA(例如质粒、病毒以及类似物，例如参见美国专利5,217,879)，并且包括表达质粒和非表达质粒。在重组微生物或细胞培养物被描述为“表达载体”的宿主的情况下，该载体包括染色体外环状和线状DNA，它们可以已经被整合到宿主染色体中。在载体通过宿主细胞来维持的情况下，该载体或者可以作为自主结构在有丝分裂过程中被细胞稳定地复制，或者被整合进宿主的基因组中。
【0205】在一个方面，表达载体含有一个或多个选择性标记基因，使得可以对含有该载体的宿主细胞进行选择。这样的选择性标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因或使得真核细胞培养物具有新霉素抗性的基因、使得大肠杆菌(E.coli)具有四环素或氨苄青霉素抗性的基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因。启动子区域可以从任何期望的基因中选择出来，使用氯霉素转移酶(CAT)载体或具有选择标记的其它载体。
【0206】用于在真核细胞中表达多肽或其片段的载体也可以含有增强子，以增加表达水平。增强子是DNA的顺式作用元件，一般长度为大约10到大约300bp，其作用于启动子，增强其转录。例子包括在复制起点下游侧100bp到270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点下游侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。
【0207】核酸序列可以通过各种方法插入载体中。一般而言，将插入物和载体用合适的限制性内切酶消化后，序列可以连接到载体中的所希望的位置。可选择地，插入物和载体的平末端可以被连接。多种克隆技术在本领域已知，例如在Ausubel和Sambrook中描述的。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的范围内。
【0208】载体可以是质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。其它载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，SV40的衍生物；细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒DNA。在原核和真核宿主中使用的各种克隆和表达载体被例如Sambrook描述。
【0209】可以使用的具体细菌载体包括商业上可获得的质粒，其包括以下熟知的克隆载体的遗传元件：pBR322(ATCC 37017)、pKK223-3(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)、GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、psiX174 pBluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、DR540、pRIT5(Pharmacia)、pKK232-8和pCM7。具体的真核载体包括pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它载体，只要它可以在宿主细胞中复制和存活。
【0210】本发明的核酸可以在表达盒、载体或病毒中表达，在植物细胞和种子中短暂地或稳定地表达。一个示例性的短暂表达系统应用了附加型(episomal)表达系统，例如，通过含有超螺旋DNA的附加小染色体的转录而在核中产生的花椰菜花叶病毒(CaMV)病毒RNA，见，例如，Covey(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1633-1637。作为选择，编码序列，即本发明的序列的全部或子片段，可以插入到植物宿主细胞基因组中，而成为该宿主染色体DNA的整体部分。正义和反义转录子可以以这种方式被表达。包含本发明的核酸的序列(例如，启动子或编码区域)的载体可以包含赋予植物细胞或种子选择性表型的标记基因。例如，所述标记可以编码生物杀灭剂抗性，特别是抗生素抗性，例如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或除草剂的抗性，例如对氯磺隆或Basta的抗性。
【0211】可以在植物中表达核酸和蛋白的表达载体在本领域中是熟知的，可以包括，例如，根瘤农杆菌的载体、马铃薯病毒X(见，例如，Angell(1997)EMBOJ.16：3675-3684)、烟草花叶病病毒(见，例如，Casper(1996)Gene 173：69-73)、番茄丛矮病毒(见，例如，Hillman(1989)Virology 169：42-50)、烟草蚀纹病毒(见，例如，Dolja(1997)Virology 234：243-252)、菜豆金色花叶病毒(见，例如，Morinaga(1993)Microbiol inimunol.37：471-476)、花椰菜花叶病毒(见，例如，Cecchini(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10：1094-1101)、玉米Ac/Ds转座元件(见，例如，Rubin(1997)Mol.Cell.Biol.17：6294-6302；Kunze(1996)Curr.Top.Microbiol.Inimunol.204：161-194)，和玉米抑制基因-突变基因(Spm)转座元件(见，例如Schlappi(1996)Plant Mol.Biol.32：717-725)；和它们的衍生物。
【0212】在一个方面，表达载体可以有两套复制系统，使其可以在两种生物中保持，例如在哺乳动物或昆虫细胞中表达，在原核宿主中克隆和扩增。进一步，对于整合表达载体，该表达载体可以包括至少一个与宿主细胞基因组同源的序列。它可以在该表达构建物的两侧包含两个同源序列。通过选择包含入载体的合适的同源序列，可以将该整合载体定位到宿主细胞的特定位置。整合载体的构建在本领域是已知的。
【0213】本发明的表达载体也可以包括选择性的标记基因，以便对已经被转化的细菌株进行选择，例如，使细菌对药物，例如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素和四环素产生抗性的基因。选择性的标记也可以包括生物合成基因，例如在组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的基因。
【0214】表达载体中的DNA序列被可操纵连接到合适的表达控制序列(一种或多种)(启动子)，以指导RNA合成。具体命名的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、λPL和trp。真核启动子包括CMV即时早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTRs以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。选择合适的载体和启动子在本领域技术人员的水平之内。表达载体还可以包括用于起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体也可以包括用于扩增表达的合适序列。启动子区域可以从任何期望的基因中选择出来，使用氯霉素转移酶(CAT)载体或具有选择标记的其它载体。此外，在一个方面，表达载体含有一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择被转化的宿主细胞的表型特征，例如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
【0215】哺乳动物表达载体还可以包括复制起点、任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。在一些方面，衍生于SV40剪接子的DNA序列和聚腺苷酸化位点可以用于提供所需要的非转录遗传元件。
【0216】用于在真核细胞中表达多肽或其片段的载体也可以含有增强子，以增加表达水平。增强子是DNA的顺式作用元件，一般长度为大约10到大约300bp，其作用于启动子，增强其转录。示例性增强子包括在复制起点下游侧100bp到270bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点下游侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。
【0217】此外，表达载体通常含有一个或多个选择性标记基因，使得可以对含有该载体的宿主细胞进行选择。这样的选择性标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因和使得真核细胞培养物具有新霉素抗性的基因、使得大肠杆菌(E.coli)具有四环素或氨苄青霉素抗性的基因和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因。
【0218】在一些方面中，编码本发明的多肽之一或含有其至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段的核酸与能指导翻译出的多肽或其片段的分泌的前导序列以适当的位置关系进行装配。任选地，该核酸可以编码融合多肽，其中本发明的多肽之一或含有其至少大约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150或更多个连续氨基酸的片段被融合到异源肽或多肽，例如N-末端鉴定肽，其给予了期望的特性，如增加的稳定性或简化的纯化特性。
【0219】合适的DNA序列可以通过各种方法插入载体中。一般而言，将插入物和载体用合适的限制性内切酶消化后，DNA序列可以连接到载体中的所希望的位置。可选择地，插入物和载体的平末端可以被连接。多种克隆技术被公开于Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley 503 Sons，Inc.1997和Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的范围内。
【0220】载体可以是例如质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。其它载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，SV40的衍生物；细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA例如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒DNA。在原核和真核宿主中使用的各种克隆和表达载体在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)中描述。
宿主细胞和转化细胞
【0221】本发明也提供了包含本发明的核酸序列的转化细胞，所述核酸序列例如编码本发明葡聚糖酶的序列，或本发明的载体。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核细胞，真核细胞，例如，细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。示例性的细菌细胞包括大肠杆菌属、杆菌属、链霉菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属和葡萄球菌属的任何种，包括埃希氏大肠杆菌、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。示例性的真菌细胞包括曲霉菌属(Aspergillus)的任何种。示例性酵母细胞包括毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或许旺酵母属(Schwanniomyces)的任何种，包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。示例性的昆虫细胞包括草地夜蛾属(Spodoptera)或果蝇属(Drosophila)的任何种，包括果蝇S2和草地夜蛾(Spodoptera)Sf9。示例性的动物细胞包括CHO、COS或黑色素瘤细胞或任何鼠或人的细胞系。合适的宿主的选择在本领域技术人员的能力范围内。转化各种高等植物种类的技术是熟知的，并在技术和科学文献中有描述，见，例如，Weising(1988)Ann.Rey.Genet.22：421-477；美国专利5,750,870。
【0222】载体可以使用各种技术导入宿主细胞中，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或者Ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂转染法(lipofection)或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。
【0223】一方面，本发明的核酸或载体导入细胞是为了筛选，所以，所述核酸是以合适于该核酸的后续表达的方式进入细胞。导入的方法大体上由靶细胞类型决定。示例性的方法包括CaPO4沉淀法、脂质体融合、脂转染法(例如，LIPOFECTINTM)、电穿孔法、病毒感染法，等等。候选的核酸可以稳定地整合到宿主细胞基因组中(例如，用反转录病毒导入)或者可以短暂的或稳定的存在于细胞质中(即，通过使用传统的质粒，利用标准的调控序列、选择标记，等等)。因为许多药学上重要的筛选要求人或模型哺乳动物靶细胞，所以可以使用能够转染这些靶的反转录病毒载体。
【0224】在适当的情况下，工程化宿主细胞可以在传统的营养培养基中培养，所述营养培养基经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增本发明的基因。在合适的宿主株被转化和宿主株生长到合适的细胞密度之后，用合适的方法(例如，温度变化或化学诱导)诱导被选择的启动子，细胞再培养一段时期，使得它们产生所需的多肽或其片段。
【0225】细胞可以通过离心收获，通过物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以用于进一步的纯化。被用来表达蛋白质的微生物细胞可以用任何常规方法破碎，包括冷冻-融解循环、超声波裂解法、机械破碎法或使用细胞裂解剂。这些方法为本领域技术人员所熟知。表达的多肽或其片段可以从重组细胞培养物中通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的方法回收和纯化。假如必要的话，可以应用蛋白质重折叠来完成多肽的构象。假如需要的话，在最终的纯化步骤中可以采用高效液相层析(HPLC)。
宿主细胞中的构建物可以以传统方式用于产生由重组序列编码的基因产物。取决于重组生产方法中所用的宿主，由含有载体的宿主细胞产生的多肽可以糖基化或者未糖基化。本发明的多肽也可以包括或不包括起始甲硫氨酸残基。
【0226】也可以采用无细胞的翻译系统来产生本发明的多肽。无细胞翻译系统可以应用由DNA构建物转录得到的mRNA，所述DNA构建物包括与编码所述多肽或其片段的核酸可操作地连接的启动子。在一些方面，该DNA构建物在进行体外转录反应之前可以被线性化。转录得到的mRNA然后与合适的无细胞翻译提取物例如兔网状细胞提取物温育，产生所需的多肽或其片段。
【0227】表达载体可以含有一个或多个选择性标记基因，为选择转化的宿主细胞提供表型特征，例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者例如大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
【0228】含有感兴趣多核苷酸如本发明的核酸的宿主细胞可以在传统的营养培养基中培养，所述营养培养基经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增基因。培养条件例如温度、pH和类似条件是先前选择宿主细胞用于表达所使用的培养条件，对于普通技术人员是明显的。然后，被鉴定为具有指定的酶活性的克隆被测序，以鉴定编码具有增强活性的酶的多核苷酸序列。
【0229】本发明提供了在细胞中过度表达重组葡聚糖酶的方法，该方法包括表达含有本发明的核酸的载体，本发明的核酸例如本发明的示例性核酸，包括例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22以及于本文所述的对SEQ IDNO：1的具体修饰。过度表达通过任何方式例如使用高活性启动子、双顺反子(dicistronic)载体或通过该载体的基因扩增来实现。
【0230】本发明的核酸可以在任何体外或体内表达系统中被表达或过度表达。任何细胞培养系统可被用于表达或过度表达重组蛋白，包括细菌、昆虫、酵母、真菌或哺乳动物培养物。通过启动子、增强子、载体(例如，复制子载体、双顺反子载体的使用(见，例如Gurtu(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.229：295-8))、培养基、培养系统等等的合适选择，可以实现过度表达。一方面，使用选择标记如谷氨酰胺合酶(见，例如Sanders(1987)Dev.Biol.Stand.66：55-63)在细胞系统中进行的基因扩增被用于过度表达本发明的多肽。关于该方法的另外详述在公开文献中和/或对本领域普通技术人员是已知的，例如EP 0659215(WO9403612 A1)(Nevalainen等)；Lapidot(1996)J.Biotechnol.Nov 51：259-64；Lüthi(1990)Appl.Environ.Microbiol.Sep 56：2677-83(1990)；Sung(1993)Protein Expr.Purif.Jun 4：200-6(1993)。
【0231】宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞，真菌细胞、酵母细胞和/或植物细胞。作为合适宿主的代表性例子，可以被提及的有：细菌细胞，例如埃希氏大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的各个种；真菌细胞，例如曲霉菌属(Aspergillus)；酵母细胞，例如毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或许旺酵母属中的任何种，包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母或粟酒裂殖酵母；昆虫细胞，例如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，例如CHO、COS或黑色素瘤细胞或腺病毒。合适的宿主的选择在本领域技术人员的能力范围内。
【0232】载体可以使用各种技术中任何技术导入宿主细胞中，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或者Ti介导的基因转移。具体的方法包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂转染法或电穿孔(例如参见Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。
【0233】在适当的情况下，工程化宿主细胞可以在传统的营养培养基中培养，所述营养培养基经改良而适于激活启动子、选择转化子或扩增本发明的基因。在合适的宿主株被转化和宿主株生长到合适的细胞密度之后，用合适的方法(例如，温度变化或化学诱导)诱导被选择的启动子，细胞再培养一段时期，使得它们产生所需的多肽或其片段。
【0234】细胞可以通过离心收获，通过物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以用于进一步的纯化。被用来表达蛋白质的微生物细胞可以用任何常规方法破碎，包括冷冻-融解循环、超声波裂解法、机械破碎法或使用细胞裂解剂。这些方法为本领域技术人员所熟知。表达的多肽或其片段可以从重组细胞培养物中通过包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析在内的方法回收和纯化。假如必要的话，可以应用蛋白质重折叠来完成多肽的构象。假如需要的话，在最终的纯化步骤中可以采用高效液相层析(HPLC)。
【0235】各种哺乳动物细胞培养系统也可以被用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7系(由Gluzman(1981)Cell，23：175描述)，以及能从相容载体表达蛋白的其它细胞系，如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。
【0236】宿主细胞中的构建物可以以传统方式用于产生由重组序列编码的基因产物。根据重组产生方法中所用的宿主，由含有载体的宿主细胞产生的多肽可以糖基化或者未糖基化。本发明的多肽也可以包括或不包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
【0237】可选地，本发明的多肽和肽可以通过常规肽合成仪合成产生。在其它方面，通过肽合成，所述多肽的片段或部分可以被用于产生相应的全长多肽；因此，所述片段可用作产生全长多肽的中间体。
【0238】也可以采用无细胞的翻译系统来产生本发明的多肽之一，其应用由DNA构建物转录得到的mRNA，所述DNA构建物包括与编码所述多肽或其片段的核酸可操作地连接的启动子。在一些方面，该DNA构建物在进行体外转录反应之前可以被线性化。转录得到的mRNA可与合适的无细胞翻译提取物例如兔网状细胞提取物温育，产生所需的多肽或肽。
核酸的扩增
【0239】在本发明的实践中，本发明的核酸和编码本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的核酸，或本发明的修饰的核酸，可以通过扩增来增殖。扩增也可以被用于克隆或修饰本发明的核酸。因此，本发明提供了用于扩增本发明核酸的扩增引物序列对。本技术领域技术人员能设计用于扩增这些序列的任何部分或全长的扩增引物序列对。一方面，本发明提供了通过本发明的扩增引物对扩增的核酸，所述扩增引物对例如本发明的核酸的大约前(5′)或大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或更多个残基，或者互补链的大约前(5′)大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或更多个残基所示的引物对。
【0240】本发明提供了用于扩增核酸的扩增引物序列对，所述核酸编码具有葡聚糖酶活性的多肽，其中所述引物对能够扩增含有本发明的序列或其片段或子序列的核酸。扩增引物序列对的一个成员或每一成员可以包含寡核苷酸，该寡核苷酸包含所述序列的至少约10至50个或更多个连续碱基，或所述序列的约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续残基。本发明提供了扩增引物对，其中所述引物对包括第一成员和第二成员，第一成员具有本发明核酸的大约前(5’)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个残基所示的序列，第二成员具有第一成员的互补链的大约前(5’)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个残基所示的序列。本发明提供了通过扩增产生的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，所述扩增例如聚合酶链反应(PCR)，其使用本发明的扩增引物对。本发明提供了通过扩增制备葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的方法，所述扩增例如聚合酶链反应(PCR)，其使用本发明的扩增引物对。一方面，所述扩增引物对从文库例如基因文库诸如环境文库扩增核酸。
【0241】扩增反应也可以被用于量化样品中核酸的量(如细胞样品中信息的量)、标记核酸(例如将其应用于阵列或印迹)、检测核酸，或量化样品中特异性核酸的量。在本发明的一个方面，扩增从细胞或cDNA文库分离出的信息。
【0242】技术人员可以选择和设计合适的寡核苷酸扩增引物。扩增方法在本技术领域也是熟知的，包括，例如聚合酶链式反应PCR(例如参见PCR PROTOCOLS，A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS，ed.Innis，Academic Press，N.Y.(1990)和PCR STRATEGIES(1995)，ed.Innis，Academic Press，Inc.N.Y.，连接酶链式反应(LCR)(例如参见Wu(1989)Genomics 4：560；Landegren(1988)Science 241：1077；Barringer(1990)Gene 89：117)；转录扩增(例如参见Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)；和自主维持序列复制(例如参见Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)；Qβ复制酶扩增(例如参见Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491)，自动Q-β复制酶扩增测定法(例如参见Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10：257-271)和其它的RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；也参见Berger(1987)Methods Enzymol.152：307-316；Sambrook；Ausubel；美国专利4,683,195和4,683,202；Sooknanan(1995)Biotechnology 13：563-564。
确定序列同一性程度
【0243】本发明提供了核酸，所述核酸包含与本发明的示例性核酸，包括SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22以及于本文所述的对SEQ ID NO：1修饰的序列，在至少大约10、20、30、40、50、60、70、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或更多残基的区域内具有至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的(100％)序列同一性的序列。本发明提供了多肽，该多肽包含与本发明的示例性多肽具有至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的(100％)序列同一性的序列。序列同一性(同源性)的程度可以使用任何计算机程序和相关参数来确定，包括本文描述的那些，如BLAST 2.2.2或FASTA 3.0t78版本，参数为默认值。
【0244】本发明的核酸序列可以包含本发明的示例性序列和与其基本上相同的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500或更多个连续核苷酸。本发明的核酸序列的同源序列和片段可以指与本发明示例性核酸例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22及其于本文所述的变化，以及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22这些序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全(100％)的序列同一性(同源性)的序列。
【0245】短语“基本上相同(substantially identical)”在用于两个核酸或多肽时，是指当两个或更多个序列被比较和提供(fed)以寻找最大对应性(maximuncorrespondence)时，它们具有例如至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸或氨基酸残基(序列)同一性，所述同一性可以使用一种已知的序列比较算法测量，或者通过视觉观察。基本上相同可存在于至少大约10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500或更多个残基的区域内。在一些方面，序列可以在编码区的整个长度范围内是基本上相同的。一方面，“基本上相同的”氨基酸序列是通过一个或多个保守或非保守氨基酸的置换、缺失或插入而与参考序列有所不同的序列，特别是当这种置换发生在不是分子的活性位点(催化结构域CDs)的位点，并且前提是多肽必需保持它的功能特性。保守的氨基酸置换，例如用一个氨基酸置换另一个相同类别的氨基酸(例如用一个疏水氨基酸，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，置换另一个疏水氨基酸，或用一个极性氨基酸置换另一个极性氨基酸，例如用精氨酸置换赖氨酸、用谷氨酸置换天冬氨酸，或用谷氨酰胺置换天冬酰胺)。可以例如从葡聚糖酶多肽中删除一个或多个氨基酸，从而形成对多肽结构的修饰，而又不会显著地改变其生物活性。例如，对葡聚糖酶的生物活性来说不需要的氨基或羧基末端氨基酸可以被去除。可以通过任何方法测定本发明的修饰的多肽序列的葡聚糖酶生物活性，所述方法包括将所述修饰的多肽序列和葡聚糖酶底物接触，确定所述修饰的多肽是否在该测定中减少特定底物的量或者增加功能性葡聚糖酶多肽与底物的酶促反应的生物产物。
【0246】序列同一性(同源性)可以使用本文所描述的任何计算机程序和参数来确定，包括FASTA3.0t78版本，参数为默认值。同源序列还包括RNA序列，其中尿嘧啶替代本发明核酸序列中的胸腺嘧啶。同源序列可以使用本文描述的任意一种方法获得，或者从对测序错误的纠正中产生。应该意识到，本发明的核酸序列可以以传统的单字母形式表示(例如参见Stryer，Lubert.Biochemistry，3rd Ed.，W.H Freeman & Co.，New York的内封底)，或以在序列中记录核苷酸的身份的任何其它形式表示。
【0247】正如本文所用，术语“计算机”、“计算机程序”和“处理器”以它们在最广的普通语境中的含义被使用，包括了所有这样的设备，例如下面所详细描述的。特定多肽或蛋白的“编码序列”或“编码特定多肽或蛋白的序列”是指当被置于适当的调控序列的控制下时可被转录和翻译成多肽或蛋白的核酸序列。
【0248】在本专利说明书中别处表明的各种序列比对程序被特别考虑用于本发明的这方面。蛋白和/或核酸序列同源性可以使用本技术领域已知的任何各种序列比较算法或程序来评价。这样的算法和程序包括，但不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(参见，例如Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448，1988；Altschul等，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Thompson等，Nucleic Acids Res.22(2)：4673-4680，1994；Higgins等，MethodsEnzymol.266：383-402，1996；Altschul等，J.Mol.Biol.215(3)：403-410，1990；Altschul等，Nature Genetics 3：266-272，1993)。
【0249】同源性或同一性通常使用序列分析软件来测量(例如，位于1710University Avenue，Madison，WI 53705的威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的序列分析软件包)。这样的软件通过对各种缺失、置换和其它的修饰指定同源性程度来匹配相似的序列。在两个或者更多个核酸或者多肽序列的上下文中，术语“同源性”和“同一性”是指这样的两个或者更多个序列或子序列，当两个或更多个序列或子序列在某一比较窗口(comparison window)或者指定区域内被比较和联配以确定最大对应性时，这些序列是相同的，或者具有特定百分比例的相同氨基酸残基或核苷酸，其可以应用各种序列比较算法或者通过人工联配和视觉观察来确定。
【0250】对于序列比较，可以将一个序列作为参考序列，而将测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，指定子序列坐标，如果必要，也指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或者可以指定别的参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算出测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
【0251】如本文所用，“比较窗口”包括参考具有任意数目的连续位置的片段，所述数目选自从20到600、通常大约50到大约200，更经常大约100到大约150，其中在序列和参考序列进行最优化联配后，序列可与具有相同数目的连续位置的参考序列作比较。用于比较的联配方法在本技术领域是熟知的。可以通过如下方法进行用于比较的序列的最优化联配：例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970的同源性联配算法，person和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988的查找相似性的方法，这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者手工联配和观察检验。除了BLAST程序(国家生物信息中心的基本局域联配搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))外，用于确定同源性或者同一性的其它的算法包括，例如，ALIGN、AMAS(多重联配序列分析(Analysis of Multiply Aligned Sequences))、AMPS(蛋白多重序列联配(ProteinMultiple Sequence Alignment))、ASSET(联配片段统计评估工具(Aligned SegmentStatistical Evaluation Tool))、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN(生物学序列比较分析节点(Biological Sequence Comparative Analysis Node))、BLIMPS(BLocksIMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman算法、DARWIN、Las Vegas算法、FNAT(强迫核苷酸联配工具(Forced NucleotideAlignment Tool))、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FASP(Fristensky序列分析软件包)、GAP(全局联配程序(Global Alignment Program))、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(灵敏性序列比较(Sensitive Sequence Comparison))、LALIGN(局部序列联配(Local Sequence Alignment))、LCP(局部内容程序(LocalContent Program))、MACAW(多重联配构建和分析工作台(Multiple AlignmentConstruction & Analysis Workbench))、MAP(多重联配程序(Multiple AlignmentProgram))、MBLKP、MBLKN、PIMA(模式诱导的多重序列联配(Pattern-InducedMulti-sequence Alignment))、SAGA(通过遗传算法的序列联配(Sequence Alignmentby Genetic Algorithm))和WHAT-IF。这样的联配程序也可以用于筛查基因组数据库，以鉴定具有大体上相同的序列的多核苷酸序列。大量的基因组数据库是可利用的，例如，作为人类基因组测序工程的一部分的人类基因组的实质部分可以被利用。至少二十一个其它基因组已经被测序，如生殖器支原体(M.genitalium)(Fraser等，1995)、甲烷球菌(M.jannaschii)(Bult等，1996)、流行性感冒杆菌(H.influenzae)(Fleischmann等，1995)、大肠杆菌(E.coli)(Blattner等，1997)和酵母(酿酒酵母(S.cerevisiae))(Mewes等，1997)和黑腹果蝇(D.melanogaster)(Adams等，2000)。在模式生物的基因组序列的测序上已经取得了很大的进展，如小鼠，线虫(C.elegans)和拟南芥(Arabadopsis sp.)。含有基因组信息并且注释有一些功能性信息的一些数据库由不同组织维护，可以通过互联网登录。
【0252】可用算法的一个例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别被描述于Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1997和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990。用于实施BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心公开获得。这一算法涉及首先通过鉴别待询序列(query sequence)中长度为W的短的字串来确定高分序列对(high scoring sequence pairs，HSPs)，所述高分序列对在与数据库序列中同样长度的字串联配时，匹配或者满足某些正值的阈值T。T是指邻近字串(neighborhood word)的分数阈值(Altschul等，如上)。这些初始的邻近字串作为种子(seed)用来启动搜索以发现包含有它们的更长的HSPs。只要累积的联配分数能够被增加，所述字串一直沿着每一个序列向两个方向延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配的残基的奖励分数；总是大于0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用记分矩阵来计算累计分数。出现下面情况时，字串在各个方向上的延伸便停止：累积的联配分数由达到的最大值下降了数量X；由于一个或者多个记分为负的残基联配的累积，累积分数达到0或者0以下；或者延伸到了任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了联配的灵敏度和速率。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值的是：字串长度(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值的是：字串长度为3，期望值(E)为10，BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)联配(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，对两条链进行比较。
【0253】BLAST算法也进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873，1993)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sum probability，P(N))，其表示两个核苷酸或者氨基酸序列间的匹配将偶然发生的概率。例如，在测试核酸和参考核酸的比较中，如果最小合计概率小于约0.2，在一方面中更优选的是小于约0.01，在一方面中最优选的是小于约0.001，就认为该核酸与参考序列相似。
【0254】一方面，应用基本局域联配搜索工具(“BLAST”)来评价蛋白和核酸序列同源性。具体而言，五个特定的BLAST程序可以用来进行以下的任务：
(1)BLASTP和BLAST3将氨基酸待询序列与蛋白质序列数据库进行比较；
(2)BLASTN将核苷酸待询序列与核苷酸序列数据库进行比较；
(3)BLASTX将待询核苷酸序列(两条链)的六个阅读框架的概念上的翻译产物与蛋白序列数据库进行比较；
(4)TBLASTN将待询蛋白序列与核苷酸序列数据库的所有六个阅读框架(两条链)的翻译结果进行比较；和
(5)TBLASTX将核苷酸待询序列的六个框架的翻译结果与核苷酸序列数据库的六个框架的翻译结果进行比较。
【0255】BLAST程序通过确定相似片段来确定同源序列，所述相似片段在此是指在待查询的氨基酸或核酸序列与受测序列之间的“高分片段对(high-scoringsegment pairs)”，该受测序列一方面从蛋白或者核酸序列数据库得到。高分片段对一方面利用记分矩阵来鉴定(即，联配)，很多的记分矩阵在本领域是已知的。一方面，应用的记分矩阵为BLOSUM62矩阵(Gonnet等，Science 256：1443-1445，1992)；Henikoff和Henikoff，Proteins 17：49-61，1993)。较不优选地，在一方面，也可以应用PAM或者PAM250矩阵(参见如，Schwartz和Dayhoff，eds.，1978，Matrices for Detecting Distance Relationships：Atlas of protein Sequence and Structure，Washingion：National Biomedical Research Foundation)。BLAST程序可从美国国家医学图书馆(U.S.National Library of Medicine)获得。
【0256】根据所研究的序列长度和同源性程度，上述算法使用的参数可以被调整。在一些方面，在无用户的指示的情况下，所述参数使用算法所采用的默认参数。
计算机系统和计算机程序产品
【0257】为了确定和鉴定序列同一性、结构同源性、基序和在计算机芯片上的类似物，本发明的核酸或多肽序列可以在可被计算机读取和访问的任何介质上存储、记录和操作。
【0258】因此，本发明提供了计算机、计算机系统、计算机可读取的介质、计算机程序产品以及其上记录或存储了本发明的核酸和多肽序列的类似设备。如本文所用，词语“记录”和“存储”指在计算机介质上存储信息的过程。熟练的技术人员能容易地采用任何已知方法，在计算机可读取的介质上存储信息，以产生包括本发明的一个或多个核酸和/或多肽序列的产品。
【0259】本发明的多肽包含本发明的氨基酸序列，例如本发明的示例性序列和与其基本上相同的序列及其片段，包括酶活性片段。基本上相同的、或同源的多肽序列是指与本发明的示例性序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的(100％)序列同一性的多肽序列。
【0260】同源性(序列同一性)可以使用本文所描述的任何计算机程序和参数来确定，包括FASTA 3.0t78版本，参数为默认值或使用任何修饰的参数。同源序列可以使用本文描述的任意一种方法获得，或者从对测序错误的纠正中产生。多肽片段包括本发明多肽的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个连续的氨基酸。应该意识到，本发明的氨基酸序列所示出的多肽代码可以以传统的单字母形式或三字母形式表示(例如参见Stryer，Lubert.Biochemistry，3rd Ed.，W.H Freeman & Co.，New York的内封底)，或以在序列中描述多肽身份的任何其它形式表示。
【0261】本发明的核酸或多肽序列可以在可被计算机读取和访问的任何介质上存储、记录和操作。正如此处所用，词语“记录”和“存储”指在计算机介质上存储信息的过程。熟练的技术人员能容易地采用任何目前已知的方法，在计算机可读取的介质上存储信息，以产生包括本发明的一个或多个核酸序列、本发明的一个或多个多肽序列的产品。本发明的另一方面是其上记录有至少2、5、10、15或20或更多个本发明核酸序列的计算机可读取介质。
【0262】本发明的另一方面是其上记录有本发明的一个或多个核酸序列的计算机可读取介质。本发明的另一方面是其上记录有本发明的一个或多个多肽序列的计算机可读取介质。本发明的另一方面是其上记录有至少2、5、10、15或20或更多个如上面所述的序列的计算机可读取介质。
【0263】计算机可读取介质包括磁性可读取介质、光学可读取介质、电子可读取介质和磁/光学介质。例如，计算机可读取的介质可以是硬盘、软盘、磁带、CD-ROM、数字化视频光盘(DVD)、随机存取存储器(RAM)或只读存储器(ROM)以及本领域的技术人员已知的其它类型的其它介质。
【0264】本发明的方面包括系统(例如基于因特网的系统)，特别是计算机系统，它们存储和操纵本文描述的序列信息。计算机系统100的一个实例以框图形式示意性地描述在图1中。正如此处所用，“计算机系统”指硬件部分、软件部分以及数据存储部分，它们用于分析本发明的核酸序列的核苷酸序列或本发明的多肽序列。计算机系统100可包括用于处理、访问和操纵序列数据的处理器。处理器105可以是任何熟知类型的中央处理单元，如来自英特尔公司的奔腾III，或来自Sun、Motorola、Compag、AMD或IBM公司的类似处理器。
【0265】计算机系统100可以是一个通用的系统，该系统包括处理器105和用于存储数据的一个或多个内部数据存储部件110，以及用于检索数据存储部件上存储的数据的一个或多个数据检索设备。技术人员能容易地意识到，任何一种当前可获得的计算机系统都是合适的。
【0266】在一个特定的方面，计算机系统100包括连接到总线上的处理器105，总线连接到主存储器115(在一方面，以RAM来实现)，和一个或多个内部数据存储设备110，例如其上已经存储了数据的硬盘驱动器和/或其它计算机可读介质。在一些方面，计算机系统100进一步包括一个或多个数据检索设备118，用于读取在内部数据存储设备110上存储的数据。
【0267】数据检索设备118可以是，例如软盘驱动器、压缩磁盘驱动器、磁带驱动器或能连接到远程数据存储系统的调制解调器(例如通过因特网)等等。在一些方面中，内部数据存储设备110是可移动的计算机可读介质，例如含有控制逻辑和/或其上记录的数据的软盘、压缩磁盘、磁带等等。计算机系统100可以有利地包括适当的软件或用适当的软件编程，用于当数据存储部件被插入到数据检索设备中时从数据存储部件读取控制逻辑和/或数据。
【0268】计算机系统100包括显示器120，用于给计算机用户显示输出。也应用注意到，计算机系统100可以被连接到网络或广域网中的其它计算机系统125a-c，以便给计算机100提供集中访问。
【0269】用于访问和处理本发明的核酸序列的核苷酸或本发明的多肽序列的软件(例如，检索工具、比较工具和建模工具等等)在执行过程中可驻留于主存储器115中。
【0270】在一些方面，计算机系统100可以进一步包括序列比较算法，其用于比较存储于计算机可读介质上的本发明核酸序列或本发明多肽序列与存储于计算机可读介质上的参考核苷酸或多肽序列。“序列比较算法”指在计算机系统100上执行(本地或远程)的一种或多种程序，以比较核苷酸序列和数据存储设备中存储的其它核苷酸序列和/或化合物。例如，序列比较算法可以将计算机可读介质上存储的本发明的核酸序列的核苷酸序列或本发明的多肽序列与计算机可读介质上存储的参考序列进行比较，以鉴定同源性或结构基序。
【0271】图2是示意性说明过程200的一个方面的流程图，该过程用于将新的核苷酸或蛋白序列与序列数据库进行比较，以便确定新序列和数据库中的序列之间的同源性水平。序列数据库可以是存储于计算机系统100上的个人数据库，或可以通过因特网获得的公共数据库如GENBANK。
【0272】过程200在起始状态201开始，然后转到状态202，其中要被比较的新序列被存储于计算机系统100的存储器上。正如上面所讨论的，该存储器可以是任何类型的存储器，包括RAM或内部存储设备。
【0273】然后过程200转到状态204，其中打开序列数据库以进行分析和比较。然后过程200转到状态206，其中数据库中存储的第一个序列被读取到计算机的存储器中。然后在状态210进行比较，以确定第一个序列是否与第二个序列相同。重要的是应该注意到，该步骤不限于进行新序列和数据库中第一个序列之间的精确比较。用于比较两个核苷酸或蛋白序列的熟知的方法对于本技术领域的普通技术人员是已知的，即使所述两个核苷酸或蛋白序列不相同。例如，可以在一个序列中引入空位，以提高两个测试序列之间的同源性水平。控制空位或其它特征在比较过程中是否被引入到序列中的参数通常由计算机系统的用户输入。
【0274】一旦已经在状态210进行两个序列的比较，在决策状态210就要作出两个序列是否相同的判断。当然，术语“相同的”不限于绝对相同的序列。在过程200中，在由用户输入的同源性参数范围内的序列都将被标记为“相同的”。
【0275】如果作出两个序列相同的判断，过程200转到状态214，其中来自数据库的序列的名称被显示给用户。该状态通知用户，具有显示的名称的序列满足所输入的同源性限制。一旦所存储序列的名称被显示给用户，过程200转到决策状态218，其中作出数据库中是否存在更多序列的判断。如果数据库中不存在更多的序列，那么过程200在结束状态220终止。然而，如果数据库中确实存在更多的序列，那么过程200转到状态224，其中指针被指向数据库中的下一个序列，以便与新序列进行比较。以这种方式，将新序列与数据库中的每一序列联配并进行比较。
【0276】应该注意到，如果已经在决策状态212已经作出了序列不同源的判断，那么过程200将立即转到决策状态218，以便确定用于比较的数据库中的任何其它序列是否可利用。
【0277】因此，本发明的一个方面是计算机系统，该系统包括处理器、其上已经存储了本发明核酸序列或本发明的多肽序列的数据存储设备、其上以可检索方式存储了待与本发明的核酸序列或本发明的多肽序列比较的参考核苷酸序列或多肽序列的数据存储设备、以及用于进行比较的序列比较器。该序列比较器可以指出被比较的序列之间的同源性水平，或鉴定上述的本发明的核酸序列的核酸密码或者本发明的多肽序列中的结构基序，或者该比较器可以鉴定与这些核酸密码和多肽密码进行比较的序列中的结构基序。在一些方面中，数据存储设备可以在其上已经存储了至少2、5、10、15、20、25、30或40个或更多个本发明的核酸序列或本发明的多肽序列的序列。
【0278】本发明的另一方面是确定本发明的核酸序列或本发明的多肽序列和参考核苷酸序列之间的同源性水平的方法。所述方法包括通过使用确定同源性水平的计算机程序读取核酸代码或多肽代码以及参考核苷酸或多肽序列，以及用该计算机程序确定核酸代码或多肽代码与参考核苷酸或多肽序列之间的同源性。所述计算机程序可以是确定同源性水平的许多计算机程序的任何一种，包括本文中具体罗列的那些程序(例如，BLAST2N，具有默认参数或任何调整的参数)。所述方法可以使用上述的计算机系统执行。所述方法还可以如下进行：通过使用所述计算机程序读取至少2、5、10、15、20、25、30或40个或更多个上述的本发明的核酸序列或本发明的多肽序列，以及确定核酸代码或多肽代码与参考核苷酸序列或多肽序列之间的同源性。
【0279】图3是示意性说明计算机中的过程250的一个方面的流程图，该过程用于确定两个序列是否同源。过程250在起始状态252开始，然后转到状态254，其中要被比较的第一个序列被存储到存储器上。然后要被比较的第二个序列在状态256被存储到存储器上。然后过程250转到状态260，其中读取第一个序列中的第一个字符，然后转到状态262，其中读取第二个序列的第一个字符。应该理解到，如果序列是核苷酸序列，那么字符将通常是A、T、C、G或U。如果序列是蛋白序列，那么字符一方面可以是单字母氨基酸代码，以便第一个序列和第二个序列可以被容易地比较。
【0280】然后在决策状态264作出两个字符是否相同的判断。如果它们相同，那么过程250转到状态268，其中第一个和第二个序列中的下一个字符被读取。然后作出该下一个字符是否相同的判断。如果它们相同，那么过程250继续循环，直到两个字符不相同。如果作出的判断是这两个字母不相符，那么过程250转到决策状态274，以确定是否有更多的字符或者序列可以读取。
【0281】如果没有可读取的任何更多的字符，那么过程250转到状态276，其中第一个和第二个序列之间的同源性水平被显示给用户。同源性水平通过计算序列之间相同的字符在第一个序列的序列总数中的比例来确定。因此，如果前100个核苷酸序列中的每一个字符都与第二个序列中的每一个字符联配，那么同源性水平将是100％。
【0282】可以选择地，计算机程序可以是这样的计算机程序，其将本发明所示的核酸序列的核苷酸序列与一个或多个参考核苷酸序列进行比较，以确定本发明的核酸代码是否在一个或多个位置上与参考核酸序列不同。任选地，这样的程序记录，相对于参考多核苷酸序列或者本发明的核酸序列，被插入、删除或置换的核苷酸的长度和身份。一方面，计算机程序可以是确定本发明的核酸序列是否相对于参考核苷酸序列含有单核苷酸多态性(SNP)的程序。
【0283】因此，本发明的另一方面是确定本发明的核酸序列是否在一个或多个核苷酸处与参考核苷酸序列不同的方法，所述方法包括通过使用鉴定核酸序列之间的差异的计算机程序读取核酸代码和参考核苷酸序列，并用该计算机程序鉴定核酸代码和参考核苷酸序列之间的差异的步骤。在一些方面，计算机程序是鉴定单核苷酸多态性的程序。该方法可以通过上面描述的计算机系统和图3所示意性说明的方法执行。所述方法还可以如下进行：通过使用所述计算机程序读取至少2、5、10、15、20、25、30或40个或更多个本发明核酸序列和参考核苷酸序列，以及用该计算机程序鉴定核酸代码与参考核苷酸序列之间的差异。
【0284】在其它方面，基于计算机的系统可以进一步包括鉴定器，其用于鉴定本发明的核酸序列或本发明的多肽序列中的特征。
【0285】“鉴定器”指在本发明的核酸序列或本发明的多肽序列中鉴定某些特征的一个或多个程序。一方面，鉴定器可以包括在本发明的核酸序列中鉴定开放阅读框(ORF)的程序。
【0286】图4是示意性说明鉴定器过程300的一个方面的流程图，用于检测序列中特征的存在。过程300在起始状态302开始，然后转到状态304，其中将被检查特征的第一个序列存储在计算机系统100的存储器115上。然后过程300转到状态306，其中打开序列特征数据库。这样的数据库包括每一特征的属性以及该特征的名称的列表。例如，特征名称可以是“起始密码子”，属性将是“ATG”。另一个实例是特征名称“TAATAA序列盒”，特征属性是“TAATAA”。这样的数据库的实例由威斯康星大学遗传学计算机组(University of Wisconsin Genetics ComputerGroup)开发。可以选择地，这些特征可以是结构多肽基序如α螺旋、β折叠，或功能多肽基序如酶活性结构域(CD)、或活性位点、螺旋-转角-螺旋基序或本技术领域技术人员已知的其它基序。
【0287】一旦在状态306打开特征数据库，过程300就转到状态308，其中从数据库读取第一个特征。然后在状态310将第一个特征的属性与第一个序列进行比较。接着在决策状态316作出在第一个序列中是否发现该特征的属性的判断。如果发现了属性，那么过程300转到状态318，其中所发现的特征的名称被显示给用户。
【0288】然后，过程300转到决策状态320，其中作出数据库中是否存在更多特征的判断。如果不存在更多特征，那么过程300在结束状态324终止。然而，如果数据库中确实存在更多的特征，那么过程300在状态326读取下一个序列特征，循环回到状态310，其中将下一个特征的属性与第一个序列进行比较。应当注意，如果在决策状态316在第一个序列中没有发现特征属性，那么过程300直接转到决策状态320，以便确定数据库中是否存在更多特征。
【0289】因此，本发明的另一方面是鉴定本发明的核酸序列或本发明的多肽序列中的特征的方法，所述方法包括通过使用鉴定其中特征的计算机程序读取核酸代码或多肽代码，并用该计算机程序鉴定核酸代码中的特征。一方面，计算机程序包括鉴定开放阅读框的计算机程序。所述方法可以如下进行：通过使用所述计算机程序读取本发明的核酸序列或本发明的多肽序列中的单个序列或至少2、5、10、15、20、25、30或40个或更多个序列，以及用该计算机程序鉴定核酸代码或多肽代码中的特征。
【0290】本发明的核酸序列或本发明的多肽序列可以以多种形式在各种数据处理器程序中存储和操作。例如，本发明的核酸序列或本发明的多肽序列可以以文本文件存储在字处理文件中，如Microsoft WORDTM或WORDPERFECTTM，或以ASCII文件存储在本领域技术人员熟悉的各种数据库程序中，例如DB2TM、SYBASETM或ORACLETM。此外，许多计算机程序和数据库可以被用作序列比较算法、鉴定器或与本发明的核酸序列或本发明的多肽序列进行比较的参考核苷酸序列或多肽序列的来源。下面的罗列不意图限制本发明，而是提供对本发明的核酸序列或本发明的多肽序列有用的程序和数据库的指导。
【0291】可以使用的程序和数据库，包括但不限于：MacPattern(EMBL)、DiscoveryBase(Molecular Applications Group)、GeneMine(Molecular ApplicationsGroup)、Look(Molecular Applications Group)、MacLook(Molecular ApplicationsGroup)、BLAST和BLAST2(NCBI)、BLASTN和BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990)、FASTA(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444，1988)、FASTDB(Brutlag等.Comp.App.Biosci.6：237-245，1990)、Catalyst(MolecularSimulations Inc.)、Catalyst/SHAPE(Molecular Simulations Inc.)、Cerius2.DBAccess(Molecular Simulations Inc.)、HypoGen(Molecular Simulations Inc.)、Insight II(Molecular Simulations Inc.)、Discover(Molecular Simulations Inc.)、CHARMm(Molecular Simulations Inc.)、Felix(Molecular Simulations Inc.)、DelPhi(MolecularSimulations Inc.)、QuanteMM(Molecular Simulations Inc.)、Homology(MolecularSimulations Inc.)、Modeler(Molecular Simulations Inc.)、ISIS(Molecular SimulationsInc.)、Quanta/Protein Design(Molecular Simulations Inc.)、WebLab(MolecularSimulations Inc.)、WebLab Diversity Explorer(Molecular Simulations Inc.)、GeneExplorer(Molecular Simulations Inc.)、SeqFold(Molecular Simulations Inc.)、MDLAvailable Chemicals Directory数据库、MDL Drug Data Report数据库、ComprehensiveMedicinal Chemistry数据库、Derwents’s World Drug Index数据库、BioByteMasterFile数据库、Genbank数据库和Genseqn数据库。基于本发明的公开内容，许多其它程序和数据库对于本技术领域的技术人员是显而易见的。
【0292】可以用上述程序检测的基序包括：编码亮氨酸拉链的序列、螺旋-转角-螺旋基序、糖基化位点、泛素化位点、α螺旋和β折叠、编码指导被编码的蛋白分泌的信号肽的信号序列、在转录调节中涉及的序列如同源框、酸性伸展物(acidic stretches)、酶活性位点(催化结构域，CDs)、底物结合位点和酶切割位点。
核酸的杂交
【0293】本发明提供了分离的、合成的或重组的核酸，所述核酸与本发明的示例性序列，例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22，或如本文所述的SEQ ID NO：1以及SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22的修饰，在严格条件下杂交。严格条件可以是高严格条件、中等严格条件和/或低严格条件，包括本文描述的高的和降低的严格性的条件。一方面，正如下面所讨论的，洗涤条件的严格性提供了决定核酸是否在本发明范围内的条件。
【0294】“杂交”指这样一个过程，即，通过该过程，核酸链与互补链通过碱基配对而结合。杂交反应可以是灵敏的并且是选择性的，以便感兴趣的特定序列可以被鉴定，甚至在其以低浓度存在的样品中也可以被鉴定。适度的严格条件(stringent condition)可以通过，例如预杂交和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度来定义，或者通过杂交温度来定义，这些严格条件在本技术领域是已知的。特别地，严格性可以通过降低盐的浓度、增加甲酰胺的浓度或升高杂交温度来增加。在可选择的方面，本发明的核酸通过它们在各种严格条件(例如高、中等和低严格条件)下杂交的能力来定义，正如本文所示。
【0295】例如，一方面，高严格性下的杂交在包括大约37℃到42℃的温度、大约50％的甲酰胺的条件下发生。杂交还可以在包括大约30℃到35℃、大约35％至25％的甲酰胺的条件中降低的严格性下发生。一方面，杂交在高度严格条件下发生，所述条件包括约42℃、在50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS中，和200μg/ml的剪切和变性鲑精DNA。一方面，杂交发生在如上所述的降低的严格条件下，但在降低的温度35℃在35％甲酰胺中。相应于特定的严格性水平的温度范围可以通过计算目标核酸中的嘌呤与嘧啶比并相应调节温度而进一步缩小。上述范围和条件的变化在本领域中是熟知的。
【0296】在可以选择的方面中，本发明的核酸，正如通过它们在严格条件下杂交的能力所定义的，可以在本发明的核酸的大约五个残基到全长之间；例如它们的长度可以是至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多残基。也包括小于全长的核酸。这些核酸可以用作，例如杂交探针、标记探针、PCR寡核苷酸探针、iRNA(单链或双链，siRNA或miRNA)、反义或编码抗体结合肽(表位)、基序、活性位点(催化结构域(CD))的序列以及类似序列。
【0297】一方面，本发明的核酸通过它们在高度严格性下杂交的能力定义，高度严格性包括在大约37℃到42℃的温度下大约50％的甲酰胺的条件。一方面，本发明的核酸通过它们在降低的严格性下杂交的能力定义，降低的严格性包括在大约30℃到35℃在大约35％至25％的甲酰胺中的条件。可以选择地，本发明的核酸通过它们在高度严格性下杂交的能力定义，高度严格性包括的条件为：在42℃、在50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS中，和封闭核酸的重复序列，如cot-1或鲑精DNA(例如200μg/ml的剪切和变性鲑精DNA)。一方面，本发明的核酸通过它们在降低的严格性条件下杂交的能力定义，降低的严格性条件包括在35℃的降低温度下的35％甲酰胺中。
【0298】在核酸杂交反应中，用于得到特定严格性水平的条件将根据杂交中的核酸的性质变化。例如，所述核酸的杂交区域的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如GC和AT含量)和核酸类型(例如RNA和DNA)可以在选择杂交条件时加以考虑。另外的考虑因素是核酸之一是否被固定，例如固定在滤膜上。
【0299】杂交可以在低度严格性、中度严格性或高度严格性的条件下进行。作为核酸杂交的一个实例，含有固定化的变性核酸的聚合物膜首先在45℃在由如下成分组成的溶液中预杂交30分钟：0.9M NaCl、50mM NaH2PO4，pH 7.0、5.0mMNa2EDTA、0.5％SDS、10×Denhardt’s和0.5mg/ml多核糖腺苷酸。然后在该溶液中加入大约2×107cpm(比活性为4-9×108cpm/ug)的32P末端标记的寡核苷酸探针。在温育12-16小时后，在室温下在含有0.5％SDS的1×SET(150mM NaCl、20mMTris盐酸，pH 7.8、1mM Na2EDTA)中将膜洗涤30分钟，随后，在该寡核苷酸探针的Tm-10℃的温度，在新鲜的1×SET中洗涤30分钟。然后将膜暴露于放射自显影胶片，以检测杂交信号。
【0300】所有的前述杂交将被认为在高严格条件下。
【0301】杂交后，洗涤滤膜以除去任何非特异性结合的可检测探针。用于洗涤滤膜的严格性也可以根据如下方面进行变化：被杂交的核酸的性质、被杂交的核酸的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如GC和AT含量)和核酸类型(例如RNA和DNA)。逐步增高的严格性洗涤条件的实例如下：2×SSC，0.1％SDS，室温下洗涤15分钟(低度严格性)；0.1×SSC，0.5％SDS，室温下洗涤30分钟到1小时(中度严格性)；0.1×SSC，0.5％SDS，在杂交温度至68℃之间洗涤15到30分钟(高度严格性)；和0.15M NaCl，72℃洗涤15分钟(极高严格性)。最终的低严格性洗涤可以在0.1×SSC在室温下进行。上述的实例仅仅是可用于洗涤滤膜的一组条件的示例性说明。本领域技术人员将知道，对于不同严格性的洗涤，可以有多种方案。下面给出了一些其它实例。通过放射自显影或其它常规技术，可以鉴定已杂交至探针的核酸。
【0302】可以对上述方法进行修改，以鉴定与探针序列具有降低水平的同源性的核酸。例如，为了获得与可检测的探针具有降低的序列同源性的核酸，可以使用较低严格性的条件。例如，杂交温度可以以5℃的梯度变化从68℃降低到42℃，杂交缓冲液的Na+浓度为大约1M。在杂交后，用2×SSC、0.5％SDS在杂交温度下洗涤滤膜。这些条件在高于50℃被认为是“中度”条件，在低于50℃被认为是“低度”条件。“中度”杂交条件的具体实例是上述杂交在55℃进行。“低度严格性”杂交条件的具体实例是上述杂交在45℃进行。
【0303】可以选择地，杂交可以在含有甲酰胺的缓冲液如6×SSC中在42℃的温度下进行。在这种情况下，杂交缓冲液中甲酰胺的浓度可以以5％的梯度变化从50％降低到0％，以鉴定与探针具有降低水平的同源性的克隆。在杂交后，用6×SSC、0.5％SDS在50℃洗涤滤膜。这些条件在高于25％的甲酰胺被认为是“中度”条件，在低于25％甲酰胺被认为是“低度”条件。“中度”杂交条件的具体实例是上述杂交在30％甲酰胺中进行。“低度严格性”杂交条件的具体实例是上述杂交在10％甲酰胺中进行。
【0304】然而，杂交形式的选择不是关键性的——洗涤条件的严格性是决定核酸是否在本发明范围内的条件。用于鉴定本发明范围内的核酸的洗涤条件包括，例如：在pH 7大约0.02M的盐浓度，至少大约50℃或大约55℃到大约60℃的温度；或者在72℃大约0.15M NaCl的盐浓度下大约15分钟；或者在至少大约50℃或大约55℃到大约60℃的温度下大约0.2×SSC的盐浓度下大约15到大约20分钟；或者用溶液将杂交复合物洗涤两次，所述溶液的盐浓度为含有0.1％SDS的大约2×SSC，在室温下洗涤15分钟，然后用含有0.1％SDS的0.1×SSC在68℃洗涤15分钟，洗涤两次；或者等同的条件。参见Sambrook，Tijssen和Ausubel对于SSC缓冲液和等同条件的描述。
【0305】这些方法可以被用于分离本发明的核酸。例如，前述方法可用于分离核酸，所述核酸具有与选自本发明的序列或其含有至少大约10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续碱基的片段以及其互补序列之一的核酸序列具有至少约97％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少50％同源性的序列。同源性可以使用联配算法来测量。例如，同源多核苷酸可以具有编码序列，该编码序列是本文描述的编码序列之一的天然发生的等位基因变体。当与本发明的核酸比较时，这样的等位基因变体可以具有一个或多个核苷酸的置换、删除或添加。
【0306】另外，上述的方法可用于分离编码多肽的核酸，所述多肽与本发明的多肽或者其包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段具有至少大约99％、至少大约95％、至少大约90％、至少大约85％、至少大约80％、至少大约75％、至少大约70％、至少大约65％、至少大约60％、至少大约55％或至少大约50％的同源性，正如使用序列联配算法(例如FASTA3.0t78版本算法，参数为默认值)所确定的。
寡核苷酸探针及使用这些寡核苷酸探针的方法
【0307】本发明也提供了核酸探针，例如可以用于鉴定编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸或其片段，或用于鉴定葡聚糖酶的基因。一方面，该探针包括本发明核酸中的至少大约10个连续碱基。可以选择地，本发明的探针可以是如本发明核酸中所示序列的至少大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、150或大约10到50、大约20到60或大约30到70个连续碱基。这些探针通过结合和/或杂交来鉴定核酸。这些探针可以在本发明的阵列中使用，参见下面的讨论，包括例如毛细管阵列。本发明的探针也可以用于分离其它核酸或多肽。
【0308】本发明的分离的核酸、与其互补的序列、或含有本发明的序列之一的至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400或500个连续碱基的片段、或与其互补的序列，也可用作探针，以确定生物样品如土壤样品是否含有具有本发明的核酸序列的生物体或从中可得到所述核酸的生物体。在这样的方法中，获得潜在地具有从中可分离出所述核酸的生物体的生物样品，并从样品中获得核酸。将这些核酸在允许探针与样品中存在的任何互补序列特异性杂交的条件下与探针接触。
【0309】在必要的时候，允许探针与互补序列特异性杂交的条件，可以通过将探针与来自样品的互补序列以及对照序列进行接触来确定，所述样品已知含有互补序列，所述对照序列不含有互补序列。杂交条件，如杂交缓冲液的盐浓度、杂交缓冲液的甲酰胺浓度或杂交温度，可以被改变以确定允许探针与互补核酸特异性杂交的条件。
【0310】如果该样品含有从中可分离出核酸的生物体，那么探针的特异性杂交被检测到。杂交可以通过用可检测的试剂标记探针来检测，所述可检测的试剂如放射性同位素、荧光染料或能催化可检测产物形成的酶。
【0311】使用标记探针来检测样品中互补核酸的存在的许多方法对于本领域技术人员是熟知的。这些方法包括DNA印迹法、RNA印迹法、集落杂交方法和斑点印迹法。这些方法中的每一种方法的方案在Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley 503 Sons，Inc.(1997)和Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中提供。
【0312】可以选择地，一种以上的探针(其中至少一种探针能与核酸样品中存在的任何互补序列特异性杂交)可以在扩增反应中使用，以确定样品是否包含含有本发明的核酸序列的生物体(例如从中可分离出所述核酸的生物体)。这些探针可以包括寡核苷酸。一方面，扩增反应可以包括PCR反应。PCR实验方案在Ausubel和Sambrook，同上中有所描述。可选地，扩增可以包括连接酶链式反应、3SR或链置换反应(见Barany，F.，″The Ligase Chain Reaction in a PCR World″，PCRMethods and Applications 1：5-16，1991；E.Fahy et ah，″Self-sustained SequenceReplication(3SR)：An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternativeto PCR″，PCR Methods and Applications 1：25-33，1991；以及Walker G.T.等，″StrandDisplacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique″，Nucleic Acid Research 20：1691-1696，1992)。在这样的方法中，将样品中的核酸与探针接触，进行扩增反应，检测任何所得的扩增产物。扩增产物可以通过对反应产物进行凝胶电泳并用嵌入剂如溴化乙锭对凝胶进行染色来检测。可以选择地，可以用放射性同位素标记一种或多种探针，放射性扩增产物的存在在凝胶电泳后通过放射自显影术来检测。
【0313】衍生自本发明核酸的末端附近的序列的探针也可以在染色体步移(chromosome walking)方法中使用，以鉴定含有临近本发明的序列的基因组序列的克隆。这样的方法允许从宿主生物中分离编码额外蛋白的基因。
【0314】本发明的分离的核酸、与其互补的序列、或含有本发明的序列之一的至少10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250、300、400或500个连续碱基的片段、或与其互补的序列，可被用作探针，以鉴定和分离相关的核酸。在一些方面，该相关的核酸可以是来自生物体的cDNA或基因组DNA，这些生物体并不是从中分离出所述核酸的生物体。例如，其它生物体可以是相关生物体。在这样的方法中，核酸样品在允许探针与相关序列特异性杂交的条件下与探针接触。然后用上面描述的任意一种方法检测探针与来自相关生物体的核酸的杂交。
【0315】通过改变用于鉴定与可检测探针杂交的核酸例如cDNA或基因组DNA的杂交条件的严格性，可以鉴定并分离与探针具有不同同源性水平的核酸。严格性通过在低于探针的解链温度的变化温度下进行杂交来改变。解链温度Tm是50％的靶序列与完全互补的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。选择非常严紧的条件，使其与特定探针的Tm相等，或比Tm低大约5℃。可以使用下述公式计算探针的解链温度：
【0316】对于长度在14到70个核苷酸的探针，使用如下公式计算解链温度(Tm)：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C的比例分数)-(600/N)，其中N是探针的长度。
如果杂交在含有甲酰胺的溶液中进行，解链温度使用如下等式计算：Tm＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C的比例分数)-(0.63％甲酰胺)-(600/N)，其中N是探针的长度。
【0317】预杂交可以在6×SSC、5×Denhardt’s试剂、0.5％SDS、100μg变性的片段化鲑精DNA或6×SSC、5X Denhardt’s试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、50％甲酰胺中进行。SSC和Denhardt’s溶液的配方已在Sambrook等，如上列出。
【0318】杂交通过将可检测探针加入到上面所列出的预杂交溶液中来进行。在探针包含双链DNA的情况下，在加入到杂交溶液之前对探针变性。将滤膜与杂交溶液接触充足的时间，以允许探针与含有与其互补的序列或与其同源的序列的cDNA或基因组DNA杂交。对于长度超过200个核苷酸的探针，杂交可以在比Tm低约15至25℃的温度进行。对于更短的探针，如寡核苷酸探针，杂交在比Tm低5-10℃的温度进行。对于6×SSC中的杂交，杂交在大约68℃进行。一方面，对于在包含50％甲酰胺的溶液中的杂交，杂交是在大约42℃进行的。
抑制酶(葡聚糖酶)的表达
【0319】本发明提供了与本发明的核酸例如编码内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶的核酸互补的核酸(例如本发明的核酸的反义序列)。反义序列能抑制编码葡聚糖酶、编码内切葡聚糖酶、编码甘露聚糖酶或编码木聚糖酶的基因的转运、剪接或转录。抑制可通过将基因组DNA或信使RNA作为靶标来实现。作为靶标的核酸的转录或功能可以被抑制，例如通过杂交和/或切割。本发明提供的一组特别有用的抑制剂包括寡核苷酸，这些寡核苷酸或者能结合葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的基因或信息，在任一种情况下阻止或抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的产生或功能。结合可通过序列特异性杂交来完成。另一类有用的抑制剂包括引起葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信息失活或切割的寡核苷酸。该寡核苷酸可具有引起此类切割的酶活性，如核酶。可以对寡核苷酸进行化学修饰，或与能切割互补核酸的酶或组分偶联。可以对许多不同的这样的寡核苷酸的库进行筛选来寻找那些具有期望活性的寡核苷酸。因此，本发明提供了在核酸和/或蛋白水平抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶表达的各种组合物，例如，含有本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶序列的反义序列、iRNA(例如siRNA、miRNA)和核酶，以及本发明的抗葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、抗甘露聚糖酶、抗木聚糖酶、抗淀粉酶、抗黄原胶酶和/或抗糖苷酶，例如抗纤维二糖水解酶、抗甘露聚糖酶和/或抗β-葡糖苷酶的抗体。
【0320】葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶表达的抑制可以具有各种工业应用。例如，抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的表达可以减慢或防止食品或饲料腐败(spoilage)。当多糖，例如结构多糖被酶降解时，可发生腐败。这可以导致水果和蔬菜的变质或腐烂。一方面，本发明的抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的表达和/或活性的组合物的使用，例如抗体、反义寡核苷酸、核酶和iRNA的使用，被用于减慢或防止腐败。因此，一方面，本发明提供了方法和组合物，包括将本发明的抗体、反义寡核苷酸、核酶和iRNA应用于植物或者植物产品(如，谷物、谷粒、果实、种籽、根、叶等)，以阻止或者延缓腐败。这些组分也可以由植物(如，转基因植物)或者其它生物(如，用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的基因转化的细菌或者其它微生物)表达。
【0321】用于抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶表达的本发明的组分(例如，反义序列、iRNA(例如siRNA，miRNA)、核酶、抗体)可用作药物组合物，例如，抗病原体剂，或用在其它治疗中，例如用作抗微生物剂，如用于沙门氏菌属。
反义寡核苷酸
【0322】本发明提供了能结合葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信息或基因的反义寡核苷酸，其能通过以mRNA作为靶标来抑制靶基因或信息，来抑制例如葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖，水解酶活性(例如催化水解内β-1，4-木糖苷键)。设计反义寡核苷酸的策略在科学和专利文献中有很好的描述，技术人员能使用本发明的新试剂设计这样的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶寡核苷酸。例如，筛选有效的反义寡核苷酸的基因步移/RNA作图方案在本技术领域是熟知的，例如参见Ho(2000)Methods Enzymol.314：168-183，该文献描述了RNA作图分析法，该分析法是基于标准的分子技术，以提供用于有效的反义序列选择的一种简单且可靠的方法。也参见Smith(2000)Eur.J.Pharm.Sci.11：191-198。
【0323】自然发生的核酸被用作反义寡核苷酸。该反义寡核苷酸可以是任意长度；例如，在可选择的方面，该反义寡核苷酸在大约5到100之间，大约10到80之间，大约15到60之间，大约18到40之间。最适长度可以通过常规筛选来决定。这些反义寡核苷酸可以以任意浓度存在。最适浓度可通过常规筛选来决定。广泛种类的合成的、非天然发生的核苷酸和核酸类似物是已知的，它们可以解决这一潜在的问题。例如，可以使用含有非离子骨架的肽核酸(PNAs)，如含有N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元。也可以使用具有硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸，正如在如下文献中所描述的：WO 97/03211；WO 96/39154；Mata(1997)Toxicol ApplPharmacol 144：189-197；Antisense Therapeutics，ed.Agrawal(Humana Press，Totowa，N.J.，1996)。正如上面所描述的，本发明提供的具有合成DNA骨架类似物的反义寡核苷酸也可以包括二硫代磷酸酯、甲基膦酸、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3′-硫代乙缩醛、亚甲基(甲基亚氨)、3′-N-氨基甲酸酯和吗啉代氨基甲酸酯核酸。
【0324】组合化学方法学可用于产生大量能被快速筛选特异性寡核苷酸的寡核苷酸，所述特异性寡核苷酸对任何靶标具有适当的结合亲和性和特异性，例如本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶正义和反义序列(例如参见Gold(1995)J.，Biol.Chem.270：13581-13584)。
抑制性核酶
【0325】本发明提供了能结合葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信息或基因的核酶。这些核酶能通过例如以mRNA作为靶标来抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性。设计核酶和选择用于靶向的葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶特异性反义序列的策略在科学和专利文献中有很好的描述，熟练的技术人员能使用本发明的新试剂来设计这样的核酶。核酶通过核酶的靶RNA结合部分来与靶RNA结合，从而发挥作用，核酶的靶RNA结合部分与该RNA上切割靶RNA的酶促部分非常接近。这样，通过互补的碱基配对，核酶识别和结合靶RNA，而且一旦结合于正确的位置，便以酶促活性作用来切割靶RNA和使其失活。如果切割发生在编码序列中，以这样的方式切割靶RNA将会破坏其引导合成编码的蛋白的能力。核酶结合和切割其RNA靶之后，它可以从结合的RNA上释放出来并且重复切割新的靶。
【0326】在一些情况下，核酶的酶促性质会优于其它的技术，如反义技术(其中核酸分子仅结合于核酸靶来阻止其转录、翻译或者与其它分子的结合)，因为实现治疗效果所必要的核酶有效浓度可能低于反义寡核苷酸的浓度。这一潜在的优点反映出核酶可以以酶促方式进行作用的能力。因此，单个核酶分子可以切割靶RNA的多个分子。另外，核酶可以是高度特异性的抑制物，其抑制作用的特异性不仅依赖于碱基配对的结合机制，也依赖于该分子抑制与其结合的RNA的表达的机制。即，所述抑制是由切割靶RNA引起的，因此特异性定义为靶RNA的切割率与非靶RNA的切割率的比值。除了涉及碱基配对的那些因素，这种切割机制还依赖于另外的因素。这样，核酶作用的特异性比结合于同样的RNA位点的反义寡核苷酸高。
【0327】本发明的核酶，例如，具有酶活的核酶RNA分子，可以形成锤头状基序、发夹基序，如肝炎δ病毒基序、I类内含子基序和/或与RNA前导序列(guidesequence)相联系的RNaseP样RNA。锤头状基序的例子在如Rossi(1992)AidsResearch and Human Retroviruses 8：183中有描述；发夹基序在Hampel(1989)Biochemistry 28：4929和Hampel(1990)Nuc.Acids Res.18：299中有描述；肝炎δ病毒基序在Perrotta(1992)Biochemistry 31：16中有描述；RNaseP基序在Guetrier-Takada(1983)Cell 35：849中有描述；I类内含子在Cech美国专利4,987,071中有描述。这些特定基序的引述并不是限制性的。本领域技术人员将认识到本发明的核酶，如，本发明的有酶活的RNA分子，可以有与一个或者多个靶基因的RNA区域互补的特异性底物结合位点。本发明的核酶可以在底物结合位点内或者其周围具有赋予了该分子RNA切割活性的核苷酸序列。
RNA干扰(RNAi)
【0328】在一个方面，本发明提供了被称为“RNAi”分子的RNA抑制性分子，其含有本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶序列。RNAi分子包括双链RNA(dsRNA)分子。RNA可抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶基因的表达。在一个方面，RNAi的长度大约为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。虽然本发明不限于任何特殊的作用机制，但RNAi可进入细胞中，引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，包括内源性mRNA。当细胞暴露于双链RNA(dsRNA)时，来自同源基因的mRNA被称为RNA干扰(RNAi)的过程选择性地降解。RNAi的一个可能的基本机制是将与特定的基因序列匹配的双链RNA(dsRNA)打断成为称为短的干扰RNA的短碎片，它可触发与其序列匹配的mRNA的降解。在一个方面，本发明的RNAi可用于基因沉默(gene-silencing)疗法中，见，例如Shuey(2002)Drug Discov.Today 7：1040-1046。在一个方面，本发明提供了使用本发明的RNAi选择性降解RNA的方法。该过程可在体外、离体或体内实施。在一个方面，本发明的RNAi分子可用来在细胞、器官或动物中产生丧失功能的突变。制备和应用可选择性降解RNA的RNAi分子的方法在本领域中是熟知的，见，例如美国专利6,506,559；6,511,82；6,515,109；6,489,127。
核酸的修饰
【0329】本发明提供了产生本发明的核酸的变体的方法，所述本发明的核酸例如那些编码葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的核酸。这些方法可以被重复或者以多种组合使用，以产生具有与模板核酸编码的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶有所改变的或不同的活性或有所改变的或不同的稳定性的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这些方法也可以被重复或以多种组合使用，从而例如在基因/信息表达、信息翻译或信息稳定性方面产生变化。另一方面，细胞的遗传组成可以被改变，例如通过同源基因的离体修饰，随后再将其插入到细胞中。
【0330】一方面，术语“变体”是指在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基处被(分别地)修饰的本发明的多核苷酸或多肽，然而它们仍然保持本发明的葡聚糖酶生物学活性。变体可以通过许多种方法产生，包括的方法诸如，例如易错PCR、改组、寡核苷酸诱导的定向突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配、基因位点饱和突变(GSSM)、合成连接重组(SLR)及其任何组合。
【0331】本发明的核酸可以通过任何方法来改变。例如，随机(random或stochastic)方法、或者非随机、或者“定向进化”的方法，参见如，美国专利6,361,974。基因的随机突变方法在本领域是已知的，参见如，美国专利5,830,696。例如，可以应用突变剂来对基因进行随机突变。突变剂包括，如，紫外线或者γ辐射，或者化学诱变剂，如，丝裂霉素，亚硝酸，光活化的补骨脂内酯，它们单独使用或者组合使用来诱导DNA的断裂，其可以通过重组被修复。其它的化学诱变剂包括，如，亚硫酸氢钠、亚硝酸、羟胺、肼或者甲酸。其它的诱变剂是核苷酸前体的类似物，如，亚硝基胍、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤或者吖啶。这些试剂可以加入到PCR反应中替换核苷酸前体，从而突变该序列。也可以应用嵌入试剂如普罗黄素、吖啶黄、奎纳克林和类似物。
【0332】可以应用分子生物学上的任何技术，如随机PCR诱变，参见，如，Rice(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5467-5471；或者组合式多重盒式诱变，参见如，Crameri(1995)Biotechinques 18：194-196。可选择地，核酸，如基因，可以在随机片段化后重新装配，参见，如，美国专利6,291,242；6,287,862；6,287,861；5,955,358；5,830,721；5,824,514，5,811,238；5,605,793。在可选择的方面，修饰、增加或者删除可以通过易错PCR、改组、寡核苷酸诱导的定点突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体突变、位点专一性诱变、基因再装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)、重组、递归序列重组(recursive sequence recombination)、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶模板的诱变、缺口双重诱变(gapped duplex mutagenesis)、点错配修复诱变(point mismatch repair mutagenesis)、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变(restriction-selection mutagenesis)、限制纯化诱变(restriction-purification mutagenesis)、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成和/或者这些方法和其它方法的组合产生。
【0333】以下的出版物描述了可以并入到本发明的方法中的各种递归重组程序和/或方法：Stemmer(1999)“Molecular breeding of viruses for targeting and otherclinical properties”Tumor Targeting 4：1-4；Ness(1999)Nature Biotechnology17：893-896；Chang(1999)“Evolution of a cytokine using DNA family shuffling”Nature Biotechnology 17：793-797；Minshull(1999)“Protein evolution by molecularbreeding”Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；Christians(1999)“Directedevolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling”Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri(1998)“DNA shuffling of a family of genesfrom diverse species accelerates directed evolution”Nature 391：288-291；Crameri(1997)“Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”Nature Biotechnology 15：436-438；Zhang(1997)“Directed-evolution of an effectivefucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Patten等(1997)“Applications of DNA Shuffling toPharmaceuticals and Vaccines”Current Opinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri等(1996)“Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNAshuffling”Nature Medicine 2：100-103；Gates等(1996)“Affinity selective isolation ofligands from peptide libraries through display on a lac repressor ′headpiece dimer′”Journal of Molecular Biology 255：373-386；Stemmer(1996)“Sexual PCR andAssembly PCR”，于The Encyclopedia of Molecular Biology中.VCH Publishers，NewYork.447-457页；Crameri和Stemmer(1995)“Combinatorial multiple cassettemutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes”BioTechniques 18：194-195；Stemmer等(1995)“Single-step assembly of a gene andentire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides”Gene，164：49-53；Stemmer(1995)“The Evolution of Molecular Computation”Science 270：1510；Stemmer(1995)“Searching Sequence Space”Bio/Technology 13：549-553；Stemmer(1994)“Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”Nature 370：389-391；和Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitrorecombination for molecular evolution”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751。
【0334】产生多样性的突变方法包括，例如，定点诱变(Ling等.(1997)“Approaches to DNA mutagenesis：an overview”Anal Biochem.254(2)：157-178；Dale等(1996)“Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioatemethod”Methods Mol.Biol.57：369-374；Smith(1985)“In vitro mutagenesis”Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein & Shortle(1985)“Strategies and applications of in vitromutagenesis”Science 229：1193-1201；Carter(1986)“Site-directed mutagenesis”Biochem.J.237：1-7；和Kunkel(1987)“The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis”在Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))；使用含有尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel(1985)“Rapidand efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)“Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection”Methods in Enzymol.154，367-382；和Bass等(1988)“Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities”Science 242：240-245)；寡核苷酸诱导的定点诱变(Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods inEnzymol.154：329-350(1987)；Zoller(1982)“Oligonucleotide-directed mutagenesisusing M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production ofpoint mutations in any DNA fragment”Nucleic Acids Res.10：6487-6500；Zoller &Smith(1983)“Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned intoM13 vectors”Methods in Enzymol.100：468-500；和Zoller(1987)Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotideprimers and a single-stranded DNA template”Methods in Enzymol.154：329-350)；硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor(1985)“The use of phosphorothioate-modifiedDNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA”Nucl.Acids Res.13：8749-8764；Taylor(1985)“The rapid generation of oligonucleotide-directed mutationsat high frequency using phosphorothioate-modified DNA”Nucl.Acids Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye(1986)“Inhibition of restriction endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directedmutagenesis”Nucl.Acids Res.14：9679-9698；Sayers(1988)“Y-T Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis”Nucl.Asids Res.16：791-802；和Sayers等(1988)“Strand specific cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in thepresence of ethidium bromide”Nucl.Acids Res.16：803-814)；使用缺口双链体DNA的诱变(Kramer等(1984)“The gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction”Nucl.Acids Res.12：9441-9456；Kramer和Fritz(1987)Methods in Enzymol.“Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA”154：350-367；Kramer(1988)“Improved enzymaticin vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations”Nucl.Acids Res.16：7207；和Fritz(1988)“Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedurewithout enzymatic reactions in vitro”Nucl.Acids Res.16：6987-6999)。
【0335】可以用于实践本发明或制造本发明组合物的另外的实验方案包括点错配修复(参见例如Kramer(1984)Cell 38：879-887)，应用修复缺陷型宿主株的诱变(参见例如Carter等(1985)Nucl.Acids Res.13：4431-4443；Carter(1987)Methods in Enzymol.154：382-403)，缺失诱变(参见例如Eghtedarzadeh(1986)Nucl.Acids Res.14：5115)，限制-选择和限制-纯化(参见例如Wells等(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423)，通过全基因合成的诱变(参见例如Nambiar(1984)Science 223：1299-1301；Sakamar(1988)Nucl.Acids Res.14：6361-6372；Wells等(1985)Gene 34：315-323；Grundstrom(1985)Nucl.Acids Res.13：3305-3316)，双链断裂修复(参见例如Arnold(1993)Current Opinion inBiotechnology 4：450-455)。很多以上的方法的另外的细节可在Methods inEnzymology第154卷中发现，其中也描述了用于解决各种诱变方法中所遇到的问题的有用策略。
【0336】在例如下列的文件中描述了可以用于实践本发明的实验方案，如Stemmer的美国专利5,605,793(1997.2.25)，“Methods for In Vitro Recombination”；Stemmer等的美国专利5,811,238(1998.9.22)“Methods for GeneratingPolynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection andRecombination”；Stemmer等的美国专利5,830,721(1998.11.3)，“DNA Mutagenesisby Random Fragmentation and Reassembly”；Stemmer等的美国专利5,834,252(1998.11.10)，“End-Complementary Polymerase Reaction”；Minshull等的美国专利5,837,458(1998.11.17)“Methods and Compositions for Cellular and MetabolicEngineering”；WO 95/22625，Stemmer和Crameri，“Mutagenesis by RandomFragmentation and Reassembly”；WO 96/33207，Stemmer和Lipschutz，“EndComplementary Polymerase Chain Reaction”；WO 97/20078，Stemmer和Crameri的“Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by IterativeSelection and Recombination”；WO 97/35966，Minshull和Stemmer，“Methods andCompositions for Cellular and Metabolic Engineerin”；WO 99/41402，Punnonen等，“Targeting of Genetic Vaccine Vectors”；WO 99/41383，Punnonen等，“Antigen LibraryImmunization”；WO 99/41369，Punnonen等，“Genetic Vaccine Vector Engineering”；WO 99/41368，Punnonen等，“Optimization of Immunomodulatory Properties ofGenetic Vaccines”；EP 752008，Stemmer和Crameri，“DNA Mutagenesis by RandomFragmentation and Reassembly”；EP 0932670，Stemmer，“Evolving Cellular DNAUptake by Recursive Sequence Recombination”；WO 99/23107，Stemmer等，“Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling”；WO99/21979，Apt等，“Human Papillomavirus Vectors”；WO 98/31837，del Cardayre等，“Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination”；WO 98/27230，Patten和Stemmer，“Methods and Compositions for PolypeptideEngineering”；WO 98/27230，Stemmer等，“Methods for Optimization of Gene Therapyby Recursive Sequence Shuffling and Selection”；WO 00/00632，“Methods forGenerating Highly Diverse Libraries”；WO 00/09679，“Methods for Obtaining in VitroRecombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences”；WO98/42832，Arnold等，“Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random orDefined Primers”；WO 99/29902，Arnold等，“Method for Creating Polynucleotide andPolypeptide Sequences”；WO 98/41653，Vind，“An in Vitro Method for Constructionof a DNA Library”；WO 98/41622，Borchert等，“Method for Constructing a LibraryUsing DNA Shuffling”；以及WO 98/42727，Pati和Zarling，“Sequence Alterationsusing Homologous Recombination”。
【0337】在例如下列的文件中描述了可以用于实践本发明的方案(提供了关于产生不同多样性的方法的细节)，如美国专利申请系列号(USSN)09/407,800，Patten等的“SHUFFLING OF CODONALTERED GENES”，于1999年9月28日提交；delCardayre等的“EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BYRECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION”，美国专利6,379,964；Crameri等的“OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION”，美国专利6,319,714；6,368,861；6,376,246；6,423,542；6,426,224和PCT/US00/01203；Welch等的“USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FORSYNTHETIC SHUFFLING”，美国专利6,436,675；Selifonov等的“METHODS FORMAKING CHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDESHAVING DESIRED CHARACTERISTICS”，2000年1月18日提交，(PCT/US00/01202)和，如Selifonov等的“METHODS FOR MAKINGCHARACTER STRINGS，POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVINGDESIRED CHARACTERISTICS”，2000年7月18日提交，(美国系列号09/618,579)；Selifonov和Stemmer的“METHODS OF POPULATING DATASTRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS”，2000年1月18日提交(PCT/US00/01138)，和Affholter的“SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACIDTEMPLAFE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENTISOLATION”，2000年9月6日提交(美国系列号09/656,549)，和美国专利6,177,263；6,153,410。
【0338】非随机或“定向进化”方法包括，例如基因位点饱和诱变(GSSMTM)、合成连接重装配(SLR)或其组合，它们被用于修饰本发明的核酸，以产生具有新的或改变的特性(例如在高度酸性或碱性条件下的活性，在高温或低温的活性，等等)的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。由修饰的核酸编码的多肽可以在测试葡聚糖或其它多糖水解或其它活性之前被筛选活性。可以使用任何测试形式或实验方案，例如使用毛细管阵列平台。例如参见美国专利6,361,974；6,280,926；5,939,250。
饱和诱变或GSSM
【0339】本发明也提供了使用基因位点饱和诱变或GSSM制备新酶或修饰本发明序列的方法，如在本文中以及美国专利6,171,820和6,579,258所述的。
【0340】一方面，含有简并N，N，G/T序列的密码子引物被用于将点突变引入多核苷酸中，例如本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶或抗体，以便产生一组子代多肽，其中在每一氨基酸位置上可表现出全范围的单氨基酸置换，置换发生的位置例如酶活性位点(催化结构域(CD))中的氨基酸残基，或将要被修饰的配体结合位点。这些寡核苷酸可以包括相邻的第一同源序列，简并N，N，G/T序列，和任选地第二同源序列。由使用这些寡核苷酸而得到的下游子代翻译产物包含沿着多肽的每一氨基酸位点上的所有可能的氨基酸变化，这是由于N，N，G/T序列的简并性包括了所有20个氨基酸的密码子。一方面，一个这样的简并寡核苷酸(例如包括一个简并N，N，G/T序列盒)被用于使亲本多核苷酸模板中的每一原始密码子进行完全范围的密码子置换。另一方面，使用至少两个简并序列盒，或在相同的寡核苷酸中或不同的寡核苷酸中，用于使亲本多核苷酸模板中的至少两个原始密码子进行完全范围的密码子置换。例如，一个寡核苷酸中可以包含一个以上N，N，G/T序列，以便在多于一个的位点上引入氨基酸突变。这些多个N，N，G/T序列可以直接相邻，或被一个或多个额外的核苷酸序列分隔开。另一方面，用于引入插入和删除的寡核苷酸可以单独使用，或者与含有N，N，G/T序列的密码子组合使用，以便引入氨基酸插入、删除和/或置换的任何排列组合。
【0341】一方面，两个或更多个连续氨基酸位置的同时诱变是使用含有相邻N，N，G/T三联体的寡核苷酸进行的，即简并(N，N，G/T)n序列。另一方面，使用与N，N，G/T序列相比具有较低简并性的简并序列盒。例如，在一些情况下，可能期望(例如，在寡核苷酸中)使用仅包括一个N的简并三联体序列，其中所述的N可以在三联体的第一、第二或第三位置上。在该三联体的剩余两个位置上，可以使用包括任意排列组合的任何其它碱基。可以选择地，在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)简并N，N，N三联体序列。
【0342】一方面，使用简并三联体(例如N，N，G/T三联体)允许在多肽中的每一和每个氨基酸位置上系统且容易地产生完全范围的可能的天然氨基酸(总共20种氨基酸)(在可以选择的方面，这些方法也包括在每一氨基酸残基或密码子、位置产生少于全部的可能置换)。例如，对于100个氨基酸的多肽，可以产生2000个不同种类(即每个位置上的20种可能氨基酸×100个氨基酸位置)。通过使用含有简并N，N，G/T三联体的寡核苷酸或一组寡核苷酸，32种不同序列可编码所有20种可能的天然氨基酸。因此，在其中使用至少一种这样的寡核苷酸对亲本多核苷酸序列进行饱和诱变的反应容器中，产生了编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反，在定点诱变中使用非简并寡核苷酸在每个反应容器中仅仅导致一种子代多肽。非简并寡核苷酸可以任选地与所公开的简并引物组合使用；例如，非简并寡核苷酸可以被用于在工作多核苷酸中产生特异性点突变。这提供了产生特异性沉默点突变、导致相应的氨基酸变化的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段的相应表达的手段。
【0343】一方面，每一饱和诱变反应容器含有编码至少20种子代多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)分子的多核苷酸，以便所有的20种天然氨基酸都会出现在对应于亲本多核苷酸中被诱变的密码子位置的特定氨基酸位置(其它方面使用了少于20个天然的组合)。从每一饱和诱变反应容器产生的32倍简并的子代多肽可以被克隆扩增(例如使用表达载体克隆到合适的宿主中，例如大肠杆菌宿主中)，并进行表达筛选。当单个子代多肽通过筛选鉴定，显示出有利的特性变化时(当与亲本多肽相比时，如在碱性或酸性条件下增高的葡聚糖水解活性)，可以对其测序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸置换。
【0344】一方面，如本文所公开的，应用饱和诱变对亲本多肽的各个和所有的氨基酸位置进行诱变后，可以在超过一个的氨基酸位置确定出有利的氨基酸变化。可以产生一个或多个新的子代分子，其含有所有或部分这些有利的氨基酸置换的组合。例如，如果在多肽的3个氨基酸位置的每一个氨基酸位置处鉴定出2个特异的有利的氨基酸变化，那么出现的排列就包括每一位置上的3种可能性(与原始氨基酸没有变化的可能性，以及两个有利变化中的每一个的可能性)和3个位置。因此，总共有3×3×3或27种可能性，其中包括了先前被检验的7种可能性，即6个单点突变(即三个位置的每一个位置有2个)和在任何位置上没有变化的点突变。
【0345】另一方面，位点饱和诱变可以与改组、嵌合、重组和其它诱变方法以及筛选一起使用。本发明提供了以反复的方式使用任何诱变方法，包括饱和诱变。在一个实例中，任何诱变方法的反复使用与筛选结合使用。
【0346】本发明还提供了使用专有密码子引物(含有简并N，N，N序列)将点突变引入多核苷酸中，以便产生一组子代多肽，其中在每一氨基酸位置上可表现出全范围的单氨基酸置换(基因位点饱和诱变(GSSM))。使用的这些寡聚体包括相邻的第一同源序列，简并N，N，N序列，以及一方面不必须包括第二同源序列。由使用这些寡聚体而得到的下游子代翻译产物包含沿着多肽的每一氨基酸位点上的所有可能的氨基酸变化，这是由于N，N，N序列的简并性包括了所有20个氨基酸的密码子。
【0347】一方面，一个这样的简并寡聚体(包括一个简并N，N，N序列盒)被用于使亲本多核苷酸模板中的每一原始密码子进行完全范围的密码子置换。另一方面，使用至少两个简并N，N，N序列盒，或在相同的寡聚体中或不同的寡聚体中，用于使亲本多核苷酸模板中的至少两个原始密码子进行完全范围的密码子置换。因此，一个寡聚体中可以包含一个以上N，N，N序列，以便在多于一个的位点上引入氨基酸突变。这些多个N，N，N序列可以直接相邻，或由一个或多个额外的核苷酸序列分隔开。另一方面，用于引入插入和删除的寡聚体可以单独使用，或者与含有N，N，N序列的密码子组合使用，以便引入氨基酸插入、删除和/或置换的任何排列组合。
【0348】在一个具体的示例中，使用含有相邻N，N，N三联体的寡聚体，即简并(N，N，N)n序列，进行两个或更多个连续氨基酸位置的同时诱变是可能的。
【0349】另一方面，本发明提供了使用与N，N，N序列相比具有较低简并性的简并序列盒。例如，在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)仅包括一个N的简并三联体序列，其中所述的N可以在三联体的第一、第二或第三位置上。在三联体的剩余两个位置上，可以使用包括任意排列组合的任何其它碱基。可以选择地，在一些情况下可能期望使用(例如在寡聚体中)简并N，N，N三联体序列、N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列。
【0350】但是，可以意识到的是由于若干个原因，使用如本发明公开的简并三联体(例如N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列)是有利的。一方面，本发明提供了在多肽中的每一和每个氨基酸位置上系统且相对容易地产生完全范围的可能的氨基酸(总共20种氨基酸)的置换的方法。因此，对于100个氨基酸的多肽，本发明提供了系统且相对容易地产生产生2000个不同种类(即每个位置上的20种可能氨基酸×100个氨基酸位置)的方法。可以理解，通过使用含有简并N，N，G/T或N，N，G/C三联体序列的寡聚体，32种不同序列可编码所有20种可能的氨基酸。因此，在其中使用一种这样的寡聚体对亲本多核苷酸序列进行饱和诱变的反应容器中，产生了编码20种不同多肽的32种不同的子代多核苷酸。相反，在定点诱变中使用非简并寡聚体在每个反应容器中仅仅导致一种子代多肽产物。
【0351】本发明还提供了非简并寡聚体的使用，其可以任选地与所公开的简并引物组合使用。可以理解，在一些情况中，使用非简并寡聚体在工作多核苷酸中产生特异性点突变是有利的。这提供了产生特异性沉默点突变、导致相应的氨基酸变化的点突变、以及导致产生终止密码子和多肽片段的相应表达的点突变的手段。
【0352】因此，在本发明的一方面，每一饱和诱变反应容器含有编码至少20种子代多肽分子的多核苷酸，以便所有的20种氨基酸都会出现在对应于亲本多核苷酸中被诱变的密码子位置的一个特定氨基酸位置。从每一饱和诱变反应容器产生的32倍简并的子代多肽可以被克隆扩增(例如使用表达载体克隆到合适的大肠杆菌宿主中)，并进行表达筛选。当单个子代多肽通过筛选鉴定，显示出有利的特性变化时(当与亲本多肽相比时)，可以对其测序以鉴定其中所含的相应的有利氨基酸置换。
【0353】应意识到的是，如本文所公开的，应用饱和诱变对亲本多肽的各个和所有的氨基酸位置进行诱变后，可以在超过一个的氨基酸位置确定出有利的氨基酸变化。可以产生一个或多个新的子代分子，其含有所有或部分这些有利的氨基酸置换的组合。例如，如果在多肽的3个氨基酸位置的每一个氨基酸位置处鉴定出2个特异的有利的氨基酸变化，那么出现的排列就包括每一位置上的3种可能性(与原始氨基酸没有变化的可能性，以及两个有利变化中的每一个的可能性)和3个位置。因此，总共有3×3×3或27种可能性，其中包括了先前被检验的7种可能性，即6个单点突变(即三个位置的每一个位置有2个)和在任何位置上没有变化的点突变。
【0354】因此，在一个非限制性示例中，本发明提供了结合另外的诱变方法使用饱和诱变，例如其中两个或更多个相关多核苷酸被引入合适的宿主细胞的方法，以便通过重组和还原性重配产生杂合多核苷酸。
【0355】除了沿着基因的全序列进行诱变之外，本发明提供了：诱变可用于替代多核苷酸序列中任意数量的碱基的每一个，其中待被诱变的碱基的数量在一个方面为从15至100,000中的每一个整数。因此，并不是沿着分子诱变每一个位置，可以对每一个或独立数目的碱基(在一个方面为总共15至100,000的亚组)进行诱变。一方面，单独的核苷酸被用于沿着多核苷酸序列诱变每一个位置或一组位置。待被诱变的3个位置可以是密码子。使用诱变引物可以引入突变，该诱变引物含有异源序列盒，也称为诱变序列盒。示例性的序列盒可以具有1至500个碱基。在这样的异源序列盒中每一个核苷酸位置可以是N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G或E，其中E是非A、C、G或T的任何碱基(E可以被称为设计寡聚体(designer oligo))。
【0356】一方面，饱和诱变包括诱变有待诱变的限定多核苷酸序列(其中待诱变的序列长度一方面为约15至100,000个碱基)中的一整组诱变序列盒(其中每一个序列盒的长度一方面为约1-500个碱基)。因此，一组突变(范围从1至100个突变)被引入每一个待诱变的序列盒。在应用一轮饱和诱变的过程中，一组待被引入到一个序列盒的突变可以与第二组待被引入到第二个序列盒的突变不同或相同。这样的分组通过缺失、插入、特定密码子的分组以及特定核苷酸序列盒的分组加以例示。
【0357】待被诱变的限定序列包括全基因、通路、cDNA、整个开放阅读框(ORF)以及整个启动子、增强子、阻抑物/反式激活蛋白、复制起点、内含子、操纵子或任何多核苷酸功能组。通常，为了此目的，“限定序列(defined sequence)”可以是15碱基多核苷酸序列的任何多核苷酸以及长度在15个碱基至15,000个碱基之间的多核苷酸序列(本发明特别指出中间的每一个整数)。选择密码子分组时的考虑因素包括由简并诱变序列盒编码的氨基酸类型。
【0358】一方面，可被引入到诱变序列盒中的突变分组，本发明特别提供了在每一个位置编码2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20种氨基酸的简并密码子置换(使用简并寡聚体)以及由此编码的多肽文库。
合成连接重装配(SLR)
【0359】本发明提供了非随机的基因修饰系统，命名为“合成连接重装配”或简单地称作“SLR”，这是一种“定向进化方法”，产生具有新的或改变的特性的多肽，例如本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶或本发明的抗体。SLR是将寡核苷酸片段非随机地连接在一起的一种方法。该方法与随机寡核苷酸改组不同的地方在于，核酸构件(building blocks)没有被随意地改组、连接或嵌合，而是被非随机地装配。例如参见美国专利6,773,900；6,740,506；6,713,282；6,635,449；6,605,449；6,537,776。
【0360】一方面，SLR包括下述步骤：(a)提供模板多核苷酸，其中模板多核苷酸包含编码同源基因的序列；(b)提供多个构件多核苷酸，其中这些构件多核苷酸被设计成可在预定的序列处与模板多核苷酸交换重装配(cross-overreassemble)，所述构件多核苷酸包含作为同源基因变体的序列和与变体序列两侧的模板多核苷酸同源的序列；(c)将构件多核苷酸与模板多核苷酸组合在一起，以便构件多核苷酸与模板多核苷酸交换重装配，以产生包含同源基因序列变异的多核苷酸。
【0361】SLR不依赖于将被重新排列的多核苷酸之间存在高度同源性。因此，该方法可以被用于非随机地产生包括超过10100个不同嵌合体的子代分子的文库(或集合)。SLR可以被用于产生包括超过101000个不同子代嵌合体的文库。因此，本发明的一些方面包括产生一组最终嵌合的核酸分子的非随机方法，所述最终嵌合的核酸分子具有按设计所选择的整个装配次序。该方法包括按设计产生多个特异性核酸构件的步骤，以及装配这些核酸构件的步骤，这样可获得依设计而定的整个装配次序，所述的多个特异性核酸构件具有可被应用的互相相容的可连接末端。
【0362】将被装配的核酸构件的互相相容的可连接末端被认为对于这种类型的有序装配是“有用的”，如果它们能使这些构件以预定次序结合的话。因此，核酸构件可以被偶联的整个装配次序是由可连接末端的设计来确定的。如果使用多于一个的装配步骤，那么核酸构件可被偶联的总装配次序也由装配步骤的连续次序来确定。一方面，用酶例如连接酶(例如T4 DNA连接酶)处理退火的结构片段，以实现结构片段的共价结合。
【0363】一方面，寡核苷酸构件的设计通过分析一组祖先核酸序列模板来获得，所述祖先核酸模板作为产生最终嵌合的多核苷酸的子代集合的基础。这些亲本寡核苷酸模板因此作为序列信息的来源，它们在将被诱变例如被嵌合或改组的核酸构件的设计中有用。在该方法的一个方面，多个亲本核酸模板的序列被联配，以便选择一个或多个分界点。这些分界点可以位于同源区域，由一个或多个核苷酸构成。这些分界点优选地由至少两个祖先模板共享。从而这些分界点可以被用于描绘将要产生的寡核苷酸构件的边界，以便重排列亲本多核苷酸。在祖先分子中鉴定和选择的分界点作为最终嵌合的子代分子的装配中的潜在嵌合点。分界点可以是由至少两个亲本多核苷酸序列分享的同源区域(包括至少一个同源性核苷酸碱基)。可以选择地，分界点可以是由至少一半的亲本多核苷酸序列分享的同源区域，或者可以是由至少三分之二的亲本多核苷酸序列分享的同源区域。甚至更优选地，在一个方面，有用的分界点是由至少四分之三的亲本多核苷酸序列分享的同源区域，或者可以是由几乎所有的亲本多核苷酸序列分享的同源区域。一方面，分界点是由所有亲本多核苷酸序列分享的同源区域。
【0364】一方面，连接再装配过程被彻底地进行，以便产生含有尽量可能多的子代嵌合多核苷酸的文库。换句话说，核酸构件的所有可能的有序组合都呈现在最终嵌合的核酸分子集合中。同时，另一方面，在每一组合中的装配次序(即各个最终嵌合核酸的5’到3序列中每一构件的装配次序)遵循如上所述的设计(或非随机地)。由于本发明的非随机特性，大大地降低了不需要的副产品的可能性。
【0365】另一方面，连接再装配方法被系统地进行。例如，实施该方法，以便产生子代分子的系统区分化的文库，该文库分成能被系统地筛选的数个部分，例如可以逐个地筛选。换句话说，通过选择性的和审慎的应用特定的核酸构件，再加上选择性的和审慎的应用连续的分步骤的装配反应，本发明使得这样一种设计可以实现，即可以在各个反应容器中制备出各自特定的一系列子代产物。这样的设计允许进行系统的检查和筛选步骤。因此，这些方法允许很可能非常大量的子代分子以更小的组被系统地检查。由于其具有以高度变通而又彻底和系统的方式进行嵌合化反应的能力，尤其是当祖先分子之间具有低水平的同源性时，这些方法可以产生包含大量子代分子的文库(或集合)。由于本发明的连接再装配的非随机特性，所产生的子代分子一方面包含有最终嵌合核酸分子的文库，这些核酸分子具有按设计而选择的总装配次序。饱和诱变和优化的定向进化方法也可以被用于产生不同的子代分子种类。应该意识到，本发明在分界点的选择、核酸构件的大小和数量以及偶联的大小和设计方面提供了选择的自由度和可控制性。进一步，应该意识到，就本发明的可操作性而言，对分子间同源性的要求大大地放宽了。事实上，甚至可以在有很少的分子间同源性或没有分子间同源性的区域内选择分界点。例如，由于密码子的摆动，即密码子的简并性，可以将核苷酸取代引入核酸构件，同时又不会改变在相应的祖先模板中最初编码的氨基酸。可以选择地，可以改变密码子，从而改变对原始氨基酸的编码。在本发明中，这样的取代可以被引入到核酸构件中，以便增加分子间同源分界点的发生率，从而使得在构件之间可获得的偶联的数量增加，而这又允许产生更多数量的子代嵌合分子。
【0366】一方面，本发明提供了非随机的方法，命名为合成基因重装配，其在一定程度上与随机改组相关，只是核酸构件不随机改组、连接或嵌合，而是被非随机地装配。
【0367】合成基因重装配法不依赖于将被改组的多核苷酸之间存在高度同源性。本发明可以被用于非随机地产生包括超过10100个不同嵌合体的子代分子的文库(或集合)。可以想象地，合成基因重装配可以被用于产生包括超过101000个不同子代嵌合体的文库。
【0368】因此，一方面，本发明提供了产生一组最终嵌合的核酸分子的非随机方法，所述最终嵌合的核酸分子具有按设计所选择的整个装配次序，该方法包括按设计产生多个特异性核酸构件的步骤，以及装配这些核酸构件的步骤，这样可获得依设计而定的整个装配次序，所述的多个特异性核酸构件具有可被应用的互相相容的可连接末端。
【0369】将被装配的核酸构件的互相相容的可连接末端被认为对于这种类型的有序装配是“有用的”，如果它们能使这些构件以预定次序结合的话。因此，一方面，核酸构件可以被偶联的整个装配次序是由可连接末端的设计来确定，并且如果使用多于一个的装配步骤，那么核酸构件可被偶联的总装配次序也由装配步骤的连续次序来确定。在本发明的一方面，用酶例如连接酶(例如T4 DNA连接酶)处理退火的结构片段，以实现结构片段的共价结合。
【0370】另一方面，核酸构件的设计通过分析一组祖先核酸模板的序列来获得，所述祖先核酸模板作为产生最终嵌合的多核苷酸的子代集合的基础。这些祖先核酸模板因此作为序列信息的来源，它们有助于设计将被诱变例如被嵌合或改组的核酸构件。
在一个示例中，本发明提供了相关基因的家族和它们编码的相关产物的家族之间的嵌合。在具体的示例中，编码的产物是酶。根据本文描述的方法，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被诱变。
【0371】因此，根据本发明的一个方面，多个祖先核酸模板序列(例如本发明的多核苷酸)被联配，以便选择一个或多个分界点，这些分界点可以位于同源区域。这些分界点可以被用于描绘将要产生的寡核苷酸构件的边界。因此，在祖先分子中鉴定和选择的分界点作为子代分子的装配中的潜在嵌合点。
【0372】一方面，有用的分界点是由至少两个祖先模板分享的同源区域(包括至少一个同源核苷酸碱基)，但分界点可以是由至少一半的祖先模板、至少三分之二的祖先模板、至少四分之三的祖先模板以及一方面可以是由几乎所有的祖先模板分享的同源区域。甚至仍在一方面，有用的分界点是由所有祖先模板分享的同源区域。
【0373】一方面，基因再装配过程被彻底地进行，以便产生含有尽量可能多的文库。换句话说，核酸构件的所有可能的有序组合都呈现在最终嵌合的核酸分子集合中。同时，在每一组合中的装配次序(即各个最终嵌合核酸的5’到3序列中每一构件的装配次序)是设计的(或非随机地)。由于本发明的非随机特性，大大地降低了不需要的副产品的可能性。
【0374】另一方面，基因再装配过程在所述方法中被系统地进行，以便例如产生子系统区分化的文库，该文库分成能被系统地筛选的数个部分，例如可以逐个地筛选。换句话说，通过选择性的和审慎的应用特定的核酸构件，再加上选择性的和审慎的应用连续的分步骤的装配反应，本发明使得这样一种实验设计可以实现，即在其中可以在各个反应容器中制备出特定的一组子代产物。这样的设计允许进行系统的检查和筛选步骤。因此，这些方法允许很可能非常大量的子代分子以更小的组被系统地检查。
【0375】由于其具有以高度变通而又彻底和系统的方式进行嵌合化反应的能力，尤其是当祖先分子之间具有低水平的同源性时，本发明可以产生包含大量子代分子的文库(或集合)。由于本发明的基因再装配的非随机特性，所产生的子代分子一方面包含有最终嵌合核酸分子的文库，这些核酸分子具有按设计而选择的总装配次序。在具体方面，这样的所产生的文库包括大于103至大于101000种不同的子代分子种类。
【0376】一方面，如所述产生的一组最终嵌合的核酸分子包括编码多肽的多核苷酸。根据一方面，该多核苷酸是基因，其可以是人造基因。根据另一方面，该多核苷酸可以是基因通路，其可以是人造基因通路。本发明产生的一种或更多种人造基因在本发明中可以掺入人造基因途径，例如在真核生物体(包括植物)中可操纵的途径。
【0377】在另一个示例中，产生构件的步骤的合成属性允许设计和引入核苷酸(例如一个或多个核苷酸，例如可以是密码子或内含子或调控序列)，这些核苷酸随后可以在体外过程中(例如通过诱变)或者在体内过程中(例如通过利用宿主生物体的基因剪接能力)被任选地去除。应该意识到，在许多情况下，除了产生有用的分界点的潜在好处之外，还有许多其它原因也使得可能期望引入这些核苷酸。
【0378】因此，根据另一方面，本发明规定，核酸构件被用于引入内含子。这样，本发明规定，功能性内含子被引入到本发明的人造基因中。本发明还规定，功能性内含子可以被引入本发明的人造基因通路中。因此，本发明提供了嵌合多核苷酸的产生，该嵌合多核苷酸是含有一个(或多个)人工引入的内含子的人造基因。
【0379】因此，本发明还提供了嵌合多核苷酸的产生，该嵌合多核苷酸是含有一个(或多个)人工引入的内含子的人造基因通路。一方面，人工引入的内含子在一种或多种宿主细胞的基因剪接中发挥作用，其发挥作用的方式与天然发生的内含子在基因剪接中发挥作用的方式在很大程度上是相同的。本发明提供了产生含人造内含子的多核苷酸的方法，该多核苷酸将被引入宿主生物体中，用于重组和/或剪接。
【0380】使用本发明产生的人造基因也可作为底物发挥作用，用于与另一核酸重组。同样，使用本发明产生的人造基因途径也可作为底物发挥作用，用于与另一核酸重组。一方面，重组由人造的含内含子基因和作为重组伙伴的核酸之间的同源区域促进，或发生在人造的含内含子基因和作为重组伙伴的核酸之间的同源区域。一方面，重组伙伴也可以是本发明产生的核酸，包括人造基因或人造基因途径。重组可以由人造基中一个(或多个)人工引入的内含子上存在的同源区域促进，或发生在由人造基中一个(或多个)人工引入的内含子上存在的同源区域。
【0381】本发明的合成基因再装配方法使用多种核酸构件，其每一种一方面具有两个可连接末端。在每一个核酸构件上的两个可连接末端可以是两个平端(即，每一个末端具有零个核苷酸的突出)，或者一方面可以是一个平端和一个突出端，或者更多的在一方面可以依然是两个突出端。
【0382】用于该目的的一个有用的突出端可以是3′突出端或5′突出端。因此，核酸构件可以具有一个3′突出端或可选地具有一个5′突出端或可选地具有两个3′突出端或可选地具有两个5′突出端。核酸构件被装配来形成最终嵌合的核酸分子的整个装配次序通过有目的试验设计确定并且是非随机的。
【0383】一方面，通过化学合成两个单链核酸(也称为单链寡聚体)并使它们接触以便允许它们退火形成双链核酸构件来生成核酸构件。
【0384】双链核酸构件可以具有不同的大小。这些构建的大小可以是小的或大的。构件的示例性大小在1碱基对(不包括任何突出端)至100,000碱基对(不包括任何突出端)之间。还提供了其它示例性大小，其具有1bp至10,000bp(包括中间的每一个整数)的下限和2bp至100,000bp(包括中间的每一个整数)的上限。
【0385】存在许多方法，通过这些方法，可以产生可用于本发明的双链核酸构件；并且这些方法在本领域中是已知的，且普通技术人员容易进行。
【0386】根据一个方面，通过首先产生两个单链核酸并使它们退火形成双链核酸构件，从而产生双链核酸构件。双链核酸构件的两条链可以在每个核苷酸处互补，除了形成突出端的任何一个核苷酸；从而除了任何突出端外不含有错配。根据另一方面，双链核酸构件的两条链可以在比除了形成突出端的任何核苷酸外的每个核苷酸更少的核苷酸处互补。因此，根据一方面，双链核酸构件可用于引入密码子简并性。一方面，使用本文描述的位点饱和诱变，使用一个或多个N，N，G/T序列盒，或者可选地，使用一个或多个N，N，N序列盒，引入密码子简并性。
【0387】本发明的体内重组方法可以在未知杂合体或具体多核苷酸或序列的等位基因的库上进行盲试。然而，不必知道所述具体多核苷酸的实际DNA或RNA序列。
【0388】采用混合基因群内的重组的方法可用于产生任何有用的蛋白质，例如白细胞介素I、抗体、tPA和生长激素。该方法可用于产生具有改变的特异性或活性的蛋白质。该方法还可以用于产生杂合核酸序列，例如，基因的启动子区、内含子、外显子、增强子序列、3’未翻译区或5’未翻译区。因此，该方法可用于产生具有增加的表达速率的基因。该方法在研究重复DNA序列中也是有用的。最后，该方法可用于制备核酶或适体。
一方面，本文中描述的发明涉及还原性重配(reductive reassortment)、重组和选择的重复循环应用，其使得可以通过重组实现高度复杂的线性序列例如DNA、RNA或蛋白质的定向分子进化。
优化的定向进化系统
【0389】本发明提供了一种非随机的基因修饰系统，命名为“优化的定向进化系统”，其可以用来产生具有新的或者改变的性质的多肽，如本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷或者抗体。优化的定向进化涉及还原性重配、重组和选择的重复循环应用，其使得可以通过重组实现核酸的定向分子进化。优化的定向进化允许产生大量的进化出的嵌合序列，其中产生的群体显著地富集了具有预定数目遗传交换事件的序列。
【0390】遗传交换事件是在嵌合序列中的一个点，在这里，从一个亲本变体到另一个亲本变体的序列转换发生。这样的点一般在来自两个亲本的寡核苷酸连接在一起形成单个序列的连接处。这一方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度，这样，序列的最终嵌合群体富集了选定数目的遗传交换事件。这也提供了对选择具有预定数目的遗传交换事件的嵌合突变体的更多控制。
【0391】此外，这一方法与其它系统相比，提供了一种用于探究大数量的可能蛋白变体空间的方便手段。以前，例如，如果在反应中产生了1013个嵌合分子，测试这样大数目的嵌合突变体的特定活性将会非常困难。此外，子代群体的相当部分将具有很高数目的遗传交换事件，其中得到的蛋白较不可能具有增高水平的特定活性。通过应用这些方法，嵌合分子的群体可以富集那些含有特定数目的遗传交换事件的变体。因此，尽管在反应中可以仍然产生1013嵌合分子，但是所选择的用于进一步分析的每一个分子很可能具有，例如，仅仅三个遗传学交换事件。因为得到的子代群体可以偏向于具有预定数目的遗传交换事件，所以嵌合分子之间的功能多样性的界限缩小了。当要计算在最初的亲本多核苷酸中的哪一个寡核苷酸可能影响到特定的性质时，这便提供了更加可控数目的变量。
【0392】产生嵌合子代多核苷酸序列的一个方法是产生对应于每一个亲本序列的片段或者部分的寡核苷酸。每一个寡核苷酸一方面包括独特的重叠区域，这样把所述寡核苷酸混合在一起，得到具有以正确顺序装配的每个寡核苷酸片段的新的变体。可选地，实践本发明的方法的方案可以在美国专利6,773,900；6,740,506；6,713,282；6,635,449；6,605,449；6,537,776；6,361,974中找到。
【0393】对应于每一个亲本变体产生的寡核苷酸数目与在最终产生的嵌合分子中得到的交换的总的数目具有一定的关系。例如，为了发现如在高温下具有更高活性的嵌合变体，可以提供三个亲本核苷酸序列变体来进行连接反应。作为一个例子，对应于每一个亲本变体的每一部分可以产生总共50个寡核苷酸序列。相应地，在连接再装配过程中，在每一个嵌合序列中就有可能有多达50个交换事件。产生的每一个嵌合多核苷酸都以交替的顺序含有来自各个亲本变体的寡核苷酸的可能性很低。如果每一个寡核苷酸片段以同样的摩尔量存在于连接反应中，有可能在一些位置上来自同一亲本多核苷酸的寡核苷酸将与相邻的彼此连接，而不导致遗传交换事件。如果在这一例子的任何连接步骤中，来自每一个亲本的每一种寡核苷酸的浓度都保持不变，那么将会有三分之一的机会(假定3个亲本)来自同一个亲本变体的寡核苷酸将连接于嵌合序列内而不产生交换。
【0394】因此，可以确定概率密度函数(PDF)，预测在一个连接反应的每一步中可能发生的遗传交换事件的总数，其中给出了一套许多的亲本变体、对应于每种变体的许多寡核苷酸、以及在连接反应的每个步骤中的每种变体的浓度。在确定PDF中应用到的统计学和数学在下面被描述。通过应用这些方法，可以计算这样的概率密度函数，而且这样就富集了来源于特定连接反应的具有预定数目的遗传交换事件的嵌合子代群体。此外，可以预先确定遗传交换事件的目标数目，然后对该系统进行程序化，以计算在该连接反应的每一个步骤中，每种亲本寡核苷酸的起始量，从而得到以遗传交换事件的预先确定的数目为中心的概率密度函数。这些方法涉及还原性重配、重组和选择的重复循环应用，使得能够通过重组实现编码多肽的核酸的定向分子进化。该系统允许产生大量的进化出的嵌合序列，其中产生的群体显著地富集了具有预定数目遗传交换事件的序列。遗传交换事件是在嵌合序列中的一个点，在这里，从一个亲本变体到另一个亲本变体的序列转换发生。这样的点一般是在两个亲本的寡核苷酸连接在一起形成单个序列的连接处。这一方法允许计算寡核苷酸序列的正确浓度，这样，序列的最终嵌合群体富集了选定数目的遗传交换事件。这也提供了对选择具有预定数目的遗传交换事件的嵌合突变体的更多控制。
【0395】此外，这些方法与其它系统相比，提供了一种用于探究大数量的可能蛋白变体空间的方便手段。通过应用在这里描述的方法，嵌合分子的群体可以富集那些含有特定数目的遗传交换事件的变体。因此，尽管在反应中可以仍然产生1013个嵌合分子，但是所选择的用于进一步分析的每一个分子很可能具有，例如，仅仅三个遗传学交换事件。因为得到的子代群体可以倾向于具有预定数目的遗传交换事件，所以造成嵌合分子之间的功能多样性的界限减少。当计算出在最初的亲本多核苷酸中的哪一个可能影响到特定的性质时，便提供了更加可控制的变量。
【0396】一方面，该方法通过产生对应于每一个亲本序列的片段或者部分的寡核苷酸，产生嵌合子代多核苷酸序列。一方面，每一个寡核苷酸包括独特的重叠区域，这样把所述寡核苷酸混合在一起，得到每一寡核苷酸片段以正确顺序装配的新的变体。也可参见美国专利6,537,776；6,605,449。
确定交换事件
【0397】本发明的多个方面包括系统和软件，它们接收所需的遗传交换的概率密度函数(PDF)、待再装配的亲本基因的数目以及在再装配中的片段数目作为输入值。该程序输出是“片段PDF”，它可以用于确定用于产生重新装配的基因和那些基因的估计的遗传交换PDF的方案。在此描述的过程一方面在MATLABTM(TheMathworks，Natick，Massachusetts)中进行，MATLABTM是一种用于技术计算的程序语言和开发环境。
迭代处理
【0398】在本发明的实践中，这些过程可以被迭代重复。例如，负责改变的或者新的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶表型的核酸(或，所述核酸)被鉴定、再分离、再修饰、再测试活性。这一过程可以重复直到工程化得到所需的表型。例如，完整的生物化学合成代谢或分解代谢途径可以被工程化到细胞中，例如包括葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶活性的细胞。
【0399】类似地，如果确定了某特定寡核苷酸对于所期望的特性(例如新的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶表型)根本不会造成影响，则可以通过合成包括待除去的序列的更大的亲本寡核苷酸，从而将这段序列作为变量除去。由于将这一序列合并到更大的序列中避免了任何遗传交换事件，所以在子代多核苷酸中，这一序列不再有任何变异。确定哪些寡核苷酸与所需的性质最有关系，以及哪些与所需的性质无关的重复实践可以更有效地探寻所有可能的可能提供特定性质或者活性的蛋白变体。
体内改组
【0400】分子的体内改组在本发明的方法中使用，提供本发明的多肽的变体，例如抗体、葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶以及类似物。体内改组可以利用重组多聚体的细胞的天然特性进行。尽管体内重组已经提供了分子多样性的主要天然途径，但遗传重组仍然是一种相对复杂的过程，该过程涉及1)同源性识别；2)链切割，链侵入，和导致产生重组交叉(recombinationchiasma)的代谢步骤；和最后3)交叉消除，得到分离的重组分子。交叉的形成需要同源序列的识别。
【0401】另一方面，本发明包括一种方法，用于由至少第一多核苷酸和第二多核苷酸产生杂合多核苷酸。本发明可被用于产生杂合多核苷酸，这通过将至少第一多核苷酸和第二多核苷酸引入到合适的宿主细胞中实现，所述至少第一多核苷酸和第二多核苷酸共享具有部分序列同源性的至少一个区域(例如SEQ ID NOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257及其组合)。部分序列同源的区域促进了导致产生杂合多核苷酸的序列再组织的过程。正如此处所用，术语“杂合多核苷酸”是从本发明的方法产生的任何核苷酸序列，其含有来自至少两个原始多核苷酸序列的序列。这样的杂合多核苷酸可以来自可促进DNA分子间序列整合的分子间重组事件。此外，这样的杂合多核苷酸可以来自分子内还原重配过程，该过程利用重复序列来改变DNA分子内的核苷酸序列。
【0402】体内重装配集中在“分子间”的过程上，统称为“重组”，在细菌中，它一般被视为是“RecA-依赖性”现象。本发明可以依赖于宿主细胞的重组过程来重组和重装配序列，或者依赖于细胞介导还原过程的能力，通过缺失来减少细胞中的准-重复序列的复杂性。该“还原性重配”过程通过“分子内的”、RecA-依赖过程而发生。
【0403】因此，在本发明的另一方面，通过还原性重装配过程，产生新型的多核苷酸。该方法包括产生含有连续序列(起始的编码序列)的构建物，它们插入到合适的载体中，并且然后将它们引入到合适的宿主细胞。单个分子同一性的重装配通过在构建物中具有同源性区域的连续序列间的组合过程，或者准-重复单位间的组合过程而发生。重装配过程重组和/或降低重复序列的复杂性和程度，并且导致产生新型的分子种类。可以应用各种处理来提高重装配效率。这些处理包括用紫外光，或者损坏DNA的化学试剂处理，和/或使用表现增高水平的“遗传不稳定性”的宿主细胞系。因此，这样的重装配过程可以涉及同源重组或者准-重复序列指导它们自身进化的天然特性。
【0404】重复或者“准重复(quasi-repeated)”序列在遗传不稳定性中起作用。在本发明中，“准重复”是并不限于它们起初的单元结构的重复。准重复单元可以在构建物中以序列的排列出现；以相似序列的连续单元出现。一旦连接，在连续序列之间的连接处变得基本上不可见，并且得到的构建物的准重复性质在分子水平现在是连续的。细胞在准重复序列之间进行的缺失过程降低了得到的构建物的复杂性。准重复单位提供了一个实际上没有限制的模板库，在模板上可以发生滑移事件。含有准重复的构建物因此有效地提供了足够的分子弹性，缺失(和潜在的插入)事件实际上可以在准重复单元内的实际上任何地方发生。
【0405】当准重复序列全部以相同方向连接，例如，头对尾或者反之亦然，细胞就不能区别各个单元。因此，还原过程可以在整个序列中发生。相反地，例如，当所述单元以头对头存在，而不是头对尾，倒置勾画了相邻单元的末端，这样缺失的形成将有利于不连续单元的失去。因此，本方法优选的是序列处于相同的方向。准重复序列的随机定向将会导致重装配效率的损失，而序列的一致定向将提供最高的效率。然而，虽然具有较少的相同方向的连续序列降低效率，但是仍然可以为新型分子的有效回收提供足够的弹性。可以用相同定向以允许更高效率的准重复序列制备构建物。
【0406】应用各种方法中的任何一种，序列可以以头对尾的定向进行装配，包括以下方法：
a)可以使用包括poly-A头和poly-T尾的引物，当制成单链时，包括poly-A头和poly-T尾的引物将提供定向。这通过具有由RNA制备引物的头几个碱基来完成，而且因此用RNaseH容易去除。
b)可以应用包括独特的限制酶切割位点的引物。这需要多个位点、一组独特的序列、和重复的合成和连接步骤。
c)引物的内部少数碱基可以被硫醇化，并且用外切酶来产生合适的具有尾巴的分子。
【0407】重装配序列的回收依赖于具有减低的重复指数(RI)的克隆载体的确定。被重装配的编码序列可以随后通过扩增回收。产物被再克隆和表达。具有减低的RI的克隆载体的回收可以通过如下实现：
1)应用仅仅当构建物的复杂性下降时才能稳定地维持的载体。
2)通过物理方法对缩短的载体进行物理回收。在这一情况下，克隆载体将应用标准的质粒分离程序进行回收，或者在具有低分子量截留的琼脂糖凝胶或者柱子上利用标准程序进行大小分离。
3)插入物的大小下降时，对含有可以选择的断裂基因的载体进行回收。
4)应用表达载体以及适当的选择，使用定向选择技术。
【0408】相关的生物体的编码序列(例如，基因)可以表现出高度的同源性，并且编码相当多样化的蛋白产物。这些类型的序列特别可作为准重复序列用在本发明中。然而，尽管下面所描述的例子证明了几乎相同的起始编码序列(准-重复)的再装配，这一过程并不限于这种几乎相同的重复。
【0409】下面的例子说明了本发明的方法。描述了来自三个(3)独特种的编码性核酸序列(准-重复)。每一序列编码具有一套不同特征的蛋白质。每一个序列在序列的唯一位置只有一个或者几个碱基对的不同。准-重复序列分别地或者共同被扩增并且被连接到随机的装配体中，以便所有可能的排列和组合可以在连接的分子群体中可获得。准-重复单位的数目可以通过装配条件来控制。在构建物中，准-重复单位的平均数目被定义为重复指数(RI)。
【0410】一旦形成，构建物可以，或可以不按照已公开的方法在琼脂糖凝胶上按大小分离，插入到克隆载体，并且转染到合适的宿主细胞中。然后细胞进行繁殖，并且进行“还原性重装配”。如果需要，还原性重装配过程的速率可以通过引入DNA损伤来刺激。RI的降低是通过一种“分子内”的机制在重复序列间形成缺失来介导，还是通过“分子间”的机制由类似重组的事件来介导是不重要的。最终的结果是分子被重装配，得到所有可能的组合。
【0411】任选地，本方法包括一个额外的步骤，即对改组库的文库成员进行筛选，以确定个别的改组文库成员——其具有与一种预定的大分子如蛋白质受体、寡糖、病毒颗粒或者其它的预定的化合物或者结构结合或者另外地相互作用，或者催化特定的反应(如，酶的催化结构域)的能力。
【0412】从这样的文库所鉴定得到的多肽可以用于治疗、诊断、研究和相关目的(例如，催化剂，用于增加水溶液的渗透性的溶质等等)和/或可以进行改组和/或选择的一个或者多个另外的循环。
【0413】在另一方面，可以预见，在重组或重装配之前，或者在重组或重装配的过程中，通过本发明的方法产生的多核苷酸可以用试剂或方法处理，这些试剂或方法促进突变引入到原始的多核苷酸中。引入这样的突变将会增加得到的杂合多核苷酸及由其编码的多肽的多样性。促进诱变的所述试剂或方法可以包括，但不限于：(+)-CC-1065，或者合成的类似物如(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤)(参见Sun和Hurley，(1992)；能够抑制DNA合成的N-乙酰化或者脱乙酰基的4’-氟-4-氨基联苯加合物(见，例如，van de Poll等(1992))；或者能够抑制DNA合成的N-乙酰化或者脱乙酰基的4-氨基联苯加合物(也见，van de Poll等(1992)，751-758页)；三价铬、三价铬的盐、可以抑制DNA复制的多环芳香烃(PAH)DNA加合物，如7-溴甲基-苯[a]蒽(“BMA”)、三(2，3-二溴丙基)磷酸盐(“Tris-BP”)、1，2-二溴-3-氯丙烷(“DBCP”)、2-溴丙烯醛(2BA)、苯并[a]芘-7，8-二氢二醇-9-10-环氧化物(“BPDE”)、铂(II)卤素盐、N-羟基-2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]-喹啉(“N-羟基-IQ”)、和N-羟基-2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-f]-吡啶(“N-羟基-PhIP”)。用于减慢或者停止PCR扩增的示例性方法由紫外线(+)-CC-1065和(+)-CC-1065-(N3-腺嘌呤)组成。特别考虑的方法是DNA加合物或者来自多核苷酸或者多核苷酸库的含有DNA加合物的多核苷酸，在进一步的处理前，其可以通过包括加热含有所述多核苷酸的溶液的过程被释放或者去除。
【0414】另一方面，本发明涉及产生具有生物活性的重组蛋白的方法，其通过在根据本发明产生杂合或再装配多核苷酸的条件下处理含有编码野生型蛋白的双链模板多核苷酸的样品进行。
产生序列变体
【0415】本发明也提供了用于产生本发明核酸(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)序列的序列变体的其它方法，所述本发明核酸序列包括本发明的示例性序列。本发明也提供了使用本发明的核酸和多肽分离葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的其它方法。在本发明的(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶编码序列(例如基因、cDNA或信息)中，其可以通过任何方法来改变，包括如上所述的例如随意或随机方法、或非随机或“定向进化”方法。
【0416】被分离的变体可以是天然发生的。变体也可以在体外产生。变体也可以应用基因工程技术来产生，如定点诱变、随机的化学诱变、核酸外切酶III缺失方法和标准的克隆技术。可选择地，可以应用化学合成或者修饰方法来产生这样的变体、片段、类似物或者衍生物。本领域技术人员也熟悉制备变体的其它方法。这些方法包括这样的程序，其中，从天然分离物中获得的核酸序列经过修饰而产生编码具有某些特征的多肽的核酸，所述的特征增加这些多肽在工业、农业、研究和医学应用中的价值。在这样的程序中，大量的变体序列被获得和表征，这些变体序列与从天然分离物中得到的序列相比，有一个或者多个核苷酸的差异。这些核苷酸的差异可能引起相对于天然分离物的核酸编码的多肽的氨基酸变化。
【0417】例如，变体可以通过使用易错PCR产生。在易错PCR中，PCR在DNA聚合酶的复制保真性较低的情况下进行，这样便在全长的PCR产物中得到较高的点突变率。易错PCR在例如，Leung，D.W.等，Technique，1：11～15，1989和Caldwell，R.C.和Joyce G.F.，PCR Methods Applic.，2：28-33，1992中描述。简要地说，在这样的程序中，待诱变的核酸与PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶以及适当浓度的dNTP混合，从而在全长的PCR产物中得到高的点突变率。例如，反应可以使用20fmol待诱变的核酸进行，每种PCR引物30pmol，反应缓冲液包含50mMKCl、10mM Tris HCl(pH8.3)和0.01％明胶、7mM MgCl2、0.5mM MnCl2、5单位的Taq聚合酶、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP和1mM dTTP。PCR可以进行30个循环，每个循环为94℃ 1分钟；45℃ 1分钟；和72℃ 1分钟。然而，应该意识到，这些参数可以适当地变化。诱变的核酸被克隆到一个适当的载体，并评价由诱变核酸编码的多肽的活性。
【0418】变体也可以用寡核苷酸诱导的定向突变产生，在任何感兴趣的克隆DNA中产生位点特异性的突变。寡核苷酸诱变在，例如，Reidhaar-Olson(1988)Science241：53-57中描述。简要地说，在这样的程序中，合成多个具有将要被导入被克隆的DNA中的一个或多个突变的双链寡核苷酸，将这些寡核苷酸插入到待诱变的克隆DNA中。回收含有诱变DNA的克隆，并评估它们编码的多肽的活性。
【0419】另一种产生变体的方法是装配PCR。装配PCR涉及由小DNA片段的混合物来装配PCR产物。大量不同的PCR反应在相同的容器中平行地发生，一个反应的产物引发另一个反应的产物。装配PCR已经被描述，例如在美国专利5,965,408中。
【0420】还有另一种产生变体的方法是有性PCR诱变。在有性PCR诱变中，由于基于序列同源性的DNA分子随机片段化，在不同的但是高度相关的DNA序列的DNA分子之间，在体外强行发生同源重组，然后通过PCR反应的引物延伸，交换得到固定。有性PCR诱变在，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Asad.Sci.USA 91：10747-10751中描述。简要地说，在这样的程序中，多个待重组的核酸用DNase消化，产生具有50到200个核苷酸的平均大小的片段。纯化具有所需的平均大小的片段，并重悬于PCR混合物中。在有利于核酸片段之间发生重组的条件下进行PCR反应。例如，PCR可以这样进行：将纯化的片段以10-30ng/μl的浓度重悬于含有0.2mM的各种dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mM的Tris-HCl，pH 9.0以及0.1％的TritonX-100的溶液中。以100∶1的比例在反应混合物中加入2.5单位的Taq聚合酶，用以下的条件进行PCR：94℃ 60秒，94℃ 30秒，50-55℃ 30秒，72℃ 30秒(30-45次)，然后72℃进行5分钟。然而，可以意识到，这些参数可以进行适当的变化。在一些方面，寡核苷酸可以被包括在该PCR反应中。在其它方面，DNA聚合酶I的Klenow片段可以用于第一组PCR反应，而Taq聚合酶可以用于后续组的PCR反应。重组序列被分离，并评估它们编码的多肽的活性。
【0421】变体也可以通过体内诱变产生。在一些方面，感兴趣的序列中的随机突变通过在细菌菌株中增殖该感兴趣的序列而产生，所述细菌菌株例如在一个或者多个DNA修复途径中具有突变的大肠杆菌菌株。这样的“突变”菌株具有比野生型亲本更高的随机突变率。在一种这样的菌株中进行DNA的繁殖，最终可产生DNA中的随机突变。适于在体内诱变中应用的突变菌株在，例如，PCT公开号WO 91/16427中有描述，其在1991年10月31日公开，题目为“Methods for Phenotype Creation fromMultiple Gene Populations”。
【0422】变体也可以通过应用盒式诱变产生。在盒式诱变中，双链DNA分子的一个小的区域被不同于天然序列的合成的寡核苷酸“盒”替代。所述寡核苷酸一般含有完全和/或部分随机的天然序列。
【0423】递归整体诱变也可以用于产生变体。递归整体诱变是一种用于蛋白质工程(蛋白诱变)的算法，它的开发是为了产生表型相关的突变体组成的多样性群体，其成员在氨基酸序列上有所不同。该方法应用反馈机制来控制连续多轮的组合式盒式诱变。递归整体诱变在如Aikin，A.P.和Youvan，D.C.，PNAS，USA 89：7811-7815，1992中有描述。
【0424】在一些方面，用指数整体诱变产生变体。指数整体诱变是一个用于产生具有高百分比的独特且具功能性的突变体的组合文库的过程，其中少部分的残基被平行随机化，以在每一个被改变的位置确认产生功能性蛋白的氨基酸。指数整体诱变在如Delegrave，S.和Youvan，D.C.，Biotechnology Research.11：1548-1552，1993中有描述。随机和定点诱变在如，Arnold，F.H.，Current Opinion in Biotechnology 4：450-455，1993中有描述。
【0425】在一些方面，变体利用改组方法产生，其中编码不同多肽的多个核酸的部分被融合在一起，产生编码嵌合多肽的嵌合核酸序列，如在美国专利5,965,408，其提交于1996年7月9日，题为“Method of DNA Reassembly byInterrupting Synthesis”；以及美国专利5,939,250，其提交于1996年5月22日，题为″Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagenesis中所描述的。
【0426】本发明的多肽的变体可以是这样的变体，其中本发明的多肽的一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(一方面，保守氨基酸残基)置换，这样置换的氨基酸残基可以是由遗传密码编码或不由其编码的氨基酸。
【0427】本发明提供本发明的多肽(和编码它们的核酸)的可选实施方式，其包含与此所述的至少一个保守氨基酸置换(例如保守氨基酸置换是那些用另一个相似特性的氨基酸置换多肽中给定的氨基酸)。本发明提供了多肽(和编码它们的核酸)，其中任何、一些或所有氨基酸残基被另一个相似特性的氨基酸置换，例如保守氨基酸置换。
【0428】保守置换是那些在多肽中一个给定的氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸取代的置换。本发明的保守置换可包括任何一种下列的替代：脂肪族氨基酸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸用另一个脂肪族氨基酸替代；丝氨酸用苏氨酸替代，或苏氨酸用丝氨酸替代；酸性残基如天冬氨酸和谷氨酸用另一个酸性残基替代；具有酰胺基因的残基，如天冬酰胺和谷氨酰胺用另一个具有酰胺基因的残基替代；碱性残基如赖氨酸和精氨酸用另一个碱性残基来交换；芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸用另一个芳香族残基替代。在可选的方面，这些保守置换也可以是这些氨基酸的合成等同物。
【0429】在可选的方面，变体是那些在本发明的多肽的一个或多个氨基酸残基中包括有取代基的变体。在可选的方面，变体包括与别的化合物联接的多肽，所述化合物例如增加多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。其它变体是其中额外的氨基酸被融合到多肽上的那些变体，例如前导序列、分泌序列、蛋白原序列或有助于多肽的纯化、富集或稳定的序列。
【0430】在一些方面，片段、衍生物和类似物保持了与本发明的多肽的相同的生物功能或活性。在其它方面，片段、衍生物或类似物包括蛋白原，这样，片段、衍生物或类似物可以通过蛋白原部分的切割来激活，以产生活性多肽。
优化密码子以便在宿主细胞中获得高水平的蛋白表达
【0431】本发明提供了修饰编码葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶的核酸来改变密码子使用的方法。一方面，本发明提供了修饰编码葡聚糖酶的核酸中的密码子来增加或者降低其在宿主细胞中的表达的方法。本发明也提供了编码葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的核酸，该核酸经过修饰从而增加其在宿主细胞中的表达；经过这样的修饰的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；以及制备修饰的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的方法。该方法包括鉴定编码葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的核酸中的“非优选的”或“较不优选的”密码子，并且用编码相同氨基酸的“优选密码子”作为替换密码子替换一个或者多个这些非优选或者较不优选的密码子，并且在所述核酸中至少一个非优选或较不优选的密码子被编码相同氨基酸的优选密码子替换。优选密码子是在宿主细胞基因的编码序列中被较多使用的密码子，而不优选的或者较不优选的密码子是指在宿主细胞基因的编码序列中较少使用的密码子。
【0432】用于表达本发明的核酸、表达盒以及载体的宿主细胞包括细菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，本发明提供了在所有这些细胞中优化密码子使用的方法、密码子被改变的核酸，以及由所述的密码子被改变的核酸编码的多肽。示例性的宿主细胞包括革兰氏阴性细菌，如埃希氏大肠杆菌；革兰氏阳性细菌，如链霉菌(Streptomyces)、加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、杆菌属某种(Bacillussp.)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、仙人掌杆菌(Bacillus cereus)。示例性的宿主细胞也包括真核生物体，如，各种酵母，如酵母菌属某种(Saccharomyces sp.)，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、黑曲霉(Aspergillus niger)和哺乳动物细胞和细胞系以及昆虫细胞和细胞系。因此，本发明也包括在这些生物体和物种中表达被优化的核酸和多肽，例如本发明的核酸是密码子优化用于在宿主细胞中表达，例如毕赤酵母属某种(Pichia sp.)，例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母属某种(Saccharomyces sp.)、或杆菌属某种(Bacillus sp.)、链霉菌属某种(Streptomycessp.)等等。
【0433】例如，编码本发明的多肽，例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶或从细菌细胞中分离出的类似酶的核酸密码子被修饰，以便该核酸(编码酶的核酸)在不同于获得该酶(葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)的细菌的细菌细胞、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中被优化地表达。优化密码子的方法在本领域是已知的，参见如，美国专利5,795,737；Baca(2000)Int.J.Parasitol.30：113-118；Hale(1998)Protein Expr.Purif.12：185-188；Narum(2001)Inect.Immun.69：7250-7253。也参见Narum(2001)Infect.Immun.69：7250-7253，描述了在小鼠系统中优化密码子；Outchkourov(2002)Protein Expr.Purif.24：18-24，描述了在酵母中优化密码子；Feng(2000)Biochemistry 39：15399-15409，描述了在大肠杆菌中优化密码子；Humphreys(2000)Protein Expr.Purif 20：252-264，描述了大肠杆菌中优化影响分泌的密码子使用。Gao(2004)Biotechnol Prog.20：443-448，描述了“上基因”(“UpGene”)，基于网络的DNA密码子优化算法的应用。
转基因非人动物
【0434】本发明提供了转基因非人动物，其包含本发明的核酸、多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)、表达盒或载体或转染细胞或转化细胞。本发明也提供了产生和应用这些转基因非人动物的方法。
【0435】转基因非人类动物可以是，例如包含本发明核酸的山羊、兔、绵羊、猪、牛、大鼠和小鼠。这些动物可以用作例如体内模型来研究葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性，或者作为模型来在体内筛选改变葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性的试剂。要在转基因非人动物中表达的多肽的编码序列可以设计为组成型的，或者在组织特异性、发育特异性或者可诱导的转录调控因子的控制之下。转基因非人动物可以应用本领域任何已知的方法设计和产生；参见，如，美国专利6,211,428；6,187,992；6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；5,892,070；5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571，它们描述了制造和应用转化的细胞和卵以及转基因小鼠、大鼠、兔、羊、猪和牛。也参见，如，Pollock(1999)J.Immunol.Methods 231：147-157，描述了在转基因产奶动物的乳汁中生产重组蛋白；Baguisi(1999)Nat.Biotechnol.17：456-461，描述了转基因山羊的产生。美国专利6,211,428，描述了制备和应用在其脑中表达含有DNA序列的核酸构建物的转基因非人哺乳动物。美国专利5,387,742，描述了把克隆的重组子或者合成的DNA序列注射至小鼠受精卵中，移植注射的卵至假孕的雌鼠中，并生长成为转基因鼠，它的细胞表达与阿尔茨海默氏病的病理相关的蛋白。美国专利6,187,992，描述了制备和应用转基因小鼠，它的基因组包括编码淀粉样前体蛋白(amyloidprecursor protein，APP)的基因的断裂。
【0436】“基因敲除动物”也可以被用于实践本发明的方法。例如，一方面，本发明的转基因或修饰动物包括“基因敲除动物”，例如“基因敲除小鼠”，其被工程改造以至于不表达内源基因，该基因被表达本发明葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的基因或包含有本发明葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的融合蛋白的基因代替。
转基因植物和种子
【0437】本发明提供了转基因植物和种子，其包含本发明的核酸、多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)、表达盒或载体或转染或转化的细胞。本发明也提供了包含本发明的核酸和/或多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)的植物产品，例如油、种子、叶、提取物和类似物。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。本发明提供具有修饰的味道、固体含量和质地的转基因植物，其中那种修饰是通过在转基因植物(或种子、或果实等)组成性地或选择性地表达至少一种本发明的酶来产生，如美国专利申请号2006195940所述。
【0438】本发明也提供了制备和应用这些转基因植物和种子的方法。表达本发明的多肽的转基因植物或者植物细胞可以按照本领域任何已知的方法构建。参见例如，美国专利6,309,872。
【0439】本发明的核酸和表达构建物可以用任何方式引入植物细胞。术语“引入”在多核苷酸——例如感兴趣核苷酸构建物的内容中，意图是指以使多核苷酸得以进入植物细胞内部的方式给植物提供多核苷酸。当一种以上的多核苷酸被引入时，这些多核苷酸可以被组装成是单一核苷酸构建物的一部分，或作为独立的核苷酸构建物，并且可以定位在相同或不同的转化载体上。因此，这些多核苷酸可以用单一转化事件、独立的转化事件或例如在植物中作为培植方法的一部分，引入感兴趣宿主细胞。本发明的方法不依赖于用于将一种或多种多核苷酸引入植物的具体方法，只要多核苷酸得以进入所述植物的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸引入植物的方法是本领域已知的，其包括但不限于：瞬时转化方法、稳定转化方法和病毒介导的方法。
【0440】“瞬时转化”在多核苷酸的内容中意图是指多核苷酸被引入植物，并且不整合入植物的基因组。
【0441】“稳定引入”或“稳定引入的”在多核苷酸引入植物的内容中意图是指引入的多核苷酸被稳定整合入植物基因组，并且因此植物是用所述多核苷酸稳定转化的。
【0442】“稳定转化”或“稳定转化的”意图是指多核苷酸，例如于本文所述的核苷酸构建物被引入至植物，整合入植物的基因组，并且能够通过其后代遗传下去，更具体地，通过多个连续世代的后代遗传下去。引入所期望植物的基因组可以使酶通过内源转录或翻译控制元件来调节。用于单子叶植物和双子叶植物的转化技术是本领域熟知的。
【0443】本发明的核酸可用于将所期望的特征赋予基本上任何植物。本发明的核酸可以用于操纵植物的代谢途径以优化或改变葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的宿主表达。它们可改变植物中的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性。可选地，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可用于转基因植物的产生，以产生不能由那种植物天然产生的化合物。这可以降低生产成本或产生新的产物。在一个实施方式中，本发明的酶可以以使酶直到需要之前不与它的底物接触的方式表达。例如，本发明的酶可被靶向并保持在植物细胞的内质网中。将酶保持在细胞内质网中，可防止酶与它的底物接触。然后，可通过各种能够破坏亚细胞结构的方式，例如研磨、碾磨、加热等等，使得所述酶和底物可接触。参见WO 98/11235、WO 2003/18766和WO 2005/096704，所有通过引用引入于此。
【0444】为了鉴定已经成功整合了转基因的植物细胞或者组织，可以将选择性标记基因加入到基因构建物中。这可能是必要的，因为在植物细胞中完成基因的整合和表达是一个罕见的事件，仅仅在较少百分率的靶组织和细胞中发生。选择性标记基因编码对试剂有抗性的蛋白，所述试剂一般对植物有毒性，如抗生素或者除草剂。当在含有适当的抗生素或者除草剂的培养基上生长时，只有已经整合了选择性标记基因的植物细胞可以成活。选择标记可常规地用于转化，并且可用于实践本发明，其包括nptll基因——赋予对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing和Vierra.Gene 19：259-268(1982)；Bevan等，Nature 304：184-187(1983))，bar基因——其赋予对除草剂草胺膦(phosphinothricin)的抗性(White等，Nucl.Acids Res18：1062(1990)；Spencer等Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990))，hph基因——其赋予对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger和Diggelmann，Mol Cell Biol 4：2929-2931)，dhfr基因——其赋予对甲氨蝶呤(methatrexate)的抗性(Bourouis等，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))，EPSPS基因——其赋予对草甘膦(glyphosate)的抗性(美国专利号4,940,935和5,188,642)。
【0445】可选地，转基因植物原料可以通过阳性选择系统来鉴定，例如利用甘露糖-6-磷酸盐异构酶基因的系统，其提供代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。
【0446】一方面，制备转基因植物或种子包括将本发明的序列以及任选的标记基因整合到目标表达构建物(如，质粒)中，同时安置启动子和终止子序列。这可以包括通过合适的方法将修饰的基因转移至植物中。本发明的一种或多种序列可与具有对昆虫、疾病、干旱的抗性，增加产率，改进谷物的营养质量，改进乙醇产率等等的序列结合。
【0447】例如，构建物可以应用如电穿孔和微注射植物细胞原生质体的技术直接引入到植物细胞的基因组DNA中，或者构建物可以应用弹道方法(ballisticmethods)，如，DNA粒子轰击(DNA particle bombardment)的方法直接引入到植物组织中。例如，参见如，Christou(1997)Plant Mol.Biol.35：197-203；Pawlowski(1996)Mol.Biotechnol.6：17-30；Klein(1987)Nature 327：70-73；Talcumi(1997)Genes Genet.Syst.72：63-69，讨论了应用粒子轰击将转基因引入到小麦中；以及Adam(1997)如上，应用粒子轰击将YAC引入至植物细胞中。例如，Rinehart(1997)如上，用粒子轰击来产生转基因棉花植物。用于加速粒子的设备在美国专利5,015,580中有描述；而且，可以商购得到BioRad(Biolistics)PDS-2000粒子加速设备；也参见，John，美国专利5,608,148；和Ellis，美国专利号5,681,730，描述了粒子介导的裸子植物的转化。
【0448】一方面，原生质体可以被固定，并用核酸例如表达构建物注射。尽管源自原生质体的植物再生对于谷类并不容易，但是应用体细胞胚胎发生由原生质体来源的愈伤组织进行植物再生在豆类中是有可能的。机化组织可以使用基因枪技术用裸DNA转化，其中，DNA被包裹于钨微射弹(tungsten microprojectiles)上，射出物的大小为细胞大小的1/100，它携带DNA深入到细胞和细胞器中。转化的组织然后被诱导再生，一般通过体细胞胚胎发生技术。这一技术已经在包括玉米和水稻的几个谷类物种中成功应用。
【0449】核酸，例如表达构建物，也可以应用重组病毒引入到植物细胞中。植物细胞可以用病毒载体转化，如，烟草花叶病毒衍生的载体(Rouwendal(1997)Plant Mol.Biol.33：989-999)，参见Porta(1996)“Use of viral replicons for theexpression of genes in plants”，Mol.Biotechnol.5：209-221。
【0450】可选择地，核酸，如表达构建物，可以与合适的T-DNA侧翼区组合，并导入到传统的根瘤农杆菌宿主载体中。根瘤农杆菌宿主的毒力功能将在植物细胞受该细菌感染时，引导构建物和邻近的标记插入至植物细胞DNA中。根瘤农杆菌介导的转化技术，包括解毒(disarming)和应用二元载体，在科学文献中有详细的说明。参见，如，Horsch(1984)Science 233：496-498；Fraley(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803(1983)；Gene Transfer to Plants，Potrykus，ed.(Springer-Verlag，Berlin 1995)。根瘤农杆菌细胞的DNA被包含在细菌染色体中，也被包含在称为Ti(肿瘤诱导)质粒的另一种结构中。Ti质粒含有一段命名为T-DNA的DNA(～20kb长)和一系列毒力(毒性)基因，T-DNA在感染过程中被转移到植物细胞中，毒力基因则引导所述感染过程。根瘤农杆菌可以通过伤口感染植物：当一种植物的根或者茎受伤时，它释放某种化学信号，作为对这种信号的响应，根瘤农杆菌的毒力基因被激活，并引发一系列从Ti质粒转移T-DNA至植物染色体所必需的事件。T-DNA然后通过伤口进入到植物细胞。一个推测是T-DNA一直等到植物DNA被复制或者转录，然后将自身插入到暴露的植物DNA中。为了应用根瘤农杆菌作为转基因载体，必须去除T-DNA的肿瘤诱导部分，而保留T-DNA的边界区域和毒力基因。转基因然后插入到T-DNA的边界区域之间，从这里转移到植物细胞并且整合到植物的染色体中。
【0451】本发明提供了应用本发明的核酸进行包括重要的谷类植物在内的单子叶植物的转化，参见Hiei(1997)Plant Mol.Biol.35：205-218。也参见如，Horsch，Science(1984)233：496；Fraley(1983)Proc.Natl Acad.Sci USA 80：4803；Thykjaer(1997)如上；Park(1996)Plant Mol.Biol.32：1135-1148，讨论了将T-DNA整合到基因组DNA中。也参见D′Halluin，美国专利5,712,135，描述了包含在谷类或者其它单子叶植物的细胞中的具有功能的基因的DNA的稳定整合过程。
【0452】一方面，第三步可能涉及完整植物的选择和再生，所述植物能够将整合的靶基因传递至下一代。这样的再生技术依赖于在组织培养生长培养基中对某些植物激素的操作，其通常依赖于同所期望的核苷酸序列一起引入的杀虫剂和/或除草剂标记。源自培养的原生质体的植物再生在以下文献中有说明，Evans等，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，124-176页，MacMillilan Publishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，21-73页，CRC Press，Boca Raton，1985。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或者其中的一部分得到。这样的再生技术在Klee(1987)Ann.Rev.of plant Phys.38：467-486中有概括性的说明。为了从转基因组织如未成熟的胚胎获得整个植物，它们可以在一系列含有营养物和激素的培养基中在可控制的环境条件下培养，即称为组织培养的过程。一旦整个植物再生并且产生种子，便开始评测其子代。
【0453】在表达序列盒稳定地整入到转基因植物之后，其可以通过有性杂交(sexual crossing)引入到其它的植物中。可以应用任何的标准繁殖技术，这依赖于待杂交的物种。参见例如Welsh J.R.，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley和Sons，NY(1981)；Crop Breeding，Wood D.R.(Ed.)American Society ofAgronomy Madison，Wis.(1983)；Mayo O.，The Theory of Plant Breeding，第二版，Clarendon Press，Oxford(1987)；Singh，D.P.，Breeding for Resistance to Diseases andInsect Pests，Springer-Verlag，NY(1986)；以及Wricke和Weber，Quantitative Geneticsand Selection Plant Breeding，Walter de Gruyter和Co.，Berlin(1986)。
【0454】因为本发明核酸的转基因表达导致表型变化，包含本发明的重组核酸的植物可以和第二种植物有性杂交而得到最终产物。因此，本发明的种子可以来自本发明的两个转基因植物的杂交，或者来自本发明的植物和另一种植物的杂交。当两个亲本植物都表达本发明的多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)时，所需的效应(例如，表达本发明的多肽来产生一种开花行为被改变的植物)可以被增强。所需的效应通过标准的繁殖方法传到以后的植物世代中。
【0455】任何植物可用于感兴趣核苷酸的引入，包括但不限于：玉米(corn)或玉米(maize)(Zea mays)，芸苔属某种(Brassica sp.)(例如B.napus，B.rapa，B.juncea)特别是那些可作为种子油来源的芸苔属物种——例如油菜，紫花苜蓿(Medicagosativa)，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高粱(sorghum)(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，粟米(例如珍珠粟(pearl millet)(Pennisetum glaucum)、黄粟(prosomillet)(Panicum miliaceum)、狐尾粟(foxtail millet)(Setaria italica)、龙爪粟(fingermillet)(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamustinctorius)，小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachis hypogaea)，棉花(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum)，甜薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属某些种(Cofea spp.))，椰子(Cocos nucifera)，菠萝(Ananas comosus)，柑桔树(柑桔属某些种(Citrus spp.))，可可(Theobroma cacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(香蕉属某些种(Musa spp.))，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(Mangifera indica)，橄榄(Olea europaea)，番木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳大利亚坚果(Macadamia)(Macadamia integrifolia)，杏(Prunus amygdalus)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属某些种(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和松类。
【0456】蔬菜可包含番茄(Lycopersicon esculentum)，莴苣(例如Lactucasativa)，青豆(Phaseolus vulgaris)，利马豆(Phaseolus limensis)，豌豆(山黧豆属某些种(Lathyrus spp.))，和甜瓜属(Cucumis)的成员——例如黄瓜(C.sativus)、罗马甜瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物可包括杜鹃花(杜鹃花属某些种(Rhododendron spp.))，绣球花(hydrangea)(Macrophylla hydrangea)，芙蓉(Hibiscus rosasanensis)，玫瑰(玫瑰属某些种(Rosa spp.))，郁金香(郁金香属某些种(Tulipa spp.))，水仙花(水仙花属某些种(Narcissus spp.))，矮牵牛花(Petuniahybrida)，康乃馨(Dianthus caryophyllus)，猩猩木(Euphorbia pulcherrima)，美人蕉(美人蕉属某些种(Cannaceae spp.))和菊花。可使用的松类包含例如：松树例如厚皮刺果松(loblolly pine)(Pinus taeda)、湿地松(slash pine)(Pinus elliotii)、西黄松(ponderosa pine)(Pinus ponderosa)、黑松(lodgepole pine)(Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine)(Pinus radiata)、花旗松(Douglas-fir)(Pseudotsugamenziesii)；西铁杉(Western hemlock)(Tsuga canadensis)；西加云杉(Sitka spruce)(Picea glauca)；红杉(redwood)(Sequoia sempervirens)；真杉(true firs)例如银杉(silver fir)(Abies amabilis)和胶杉(balsam fir)(Abies balsamea)；和雪松(cedars)例如西红雪松(Western red cedar)(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Alaska yellow-cedar)(Chamaecyparis nootkatensis)。豆科植物可包括但不限于：豆和豌豆。豆(bean)可包括瓜尔豆、刺槐豆、胡芦巴(fenugreek)、大豆、青刀豆(garden beans)、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。豆类(legume)可包括但不限于：落花生(Arachis)例如花生，野豌豆(Vicia)例如小冠花(crownvetch)、毛叶苕子(hairy vetch)、赤豆(adzuki bean)、绿豆(mung bean)和鹰嘴豆(chickpea)，羽扇豆属(Lupinus)例如羽扇豆(lupine)、三叶草(trifolium)，菜豆属(Phaseolus)例如菜豆(common bean)和利马豆(lima bean)，豌豆属(Pisum)例如菜豆(field bean)，草木犀属(Melilotus)例如草木犀(clover)，苜蓿属(Medicago)例如紫花苜蓿，百脉根属(Lotus)例如三叶草(trefoil)，兵豆属(lens)例如小扁豆(lentil)和紫穗槐(false indigo)。草料和草皮草可包括紫花苜蓿、柳枝稷(Panicum virgatum)、芒(Miscanthus)、果园草(orchard grass)、高羊茅(tall fescue)、多年生黑麦草、翦股颖(creeping bent grass)和小糠草(redtop)。
【0457】特别感兴趣的植物可包括农作物植物和用于产生能量或燃料的植物，例如玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、粟米、大麦、水稻、松类、草例如柳枝稷和芒(Miscanthus)，豆类农作物例如豌豆、豆和大豆，淀粉块茎/根例如马铃薯、甜薯、木薯、芋头、美人蕉和甜菜和类似物。
【0458】在可选择的实施方式中，本发明的核酸在含有纤维细胞的植物中表达，包括，如，棉、丝棉树(木棉、吉贝木棉)、沙漠柳、石炭酸灌木、北美驼绒藜(winterfat)、轻木(balsa)、苎麻、洋麻、大麻、洛神葵、黄麻、马尼拉剑麻和亚麻。在可供选择的实施方式中，本发明的转基因植物可以是棉属(Gossypium)的成员，包括任何棉种(Gossypium)的成员，如，亚洲棉(G.arboreum)、草棉(G.herbaceum)、海岛棉(G.barbadense)和陆地棉(G.hirsutum)。
【0459】本发明也提供了用于产生大量本发明多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)的转基因植物。例如，参见Palingren(1997)Trends Genet.13：348；Chong(1997)Transgenic Res.6：289-296(利用植物生长素诱导的双向甘露氨酸合成酶(mas1′，2′)启动子，应用根瘤农杆菌介导的叶片圆盘(leaf disc)转化方法在转基因马铃薯植物中生产人乳汁蛋白β-酪蛋白)。
【0460】应用已知的程序，技术人员可以通过检测在转基因植物中转基因mRNA或蛋白的增加或减少来筛选本发明的植物。检测和定量mRNA或蛋白的方法在本领域是熟知的。
多肽和肽
【0461】一方面，本发明提供了分离的、合成的或重组的多肽和肽，其与本发明的示例性序列具有序列同一性(例如至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或完全的(100％)序列同一性)，本发明的示例性序列例如具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23以及于本文所述的对SEQ ID NO：2的具体修饰的序列的蛋白质。本发明的示例性多肽或肽序列包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23，其子序列以及其变体，其中一方面，本发明的示例性多肽序列包括一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多个或所有如下对SEQ ID NO：2的氨基酸残基变化，或可选地由这些数目的下列变化组成：
在氨基酸位置2的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置13的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置57的丝氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置61的酪氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置62的丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置70的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置71的精氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置101的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置106的谷氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置109的谷氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置130的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置131的苯丙氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置148的谷氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置162的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置216的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置230的组氨酸是赖氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置234的谷氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置246的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置246的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置262的亮氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置270的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置271的苯丙氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置277的谷氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置290的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置300的赖氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置305天冬氨酸的是脯氨酸，
在氨基酸位置312的甘氨酸是异亮氨酸，和/或
在氨基酸位置315的丝氨酸是异亮氨酸。
【0462】所有这些序列是本发明的示例性氨基酸序列，其具有对“亲本”SEQ IDNO：2的具体残基改变，概括于(部分地)上文表1和下文实施例5的表2中。
【0463】一方面，多肽具有葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性，例如可水解多糖例如葡聚糖中的糖苷键。一方面，多肽具有葡聚糖酶活性，包括催化水解1，4-β-D-糖苷键或β-1，3-糖苷键。一方面，内切葡聚糖酶活性包括内切-1，4-β-内切葡聚糖酶活性。一方面，内切葡聚糖酶活性包括水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖，以产生较小分子量的葡聚糖或葡聚糖-寡聚体。一方面，葡聚糖包括β-葡聚糖，例如水溶性β-葡聚糖。
【0464】本发明的多核苷酸编码的酶包括但不限于水解酶，例如葡聚糖酶例如内切葡聚糖酶，(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。一方面，本发明的酶还可具有甘露聚糖酶活性，例如它可降解(或水解)甘露聚糖。含有甘露聚糖的多糖是硬木和软木，以及许多豆科种子和非豆科植物的一些成熟种子胚乳中的半纤维素部分的主要成分。一方面，本发明的甘露聚糖酶水解甘露聚糖、葡糖甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖和半乳糖葡糖甘露聚糖(甘露聚糖是具有由β-1，4联接的甘露糖组成的骨架的多糖；葡糖甘露聚糖是具有更多或更少规则交互的β-1，4联接的甘露糖和葡萄糖的骨架的多糖)中的β-1，4键。测定甘露聚糖酶活性的分析方法是本领域熟知的，参见例如美国专利申请号：20030215812；20030119093；美国专利号5,661,021；5,795,764；6,376,445；6,420,331。测定木聚糖酶活性的分析方法是本领域熟知的，参见例如美国专利申请号：5,693,518；5,885,819；6,200,797；6,586,209；6,682,923。
【0465】如本文所使用，“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白序列，或寡肽、肽、多肽或蛋白序列中任意一种的片段、部分或亚基，以及天然发生的或合成的分子。“氨基酸”或“氨基酸序列”包括寡肽、肽、多肽或蛋白序列，或寡肽、肽、多肽或蛋白序列中任意一种的片段、部分或亚基，以及天然发生的或合成的分子。如本文所使用，术语“多肽”是指通过肽键或修饰的肽键即肽等排体(peptide isosteres)彼此结合在一起的氨基酸，可以含有除20个由基因编码的氨基酸之外的修饰的氨基酸。所述多肽可以通过天然过程，如，翻译后加工或者通过本领域所熟知的化学修饰技术进行修饰。修饰可以发生在所述多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或者羧基端。可以理解，相同类型的修饰可以在给定的多肽中以相同的或者不同的程度在几个位点处发生。一个给定的多肽也可以具有很多类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、共价连接核黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或者核苷酸衍生物、共价连接脂质或者脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联的环化作用、形成二硫键、去甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、形成GPI锚、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰基化作用、氧化作用、聚乙二醇化、葡聚糖水解酶处理、磷酸化作用、异戊烯作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸盐化作用，和转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质中，如精氨酰化。(参见，如，Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.，W.H.Freeman和Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，New York，11-12页(1983))。本发明的肽和多肽也包括所有“模拟物”和“肽模拟物”形式，正如下面进一步详细描述的。
【0466】如本文所使用，“片段”是天然存在的蛋白质的一部分，其可以以至少两种不同的构象存在。片段可以具有与天然发生的蛋白质相同或基本上相同的氨基酸序列。“基本上相同”(“Substantially the same”)是指氨基酸序列大部分，但不是完全地相同，但保留至少一种与之相关序列的功能性活性，例如只具有于本文所述的保守氨基酸置换。还包含具有与自然发生的蛋白不同三维结构的片段。这种片段的例子是“原形式”(“pro-form”)分子，例如低活性原蛋白，其可通过切割被修饰以产生具有显著更高活性的成熟酶。
【0467】如本文所使用，术语“分离的”意指从其原始环境(例如天然环境，如果该环境是天然存在的话)中分离出的物质。例如，在活的动物中存在的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但与该天然系统中的一些或所有的共存物质分离开的同一多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以成为载体的一部分，和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但它们仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是其天然环境的组成部分。正如本文所用，术语“纯化的”并不要求绝对的纯度；相反，这意味着是一个相对定义。从文库获得的各核酸可以按常规纯化为电泳同质。从这些克隆获得的序列不能够从所述文库或从总人DNA直接获得。本发明的纯化的核酸已经以至少104-106倍从该生物体的基因组DNA的剩余物中纯化出来。但是，术语“纯化的”还包括核酸，这些核酸已经以至少一个数量级，通常以两个或三个，和更通常地四个或五个数量级的程度从基因组DNA的剩余物或从文库或其它环境中的其它序列中被纯化出来。
【0468】“重组的”多肽或蛋白是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白；即，由用编码期望多肽或蛋白的外源DNA构建物转化的细胞产生的多肽或蛋白。“合成的”多肽或蛋白是那些通过化学合成制备的多肽或蛋白。固相化学肽合成方法也可以用于合成本发明的多肽或者片段。这样的方法自二十世纪六十年代早期起就是本领域已知的方法(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，1963)(也参见Stewart，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，PierceChemical Co.，Rockford，III，11-12页)，并且这些方法已经被用于商业上可获得的实验室肽设计和合成试剂盒(Cambridge Research Biochemicals)。商业上可获得的实验室试剂盒一般是利用H.M.Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的教导，并将肽合成在多个“杆(rods)”或者“钉(pins)”的顶端，而所有的“杆”或者“钉”都被连接到一块板上。当使用这样的系统时，一个板的杆或者钉被倒转并插入到第二个板的相应孔或者贮存器中，所述孔或者贮存器含有用于将一种适合的氨基酸附着或固定在杆或钉的顶端的溶液。通过重复这样的处理步骤，即是，反转和插入所述杆和钉的顶端至适当的溶液中，将氨基酸构建成所要的肽。此外，大量的可利用的FMOC肽合成系统是可利用的。例如，应用Applied Biosystems，Inc.的Model 431A自动肽合成仪可以在固体支持物上装配多肽或者片段。这些设备使得本发明的肽容易获得，或者通过直接的合成或者通过合成用其它已知的技术可以偶联起来的一系列片段。
【0469】本发明提供具有共同新颖性的葡聚糖酶，因为它们最初源自类似的“糖苷酶水解酶”家族。糖苷酶水解酶于1991年首次分类成各家族，参见例如Henrissat(1991)Biochem，.J.280：309-316。从那时起，该分类已被不断地更新，参见例如Henrissat(1993)Biochem.J.293：781-788；Henrissat(1996)Biochem.J.316：695-696；Henrissat(2000)Plant Physiology 124：1515-1519。存在大约87个鉴定的糖苷酶水解酶家族。本发明的葡聚糖酶可以以家族来分类，参见例如Strohmeier(2004)ProteinSci.13：3200-3213。
【0470】本发明的多肽包括活性或非活性形式的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。例如，本发明的多肽包括在“成熟”或例如通过蛋白原加工酶如蛋白原转化酶来产生“活性”成熟蛋白对前原序列加工之前的蛋白原。本发明的多肽包括由于其它原因而不具有活性的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，所述其它原因例如在通过翻译后加工事件诸如内切或外切肽酶或蛋白酶作用、磷酸化事件、酰胺化、糖基化或硫酸化或二聚化事件等等进行“活化”之前。本发明的多肽包括所有的活性形式，包括葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性子序列，例如，催化结构域或活性位点。鉴定“前原”结构域序列和信号序列的方法是本领域熟知的，参见例如Van de Ven(1993)Crit.Rev.Oncog.4(2)：115-136。例如，为了鉴定前原序列，从细胞外空间纯化蛋白，并且测定N-末端蛋白序列并与未加工形式比对。
【0471】如上所注，本发明提供分离的、合成的或重组的多肽和肽，其具有与本发明的示例性序列，例如具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、AND SEQ ID NO：23和于本文所述的对SEQ ID NO：2的具体修饰的序列的蛋白的序列同一性，其中在各种方面序列同一性的百分比可以是多肽的全长，或者所述同一性可以是在至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多个残基的区域。本发明的多肽还可短于示例性多肽的全长。在可选的方面，本发明提供多肽(肽，片段)的大小范围在约5残基至多肽全长，所述多肽例如酶，例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；示例性大小为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多个残基，例如本发明的示例性葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的连续残基。
【0472】本发明的肽(例如本发明示例性多肽的子序列)可以用于例如标记探针，抗原，表位，耐受原(toleragen)，基序，葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性位点(例如“催化结构域”)，信号序列和/或前原结构域。本发明的多肽和肽可以分离自天然来源，可以是合成的，或者可以是重组产生的多肽。肽和蛋白可以在体外或体内重组表达。本发明的肽和多肽可以使用本技术领域已知的任何方法产生和分离。本发明的多肽和肽也可以使用本技术领域熟知的化学方法全部或部分合成。例如参见Caruthers(1980)NucleicAcids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.，Therapeutic Peptides and Proteins，Formulation，Processing and DeliverySystems(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA。例如，肽合成可以使用各种固相技术进行(例如参见Roberge(1995)Science 269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)，自动合成可以根据制造商提供的说明书来实施，例如使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)。
【0473】本发明的肽和多肽也可被是糖基化。所述糖基化可以在翻译后通过化学方法或者通过细胞的生物合成机制而加上，其中后者包括应用已知的糖基化作用基序，所述糖基化作用基序可以对于所述序列是天然的，或者是作为肽段而被加入的，或者是在核酸编码序列中加入的。糖基化作用可以是O-联接的或者是N-联接的。
【0474】本发明的肽和多肽，如以上所定义的，包括所有的“模拟物(mimetic)”和“肽模拟物(peptidomimetic)”形式。术语“模拟物”和“肽模拟物”是指具有与本发明的多肽实质上相同的结构和/或功能特征的合成的化学化合物。该模拟物或者完全由合成的非天然的氨基酸类似物组成，或者是由部分天然的肽氨基酸和部分非天然的氨基酸类似物构成的嵌合分子。所述模拟物也可以包括任意数量的天然氨基酸保守置换，只要这样的置换本质上不改变该模拟物的结构和/或活性。对于作为保守性变体的本发明多肽，常规实验将可以确定一种模拟物是否在本发明的范围内，即，其结构和/或功能并没有实质上的改变。因此，一方面，如果一种模拟组合物具有葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性，那么它在本发明的范围内。
【0475】本发明的多肽模拟组合物可以包含非天然结构成分的任何组合。在可供选择的方面，本发明的模拟组合物包括以下三种结构基团中的一种或全部：a)不是天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团；b)置换天然发生的氨基酸残基的非天然残基；或者c)诱导二级结构拟态(mimicry)的残基，即，可以诱导或者稳定二级结构，如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象，以及类似的结构。例如，当本发明的多肽的所有残基或者一些残基通过非天然肽键的化学方式连接时，该多肽可以表征为模拟物。各个肽模拟物残基可以通过肽键、其它的化学键或者偶联方式连接，如，通过戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或者N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)连接。可以替代传统的酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，如，酮基亚甲基(如，-C(＝O)-CH2-代替-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、次乙基、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或者酯(参见如，Spatola(1983)在Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins，第7卷，267-357页，“Peptide Backbone Modifications”Marcell Dekker，NY)。
【0476】本发明的多肽也可以由于含有全部或者部分替代了天然发生的氨基酸残基的非天然氨基酸残基而被表征为模拟物。在科学和专利文献中充分描述了非天然的残基；用作为天然氨基酸残基的模拟物的一些典型的非天然组合物及指导在下面有描述。芳香族氨基酸的模拟物可以通过用以下进行取代来产生，如，D-或L-萘基丙氨酸；D-或L-苯基甘氨基，D-或L-2 thieneyl丙氨酸；D-或L-1，-2，3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3 thieneyl丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸，D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-p-氟-苯基丙氨酸；D-或L-p-二苯基苯基丙氨酸；D-或L-p-甲氧基-二苯基苯基丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和，D-或L-烷基丙氨酸，其中的烷基可以是取代的或非取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异基(sec-isotyl)、异戊基或者非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括，如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香环。
【0477】酸性氨基酸的模拟物可以通过用以下的取代来产生，如，保持负电荷的非羧酸氨基酸；(膦酰基)丙氨酸；硫酸化的苏氨酸。羧基侧链基团(如，天冬氨酰基或者谷氨酰基)也可以通过与碳二亚胺(R′-N-C-N-R′)反应进行选择性的修饰，所述碳二亚胺如1-环己基-3(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或者1-乙基-3(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。天冬氨酰基或者谷氨酰基也可以通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。碱性氨基酸的模拟物可以通过用如，(除了赖氨酸和精氨酸外)氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸、或者(胍基)-乙酸，或者(胍基)烷基-乙酸取代产生，其中烷基如以上定义。腈衍生物(如，含有取代COOH的CN-部分)可以取代天冬酰胺或者谷氨酰胺。天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基可以脱氨基成为相应的天冬氨酰基或者谷氨酰基残基。精氨酸残基模拟物可以通过精氨酰基与例如一种或者多种常规试剂一方面在碱性的条件下反应而产生，所述的常规试剂包括如苯乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮或者茚三酮。酪氨酸残基模拟物可以通过酪氨酰基与例如芳香重氮化合物或者四硝基甲烷反应而产生。N-乙酰基咪唑基甲烷和四硝基甲烷可以分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。半胱氨酸残基模拟物可以通过半胱氨酰残基与例如α-卤素乙酸例如2-氯乙酸或者氯乙酰胺和相应的胺反应而产生；得到羧甲基或者羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酸残基模拟物也可以通过半胱氨酰残基与例如溴代-三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸；氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；p-氯汞苯甲酸盐；2-氯汞-4硝基苯酚，或者，氯-7-硝基苯并-氧杂-1，3-二唑反应而产生。可以通过赖氨酰基与例如琥珀酸或者其它的羧酸酸酐反应而产生赖氨酸模拟物(和改变氨基末端残基)。赖氨酸和其它的含有α-氨基的残基模拟物也可以通过与亚氨酸酯例如methyl picolinimidate、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基-苯磺酸、O-甲基异脲、2，4，戊二酮的反应，和与乙醛酸的转酰胺基酶催化的反应而产生。甲硫氨酸的模拟物可以通过与例如甲硫氨酸亚砜反应而产生。脯氨酸的模拟物包括，例如，2-哌啶酸、四氢噻唑羧酸、3-或4-羟脯氨酸、脱氢脯氨酸、3-或4-甲基脯氨酸，或者3，3，-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过组氨酰基与例如二乙基原碳酸酯或对溴苯甲酰甲基溴化物反应而产生。其它的模拟物包括，例如，由脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用产生的模拟物；由丝氨酰或者苏氨酰残基的羟基的磷酸化作用产生的模拟物；由赖氨酸、精氨酸和组氨酸的α氨基基团的甲基化作用产生的模拟物；由N-末端胺的乙酰化作用而产生的模拟物；由主链酰胺残基的甲基化或用N-甲基氨基酸取代而产生的模拟物；或者，由C-末端羧基的酰胺化而产生的模拟物。
【0478】本发明的多肽的残基例如氨基酸也可以用相反手性的氨基酸(或者肽模拟物残基)替代。因此，天然发生的L-构型(也可以被称为R或者S，取决于化学实体的结构)的任何氨基酸都可用相同化学结构类型但是具有相反手性的氨基酸或者肽模拟物替代，相反手性的氨基酸称为D-氨基酸，但也可以称R-或者S-型。
【0479】本发明也提供了通过天然过程，如，翻译后加工(如，磷酸化，酰化以及类似作用)或者通过化学修饰技术来修饰本发明的多肽的方法，以及得到的被修饰的多肽。修饰可以发生在所述多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或者羧基端。可以理解，相同类型的修饰可以在已知的多肽中以相同的或者不同的水平在几个位点处发生。一个给定的多肽也可以具有很多类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、共价连接核黄素、共价连接血红素组分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联环化作用、二硫键形成、去甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、形成GPI锚、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰基化作用、氧化作用、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化作用、异戊烯作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸盐化作用，和转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质中，如精氨酰化。参见，如，Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification ofProteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，11-12页(1983)。
【0480】固相化学肽合成方法也可以用于合成本发明的多肽或者片段。这样的方法自二十世纪六十年代早期起就是本领域已知的方法(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154，1963)(也参见Stewart，J.M.和Young，J.D.，Solid PhasePeptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，III，11-12页)，并且这些方法近来已经可以用于商业上可获得的实验室肽设计和合成试剂盒(CambridgeResearch Biochemicals)。这样的商业上可获得的实验室试剂盒一般是利用H.M.Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的教导，它们将肽合成在多个“杆(rods)”或者“钉(pins)”的顶端，而所有的“杆”或者“钉”都被连接到一块板上。当使用这样的系统时，一个板的杆或者钉被倒转并插入到第二个板的相应孔或者贮存器中，所述孔或者贮存器含有用于将一种适合的氨基酸附着或固定在杆或钉的顶端的溶液。通过重复这样的处理步骤，即是，反转和插入所述杆和钉的顶端至适当的溶液中，将氨基酸构建成所要的肽。此外，大量的可利用的FMOC肽合成系统是可利用的。例如，应用Applied Biosystems，Inc.的Model 431ATM自动肽合成仪可以在固体支持物上装配多肽或者片段。这些设备使得本发明的肽容易获得，或者通过直接的合成或者通过合成用其它已知的技术可以偶联起来的一系列片段。
【0481】本发明包括带有或不带有信号的本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。包括本发明的信号序列的多肽可以是本发明的葡聚糖酶或另一葡聚糖酶或另一酶或其它多肽。
【0482】本发明包括固定化的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；抗葡聚糖酶、抗甘露聚糖酶、抗木聚糖酶抗体及其片段。本发明提供了抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的方法，例如使用本发明的显性负突变体或抗葡聚糖酶、抗甘露聚糖酶或抗木聚糖酶抗体。本发明包括含有本发明的葡聚糖酶的异源复合物，例如融合蛋白、异二聚体等等。
【0483】本发明的多肽可以在多种不同的条件下具有葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性，例如在极端pH和/或温度、氧化剂以及类似的条件下。本发明提供了产生可供选择的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶制剂的方法，所述制剂例如对温度、氧化剂和改变洗涤条件具有不同的催化效率和稳定性。一方面，葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶变体可以使用定点诱变和/或随机诱变的技术来产生。一方面，定向进化可以被用来产生大量不同的具有可供选择的特异性和稳定性的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶变体。
【0484】本发明的蛋白也可用作研究试剂，以鉴定葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的调节物，例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的激活剂或抑制剂。简单的说，将测试样品(化合物、培养液、提取物和类似物)加入到葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶分析中，以确定它们抑制底物切割的能力。用该方式鉴定的抑制剂可用于工业和研究中，以减少或阻止不期望的蛋白水解。葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的抑制剂可以被组合以增加活性谱。
【0485】本发明的酶也可用作消化蛋白质的研究试剂或用在蛋白测序中。例如，为了使用例如自动测序仪进行测序，可以使用葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶将多肽破碎成更小的片段。
【0486】本发明也提供了应用本发明的核酸、多肽和抗体来发现新的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的方法。一方面，筛选噬菌粒文库，基于表达来发现葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。另一方面，筛选λ噬菌体文库，基于表达来发现葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。通过筛选噬菌菌体或噬粒文库，可以检测到毒性克隆；更方便地利用底物；减少工程改造宿主的需要，绕过由文库中大的切除带来任何偏差的可能性；以及获得在低克隆密度下更快的生长速率。噬菌体或噬粒文库的筛选可以是在液相中或者固相中进行。一方面，本发明提供了在液相中的筛选。与固相筛选相比，这给予了分析条件上的更大灵活性；额外底物的灵活性；对于弱的克隆的更高灵敏性；和更容易实现的自动化。
【0487】本发明提供了使用本发明的蛋白和核酸以及机器人自动化来进行筛选的方法，机器人自动化使得在例如一天的短时间内能进行数千个生物催化反应和筛选分析，并且保证了高水平的精确度和可重复性(参见下面关于阵列的讨论)。结果，衍生化合物的文库可以在数周内产生。对于包括小分子在内的分子的修饰的进一步教导，参见PCT/US94/09174。
【0488】本发明的另一方面是分离的或纯化的多肽，其包含本发明之一的序列或包含其至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段。如上所讨论，这些多肽可通过如下获得：将编码多肽的核酸插入至载体以使该编码序列可操作地连接至能够驱动编码的多肽在合适的宿主细胞中表达的序列。例如，表达载体可包括启动子，用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包含用于扩增表达的适合序列。
【0489】本发明的另一方面是多肽或其片段，其具有与本发明的多肽之一或包含其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150或更多个连续氨基酸的片段至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或大于约95％序列同一性(同源性)。序列同一性(同源性)可使用上文所述的任何程序测定，所述程序比对进行比较的多肽或片段并测定它们之间的氨基酸同一性或相似性程度。应意识到的是氨基酸等同，或序列同一性，或“同源性”包括例如那些如上所述的保守氨基酸置换。
【0490】与本发明的多肽之一或包含其至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、或150连续的氨基酸的片段具有同源性的多肽或片段，可通过使用如上所述的技术分离编码它们的核酸来获得。
【0491】可选地，同源的多肽或片段可通过生物化学富集或纯化方法来获得。可能的同源多肽或片段的序列可通过葡聚糖水解酶消化、凝胶电泳和/或微测序来测定。预期的同源多肽或片段的序列可以使用如上所述的任何程序，与本发明的多肽之一或包含其至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150连续的氨基酸的片段比较。
【0492】本发明的另一方面是用于鉴定本发明的片段或变体的分析，所述片段或变体保持本发明多肽的酶功能。例如，所述多肽的片段或变体可用于催化生物化学反应，其显示片段或变体保留本发明多肽的活性。
【0493】用于测定变体的片段是否保持本发明多肽的酶活性的分析包括以下步骤：在使得多肽片段或变体发挥功能的条件下将多肽片段或变体与底物分子接触，以及检测底物水平的降低或多肽和底物之间的反应的具体反应产物水平的增加。
【0494】本发明的多肽或包含其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150连续氨基酸的片段可用于各种应用中。例如，多肽或其片段可用于催化生物化学反应。根据本发明的一方面，提供了利用本发明的多肽或编码这些多肽的多核苷酸用于水解糖苷键的方法。在这些方法中，在促进葡糖苷键水解的条件下，将含有葡糖苷连接的底物(例如淀粉)与本发明的多肽之一或基本与其相同的序列接触。
【0495】本发明开发了酶的独特的催化性质。鉴于生物催化剂(即，纯化的或者粗制的酶，非存活的或者存活的细胞)在化学转化中的应用一般需要确定与特定的起始化合物反应的特定的生物催化剂，本发明应用的经选择的生物催化剂和反应条件是对于存在于很多起始化合物如小分子中的官能团具有特异性的。每种生物催化剂对于一种官能团或者几种相关的官能团是特异的，并且可以和含有这一官能团的许多起始化合物反应。
【0496】生物催化反应可以从单一的起始化合物产生一个衍生物的群体。这些衍生物可以进行另一轮的生物催化反应来产生第二个衍生化合物的群体。通过生物催化的衍生作用的每一次迭代，可以产生起始小分子或化合物的数千种变化。
【0497】酶可以在起始化合物的特定位点发生反应而不影响分子的其它部分，该过程通过传统的化学方法很难实现。这种高度的生物催化特异性提供了用于在文库中鉴定单个活性化合物的手段。该文库是通过用于产生该文库的一系列生物催化反应来表征的，这也称为“生物合成历史”。对该文库的生物活性的筛选和对生物合成历史的追踪确定出产生活性化合物的特定反应顺序。重复该反应顺序，并确定合成出的化合物的结构。这种确认方式，不同于其它的合成和筛选方法，并不需要固定化技术，并且化合物可以利用实际上任何类型的筛选分析在溶液中自由合成和测试。重要的是，注意到酶反应在官能团上的高度特异性允许“追踪”特定的酶促反应，由所述酶促反应构成了生物催化产生的文库。
【0498】许多程序化的步骤可使用机器人自动化来实施，这使得每天可执行数千个生物催化反应和筛选分析，并保证高水平的准确性和可重复性。结果，一方面，在几周内便产生了衍生化合物的文库，而采用现有的化学方法则需要几年的时间。
【0499】在一个特定的方面，本发明提供了修饰小分子的方法，包括将在此所述的由多核苷酸编码的多肽或其酶活性片段与小分子接触，产生修饰的小分子。检测被修饰的小分子的文库以确定显示出所需活性的修饰小分子是否存在于文库内。产生具有所需活性的修饰小分子的特异性生物催化反应的鉴定可通过系统性地去除用来产生一部分文库的每个生物催化反应，然后检测在这一部分文库中产生的小分子是否存在或不存在具有所需活性的修饰小分子。产生具有所需活性的修饰小分子的特异生物催化反应可任选地被重复。生物催化反应可用一组生物催化剂来进行，它们可与在小分子的结构中发现的各种不同结构部分反应，每个生物催化剂对一个结构部分或一组相关的结构部分是特异的；每个生物催化剂可与含有各种不同的结构部分的许多不同的小分子反应。
信号序列、前原结构域和催化结构域
【0500】本发明提供了葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信号序列(例如信号肽(SPs))、前原(prepro)结构域和催化结构域(CDs)(例如活性位点)。“信号序列”可以是分泌信号或促进本发明多肽从宿主细胞分泌的其它结构域。本发明的SPs、前原结构域和/或CDs可以是分离的或重组的肽或可以是融合蛋白的一部分，例如作为嵌合蛋白中的异源结构域。本发明提供了编码这些催化结构域(CDs)、前原结构域和信号(前导)序列(SPs，例如具有包括本发明的多肽的氨基末端残基或由本发明的多肽的氨基末端残基组成的序列的肽)的核酸。一方面，本发明提供了包括肽的信号(前导)序列，该肽包括下列序列或由下列序列组成，所述序列如本发明的多肽的残基1到15、1到16、1到17、1到18、1到19、1到20、1到21、1到22、1到23、1到24、1到25、1到26、1到27、1到28、1到28、1到30、1到31、1到32、1到33、1到34、1到35、1到36、1到37、1到38、1到39、1到40、1到41、1到42、1到43、1到44所示的序列。
【0501】本发明还提供嵌合多肽(和编码它们的核酸)，其包括至少两种本发明的酶或其子序列，例如活性位点或催化结构域(CDs)。本发明的嵌合蛋白(例如融合蛋白，或其它异源二聚体例如用其它方式例如连接体或静电连接的两个结构域)可包括一种本发明的多肽(例如活性位点或催化结构域肽)和本发明的另一种多肽(例如活性位点或催化结构域肽)或其它多肽。例如，本发明的嵌合蛋白可具有甘露聚糖酶和木聚糖酶活性，甘露聚糖酶和多聚糖酶活性等。一方面，本发明的嵌合蛋白包括结构域的融合，例如单一结构域可显示葡聚糖酶/木聚糖酶/甘露聚糖酶活性或活性的任何组合(例如作为重组嵌合蛋白)。
【0502】本发明包括具有或没有信号序列和/或前原序列的多肽。本发明包括具有异源信号序列和/或原前序列的多肽。前原序列(包括用作异源前原结构域的本发明序列)可以位于蛋白质的氨基末端或羧基末端。本发明还包括含有本发明序列的分离或重组的信号序列、前原序列和催化结构域(例如，活性位点)。
【0503】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信号序列(SP)和/或前原序列可以是分离的肽，或与另一种葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶或非葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如非内切葡聚糖酶、非甘露聚糖酶、非木聚糖酶、非淀粉酶、非黄原胶酶和/或非糖苷酶，例如非纤维二糖水解酶、非甘露聚糖酶和/或非β-葡糖苷酶多肽连接的序列，例如作为融合(嵌合)蛋白。在一个方面，本发明提供了包含本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶信号序列的多肽。在一个方面，包含本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信号序列SP和/或前原序列的多肽包含与本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶异源的序列(例如，包含本发明的SP和/或前原序列和来自另一种葡聚糖酶或非葡聚糖酶蛋白的序列的融合蛋白)。在一个方面，本发明提供了具有异源SP和/或前原序列如具有酵母信号序列的序列的本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以在载体例如pPIC系列载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中含有异源SP和/或前原序列。
【0504】在一个方面，本发明的SP和/或前原序列在鉴定新的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶多肽之后被鉴定出来。蛋白被分选和转运至其正确的细胞位置的通路通常被称为蛋白靶向通路(protein targetingpathways)。在所有这些靶向系统中最重要的元件之一是新合成的多肽的氨基末端上的短的氨基酸序列，称为信号序列。这种信号序列可指引蛋白至其在细胞中的适合位置，并在转运过程中或在蛋白到达其最终目的地时被去除。大多数的溶酶体蛋白、膜蛋白或分泌蛋白都具有氨基末端信号序列，这些信号序列标示着它们将转位至内质网腔内。已测定出这组中的蛋白的100多个信号序列。信号序列的长度可以从13至36个氨基酸残基之间变化。识别信号序列的各种方法对于本领域技术人员是已知的。例如，在一个方面，新的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信号肽可通过称为SignalP的方法来鉴定。SignalP应用了既可识别信号肽，又可识别其裂解位点的组合神经网络。(Nielsen等，“Indentification ofprokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.”蛋白Engineering，卷10，1期，1-6页(1997))。
【0505】可以理解的是，在一些方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以没有SP和/或前原序列，或“结构域”。一方面，本发明提供了缺少所有或部分的SP和/或前原结构域的本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。在一个方面，本发明提供了编码来自一种葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信号序列(SP)和/或前原序列的核酸序列，其可操作地连接于一种不同的葡聚糖酶的核酸序列，或者任选地，来自非葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶蛋白的信号序列(SP)和/或前原结构域可以是期望的。
【0506】本发明也提供了分离的或重组的多肽，其包含本发明的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)和异源序列。所述异源序列是与SP、前原结构域和/或CD天然不相关的序列(例如与葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)。与SP、前原结构域和/或CD天然不相关的序列可以在SP、前原结构域和/或CD的氨基末端、羧基末端，和/或SP和/或CD的两个末端上。在一个方面，本发明提供了分离的或重组的多肽，其包含(或由之组成)含有本发明的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)的多肽，条件是它同与其天然相关的任何序列(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶序列)不连接。同样，在一个方面，本发明提供了编码这些多肽的分离的或重组的核酸。因此，在一个方面，本发明的分离的或重组的核酸包括本发明的信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)的编码序列和异源序列(即，与本发明信号序列(SP)、前原结构域和/或催化结构域(CD)天然不相关的序列)。异源序列可在SP、前原结构域和/或CD编码序列的3’末端、5’末端和/或两个末端上。
杂合(嵌合)葡聚糖酶，甘露聚糖酶或木聚糖酶以及肽库
【507】在一方面，本发明提供杂合葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶和融合蛋白，包括肽库，其包含本发明的序列。本发明的肽库可以被用于分离靶的肽调节剂(例如，激活剂或抑制剂)，所述靶例如葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶底物、受体、酶。本发明的肽库可以被用于鉴别靶的形式结合伴侣，如配体，例如细胞因子、激素及类似物。在一方面，本发明提供嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含本发明的信号序列(SP)、前原结构域(prepro domain)和/或催化结构域(CD)或其组合以及异源序列(见上述)。
在一方面，本发明的融合蛋白(如肽部分)被构象稳定化(相对于线性肽)，从而允许其对靶的较高的结合亲和力。本发明提供了本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶和其它肽的融合物，所述其它肽包括已知的和随机的肽。它们可以以这样的方式融合：葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的结构没有被显著地干扰，并且所述肽在代谢上或结构构象上是稳定的。这使得能够产生这样的肽文库，即该肽文库在细胞内的存在和其数量可容易被监测。
【508】本发明的氨基酸序列变体可以通过预先确定的变异的性质来表征，所述预先确定的变异的性质是使它们与天然存在的形式区分开的特征，例如葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶序列的等位基因的或种间的变异。在一方面，本发明的变体显示出与天然存在的类似物相同性质的生物活性。可选地，可以选择具有改良特性的变体。在一方面，尽管引入氨基酸变异的位点或区域是预先确定的，但该突变本身不需要被预先确定。例如，为了最优化在给定位点的突变性能，可以在靶密码子或区域进行随机诱变并且筛选表达的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶变体，以寻求期望活性的最佳组合。在具有已知序列的DNA中的预定位点进行置换突变的技术是熟知的，如本文描述的，例如M13引物诱变和PCR诱变。可以使用例如葡聚糖水解分析方法来进行突变体的筛选。在可选的方面，氨基酸置换可以是单个残基；插入可以是大约1到20个氨基酸的水平，尽管可以进行大得多的插入。缺失的范围可以在大约1到大约20、30、40、50、60、70个残基或更多残基。为了获得具有最佳特性的最终衍生物，置换、缺失、插入或其任何组合可以被使用。一般地，这些改变在少数氨基酸上进行，以使分子的改变最小化。然而，在某些情况下可以容忍较大的改变。
【509】本发明提供了葡聚糖酶(或纤维素酶)如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，其中多肽骨架结构、二级或三级结构，如α-螺旋或β-折叠结构，已经被修饰。在一方面，电荷或疏水性已经被修饰。在一方面，侧链大小已经被修饰。通过选择较不保守的置换来产生功能或免疫特性的实质变化。例如，可以进行这样的置换，它们将更加显著地影响：发生变化的区域的多肽骨架的结构，例如α螺旋或β折叠结构；分子的电荷或疏水位点，其可以是活性位点；或侧链。本发明提供了在本发明的多肽中的置换，其中(a)亲水残基，例如丝氨酰或苏氨酰，被疏水残基例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰置换(或者相反)；(b)半胱氨酸或脯氨酸被任何别的残基置换(或者相反)；(c)具有正电性侧链的残基，例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰被带负电的残基，例如谷氨酰或天冬氨酰置换(或者相反)；或者(d)具有大体积侧链的残基，例如苯丙氨酸，被不具侧链的氨基酸例如甘氨酸置换(或者相反)。所述变体可以表现出相同性质的生物学活性(即，葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性)，尽管变体可被选择以根据需要改变葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的特征。
【510】在一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶包括表位或纯化标记、信号序列或其它的融合序列等。在一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以与随机的肽融合，形成融合多肽。“融合”或者“可操作地连接”在此是指随机肽和葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶连接在一起，其连接方式对葡聚糖酶结构稳定性的破坏最小，例如，其仍保持葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性。所述的融合多肽(或者编码该融合多肽的融合多核苷酸)也可以包含进一步的成分，包括在多个环处的多个肽。
【0511】在一方面，肽和编码它们的核酸被随机化，或者是被完全随机化，或者在它们的随机化中有偏向，例如，在核苷酸/残基的总的频率或者每个位置的频率方面有偏向。“随机化”是指每一核酸和肽分别由基本上随机的核苷酸和氨基酸组成。在一方面，产生肽的核酸可以化学合成，并且因此可以在任何位置整合任何核苷酸。因此，当核酸被表达而形成肽时，任何氨基酸残基可以被整合在任何位置。可以设计合成过程来产生随机化的核酸，从而允许在核酸的长度范围内形成所有的或大多数的可能组合，由此形成随机核酸文库。该文库可以提供结构上充分多样的随机化表达产物群体，从而影响概率上充分的细胞响应范围，以提供一种或多种表现出期望响应的细胞。因此，本发明提供了一个足够大的相互作用文库，以使其成员中的至少一个将具有使其对于一些分子、蛋白或者其他因子具有亲和性的结构。
【512】内切葡聚糖酶是任选地由信号肽、糖类结合模块、葡聚糖酶催化结构域、连接子和/或另一催化结构域组成的多结构域酶。
【513】本发明提供了产生可以编码生物学活性杂合多肽(例如，杂合葡聚糖酶，(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)的嵌合多肽的方法。在一方面，原始的多核苷酸编码生物学活性多肽。本发明的方法通过利用细胞加工产生新的杂合多肽，所述细胞加工整合原始多核苷酸序列，使得得到的杂合多核苷酸编码显示源自原始生物学活性多肽的活性的多肽。例如，原始的多核苷酸可以编码来自不同微生物的特定酶。由来自一个生物体的第一多核苷酸编码的酶、或变体可以例如在特定的环境条件下，例如高盐条件下，有效地发挥功能。由来自不同生物体的第二多核苷酸编码的酶、或变体可在不同的环境条件下，如超高温条件下有效地发挥功能。含有来自第一和第二原始多核苷酸的序列的杂合多核苷酸可以编码这样的酶，所述酶显示出由原始多核苷酸编码的两种酶的特性。因此，由杂合多核苷酸编码的酶可在第一和第二多核苷酸编码的每一种酶所共有的环境条件下，例如高盐和极端温度下有效地发挥功能。
【514】由本发明的方法得到的杂合多肽可显示出在原始酶中不具有的特异酶活性。例如，在编码水解酶活性的多核苷酸重组和/或还原性重配后，从由杂合多核苷酸编码的所得杂合多肽中可筛选由每个原始酶获得的特异水解酶活性，即，水解酶作用的键的类型以及水解酶发挥作用的温度。因此，例如所述水解酶可以被筛选以确定那些可区分杂合水解酶和原始水解酶的化学官能度，如：(a)酰胺(肽键)即，内切葡聚糖酶；(b)酯键，即酯酶和脂肪酶；(c)乙缩醛，即糖苷酶，以及确定例如杂合多肽发挥作用的温度、pH或盐浓度。
【515】原始多核苷酸的来源可以分离自个体生物体(“分离物”)、已经在确定的培养基中生长的生物体收集物(“富集培养物”)、或者未经培养的生物体(“环境样品”)。应用不依赖于培养物的方法从环境样品获得编码新的生物活性的多核苷酸是最优选的，因为其使得能够接近具有生物多样性的未被利用的来源。
【516】“环境文库”可以从环境样品产生，其代表天然存在的生物体的基因组集合，其存储于可以在适合的原核宿主中繁殖的克隆载体中。因为被克隆的DNA起初是直接从环境样品提取的，所以所述文库并不限于可以在纯培养物中生长的小部分原核生物。另外，存在于这些样品中的环境DNA的标准化使其可以更加公正地代表来自存在于原始样品的所有物种的DNA。这可以大大增加从所述样品的次要组成中发现令人感兴趣的基因的效率，所述次要组成与优势种相比，其所代表的可能小几个数量级。
【517】例如，从一个或者多个未经培养的微生物中获得的基因文库被筛选以发现感兴趣的活性。编码感兴趣的生物活性分子的潜在途径首先在原核细胞中以基因表达文库的形式捕获。编码令人感兴趣的活性的多核苷酸从这样的文库中分离出来并导入到宿主细胞中。该宿主细胞在促进重组和/或还原性重配的条件下生长，产生潜在的具有新的或者增强活性的活性生物分子。
【518】此外，可进行亚克隆以进一步分离感兴趣的序列。在亚克隆中，DNA的一部分被扩增、消化——通常是通过限制性酶——以切割所需的序列，所需的序列被连接进接受载体中，并被扩增。在亚克隆的每个步骤中，该部分被检测感兴趣的活性，以保证编码结构蛋白的DNA不被排除。插入物可在亚克隆的任何步骤中被纯化，例如，在连接入载体之前通过凝胶电泳，或在含有接受载体的细胞和不含有接受载体的细胞被置于选择性培养基中时，所述培养基含有例如抗生素，其可杀死不含有接受载体的细胞。将cDNA插入物亚克隆进载体中的具体方法在本领域中是熟知的(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。在另一方面，本发明的酶是亚克隆。这种亚克隆与亲代克隆的差别在于，例如，长度、突变、标志物(tag)或标记(label)。
【519】在一方面，在鉴别新的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶多肽之后，鉴别本发明的信号序列。蛋白被分选和转运至其正确的细胞位置的通路通常被称为蛋白靶向通路(protein targeting pathways)。在所有这些靶向系统中最重要的元件之一是新合成多肽的氨基末端上的短氨基酸序列，称为信号序列。这种信号序列可指引蛋白至其在细胞中的适合位置，并在转运过程中或在蛋白到达其最终目的地时被去除。大多数的溶酶体蛋白、膜蛋白或分泌蛋白都具有氨基末端信号序列，这些信号序列标示着它们将转位至内质网腔内。在该组中超过100个的蛋白质信号序列被确定。信号序列的长度可以为从13至36个氨基酸残基变化。识别信号序列的各种方法对于本领域技术人员是已知的。在一方面，肽可通过称为SignalP的方法来鉴定。SignalP应用了既可识别信号肽，又可识别其切割位点的组合神经网络。参见，例如(Nielsen(1997)，“Indentification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of theircleavage sites”Protein Engineering，卷10，1，1-6页)。应该理解，本发明的一些葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以包含或不包含信号序列。包括连接到不同的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的核酸序列的编码来自一种葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的信号序列的核酸序列是令人期望的，或者，任选地，来自非葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如非内切葡聚糖酶、非甘露聚糖酶、非木聚糖酶、非淀粉酶、非黄原胶酶和/或非糖苷酶，如非纤维二糖水解酶、非甘露聚糖酶和/或非β-葡糖苷酶的信号序列可以被期望。
【520】可以从其制备多核苷酸的微生物包括原核微生物，如真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaebacteria)以及低等真核微生物如真菌、一些藻类和原生动物。多核苷酸可以是发现于、分离自或制备自样品如环境样品，在这种情况下，核酸可以被回收而不需培养某一种生物体，或者是从一种或者多种培养的生物中回收。在一方面，这样的微生物可以是适于极端环境的，如，嗜高温的、嗜冷的、兼性嗜冷菌(psychrotroph)、嗜盐的、嗜压的和嗜酸的。编码从极端微生物中分离出来的酶的多核苷酸可以被应用。这样的酶可以在地表温泉和深海的热火山口中在超过100℃的温度发挥作用，在北极的水域中在低于0℃的温度起作用，在死海的饱和的盐环境下起作用，在煤层沉积物和地热富硫矿泉中在pH值在0附近起作用，或者在污水污泥中在pH值超过11下起作用。例如，从极端微生物中克隆和表达的几种酯酶和脂肪酶在很宽的温度和pH范围内表现出高活性。
【521】如上所述选择和分离的多核苷酸被导入进合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是能够促进重组和/或还原性重配的任何细胞。被选择的多核苷酸在一方面已经在包括有合适的控制序列的载体中。宿主细胞可以是高等的真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或在一方面，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。将构建物导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔来实现(Davis等人，1986)。
【522】作为合适宿主的代表性例子，可能被提及的有：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇S2(Drosophila S2)和草地夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)；动物细胞如CHO、COS或者黑色素瘤细胞；腺病毒和植物细胞。通过本文的教导，适合宿主的选择被认为是在本领域技术人员的范围内。
【523】特别提及可以用于表达重组蛋白的各种哺乳动物细胞培养系统，哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞的COS-7系，其在“SV40-transformedsimian cells support the replication of early SV40 mutants”(Gluzman，1981)中有说明，和其它的能够表达相容性载体的细胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包括复制起点、合适的启动子和增强子，以及任何必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列，以及5’侧翼的非转录序列。源于SV40剪接的DNA序列和多聚腺苷酸化的位点可以被用于提供所需的非转录的遗传学元件。
【524】在另一方面，预见本发明的方法可以被用于产生编码来自一个或者多个操纵子或者基因簇或者其部分的生物化学途径的新的多核苷酸。例如，细菌和许多真核生物具有用于调控基因的协作机制，所述基因的产物参与相关的过程。基因成簇排列在单一染色体上，在结构上称为“基因簇”，并且它们在单个调控序列的控制下一起转录，所述调控序列包括起始整个簇的转录的单个启动子。因此，基因簇是一组或者相同或者相关的相邻基因，一般是指功能上相同或相关。通过基因簇编码的生物化学途径的一个例子是聚酮化合物(polyketides)。
【525】基因簇DNA可以从不同的生物体中分离出来并且连接到载体中，尤其是含有表达调控序列的载体，所述表达控制序列可以控制和调控可检测蛋白或者来自所连接的基因簇的蛋白相关系列活性的产生。对于外源DNA引入具有非常大的容量的载体的应用特别适合用于这样的基因簇，在这里通过包括大肠杆菌的f-因子(或者致育因子)的例子加以描述。该大肠杆菌的f-因子是一种质粒，在接合过程中它能实现自身的高频率转移，f-因子对于获得和稳定扩增大的DNA片段，如来自混合的微生物样品的基因簇是理想的。一个方面是使用被称作“F-质粒(Fosmid)”的克隆载体，或者细菌人工染色体(BAC)载体。它们源于大肠杆菌f因子，能够稳定地整合大的基因组DNA片段。当整合来自混合的未经过培养的环境样品的DNA时，这就有可能得到稳定的“环境DNA文库”形式的大的基因组片段。用于本发明的另一类型的载体是黏粒载体。黏粒载体最初是设计用来克隆和扩增基因组DNA的大片段。进入黏粒载体的克隆在Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Mannual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中有详细说明。一旦连接到适当的载体，含有不同的聚酮化合物合成酶基因簇的两个或者更多个载体可以被引入到适合的宿主细胞中。这些基因簇所共有的具有部分序列同源性的区域将促进导致序列重新组织为杂合基因簇的过程。然后可以对新的杂合基因簇进行筛选，以寻找在起初的基因簇中没有发现的增强的活性。
【526】因此，在一方面，本发明涉及用于产生具有生物活性的杂合多肽以及筛选具有增强活性的这样的多肽的方法，通过：
1)以可操纵的连接导入至少第一多核苷酸和以可操纵的连接导入第二多核苷酸到合适的宿主细胞中，所述的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸共有具有部分序列同源性的至少一个区域；
2)在促进序列再组织的条件下培养宿主细胞，得到可操纵连接的杂合多核苷酸；
3)表达由所述杂合多核苷酸编码的杂合多肽；
4)在有利于鉴定增强的生物活性的条件下筛选所述的杂合多肽；和
5)分离编码该杂合多肽的多核苷酸。
【527】筛选各种酶活性的方法对于本领域技术人员是已知的并且在整个本说明书中被讨论。当分离本发明的多肽和多核苷酸时，可以采用这些方法。
筛选方法和“在线”监控设备
【528】在实践本发明的方法中，多种仪器和方法可以与本发明的多肽和核酸一起使用，例如，用来筛选多肽的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性(例如，测定如在酶谱中酪蛋白的水解，荧光从明胶的释放，或者p-nitroanalide从多种小肽底物的释放)，用来筛选作为葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的潜在调节剂的化合物，诸如激活剂或抑制剂，用来筛选与本发明的多肽结合的抗体、与本发明的核酸杂交的核酸，用来筛选表达本发明的多肽的细胞，等等。除了下面详细描述的用于筛选样品的阵列形式以外，也可使用可选形式来实施本发明的方法。这样的形式包括，例如质谱仪、色谱仪，例如，高通量HPLC和其它形式的液相色谱，和更小的形式，如1536-孔板、384-孔板等等。高通量筛选仪器可被改装并用来实施本发明的方法，见美国专利申请20020001809。
毛细管阵列
【529】本发明的核酸或多肽可被固定或应用于阵列上。阵列可用来筛选或监测组合物(例如，小分子、抗体、核酸等)的文库，以发现它们结合本发明的核酸或多肽或者调节本发明的核酸或多肽的活性的能力。毛细管阵列，如GIGAMATRIXTM，戴弗萨公司(Diversa Corporation)，San Diego，CA；和描述在例如美国专利申请20020080350 A1；WO 0231203 A；WO 0244336 A中的阵列，提供了容纳和筛选样品的可供选择的装置。在一方面，毛细管阵列包括多个毛细管，它们形成相互邻接的毛细管的阵列，其中每个毛细管含有至少一个壁，其限定了一个用以保留样品的腔。这个腔可以是圆柱形的、正方形的、六边形的或其它任何几何形状，只要其壁能够形成腔以保留液体或样品。毛细管阵列的毛细管可相互靠近联合在一起形成平面结构。毛细管可通过融合(例如，当毛细管由玻璃制成时)、粘合、键合或面对面的夹合而结合在一起。此外，毛细管阵列可以包括在阵列中相邻毛细管之间放置的间质材料(interstitial material)，从而形成含有多个穿通孔(through-holes)的固体平面装置。
【530】毛细管阵列可由任何数量的单个毛细管形成，例如，100至4,000,000个毛细管。进一步，具有大约100,000或更多个单个毛细管的毛细管阵列可形成标准大小和形状的板，其适合于标准的实验室设备。通过毛细作用或使用细针的微注射，人工或自动地将腔充满。随后可以从单个毛细管中移出感兴趣的样品用于进行进一步的分析或表征。例如，安置细的针状探头，使其与选择的毛细管流体连通，从而可以向腔内加入材料或从腔中移走材料。
【531】在单区筛选分析(single-pot screening assay)中，分析组分在插入到毛细管阵列中之前被混合在一起，产生目的溶液。当至少一部分阵列被浸入感兴趣的溶液中时，通过毛细作用充满腔。在每个毛细管中的化学或生物学反应和/或活性被监测，以发现可检测事件。可检测事件常常被称为“命中事件(hit)”，其常常可以通过光学检测与产生“非命中事件(non-hit)”的毛细管区分开来。因此，毛细管阵列可大量地并行检测“命中事件”。
【532】在多区筛选分析(multi-pot screening assay)中，多肽或核酸，例如，配体可被导入进第一组分中，该组分被导入进毛细管阵列的至少一部分毛细管中。然后可将气泡引入进第一组分后面的毛细管中。然后将第二组分导入进毛细管内，其中所述的第二组分与第一组分通过气泡相隔。然后可通过在毛细管阵列的两侧施加静水压挤破气泡将第一和第二组分混合在一起。然后监测毛细管阵列中由两个组分的反应或非反应而导致的可检测事件。
【533】在结合筛选分析(binding screening assay)中，目标样品可作为用可检测颗粒标记的第一液体导入进毛细管阵列的毛细管中，其中为了使可检测颗粒与腔结合，毛细管的腔涂覆了结合材料。然后第一液体可从毛细管中移去，其中结合的可检测颗粒仍保留在毛细管内，可以将第二液体导入进毛细管内。然后监测毛细管中由颗粒与第二液体的反应或非反应而导致的可检测事件。
阵列或“生物芯片”
【534】本发明的核酸或者多肽可以固定于或者应用于阵列。可以应用阵列来筛选或者监测组合物(例如，小分子、抗体、核酸等等)的文库，所述筛选或者监测是针对它们结合本发明的核酸或多肽或者调控本发明的核酸或多肽的活性的能力。例如，在本发明的一个方面，一个被监测的参数是葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶基因的转录体表达。细胞的一种或多种或所有的转录体可以通过包含细胞转录体、或代表细胞转录体的核酸、或与细胞转录体互补的核酸的样品的杂交，通过与阵列或“生物芯片”上的固定化核酸的杂交来测定。通过在微型芯片上应用核酸“阵列”，细胞的一些或所有的转录体可以同时被定量。可选择地，包含基因组核酸的阵列也可以用于确定通过本发明的方法制造的新的工程菌株的基因型。“多肽阵列”也可以用于同时定量多种蛋白。本发明可以用任何已知的“阵列”进行实践，所述“阵列”也被称为“微阵列”或“核酸阵列”或“多肽阵列”或“抗体阵列”或“生物芯片”，或者它们的变型。阵列一般是多个“点”或者“靶元素”，每一个靶元素包括确定数量的一种或多种生物分子，例如，固定于基材表面的确定区域、用于特异结合样品分子如mRNA转录体的寡核苷酸。
【535】在此使用的术语“阵列”或“微阵列”或“生物芯片”或“芯片”是多个靶元素，每个靶元素包括固定在基材表面的确定区域上的确定量的一种或多种多肽(包括抗体)或核酸。在实践本发明的方法时，任何已知的阵列(包括“微阵列”或“生物芯片”或“芯片”)和/或制备和应用阵列的方法都可以被全部或者部分地并入，或者引入它们的变型，例如在下列文献中描述的：美国专利6,277,628、6,277,489、6,261,776、6,258,606、6,054,270、6,048,695、6,045,996、6,022,963、6,013,440、5,965,452、5,959,098、5,856,174、5,830,645、5,770,456、5,632,957、5,556,752、5,143,854、5,807,522、5,800,992、5,744,305、5,700,637、5,556,752、5,434,049；也参见，例如WO 99/51773、WO 99/09217、WO 97/46313、WO 96/17958；也参见，例如Johnston(1998)Curr.Biol.8：R171-R174；Schummer(1997)Biotechniques23：1087-1092；Kern(1997)Biotechniques 23：120-124；Solinas-Toldo(1997)Genes，Chromosomes & Cancer 20：399-407；Bowtell(1999)Nature Genetics Supp.21：25-32。也参见公开的美国专利申请号20010018642、20010019827、20010016322、20010014449、20010014448、20010012537、20010008765。
抗体和基于抗体的筛选方法
【536】本发明提供了分离的、合成的或重组的抗体，其特异地结合本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这些抗体可以用于分离、识别或量化本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶或相关多肽。这些抗体可以被用于分离在本发明范围内的其它多肽，或其它相关的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。抗体可以被设计成结合葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的活性位点。因此，本发明提供了使用本发明的抗体抑制葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的方法(参见上文关于本发明的抗葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶组合物的应用的论述)。
【537】术语“抗体”包括由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因衍生(derived)、仿造(modeled after)或基本上由之编码的肽或多肽或者其片段，它们能特异地结合抗原或表位，见例如，Fundamental Immunology，第三版，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175：267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25：85-97。术语抗体包括结合抗原的部分，即，保留与抗原结合的能力的“抗原结合位点”(例如，片段、子序列、互补决定区(CDRs))，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也被包括在术语“抗体”中。
【538】本发明提供了本发明的酶的片段，包括本发明多肽的免疫原性片段。本发明提供了含有本发明的多肽或肽和佐剂或载体以及类似物的组合物。
【539】所述抗体可以在免疫沉淀、染色、免疫亲合柱等等中被应用。如果需要的话，编码特异抗原的核酸序列可以通过免疫产生，随后分离多肽或核酸，进行扩增或克隆，并且将多肽固定在本发明的阵列上。可选择地，本发明的方法可以用于修饰由细胞产生的待修饰的抗体的结构，如，抗体的亲和性可以被增加或降低。而且，制备或修饰抗体的能力可以是通过本发明方法改造到细胞中的表型。
【540】免疫、产生和分离抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)的方法是本领域技术人员已知的，并且在科学和专利文献中有描述，参见，如Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(第7版)Lange MedicalPublications，Los Altos，CA(“Stites”)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256：495；Harlow(1988)ANTIBODIES，A LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York。除了使用动物的传统的体内方法外，抗体也可以在体外产生，例如，应用表达重组抗体结合位点的噬菌体展示文库。参见如，Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：27-45。
【541】本发明的多肽或者含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段，也可以被用于产生与所述多肽或片段特异结合的抗体。得到的抗体可应用于免疫亲和层析方法，以分离或纯化多肽，或确定多肽是否存在于生物样品中。在这样的方法中，蛋白质制备物，如提取物，或生物样品与能够同本发明的多肽之一或含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段特异结合的抗体接触。
【542】在免疫亲和步骤中，抗体被连接到固态支持物，如珠子或其它柱基质。在抗体特异性结合本发明的一种多肽或其片段的条件下，蛋白质制备物被置于与抗体接触。经清洗去除非特异性结合的蛋白质之后，特异性结合的多肽被洗脱。
【543】在生物样品中蛋白质结合抗体的能力可以通过使用本领域技术人员所熟悉的各种方法中的任何一种来确定。例如，结合可以通过用可检测标记物，例如荧光试剂、酶标记或放射性同位素标记抗体来确定。可选择地，抗体与样品的结合可以通过应用具有这样的可检测标记的二抗来检测。特定的分析包括ELISA分析、夹心分析、放射免疫分析以及蛋白质印迹法。
【544】针对本发明的多肽或含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段产生的多克隆抗体可通过直接将多肽注射进动物中或通过将多肽给予动物，例如非人动物而获得。这样获得的抗体然后可结合多肽本身。以这种方式，甚至仅编码多肽的片段的序列也可用来产生可与整个天然多肽结合的抗体。这种抗体然后可用来从表达多肽的细胞中分离多肽。
【545】为了制备单克隆抗体，可使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，Nature，256：495-497，1975)、三体瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today 4：72，1983)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
【546】描述用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可被改动，以使之适于产生本发明的多肽或含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段的单链抗体。可选择地，转基因小鼠可用来表达这些多肽或其片段的人源化抗体。
【547】产生的针对本发明的多肽或含有其至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150个连续氨基酸的片段的抗体可被用于筛选来自其它生物体和样品的类似多肽。在这样的技术中，来自生物体的多肽与抗体接触，并且检测可与抗体特异性结合的那些多肽。上述的任何方法可用来检测抗体的结合。一种这样的筛选试验在“Methods for Measuring Cellulase Activities”，Methods inEnzymology，Vol 160，pp.87-116中描述。
试剂盒
【548】本发明提供了包含组合物，如本发明的核酸、表达盒、载体、细胞、转基因种子或植物或植物部分、多肽(如葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)和/或抗体的试剂盒。试剂盒还可以含有教导本发明的方法学以及工业、农业、研究和医疗用途的指导性材料，如在此所述的。
全细胞工程改造和测定代谢参数
【549】本发明的方法提供了细胞的全细胞进化或全细胞工程改造，以通过修饰细胞的遗传组成开发出具有新表型，如新的或修饰的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的新细胞株。可以通过将本发明的核酸，如编码本发明的酶的序列加入到细胞而修饰遗传组成。如参见WO0229032；WO0196551。
【550】为了检测新的表型，在“实时”或者“在线”的时间范围内在细胞中监测被修饰的细胞的至少一种代谢参数。在一方面，多个细胞，如细胞培养物被“实时”或者“在线”监测。在一方面，“实时”或者“在线”监测多个代谢参数。代谢参数可以应用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶进行监测。
【551】代谢流分析(MFA)是以已知的生物化学框架为基础。以质量守恒定律和关于细胞内代谢的假稳态假说(PSSH)为基础，构建线性独立代谢矩阵。在实践本发明的方法时，建立代谢网络，包括：
·所有途径底物、产物和中间代谢物的特性；
·使途径代谢物互变的所有化学反应的特性，途径反应的化学计量学；
·催化反应的所有酶的特性，酶反应动力学；
·途径组分之间的调控性相互作用，如变构效应相互作用，酶-酶相互作用等；
·酶或者酶的任何其它超大分子组织在细胞内的区室化，以及
·任何浓度梯度的代谢物、酶或者效应分子的存在，或者它们运动的扩散障碍。
【552】一旦针对给定的细胞株建立了代谢网络，如果在线代谢数据可用，通过矩阵概念的数学显示可以被引入以评估细胞内的代谢流。代谢表型取决于细胞内整个代谢网络的变化。代谢表型取决于途径利用相对于环境条件、遗传调控、发育状态和基因型等等的变化。在本发明方法的一些方面，在在线MFA计算之后，通过研究途径利用来分析细胞的动力学行为、它们的表型和其它性质。例如，在酵母发酵中，如果葡萄糖供应增加，氧气减少，呼吸途径的利用将会被降低和/或者停止，而发酵途径的利用将占优势。在途径分析之后，细胞培养物的生理状态的控制将成为可能。通过确定如何改变底物供给、温度、诱导物的使用等来控制细胞的生理状态朝着所需的方向进行，本发明的方法可以帮助确定如何操纵发酵。在实践本发明的方法时，MFA结果也可以与转录体组(transcriptome)和蛋白质组(proteome)的数据比较，以用于代谢工程改造或基因重排的设计实验和方案等等。
【553】在实践本发明的方法时，可以产生和检测任何经修饰的或者新的表型，包括在细胞中新的或者改进的特征。可以监测代谢或生长的任何方面。
监测mRNA转录体的表达
【554】在本发明的一个方面，工程化的表型包括增加或者降低mRNA转录体(如，葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶信息)的表达或者在细胞中产生新的(如，葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)转录体。这一增加或减少的表达可以通过测定本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的存在，或者通过葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性分析来追踪。mRNA转录体或信息也可以通过本领域已知的任何方法来检测或者定量，包括，例如Northern印迹、定量扩增反应、杂交至阵列以及类似的方法。定量扩增反应包括如定量PCR，包括如定量反转录聚合酶链式反应或RT-PCR；定量实时RT-PCR，或“实时动力学RT-PCR”(参见Kreuzer(2001)Br.J.Haematol.114：313-318；Xia(2001)Transplantation 72：907-914)。
【555】在本发明的一个方面，工程化的表型通过敲除同源基因的表达来产生。可以敲除所述基因的编码序列或者一个或多个转录控制元件，如启动子或增强子。这样，转录体的表达可以完全去除或者仅被降低。
【556】在本发明的一个方面，工程化的表型包括增加同源基因的表达。这可以通过敲除负调控元件或者诱变正调控元件而实现，负调控元件包括以顺式或者反式起作用的转录调控元件。细胞的一种或多种或所有的转录体可以通过包含细胞转录体、或代表细胞转录体的核酸、或与细胞转录体互补的核酸的样品的杂交，通过与阵列上的固定化核酸的杂交来测定。
监测多肽、肽和氨基酸的表达
【557】在本发明的一个方面，工程化的表型包括增加或者降低多肽(如葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)的表达或者在细胞内产生新的多肽。这一增加或者减少的表达可以通过确定存在的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的量，或者通过葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性分析来追踪。也可以通过本领域任何已知的方法来检测并定量多肽、肽和氨基酸，所述方法包括如核磁共振(NMR)、分光光度法、射线照像术(蛋白放射性标记)、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱，各种免疫学方法，如免疫沉淀、免疫扩散、免疫电泳、放射性免疫分析(RIAs)、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、免疫荧光分析，凝胶电泳(如，SDS-PAGE)、用抗体染色、荧光激活的细胞分选器(FACS)、热解质谱、傅立叶变换红外光谱、拉曼光谱、GC-MS和LC-电喷以及cap-LC-串联-电喷质谱，以及类似的方法。应用这些方法或者它们的变化也可以筛选新的生物活性，在美国专利6,057,103中有描述。而且，可以应用蛋白阵列测定细胞的一种或者多种或者所有的多肽。
工业、钻井、能源、农业、研究和医学应用
【558】本发明提供了本发明的多肽，包括酶、肽、抗体和“酶混合物”，的许多工业、钻井、能源、农业、研究和医学应用，“酶混合物”包括例如本发明的具有葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶活性的多肽。本发明的多肽可以用在食品加工(例如，面包和面团加工)，酿造，浴添加剂(bath additive)，酒精生产，肽合成，对应选择性，皮革工业中的皮革制备，废物处理和动物降解，医学治疗，生物膜降解，生物质转化为乙醇，生物防御，抗微生物剂和消毒剂，个人护理和化妆品，生物技术试剂，水解、分解或裂解含有葡聚糖的组合物，如药物或消化助剂例如抗炎(消炎)剂，和/或能源、石油或天然气工业中。本发明的方法和组合物(例如，“酶混合物”)可以被用于任何油和气勘探和/或钻井过程，或任何油和气井洗涤和/或压裂过程。
【559】在一种实施方式中，可以应用酶组合。酶的混合物或“酶鸡尾酒”可以包括，但不限于酶如木聚糖酶、酯酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、淀粉酶、脱羧酶、漆酶、葡聚糖酶、蛋白酶、肽酶、蛋白水解酶、淀粉葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、葡糖淀粉酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、半纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、糖基转移酶、磷脂酶、脂加氧酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、其它的甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳糖酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶的任何组合。本发明的葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶可以相互组合或与另外的酶组合。
【560】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以是高度选择性的催化剂。它们能够以灵敏的立体选择性、区域选择性和化学选择性催化反应，这是传统合成化学无法比拟的。而且，酶是非常多用的。本发明的酶可以被修改以适合在有机溶剂中发挥作用，在极端pH(例如，高pH和低pH)、极端温度(例如，高温和低温)、极端盐度水平(例如高盐度和低盐度)中作业，并且催化与结构上和其天然的、生理学底物无关的化合物的反应。
洗涤剂组合物
【561】本发明提供了包含本发明的一种或多种多肽(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)的洗涤剂组合物，和制备并应用这些组合物的方法。本发明引入了制备和使用洗涤剂组合物的所有方法，参见例如，美国专利第6,413,928；6,399,561；6,365,561；6,380,147号。
【562】所述洗涤剂组合物可以是一部分和两部分水性组合物、非水液体组合物、注塑固体、颗粒形式、微粒形式、压缩片剂、凝胶和/糊剂和浆液形式。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶也可以被用作固体或液体形式的洗涤剂添加剂产品。这种添加剂产品意图补充或促进传统洗涤剂组合物的性能，并且可以在清洁过程的任何阶段被加入。
【563】假定洗涤剂溶液具有期望的酶活性，那么实际的活性酶含量取决于洗涤剂组合物的制造方法并且该含量不是关键的。在一方面，在最终溶液中存在的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的量在每克所述洗涤剂组合物大约0.001毫克至0.5毫克的范围内。选择用于本发明的方法和产品中的具体的酶取决于最终的应用条件，包括产物的物理形式、使用pH、使用温度、以及待降解或改变的污物类型。酶可以被选择以提供用于任何给定的一组应用条件的最佳活性和稳定性。在一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶在大约4至大约12的pH范围内以及在大约20℃至大约95℃的温度范围内是有活性的。本发明的洗涤剂可以包括阳离子、半极性非离子或两性离子表面活性剂；或它们的混合物。
【564】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被配制成粉末的和液体洗涤剂，所述粉末的和液体洗涤剂在按重量计大约0.01至大约5％(在一个方面0.1％至0.5％)的水平具有4.0至12.0之间的pH。这些洗涤剂组合物也可以包括其它的酶，如其它葡聚糖酶、甘露聚糖酶、或木聚糖酶、或纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、过氧化氢酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、脂肪酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳糖酶、蛋白酶、果胶酸裂合酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。这些洗涤剂组合物也可以包括助洗剂和稳定剂。
【565】将本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶添加到传统的清洁组合物中不产生任何特定的应用限制。也就是说，只要酶在预期应用的pH和/或温度有活性或能忍受预期应用的pH和/或温度，适合洗涤剂的任何温度和pH也适合本发明的组合物。此外，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于无洗涤剂的清洁组合物，同样或单独或与助洗剂和稳定剂组合应用。
【566】本发明提供了清洁组合物，包括用于清洁硬表面的洗涤剂组合物、用于清洁织物的洗涤剂组合物、洗碟组合物、口腔清洁组合物、牙齿清洁组合物以及隐形眼镜清洗液。
【567】在一方面，本发明提供了洗涤物体的方法，所述方法包括在足以洗涤的条件下，将本发明的多肽与物体接触。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被包括作为洗涤剂添加剂。本发明的洗涤剂组合物可以，例如，被配制为包含本发明多肽的手洗或机械洗衣洗涤组合物。适合预处理玷污的织物的洗衣添加剂可以包括本发明的多肽。织物柔软剂组合物可以包括本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。
【568】可选地，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被配制为用于普通家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物。在可选的方面，本发明的洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可以包括一种或多种其它的酶，如另一种葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，或者，木聚糖酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、半乳糖酶、氧化酶，如乳糖酶、和/或过氧化物酶(也参见上述)。本发明的酶的性质被选择以与所选的洗涤剂相容(即，pH最适宜，与其它的酶和非酶成分相容，等等)，并且所述酶(一种或多种)以有效量存在。在一方面，本发明的酶被用于从织物除去有恶臭的物质。可以被用于实践本发明的各种洗涤剂组合物和制备它们的方法在如美国专利第6,387,690；6,333,301；6,329,333；6,326,341；6,297,038；6,309,871；6,204,232；6,197,070；5,856,164中被描述。
【569】本发明的酶可以被用于这样的洗涤剂或清洁剂，其包括在分散剂例如非离子聚合物如聚乙二醇或聚丙二醇中的固体颗粒分散体，如在美国专利申请第20060122089号中所述。本发明的酶可以被用于水溶性和/或水可分散的颗粒，例如包括聚乙烯醇，如例如在美国专利申请第20050075261号中所述。
【570】本发明的酶可以被用于洗涤剂，例如人工洗碟洗涤剂，在去除烹调、烘焙或烧烤食物残留污物中是有效的，如在美国专利申请第20060281653号中所述。
【571】当被配制为适合用于洗衣机洗涤方法的组合物时，本发明的酶可以包括表面活性剂和助洗剂化合物。它们可以另外包括一种或多种洗涤剂成分，例如，有机聚合化合物、漂白剂、额外的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、污物悬浮剂和抗再沉淀剂以及缓蚀剂。本发明的洗衣组合物也可以包括软化剂，如额外的洗涤剂成分。当被配制为洗衣洗涤剂组合物时，包含糖酶的这种组合物可以提供织物清洁、污物去除、白度保持、软化、色表、染料转移抑制和清洁卫生。
【572】本发明的洗衣洗涤剂组合物的密度可以在组合物的大约200至1500克/升，或大约400至1200克/升，或大约500至950克/升，或大约600至800克/升的范围；这可以在大约20℃测量。
【573】本发明的洗衣洗涤剂组合物的“紧密”形式最好由密度，以及对组合物而言由无机填充剂盐的量来反映。无机填充剂盐是粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规的洗涤剂组合物中，该填充剂盐以相当大的量，典型地以按总的组合物的重量计17％至35％的量存在。在紧密组合物的一个方面，填充剂盐以按组合物的重量计不超过总组合物的15％，或不超过10％，或不超过5％的量存在。无机填充剂盐可以选自碱和碱土金属的硫酸盐和氯化物，例如，硫酸钠。
【574】本发明的液体洗涤剂组合物也可以是“浓缩形式”。在一方面，与传统的液体洗涤剂相比，该液体洗涤剂组合物可以含有少量的水。在可选的方面，浓缩的液体洗涤剂的水含量按该洗涤剂组合物的重量计少于40％，或少于30％，或少于20％。本发明的洗涤剂化合物可以包括如WO 97/01629所述的制剂。
【575】本发明的酶可以在制备各种清洁组合物中有用。一些已知的化合物是适合的表面活性剂，包括非离子、阴离子、阳离子或两性离子洗涤剂，其可以被应用，例如，如在美国专利第4,404,128；4,261,868；5,204,015中所述。此外，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于，例如肥皂或液体肥皂应用，盘碟护理制剂、隐形眼镜清洁液或产品、肽水解、废物处理、纺织品应用、在蛋白质生产中的融合-切割酶和类似物中。与另一种洗涤剂葡聚糖酶相比，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以在洗涤剂组合物中提供增强的性能，也就是，所述酶组可以增加某些酶敏感污物如草或血液的清洁，如在标准洗涤循环之后通过通常的评价所确定。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被配制为已知的粉末的和液体洗涤剂，所述粉末的和液体洗涤剂在按重量计大约0.01至大约5％(例如大约0.1％至0.5％)的水平具有6.5至12.0之间的pH。这些洗涤剂清洁组合物也可以包括其它的酶，如已知的葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶或内切糖苷酶，以及助洗剂和稳定剂。
【576】本发明的洗涤剂组合物，例如，包括本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的那些洗涤剂组合物，也可以被用于清洗水果、蔬菜和/或泥和粘土化合物，参见，例如美国专利第5,786,316号。
【577】在一方面，本发明提供了具有葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性(本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)的洗涤剂组合物，用于水果、蔬菜和/或泥和粘土化合物的洗涤(参见，例如，美国专利第5,786,316号)。
处理纤维和纺织品
【578】本发明提供了应用本发明的一种或多种葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶处理纤维、纺织品、布、线、织物和类似物的方法。本发明的酶可以被用于任何处理纺织品、线、布、纤维或织物的方法，其在本领域中是熟知的，参见例如美国专利第6,387,690；6,261,828；6,077,316；6,024,766；6,021,536；6,017,751；5,980,581号，美国专利公开号20020142438A1。
【579】例如，本发明的酶可以被用于纤维和/或织物脱浆。在一方面，织品的触感和外观通过包括在溶液中将织物与本发明的酶接触的方法来改善。在一方面，在压力下用所述溶液处理织物。例如，本发明的酶可以被用于污物的去除。因而，在另一方面，本发明提供了包含本发明的多肽的纤维、纺织品、布、线、织物和类似物。
【580】在一方面，本发明的酶被应用在纺织品的编织期间或之后，或者在脱浆阶段过程中，或者在一个或多个额外的织物处理步骤期间。在纺织品的编织过程中，织线暴露于相当大的机械应力。在机械织机上编织之前，经常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆纺纱，从而增加它们的拉伸强度并且防止断裂。在纺织品被编织完之后，织品可以继续脱浆过程。在这之后进行一个或多个额外的纤维处理步骤。脱浆是从纺织品中除去“浆料”的作用。为了保均一的和耐水洗(wash-proof)的结果，在编织之后，在进一步处理织物之前，浆液涂层必须被除去。
【581】本发明的酶可以被用于处理任何纤维素物质，包括纤维(例如来自棉花、大麻、亚麻或亚麻布的纤维)、缝制和未缝制的织物，例如，由棉、棉掺和物或天然的或人造的纤维素(例如源自包含葡聚糖的纤维素纤维，如源自木浆)或其掺和物制成的针织品、纺织品、斜纹粗棉布、纱线以及毛巾料。掺和物的实例是棉花或人造丝/粘胶丝与一种或多种辅助材料(companion material)诸如羊毛、合成纤维(如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚偏氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含纤维素的纤维(例如，人造丝/粘胶丝、苎麻、大麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱塞尔纤维(lyocell))的掺和物。
【582】本发明的酶可以作为例如在水性组合物中的洗涤剂添加剂，被用于处理织物或任何含有葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖或纤维素的物质，包括含棉的织物。对于布料的制造，织物可以被裁剪并且被缝制成衣物或服装。这些可以在处理之前或之后完成。特别是，对于粗斜纹棉布牛仔裤的制造，已经开发了不同的酶修整方法。粗斜纹棉布服装的修整通常以酶脱浆步骤开始，在此步骤期间，服装受到淀粉分解酶的作用，从而赋予织物以柔顺并且使该棉织品更易于进行以后的酶修整步骤。本发明提供了通过应用本发明的酶，如甘露聚糖酶、木聚糖酶或葡聚糖酶(例如内切葡聚糖酶)的任何组合，处理纺织品例如修整粗斜纹棉布服装、酶脱浆以及赋予织物以柔顺的方法。在一方面，本发明的酶可以被用于处理以防止纺织品泛灰。
【583】在一方面，本发明的碱性和/或热稳定的甘露聚糖酶、木聚糖酶和葡聚糖酶(例如内切葡聚糖酶)被组合在单一的脱浆和生物煮练浴中。将脱浆和煮练组合在一个步骤中的优点之一是成本降低和环境影响较小，原因在于节约了能源和水利用并且产生较少的废物。脱浆和生物煮练的应用条件可以是在大约pH 8.5至pH10.0之间，并且在大约40℃和以上的温度。可以使用低的酶剂量(例如，每顿棉花大约5克)和短的反应时间(例如，大约15分钟)以获得有效的脱浆和煮练而不添加钙。
【584】本发明的酶可以用于处理含纤维素的织物，以获得粗糙度降低、色彩澄清(color clarification)、或使得这种织物的颜色发生局部变化。参见，例如，美国专利第6,423,524号。例如，本发明的酶可以作为例如降低粗糙度的洗涤剂添加剂，用于降低含棉织物的粗糙度。本发明的酶可以用于处理织物，以在着色的织物中产生“石洗的”外观，同时降低再沉淀到该织物上的着色剂数量。
【585】本发明的纺织品处理方法(应用本发明的酶)可以与其它纺织品处理例如煮练和漂白联合使用。煮练是从棉纤维，例如，角质层(主要由蜡组成)和初生细胞壁(主要由果胶、蛋白质和木葡聚糖组成)中除去非-纤维素物质。适当的去除蜡对于获得高润湿性是必要的。这是染色需要的。通过本发明的方法去除初生细胞壁改善了蜡去除并且确保更均匀的染色。用本发明的方法处理纺织品能够在漂白过程中提供白度。在煮练中使用的主要化学品是在高温下和高浓度下使用氢氧化钠。漂白包括使纺织品氧化。漂白典型地涉及使用作为氧化剂的过氧化氢，从而或者获得充分漂白的(白色的)织物或者确保染料的干净色调。
【586】本发明还提供碱性葡聚糖酶(例如，在碱性条件下有活性的内切葡聚糖酶)、甘露聚糖酶或木聚糖酶。这些酶在纺织品加工、植物纤维(例如，植物韧皮部纤维)脱胶、废物处理例如果胶废水、造纸以及咖啡和茶发酵中具有广泛的应用。参见，例如，Hoondal(2002)Applied Microbiology and Biotechnology59：409-418。
【587】本发明的纺织品处理方法还可以包括应用其它酶(包括糖类降解酶)的任何组合，其它的酶如过氧化氢酶、其它葡聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、其它甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、其它木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳糖酶、果胶酸裂合酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。本发明的酶可以与其它的糖类降解酶，例如纤维素酶、阿拉伯聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶和类似的酶联合使用，用于纤维的制备或用于纤维的清洁。蛋白酶也可以与本发明的酶联合应用。这些酶可以与洗涤剂联合应用。
处理食品和食品加工
【588】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶在食品加工工业中具有大量的应用。例如，在一方面，本发明的酶被用于改进从富油植物原料例如富油种子中提取油，例如，从大豆中提取豆油，从橄榄中提取橄榄油，从油菜籽提取油菜籽油和/或从葵花籽中提取葵花油。
【589】本发明的酶可以被用于分离植物细胞材料中的成分。例如，本发明的酶可被用于将富含葡聚糖的材料(例如，植物细胞)分离为成分。在一方面，本发明的酶可以被用于将富含葡聚糖或富含油的农作物分离成有价值的蛋白质和油以及外壳部分。分离过程可以通过采用本领域已知的方法进行。
【590】本发明的酶可以被用于制备水果或蔬菜汁、糖浆、提取物和类似物，以增加产率。本发明的酶可以被用于各种植物细胞壁来源的材料或废料，例如来自谷物、谷类、葡萄酒或果汁生产的废料，或农业残余物如蔬菜皮、豆荚、甜菜浆、橄榄浆、马铃薯浆和类似物的酶促处理(例如，含葡聚糖的植物材料的水解)。本发明的酶可以被用于改变处理的水果或蔬菜的稠度和外观。本发明的酶可以被用于处理植物材料，从而促进包括食品的植物材料的加工，促进植物成分的纯化或提取。本发明的酶可以被用于提高饲用价值、降低水结合能力，提高在废水工厂中的降解性和/或改善植物原料到青贮饲料的转化，等等。
【591】本发明的酶还可以被用于水果和酿造工业，用于设备的清洁和维护。
【592】本发明的酶可被用于任何食品或饲料(包括添加剂和营养补充剂)，或用于制造或保存任何食品或饲料的方法中；例如，本发明的酶可以被用于增加食品的粘度或凝胶强度的方法中，所述食品如果子酱、甜果酱、冻胶、果汁、膏、汤、调味汁(salsa)等，如在美国专利第6,036,981号中所述。采用本发明的酶可以增强食品的风味，如在美国专利申请第0070020744号中所述。本发明的酶可以被用于模控制和延长的货架期过程，例如，用于制备任何食品或饲料，如基于可食用面团的产品，如在美国专利申请第20060286213号中所述。
【593】在一方面，本发明的酶，例如葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶被用于烘焙应用，例如面包、饼干、薄脆饼干和类似物，以水解葡聚糖、甘露聚糖、阿拉伯木聚糖或木聚糖或者其它多糖，并且降低粘度。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶还可以被用于产生非粘性的面团，所述非粘性面团容易用于机械加工并易于减小饼干的大小。应用本发明的酶水解葡聚糖、甘露聚糖、阿拉伯木聚糖或木聚糖或者其它多糖，被用于防止烘焙产品的快速再水化，快速再水化导致松脆性降低和货架期减少。在一方面，本发明的酶作为添加剂用在面团加工中。在一方面，本发明的酶被用于面团调理(conditioning)，其中在一方面，酶在大约25-35℃的温度范围内并且接近中性pH(7.0-7.5)下具有高活性。在一方面，面团调理酶可以在极端的烘焙温度(＞500°F)失活。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶也可以用作面粉、面团和面包改进剂，参见例如美国专利第5,108,765和5,306,633号；因此，本发明提供包含本发明酶的面粉、面团和面包。本发明的酶可以被用于制造面包，例如高纤维面包，如在美国专利申请第20070054024号中所述；在一方面，本发明提供包含本发明酶的高纤维面包，或应用本发明的酶加工的面包，所述面包也包含例如羧甲基纤维素和至少一种其它类型的纤维材料以提高面包屑的柔软性并且提供时间延长的柔软性。
【594】本发明的食品处理方法还可以包括使用其它酶的任何组合，其它酶例如过氧化氢酶、葡聚糖酶、纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂酶、磷脂酶、脂氧化酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、肽酶、蛋白水解酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。在一些实施方式中，通过包括本发明的酶，这些酶混合物包括本发明的“酶鸡尾酒”。
纸或纸浆处理
【595】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以在纸或纸浆处理或纸脱墨中使用。例如，在一方面，本发明提供了使用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的纸处理方法。因此，本发明还提供了包括本发明的酶的纸、纸浆、木浆、牛皮纸浆、纸或木材废料和类似物，或者非木纸产品或副产品，如通草纸。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于制造和/或加工任何含纤维素的溶液；参见例如美国专利第5,760,211号。
【596】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶还可以被用于半纤维素的水解，半纤维素的水解是选择性的，特别是在纤维素存在的情况下；例如在美国专利第4,725,544中描述的方法。应用适合水解纤维素的酶，本发明的酶可以被用于处理富含纤维素的残留物(参见，USPN 4,725,544)。
【597】在一方面，本发明的酶，例如，示例性的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23，它们由例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22编码，或者这些“亲本”序列的示例性变体——如在表1和表2中列出的，以及SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ ID NO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，可应用在需要化学漂白剂如二氧化氯的还原和高碱高温环境中。在一方面，本发明的酶是热稳定的碱性葡聚糖酶，其能够在需要二氧化氯的牛皮纸浆中实现超过25％的还原，同时纸浆产量损失低于0.5％。在一方面，边界参数是pH 10、65-85℃，并且在酶装载小于0.001wt％时，处理时间为60分钟以下。可以在例如pH 10和60℃，就水解染料标记的葡聚糖的能力，对内切葡聚糖酶库进行测试。然后，在这些条件下测试阳性的酶可以在例如pH 10和70℃被评价。可选地，酶可以在70℃，在pH 8和pH 10被测试。在发现在纸浆和纸工业中期望的内切葡聚糖酶时，来自高温或高碱性环境的文库被作为目标。具体地，筛选这些库以寻找在碱性pH和大约45℃的温度起作用的酶。在另一方面，本发明的葡聚糖酶被用于浆和纸工业，降解木质素半纤维素键，从而释放木质素。
【598】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于纸和纸浆工业，如在例如美国专利第5,661,021；6,387,690；6,083,733；6,140,095和6,346,407号中所述。例如，如在美国专利第6,140,095号中，本发明的酶可以是耐碱的葡聚糖酶。本发明的酶，例如示例性的SEQ ID NO：2(其由例如SEQ IDNO：1编码)，以及SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ IDNO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ ID NO：13(由SEQ IDNO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ IDNO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，可以被用于纸和纸浆工业，其中所述酶在65℃到75℃的温度范围和在大约10的pH下是有活性的。此外，可用于纸和纸浆工业的本发明的酶将减少漂白化学品如二氧化氯的需要。
【599】本发明的酶，例如本发明的变体或进化的酶，如对于SEQ ID NO：2的具体变异，如在表1和表2中列出的，以及SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQID NO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ IDNO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，可以具有这样的活性(例如结合和/或酶促活性)，其在酸性或碱性条件下是耐热的或是热活性的。例如，本发明的酶，例如本发明示例性的酶，包括SEQ ID NO：2、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：21和/或SEQ ID NO：23——它们由例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22编码，和对SEQ ID NO：2的具体变异，如上述在表1中列出的，以及SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ ID NO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，可以在微酸性pH，例如在大约pH 5.5到pH 6.0之间，例如在大约40℃到70℃之间的温度范围内具有活性。在一方面，本发明的酶，例如，示例性的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23——它们由例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22编码，在大约40℃到75℃，和大约pH 5.5到6.0具有最佳活性；并且在70℃稳定至少50分钟，而在大约96℃到100℃失活。在另一方面，本发明的酶，例如，SEQ IDNO：2的变体，如在表1和表2中列出的，以及SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ ID NO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，是耐热的和/或热稳定的；例如，本发明的酶，例如SEQ ID NO：2的变体，如在表1和表2中列出的，以及SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ ID NO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，在95℃加热2分钟之后能够保留至少75％的残余活性(例如，葡聚糖酶活性)；并且在另一方面，在95℃加热30分钟之后保留100％的活性。而在另一方面，本发明的酶，例如SEQID NO：2的变体，如在表1和表2中列出的，以及SEQ ID NO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ ID NO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，在96℃、97℃、98℃或99℃加热30分钟后保留100％的活性。而在另一方面，本发明的酶，例如SEQ ID NO：2的变体，如在表1和表2中列出的，以及SEQ IDNO：7(由SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：9(由SEQ ID NO：8编码)、SEQ ID NO：11(由SEQ ID NO：10编码)、SEQ ID NO：13(由SEQ ID NO：12编码)、SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码)、SEQ ID NO：21(由SEQ ID NO：20编码)和SEQ ID NO：23(由SEQ ID NO：22编码)，在100℃加热30分钟后保留至少90％的活性。
【600】此外，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于化学浆的生物漂白和处理，如在例如美国专利第5,202,249号中所述，用于木材或纸浆的生物漂白和处理，如在例如美国专利第5,179,021、5,116,746、5,407,827、5,405,769、5,395,765、5,369,024、5,457,045、5,434,071、5,498,534、5,591,304、5,645,686、5,725,732、5,759,840、5,834,301、5,871,730和6,057,438中所述，用于减少木材中的木质素和改良木材，如在美国专利第5,486,468和5,770,012号中所述。
【601】在一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶被用于纸和纸浆工业，或单独或与木聚糖酶(例如，本发明的木聚糖酶)一起使用。在一方面，本发明的酶被用于漂白工艺以增强所漂白的木浆的亮度，木浆例如全部或部分地来自软木材。应用本发明的酶，可以减少在漂白阶段所使用的氯的量。在一方面，本发明的甘露聚糖酶被用于增加再循环纸过程中纸浆的打浆度。在一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶被单独使用或与木聚糖酶(例如，本发明的木聚糖酶)联合使用，用于木质素纤维素浆(例如，全部或部分地来自软木材)的处理，以改善其可漂白性。参见例如美国专利第5,795,764号。
【602】本发明的纸浆和纸工艺还可以包括使用其它酶的任何组合，所述其它酶如过氧化氢酶、葡聚糖酶、纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂酶、磷脂酶、脂氧化酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、肽酶、蛋白水解酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。在一些实施方式中，通过包括本发明的酶，这些酶混合物包括本发明的“酶鸡尾酒(酶混合物)”。
饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂
【603】本发明提供了应用本发明的葡聚糖酶，处理用于人和/或动物(包括，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类和类似动物；包括反刍动物)的饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂的方法。本发明提供了饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂，其包含本发明的多肽，例如，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，包括本发明的酶混合物。本发明提供包含本发明的酶和“混合物”的饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂，如在美国专利申请第20060193897号中所述。
【604】在一方面，应用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶处理饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂，可有助于营养物，如淀粉、蛋白质和类似物在饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中的可利用性。通过分解难以消化的蛋白质或者直接地或间接地暴露淀粉(或其它的营养物)，本发明的酶使得营养物对其它内源或外源的酶更可及。本发明的酶还可以简单地引起容易消化和易于吸收的营养物和糖的释放。在另一方面，本发明的酶被用于饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂，以降低食品、饲料、食物或其它可食用的物质，例如在高大麦或高小麦食物如家禽饮食中葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖或其它多糖的粘度。在一方面，这可以使得湿滴减到最少。
【605】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用作或用于饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂，包括用于本领域已知的任何饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂，例如在美国专利第5,432,074、5,429,828、5,612,055、5,720,971、5,981,233、5,948,667、6,099,844、6,132,727和6,132,716中所列出的。
【606】当被加入到饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂时，本发明的葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶改进了植物细胞壁材料在体内的分解，部分原因在于肠内粘度的降低(参见，例如，Bedford等人，Proceedings of the 1st Symposium on Enzymes in Animal Nutrition，1993，pp.73-77)，由此实现动物对植物营养物的更好利用。因此，通过在饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中应用本发明的酶(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)，动物的生长速率和/或饲料转化率(即，消化的饲料重量相对于体重增加量)被提高。
【607】本发明的饲料添加剂、食品添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂可以是颗粒化的酶产物，其可容易地与食品或饲料成分混合。可选地，本发明的饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂能够形成预混合的成分。本发明颗粒化的酶产物可被包覆或未包覆。酶颗粒的颗粒大小可以与饲料和预混合成分的颗粒大小一致。这提供了将酶掺入到饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中的安全方便的手段。可选地，本发明的饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂可以是稳定化的液体组合物。这可以是基于水或油的浆液。参见例如美国专利第6,245,546号。
【608】在饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂的改进中，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以在体外(通过改变饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂的成分)或者在体内处理饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被加入到含有大量葡聚糖的饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中，例如，包含来自谷物、谷类和类似物的植物原料的饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中。当被加入到饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中时，葡聚糖酶显著提高含葡聚糖材料，例如植物细胞壁在体内的分解，由此实现人或动物较好地利用植物营养。在一方面，提高了人或动物的生长速率和/或食物/饲料转化率(即，所消化的食品/饲料重量相对于体重增加量)。例如，含部分不可消化或不可消化的葡聚糖的蛋白质完全或部分地被本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，例如与另外一种酶，例如β-半乳糖酶联合，进行降解，成为肽和半乳糖和/或半乳糖寡聚体。这些酶消化产物更易于被人或动物消化。因此，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶能有助于饲料和/或食物能量的利用。同样，通过促进含葡聚糖蛋白质的降解，本发明的葡聚糖酶能够提高糖类和非糖类饲料或食品组分如蛋白质、脂肪和矿物质的可消化性和摄取。
【609】在另一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以通过在转基因食物和/或饲料作物(如，例如，转基因植物，种子和类似物)，如谷类、谷物、玉米、大豆、油菜籽、羽扇豆和类似物中直接表达所述酶来供应。如上所讨论的，本发明提供了包含编码本发明的多肽的核酸序列的转基因植物、植物部分和植物细胞。在一方面，所述核酸被表达，以使本发明的酶(例如，葡聚糖酶)以可收回的量产生。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以从任何植物或植物部分回收。可选地，包含重组多肽的植物或植物部分可以被这样使用，用于提高食物或饲料的质量，例如，提高营养价值、适口性和流变特性，或者用来破坏抗营养因子。
【610】在一方面，本发明提供方法，所述方法应用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，在动物食用之前从食物或饲料中除去寡糖。在该过程中，食物或饲料形成，其具有增加的可代谢的能量价值。除了本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶之外，半乳糖苷酶、纤维素酶以及它们的组合可以被使用。在一方面，所述酶可以以等于按食物或饲料原料的重量计大约0.001％到1％的量被加入。在一方面，食物或饲料是谷物、小麦、谷类、大豆(例如大豆粉)原料。参见，例如，美国专利第6,399,123号。
【611】在另一方面，本发明提供了方法，所述方法利用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶作为人或动物饮食中的营养补充剂或食品强化剂，这通过制备包含本发明的重组酶的营养补充剂或食品强化剂，并且将所述营养补充剂或食品强化剂施用给人或动物，来增加包含在被人或动物摄取的食品或饲料中的葡聚糖的利用而进行。
【612】在一方面，本发明的酶可被用于处理/加工“DDGS”，或含可溶物干酒糟(Distillers dried grain with solubles)，其是干磨乙醇(dry-grind ethanol)工厂的副产品，例如用于食物或饲料应用，例如用于禽类、牛、猪和其它家养动物。
仍在另一方面，本发明提供可食用的丸状酶输送基质，和用于将本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶例如作为营养补充剂或食品强化剂输送到人或动物的方法。酶输送基质容易在水介质，如，例如人或动物的消化液中释放本发明的酶(例如葡聚糖酶)，如具有本发明的氨基酸序列的酶，或其酶促活性片段(例如，其至少30、40、50、60、70、80、90或100个或更多个相邻氨基酸的子序列)。
【613】本发明的酶输送基质可以从粒状可食用载体制备，所述载体选自这样的成分，如耗尽油的谷类胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、豆壳、葵花籽饼粕、次粉和类似物，其容易将包含在其中的重组酶分散到水介质中。在使用中，可食用的粒状酶输送基质被施用给动物以将葡聚糖酶输送给人或动物。合适的基于谷类的或基于草的基质可以包括或源自任何合适的可食用谷类或草，如小麦、荞麦、粟、黑麦、玉米、大豆、水稻、高粱、紫花苜蓿、大麦、一年生草等。示例性的基于谷类的基质是基于玉米的基质。基质可以源自任何合适的谷类部分，但是在一方面是被批准用于动物饲料用途的谷类胚芽，如在湿磨或干磨过程中获得的玉米胚芽。谷类胚芽在一方面包括废胚芽(spent germ)，所述废胚芽是油已经排出的谷类胚芽，油如通过挤压或己烷或其它溶剂萃取排出。可选地，谷类胚芽通过螺旋式压榨器提取，也即是，油已经通过挤压除去。
一方面，本发明的酶输送基质是以分离的多个微粒、小丸或颗粒形式存在。“颗粒”的含义是被压缩或压紧的微粒，如通过制丸、挤压或类似的压制过程从基质中去除水分。微粒的这种压缩或压紧也可促进微粒的微粒内粘结力。例如，通过在制丸机中将基于谷类的基质进行制丸来制备颗粒。由此制备的小丸被研磨或粉碎成适合用作食物或饲料辅料的颗粒大小。基质本身可被用作在食物或饲料中输送酶的稀释剂。
【614】在一方面，酶输送基质为颗粒的形式，其具有大约4到大约400目(USS)的颗粒大小范围；更在一方面，大约8到大约80目；最在一方面，大约14到大约20目的颗粒大小范围。如果谷类胚芽通过溶剂萃取被耗尽，可能有必要在造粒机中使用润滑剂如玉米油，但是，如果所述胚芽被螺旋式压榨器提取，这种润滑剂通常是不必要的。在本发明的其它方面，通过其它的压紧或压缩方法如，例如，通过模挤压基于谷类的基材和将挤压物磨碎至合适的颗粒大小来制备基质。
【615】酶输送基质可以进一步包括多糖成分，作为粘结剂，增强基质颗粒的粘结性。粘结剂被认为提供了额外的羟基，其增强了基质颗粒内谷类蛋白质之间的键合。进一步认为，所述额外的羟基通过增强蛋白质与淀粉以及与其它蛋白质的氢键合起作用。粘结剂可以以适合增强酶输送基质颗粒的粘结性的任何量存在。合适的粘结剂包括糊精、麦芽糊精、淀粉如玉米淀粉、面粉、纤维素、半纤维素和类似物质的一种或多种。例如，基质(不包括酶)中的谷类胚芽和粘结剂的百分比按重量计为78％的玉米胚芽和20％的玉米淀粉。
【616】在一个实施方式中，因为本发明的酶-释放基质是用生物可降解的原料制成的，所述基质可以受到损坏，如被霉菌损坏。为了防止或抑制这种霉菌，基质可以包括霉菌抑制剂，如丙酸盐，其可以以足以抑制酶-释放基质中的霉菌的任何量存在，因而提供了在不需要冷藏的稳定制剂中的输送基质。
【617】在一个实施方式中，本发明提供了在本发明的酶输送基质中的本发明的酶和使用它们的方法；并且在一方面，所述酶是如本文所述的热稳定的葡聚糖酶、甘露聚糖酶或木聚糖酶，从而在升高的温度和/或蒸汽可能用来制备丸化的酶输送基质的生产期间抵抗葡聚糖酶的失活。在消化包含本发明的酶输送基质的饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂的期间，含水消化液将引起活性酶的释放。其它类型的热稳定酶和热稳定的营养补充剂也可以被掺入到输送基质中，从而在任何类型的含水条件下释放。
【618】出于许多不同的目的，可以对本发明的酶基质微粒施加涂层，如为了向饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中添加调味剂或营养补充剂，为了在胃内条件下延缓补充剂和酶的释放，以及类似的目的。或者，可施加涂层来实现功能性的目的，例如在需要延缓酶从基质微粒的释放或控制酶将被释放的条件时。涂层材料的组分可以是这样的，其可选择性地被其敏感的试剂(如热、酸或碱、酶或其它化学物质)分解。可选择地是，对不同的这样的分解剂敏感的两种或更多种涂层可被连续地施加于基质微粒。
【619】本发明也涉及制备酶释放基质的方法。根据本发明，该方法包括提供基于谷类的基材的多个分散颗粒，其颗粒大小适合用作酶释放基质，其中所述颗粒包括由本发明的氨基酸序列编码的葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶。一方面，该方法包括将酶释放基质的颗粒压制或压缩成小粒，最多的在一个方面是通过造粒方法来完成。霉菌抑制剂和粘结剂，当被使用时，可在任何合适的时间被加入，并且在一方面，以所需的比例与基于谷类的基材在将基于谷类的基材造粒之前混合。造粒机进料中的含水量一个方面是在上面关于最终产物含水量所述的范围中，并且在一个方面是大约14-15％。一方面，水分以酶的含水制剂的形式加入至原料中，使该原料达到此含水量。在造粒机中的温度在一个方面用蒸汽达到大约82℃。造粒机可在任何条件下进行操作，使得对原料进行足够的操作以提供丸粒。对于从含酶组合物中去除水分来说，造粒方法本身是一个成本上有效的方法。
【620】在一方面，造粒机在100磅/分钟的压力下，在82℃用1/8英寸×2英寸的模进行操作，以提供丸粒，然后其在造粒机的粉碎部件中被粉碎以提供多个分散颗粒，所述分散颗粒具有能够通过8目筛但是保留在20目筛上的颗粒大小。
【621】本发明的热稳定的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以用于本发明的丸粒。它们可以具有高的最适温度和高的耐热性，以使酶反应可以在迄今未进行的温度下完成。编码根据本发明的葡聚糖酶的基因(例如，如在本发明的任何序列中示出的)可以被用于制备具有与本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的那些性质不同的性质(在最适pH、最适温度、耐热性、溶剂稳定性、比活性、对底物的亲和力、分泌能力、翻译速率、转录控制等方面)的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶(例如，应用GSSSM技术，如本文所述)。此外，本发明的多核苷酸可以被用于筛选通过此处描述的方法制备的变体葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，从而确定具有期望的活性，如提高的或改变的热稳定性或耐热性的那些变体。例如，美国专利第5,830,732号描述了用于确定葡聚糖酶的耐热性的筛选试验。
【622】在一方面，饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中的本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶在人或动物的胃中是有活性的。因此，在一方面，例如，在饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中的本发明的酶，在大约37℃和单胃动物的低pH(pH 2-4)以及反刍动物的接近中性的pH(pH 6.5-7)下具有活性。本发明的酶对肠酶例如蛋白酶具有抵抗力，并且在与食品和饲料粒化有关的较高温度下具有稳定性。在一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶被用于饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂，并且可以具有高比活性，例如，在35-40℃和pH 2-4具有活性，在SGF中具有30分钟以上的半衰期并且在配制状态下在85℃具有大于5分钟的半衰期。对于反刍动物的饲料，在饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂中的本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶具有高比活性，例如在35-40℃和pH 6.5-7.0具有活性，在SRF中具有30分钟以上的半衰期并且作为浓缩的干粉具有稳定性。
【623】本发明的饲料、食品、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂和/或食品强化剂生产方法可以包括其它酶的任何组合，所述其它酶如过氧化氢酶、其它的葡聚糖酶、纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂酶、磷脂酶、脂氧化酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、肌醇六磷酸酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、其它的甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。在一些实施方式中，通过包括本发明的酶，这些酶混合物包括本发明的“酶鸡尾酒”。
废物处理
【624】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于各种其它的工业应用，例如，用于废物处理(除了，例如，生物质转化成燃料)。例如，在一方面，本发明提供了使用本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的固体废物消化方法。该方法可以包括减少基本上未处理的固体废物的质量和体积。固体废物可在酶溶液(包括本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)存在的情况下在控制的温度下用酶促消化方法进行处理。这导致没有因添加微生物引起的明显细菌发酵的反应。固体废物被转变为液化的废物和任何残余的固体废物。得到的液化废物可与所述的任何残余的固化废物分离。参见，例如美国专利5,709,796。因此，本发明提供废物产品，如液化的废物或任何残余的固体废物，其包括本发明的多肽，例如，本发明的酶。
【625】本发明提供了使用本发明的酶或酶混合物处理源自人、动物和/或工业领域的废料的方法；并且这些方法也可以用于回收重要的营养元素和有毒的重金属，如，例如美国专利申请第20060194299号中所述。在一方面，本发明提供释放植物营养元素和利用存在于这种废物中的有毒金属和碳能源的方法，包括用本发明的一种或多种酶处理废物。
【626】本发明的废物处理方法可以包括使用其它酶的任何组合，其它酶例如过氧化氢酶、其它的葡聚糖酶、纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂酶、磷脂酶、脂氧化酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、肌醇六磷酸酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、其它的甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白水解酶、肽酶、蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。在一些实施方式中，通过包括本发明的酶，这些酶混合物包括本发明的“酶鸡尾酒”。
口腔护理产品
【627】本发明提供了包含本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的口腔护理产品。示例性的口腔护理产品包括牙膏、牙用乳膏(dentalcream)、凝胶或牙粉、洁齿剂(odontics)、漱口水、刷牙之前或之后的漱口制剂、口香糖、含片或糖果。参见，例如，美国专利第6,264,925号。
【628】本发明的口腔产品可以包括其它酶的任何组合，所述其它酶如蛋白水解酶、肽酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、葡聚糖酶、纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶和葡糖苷酶。
酿造和发酵
【629】本发明提供了包含本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的啤酒酿造(例如发酵)方法。在一个示例性的方法中，含淀粉的原料被分解并加工以形成麦芽。本发明的酶可以在发酵过程中的任意点使用。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于酿造工业，用于β-葡聚糖的降解。在一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶被用于酿造工业，用于饮料的澄清。本发明的酶可以用于饮料工业，用于提高麦芽汁或啤酒的过滤性，如，例如美国专利第4,746,517号所述。
【630】在一方面，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以在大麦麦芽的加工中使用。啤酒酿造的主要原料是大麦麦芽。这可以是一个三阶段过程。首先，大麦谷物被浸渍以增加水含量，例如增加到大约40％左右。第二，所述谷物可以在15-25℃温育3到6天以便发芽，此时酶合成在赤霉素的控制下被刺激。一方面，本发明的酶在该过程的这个(或任意其它)阶段加入。
【631】在一方面，本发明的酶被用于淀粉糖化和转换过程。在酿造和发酵工业，淀粉糖化和转换过程在太低的温度下进行，以至于不能促进水溶性葡聚糖、甘露聚糖、阿拉伯木聚糖或木聚糖，或其它多糖的充分降解。这些聚合物形成粘性基材，所述基材能够使淀粉糖化麦芽汁的粘度增加，导致较长的醪液流出、在最终的啤酒产品中残余浑浊和沉淀，原因在于低效的过滤和低的提取产率。由于这些原因，在发酵过程中加入酶以分解β-1，4-和β-1，3-联接的葡聚糖或其它的多糖。
【632】在一方面，本发明的酶被用于麦芽坊操作中，例如，葡聚糖酶被加入到处理水中，以缩短发芽时间和/或促进质量差的大麦转化为可接受的麦芽。在一方面，本发明的酶被用于淀粉糖化，例如，加入它们以增加麦芽汁的滤过性和/或提高过滤(从醪液中分离麦芽汁)。在一方面，本发明的酶被用在发酵罐和/或沉淀桶中，以例如辅助澄清浑浊和/或改进过滤。在一方面，本发明的酶被用在辅助酿造中，例如，加入本发明的葡聚糖酶以分解葡聚糖、甘露聚糖、阿拉伯木聚糖或木聚糖和来自大麦、小麦和/或其它谷物的其它多糖，包括麦芽中的聚糖。在一方面，本发明的酶被用在麦芽酿造中，例如，加入本发明的葡聚糖酶以改变具有高葡聚糖含量的劣质麦芽。
【633】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以在任何啤酒或酒精饮料生产方法中使用，如例如美国专利5,762,991；5,536,650；5,405,624；5,021,246；4,788,066中所述。
【634】本发明的酿造方法可以包括使用其它酶的任何组合，所述其它酶如其它的木聚糖酶、酯酶、纤维素酶、果胶酶、果胶裂解酶、淀粉酶、脱羧酶、漆酶、葡聚糖酶、蛋白水解酶、肽酶、蛋白酶、淀粉葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、葡糖淀粉酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、半纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、糖基转移酶、磷脂酶、脂氧化酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、其它的甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。在一些实施方式中，通过包括本发明的酶，这些酶混合物包括本发明的“酶鸡尾酒”。
医学和研究应用
【635】由于溶菌性质和抗真菌特性，本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可被用作抗菌剂，例如药物组合物。本发明的酶可以被用于改善、消除真菌、酵母或细菌感染，或保护动物免受真菌、酵母或细菌感染，例如细菌毒素或细菌孢子，如沙门氏菌(salmonellae)或芽孢杆菌(Bacillus)，例如在PCT申请第WO0049890和WO9903497号中所述。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以在糖酶和/或葡聚糖酶的应用方法和组合物中使用，用于制造治疗和/或预防球虫病的药剂。所制造的药剂可以是基于谷物的动物饲料的形式，参见例如美国专利第5,624,678号。
【636】本发明的酶可以用于治疗和/或预防动物的细菌感染，例如，由沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)或产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)引起的感染，以及用于制备治疗和/或预防动物细菌感染的药剂，例如，由沙门氏菌、弯曲杆菌或产气荚膜梭菌引起的感染，如例如美国专利申请第20060083731号中所述；并且在一个实施方式中，所述酶被加入到饲料、饲料添加剂或营养补充剂中。
生物质转换和清洁生物燃料的生产
【637】本发明提供了多肽，其包括酶(本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)和抗体，和将生物质或任何木质素纤维素材料(例如，包括纤维素、半纤维素和木质素的任何组合)转换为除了饲料、食品和化学制品以外的燃料(例如，生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物丙醇、生物甲醇、生物柴油)的方法。例如，在一方面，本发明的酶具有β-葡糖苷酶活性，以从纤维二糖二聚体释放出D-葡萄糖。在一方面，所述酶具有外切或内切β-葡聚糖酶活性。
【638】因此，本发明的组合物和方法提供了使用石油产品的有效且可持续的替代品或添加剂，例如，作为生物燃料如生物甲醇、生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇和类似生物燃料与柴油、汽油、煤油和类似物的混合物。本发明提供了表达本发明的酶的生物，用于参与涉及天然生物质转化的化学循环。在一方面，用于转化的酶和方法被用在酶整体(enzyme ensembles)中，用于有效地将多糖、纤维素和/或半纤维素聚合物解聚成可代谢的(例如可发酵的)碳部分。本发明提供了发现和实施最有效的酶的方法，使这些重要的新“生物质转化”和替代性的能源工业过程可行。
【639】本发明的组合物和方法可以被用于提供使用石油产品的有效且可持续的替代品或添加剂，例如，作为生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇、生物丙醇、生物甲醇和/或生物柴油与汽油的混合物。本发明提供了表达本发明的酶的生物，用于参与涉及天然生物质转化的化学循环。本发明提供了发现和实施最有效的酶的方法，使这些重要的新的“生物质转化”和替代性的能源工业过程可行。
【640】本发明提供了方法、酶和酶的混合物或本发明的“鸡尾酒”，用于处理材料，例如包含纤维寡糖、阿拉伯木聚糖寡聚体、木质素、木质素纤维素、木聚糖、葡聚糖、纤维素和/或可发酵糖的生物质材料，这包括使组合物与本发明的多肽，或由本发明的核酸编码的多肽接触，其中任选地，所述材料源自农作物(例如小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、白杨木)，是食品或饲料生产的副产物，是木质素纤维素废品、或是植物残渣或废纸或废纸产品，并且任选地所述植物残余物包括茎、叶、壳、皮、玉米或玉米穗、玉米秸秆、玉米纤维、干草、稻草(例如，水稻杆或小麦杆)、甘蔗渣、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮、木材、木屑(wood thinning)、木片、木浆、废浆、木材废物、木材刨花和锯屑、建筑和/或爆破废物和残片(例如木材、木材刨花和锯屑)，并且任选地，所述纸废品包括废弃或用过的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字机用纸、报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料以及再生纸材料。此外，城市废物，例如城市固体废物的纸质部分、城市木材废物和城市绿色废物以及包含糖、淀粉和/或纤维素的其它材料可以被应用。任选地，材料例如生物质材料的处理产生生物醇类，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇。
【641】可选地，本发明的多肽可以在生物质植物材料或原料本身中表达。
【642】本发明的方法也包括获得转化的木质素纤维素材料(由本发明的酶处理)并且通过发酵和/或通过化学合成使其成为燃料(例如，生物醇类，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)。在一方面，所产生的糖类进行发酵和/或不可发酵的产物被气化。
【643】本发明的方法也包括应用本发明的酶转化藻类、初级植物油(virginvegetable oil)、废植物油、动物脂肪和软脂(例如，牛脂、猪油和黄色软脂)或污水，并且通过发酵和/或通过化学合成或转化使其成为燃料(例如生物醇类，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)。
【644】本发明的酶(包括例如生物体，如微生物，例如真菌、酵母或细菌，其产生并且在一些方面分泌本发明的重组酶)可以被用于或被包括/并入在任何生物质转化过程的任何阶段，例如，在任何一个步骤、几个步骤，或者被包括在所有的步骤中，或所有下列生物质转化过程的方法中，或所有这些生物燃料替代品中：
直接燃烧：材料通过直接加热燃烧并且是最简单的生物质技术；如果生物质来源在附近，可能是非常经济的。
热解：是在没有氧存在的情况下通过加热对生物质进行热降解。在一方面，生物质被加热至大约800到1400华氏度之间的温度，但是没有氧被引入以支持燃烧，导致气体、燃料油和炭的产生。
气化：生物质可以被用于通过加热或厌氧消化产生甲烷。合成气，一氧化碳和氢的混合物，可以源自生物质。
掩埋气：通过填埋物中掩埋的垃圾腐败(厌氧消化)产生。有机废物在分解时，产生气体，所述气体由大约50％的甲烷组成，甲烷是天然气的主要成分。
厌氧消化：将有机物质转化为甲烷和二氧化碳的混合物，甲烷是天然气的主要成分。在一方面，生物质如废水(污水)、肥料或食品加工废物与水混合且在没有空气的情况下进料到消化罐中。
发酵
醇类发酵：燃料醇通过将纤维素物质和/或淀粉转化为糖，将糖发酵成醇类，然后通过蒸馏分离醇水混合物来产生。原料可以被转化为糖并且然后通过用酵母发酵转化为醇，所述原料如专用作物(例如，小麦、大麦、马铃薯、柳枝稷、白杨木)、农业残余物和废物(例如，水稻杆、玉米秸秆、小麦杆、甘蔗渣、稻壳、玉米纤维、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮)、林业废物(例如，硬木和软木屑、来自木材加工的硬木和软木残余物、木材刨花和锯屑)、城市废物(例如，城市固体废物的纸质部分、城市木材废物以及城市绿色废物)、木材废物(例如，锯木厂废物、纸浆厂废物、建筑废物、爆破废物、木材刨花和锯屑)、和废纸或包含糖、淀粉和/或纤维素的其它材料。可选地，包含糖的材料可以通过发酵被直接转化为醇类。
酯交换作用：将油转化为生物柴油的示例性反应称为酯交换作用。酯交换过程使醇(如甲醇)与包含在植物油、动物脂肪或再循环油脂中的甘油三酯油反应，形成脂肪酸烷基酯(生物柴油)和甘油。该反应需要热和强碱催化剂，如氢氧化钠或氢氧化钾。
生物柴油：生物柴油是由植物油、动物脂肪或再循环油脂制造的脂肪酸烷基酯的混合物。生物柴油可以以纯的形式用作交通工具的燃料，但是其通常被用作石油柴油添加剂，以降低来自柴油动力交通工具的微粒、一氧化碳、碳氢化合物和空气有毒物质的水平。
水解：包括应用本发明的酶催化的化合物的水解，所述化合物例如生物质，如木质素纤维素材料。
热点联产(Congeneration)：是采用单一的燃料和设备，同时生产一种以上形式的能量。在一方面，生物质热点联产比单独的生物质生产具有更具潜力的增长，因为热点联产产生热和电。
【645】在一方面，本发明的多肽具有水解酶/纤维素水解活性，例如葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶和/或其它的酶活性，用于从有机原料产生燃料(例如，生物醇，例如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇或生物柴油)，所述有机原料例如生物质，如源自植物和动物的组分，包括任何农业作物或其它可更新的原料，农业残余物或动物废物、城市和工业废物的有机成分、或建筑或爆破废物或残片、或微生物如藻类或酵母。
【646】在一方面，本发明的多肽被用在将木质素纤维素生物质转化为燃料(例如，生物醇，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的过程中，或者另外被用在水解或消化生物材料的过程中，这样它们可以被用作燃料(例如，生物醇，例如，生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)，或用于使生物质更容易被加工成燃料。
【647】在可选的方面，本发明的多肽，包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”被用在酯交换方法的过程中，所述酯交换方法使醇类(如乙醇、丙醇、丁醇、丙醇、甲醇)与包含在植物油、动物脂肪或再循环油脂中的甘油三酯油反应，形成脂肪酸烷基酯(生物柴油)和甘油。在一方面，生物柴油由大豆油或再循环的厨房用油制成。动物脂肪、其它的植物油和其它的再循环油也可以被用于生产生物柴油，这取决于它们的成本和可用性。在另一方面，各种脂肪和油的掺和物被用于生产本发明的生物柴油燃料。
【648】本发明的酶，包括酶的混合物或本发明的“鸡尾酒”也可以被用在甘油精炼中。甘油副产品含有未反应的催化剂和用酸中和的肥皂。水和醇被除去以产生50％到80％的粗甘油。残留的污染物包括未反应的脂肪和油，其可以使用本发明的多肽处理。在本发明大型生物柴油工厂中，甘油可以被进一步纯化到例如99％或更高的纯度，用于制药和化妆品工业。
【649】应用本发明的多肽——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——制造的燃料(包括生物醇类，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)可以与燃料含氧化物一起使用以改善燃烧特性。加入氧可导致更完全的燃烧，其减少了一氧化碳的排放。这是用生物燃料(例如本发明的燃料)代替石油燃料的另一个环境益处。应用本发明的组合物和/或方法制造的生物燃料可以与汽油掺和，形成E10掺和物(大约5％到10％的乙醇和大约90％到95％的汽油)，但是其可以以更高的浓度使用如E85，或以其纯的形式使用。应用本发明的组合物和/或方法制造的生物燃料可以与石油柴油掺和，形成E20掺和物(20％的生物柴油和80％的石油柴油)，尽管可以使用高达B100(纯的生物柴油)的其它掺和水平。
【650】本发明还提供了由包含木质素纤维素生物质的组合物制备生物燃料(包括生物醇类，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的方法。木质素纤维素生物质材料可以从农作物获得，如食品或饲料生产的副产物，或如木质素纤维素废产物，诸如植物残余物、废纸或建筑和/或爆破废物或残片。用本发明的多肽处理的合适的植物来源或植物残余物的例子包括大型海藻、藻类、谷类、种子、茎、叶、壳、皮、玉米穗、玉米秸秆、稻草、草(例如，印度草如蓝刚草(Sorghastrum nutans)；或柳枝稷(switch grass)，例如黍(Panicum)的种，如柳枝稷(Panicum virgatum))和类似物，以及木材、木片、木浆和锯屑。适合用本发明的多肽处理的纸废物的例子包括废弃的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字机用纸等等，以及报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料。建筑和爆破废物和残片的例子包括木材、木材碎屑、木材刨花和锯屑。
【651】在一个实施方式中，本发明的酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——和方法可以与从生物质制备乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙醇和/或柴油的更“传统的”方法一起使用，例如，这样的方法，其包括通过使干燥的木质素纤维素材料在反应器中与由强酸和金属盐的稀释溶液组成的催化剂接触而水解木质素纤维素材料；这可以降低纤维素水解的活化能或温度，以获得更高的糖产率；参见，例如，美国专利6,660,506和6,423,145。
【652】使用本发明的酶——其包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——的另一种示例性方法包括：通过在一定的温度和压力下在含水介质中经受第一阶段的水解步骤而水解含有半纤维素、纤维素和木质素或能被本发明的酶水解的任何其它多糖的木质素纤维素材料，所述温度和压力被选择来实现半纤维素的初步解聚而不将纤维素大部分解聚成葡萄糖。该步骤产生一种浆，其中含水液相含有由半纤维素解聚得到的溶解的单糖，而固相含有纤维素和木质素。第二阶段水解步骤可以包括使得至少大部分纤维素解聚的条件，该步骤产生含有溶解的/可溶的纤维素解聚产物的含水液相。参见例如美国专利5,536,325。本发明的酶(包括本发明的混合物或酶的“鸡尾酒”)可以在该示例性方法的任何阶段加入。
【653】使用本发明的酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——的另一种示例性方法包括：通过一个或多个用大约0.4％至2％的强酸进行稀酸水解的阶段来处理含木质素纤维素的生物质材料；以及通过碱性去木质作用来处理酸水解的生物质材料的未反应的固体木质素纤维素成分，以产生可生物降解的热塑性塑料和衍生物的前体。参见例如美国专利6,409,841。本发明的酶可以在该示例性方法的任何阶段加入。
【654】使用本发明的酶——包括本发明的酶混合物或“鸡尾酒”——的另一种示例性方法包括：在预水解反应器中预水解木质素纤维素材料；向固体木质素纤维素材料加入酸性液体，制备混合物；将该混合物加热至反应温度；维持反应温度足够的时间，以将木质素纤维素材料分馏成含有至少大约20％的来自木质素纤维素材料的木质素的溶解部分以及含有纤维素的固体部分；当处于或接近固体部分中的纤维素变得更易于进行酶消化的反应温度时，从固体部分除去溶解部分；以及回收溶解部分。参见例如美国专利5,705,369。本发明的酶可以在该示例性方法的任何阶段加入。
【655】本发明提供了制备基于液体烃的发动机燃料组合物(例如，用于火花点火发动机)的方法，所述液体烃掺混有利用本发明的酶或方法制备的燃料级醇。在一方面，利用本发明的酶制造的燃料包括例如液体煤气-醇掺合物或液体天然气-醇掺合物。在一方面，共溶剂是生物质衍生的2-甲基四氢呋喃(MTHF)。参见，例如美国专利6,712,866。
【656】在一方面，用于木质素纤维素的酶促降解的本发明的方法，例如用于从木质素纤维素材料生产生物燃料(包括生物醇类，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的方法，还可以包括使用生物质材料的超声处理；参见，例如美国专利6,333,181。
【657】在另一方面，用于从纤维素基质生产生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的本发明的方法包括：提供以包含纤维素基质的浆的形式的反应混合物，本发明的酶和发酵剂(例如，在反应容器内，如半连续固体给料的生物反应器)，并且该反应混合物在足以引发和维持发酵反应(如在美国专利申请第20060014260号中所述)的条件下进行反应。在一方面，实验或理论计算可以确定最佳的给料频率。在一方面，额外数量的纤维素基质和酶以根据所述最佳给料频率的间隔(一次或多次)被提供到反应容器中。
【658】用于制造本发明的生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的一个示例性方法被描述在美国专利申请第20050069998；20020164730中；并且在一方面，包括如下的阶段：磨碎木质素纤维素生物质(例如磨碎到15-30毫米的大小)；使获得的产物在反应器中受到水蒸气爆炸预处理(例如，在190-230℃的温度)1到10分钟；在旋风分离器中收集预处理的材料或相关制造产物；并且通过在压滤机中过滤分离液体和固体部分，将所述固体部分引入到发酵沉淀物中并且加入一种或几种本发明的酶，例如纤维素酶和/或β-葡糖苷酶酶(例如，溶解在pH 4.8的柠檬酸盐缓冲液中)。
【659】应用本发明的酶制备包括生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇的本发明的生物燃料(包括生物醇，如生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇、或生物柴油)的另一个示例性方法包括：预处理包含木质素纤维素原料的起始材料，所述木质素纤维素原料至少含有半纤维素和纤维素。在一方面，起始材料包括马铃薯、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗或成分或废物或食品或饲料生产副产物。起始材料(“原料”)在破坏植物纤维结构以实现半纤维素和纤维素至少部分水解的条件下发生反应。破坏性条件可以包括，例如使起始材料在pH 0.5至2.5经受180℃至270℃的平均温度大约5秒至60分钟的时间；或在pH 0.5至2.5经受220℃至270℃的温度5秒至120秒的时间，或等同条件。这产生了以增加的可及性被酶例如本发明的纤维素酶消化的原料。美国专利6,090,595。
【660】利用本发明的酶水解木质素纤维素材料的示例性条件包括在大约30℃至48℃之间的温度下和/或大约4.0至6.0之间的pH下反应。其它示例性条件包括在大约30℃至60℃之间的温度下和/或大约4.0至8.0之间的pH。
【661】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用在生物质到燃料的转化中以及用在乙醇的生产中，例如如在PCT申请第WO0043496和WO8100857中所述。本申请的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于生产可以被转化为燃料乙醇的可发酵糖和含葡聚糖的生物质。
工业、钻井和能源应用
【662】本发明的方法和组合物(包括“酶鸡尾酒”——参见下文)可以被用在任何油和气的发现和/或钻探工艺中，或者用在任何油和气井的清洗和/或压裂工艺中；例如：
【663】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于改良任何植物来源的材料的粘度，例如该材料应用到油和气工业中。例如，在一方面，本发明的酶被用在油和气工业，其中瓜尔胶和改性的瓜尔豆被用在例如压裂流体和钻探泥浆中。本发明的酶可以被用于清洁油井，例如，在压裂后破坏压裂液中的高粘度或凝胶结构。在一方面，在这些应用中使用的本发明的酶具有高的热稳定性。在一方面，在这些应用中使用的本发明的酶抵抗地层中或者钻井过程产生的升高的温度。本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以被用于处理钻探泥浆(例如，用过的泥浆)。
【664】本发明的酶可以在组合物中使用，该组合物用于防止井孔滤网(wellbore screen)和割缝衬管(slotted liners)的产能系数损失，包括在将滤网和割缝衬管插入井孔之前它们与施加到井孔滤网或割缝衬管上的涂层一起使用，或用于在该涂层中，例如，如在美国专利申请第20050065037号中所述。
增加来自地下岩层的生产流体的流动
【665】本发明提供使用如此处描述的一种或多种酶或酶鸡尾酒(一种或多种)的方法，其中所述方法通过除去在生产作业过程中形成的粘性的、含淀粉的、破坏性流体来增加来自地下岩层(subterranean formation)的生产流体的流动；这些流体可以在包围已完成井孔的地下岩层内找到。因此，本发明的该方法产生能够从井孔流出的流体。本发明的该方法还解决破坏性流体的问题，该破坏性流体将来自地层的生产流体的流动降低到预期流速之下。在一方面，本发明提供：通过将含水流体和本发明的多肽混合来配制酶处理物(使用本发明的酶)；将酶处理物泵入到井孔内的期望位置；允许酶处理物降解粘性、含淀粉的、破坏性流体，因而流体可以从地下岩层中被移至井表面；并且其中酶处理物可以有效地攻击含多糖流体中的α葡糖苷键。
【666】本发明的地下岩层酶处理方法还可以包括(除了本发明的酶)使用其它酶的任何组合，其它酶例如淀粉酶、黄原胶酶、糖苷酶、纤维素酶、色氨酸酶或酪氨酸脱羧酶、漆酶、过氧化氢酶、漆酶、其它纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-漆酶、淀粉葡糖苷酶、其它葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂酶、磷脂酶、脂氧化酶、β-漆酶、内切-β-1，3(4)-漆酶、角质酶、过氧化物酶、其它淀粉酶、黄原胶酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木漆酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白水解酶、肽酶、蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、其它纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。
在钻井和采矿作业中的应用
【667】本发明也包括在井和钻井作业中使用本发明的酶(例如淀粉酶、黄原胶酶、糖苷酶和/或纤维素酶、木质素降解酶、α淀粉酶、β淀粉酶、葡糖淀粉酶、糊精酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、漆酶、木质素过氧化物酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、黄原胶裂解酶、黄原胶解聚酶、支链淀粉酶、地衣多糖酶、茯苓多糖酶、脂酶、蛋白水解酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、肽酶和/或过氧化氢酶)的方法，所述井和钻井作业例如气、油或其它钻井或采矿作业，包括任何油和气井洗涤和/或压裂过程。例如，在一方面，本发明的酶被用于增加生产流体从地下岩层例如井或矿的流动。在一方面，用于实践本发明的酶或酶混合物被用于去除可能具有破坏性的粘性的、含多糖的(例如含淀粉的)流体，例如在生产作业期间中形成的流体。这些含多糖的(例如，含淀粉的)流体可以在包围已完成井孔的地下岩层中找到。在一方面，本发明的酶或酶混合物被用在油井钻井流体中，以帮助带走钻探泥浆。
【668】在一方面，所述方法包括允许生产流体(包括本发明的酶或酶混合物)从井孔或矿中流出。该方法可以包括将来自地层的生产流体的流动降低到预期流速之下，并且通过将含水流体和本发明的多肽混合在一起配制成酶处理物。该方法可以包括将酶处理物泵入到井孔或其它已钻竖井(shaft)内的期望位置，并且允许酶处理物降解粘性、含多糖的、破坏性流体。该方法可以包括将流体从地下岩层移出至井或矿井表面。在一方面，所述酶处理物可以有效地攻击含多糖流体中的α葡糖苷键。在一方面，本发明的酶或酶混合物被用于矿钻探、钻井(例如，气或油井钻井)和类似作业，以例如在钻孔(井孔或竖井)的同时运走钻探泥浆。
【669】本发明的酶或酶混合物可以在任何井、竖井或矿钻探作业中使用，其中许多在本领域是熟知的。例如，本发明提供将本发明的酶或酶混合物——其在一方面可以包括油田或气田生产化学品——引入到包含油和/或气的岩层中，其包括将包含酶(在一方面，和化学品)的微乳液向下传递到生产井并且然后进入岩层中。在一方面，生产井受到“关井”(shut-in)处理，由此包含本发明酶的含水组合物在压力下被注入到生产井中，并被“挤压”入地层中，并保持在那里。参见，例如美国专利第6,581,687号。
【670】在一方面，本发明的酶和酶混合物——其被用在这些气、油或其它钻井或采矿作业中，或包括任何油和气井洗涤和/或压裂过程，在高的和低的pH和/或高温或低温下是有活性的，例如本发明的聚合物-降解或多糖-降解(“聚合物分解”)酶，其包括使用这些酶和其它酶的混合物，其它酶如淀粉酶、黄原胶酶、糖苷酶和/或纤维素酶、或木质素降解酶、α淀粉酶、β淀粉酶、葡糖淀粉酶、糊精酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、漆酶、木质素过氧化物酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、黄原胶裂解酶、黄原胶解聚酶、支链淀粉酶、地衣多糖酶、茯苓多糖酶、脂酶、蛋白水解酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、肽酶和/或过氧化氢酶，其包括使用这些酶和其它酶的“鸡尾酒”，在包括大约pH 6.5、pH 6、pH 5.5、pH 5、pH 4.5、pH 4.0、pH 3.5、pH 3.0或更低(更酸性的)的条件下，或在包括大约pH 7、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11.0、pH 11.5、pH 12、pH 12.5、或更高(更碱性的)的条件下，被用于这些过程是有活性的。在一方面，用于这些过程的本发明的酶或酶混合物在下列条件下是有活性的，所述条件包括在大约-100℃到大约-80℃、大约-80℃到大约-40℃、大约-40℃到大约-20℃、大约-20℃到大约0℃、大约0℃到大约37℃、大约0℃到大约5℃、大约5℃到大约15℃、大约15℃到大约25℃、大约25℃到大约37℃、大约37℃到大约45℃、大约45℃到大约55℃、大约55℃到大约70℃、大约70℃大约75℃、大约75℃到大约85℃、大约85℃到大约90℃、大约90℃到大约95℃、大约95℃到大约100℃、大约100℃到大约105℃、大约105℃到大约110℃、大约110℃到大约120℃、或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、120℃或更高的任何温度范围。
游离的和固定化的酶在水力压裂和钻井作业中的应用
【671】本发明提供了包括聚合物分解(聚合物降解)例如，多糖-降解酶的组合物和方法，所述酶是游离形式或是固定化的形式，例如，在例如颗粒、例如砂粒或陶瓷材料如烧结的铝土矿的涂层上的固定化形式。
【672】在一方面，所述组合物和方法包括聚合物分解(聚合物降解)例如，多糖-降解酶，所述酶在涂敷颗粒例如砂粒或陶瓷材料如烧结的铝土矿的树脂或相似材料之中或之上；这些颗粒(例如，砂粒)可以被用作水力压裂流体中的支持剂(proppant)。在一方面，用于实践本发明的支持剂是与水力压裂流体混合的分级颗粒，以在水力压裂处理之后保持裂缝张开。除了天然存在的砂粒之外，也可以使用人造的或特别设计的支持剂，如涂敷树脂的砂或高强度的陶瓷材料，如烧结的铝土矿。可以根据大小和球形度对支持剂材料进行分类，从而为流体从油层产生到井孔提供有效的管道。在砂粒沉淀到井裂缝和缝隙中之后，树脂结合的酶可以扩散出去并且作用在集中的和未分解的聚合物上，所述聚合物通常沉积在压裂作业完成时的地层表面上。因此，本发明的该方面可以有效地从压裂的油和气井去除多糖、黄原胶或瓜尔胶，例如瓜尔胶滤饼，和/或可以增加压裂带的渗透性。
【673】在一个实施方式中，在水力压裂操作期间中，大量的水、沙子、辅助化学品(包括本发明的酶和酶混合物)和基于多糖的聚合物(例如瓜尔胶和/或其衍生物)被混合并且在压力下被注入到油和/或气井中，以“压裂”周围的地层，并且增加气或油到井孔中的流动。如此处所述的酶和酶混合物可以被用于水解这些多糖聚合物并且降低流体(在水力压裂作业中使用)的粘度，以便更好的渗透到地层中和在作业结束时更有效地回流。
【674】在一个实施方式中，本发明的组合物和方法被用在原料聚合物(例如，基于多糖的聚合物，如瓜尔胶、黄原胶和/或它们的衍生物)的酶促水解中；本发明的实践可以解决这样的问题，即这些原料聚合物的酶促水解可能是不完全的，从而在水力压裂作业中使用的流体中留下一些“未分解”的聚合物。当流体水含量流失到地层时，流体变得更浓并且未分解的聚合物形成厚的滤饼；该滤饼堵塞地层孔并且减少了油或气到井孔中的流动——在一个实施方式中，本发明的组合物和方法被用于破碎这些滤饼堵塞物。
【675】压裂流体包括大量的沙子，一般称为支持剂。当流体被泵到井中时，支持剂沉到裂缝和裂隙中，并且防止它们闭合。这有助于增加地层的多孔性和渗透性，获得更好的气/油流动。经常用不同的工业树脂涂覆砂粒，以增加它们的机械强度并且防止它们在地层压力下被压碎。因此，在一个实施方式中，本发明提供了在沙子的涂覆材料的周围、里面或上面使用游离或固定化的聚合物降解(“聚合物分解”)酶的组合物和方法。在一方面，这是通过将酶夹带在树脂中或通过将酶固定在涂层表面上来完成。因而，在一方面，用于实践本发明的酶(一种或多种)可以与滤饼保持接触，从而持续水解集中的聚合物，从裂缝除去滤饼，并且增加压裂地层的渗透性。
【676】在一方面，本发明提供在钻井作业中使用这些描述的酶的方法，所述钻井作业例如典型的钻井作业，其中井通过用旋转钻头的抽油装置向地下钻一个5到30英寸(13-76厘米)直径的孔而产生。在孔钻成之后，比所述孔稍微小的钢管(套管)被放置在孔中，并用水泥固定。除了使潜在危险的高压区相互分开并且使其与表面分开之外，该套管为新钻的井孔提供了结构完整性。
【677】在这些区域被安全地分开并且地层用套管保护后，井可以用较小的钻头钻得更深(深到潜在更不稳定且更强烈的地层中)，并且也用尺寸较小的套管下套管。井可以具有2至5组逐渐更小的孔尺寸，其被钻在彼此的内部，每一个用套管固定。为了钻井，在旋转扭矩和在其上的钻铤压重辅助下，钻头使土破碎。钻井流体或“泥浆”，其包括游离形式或固定化形式的本发明的聚合物分解(聚合物降解)例如多糖降解酶和酶混合物，被向下泵到钻杆内。流体离开钻头并且帮助破碎岩石，在钻头上面保持压力，以及清洁、冷却并且润滑该钻头。
【678】随着钻井流体循环回到钻杆外的表面，产生的岩石“碎片”被钻井流体冲扫干净。包含游离形式或固定化形式的本发明的聚合物分解(聚合物降解)例如，多糖降解酶和酶混合物的流体，也可以在此阶段被加入。然后，该流体通过“振荡器”——其摇出切片到筛上，允许好的流体返回到坑槽(pit)中。包括游离形式或固定化形式的本发明的聚合物分解(聚合物降解)例如多糖降解酶和酶混合物的流体，也可以在此阶段被加入。通过加入游离形式或固定化形式的本发明的聚合物分解(聚合物降解)例如多糖降解酶和酶混合物，可以促进本发明的这些方法。钻机可以含有所有必需的设备以循环钻井流体，提升和旋转钻杆，控制井下压力，从钻井流体除去碎片，和为这些作业产生现场动力。
【679】可以用任何钻探泥浆或钻井流体(相对于更成熟的和定义明确的“泥浆”，一些人更喜欢保留术语“钻井流体”)或在作业中用于向地下钻井孔的任何流体，实践本发明的酶、酶混合物和方法。在钻探油和/或天然气井和钻机探测时，可以实践本发明的酶、酶混合物和方法，包括用于较简单的孔。
【680】本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于任何井或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，例如，其中使用任何泥浆，包括使用泥浆的三种主要分类方案的任何一种，其中“泥浆”被广义地应用并且基于组成泥浆的主要成分被分成3类：(1)“水基泥浆”(WBM)，其可以被细分成分散的和非分散的泥浆；(2)“非水的”或更普通地“油基的泥浆”(OBM)，其包括合成油(SBM)；和/或(3)气态的或气泥浆。本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于任何井或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，例如，也可以被用于下列井或与下列井一起应用：
生产井：一旦生产结构和特性被建立，则它们被钻井，主要用于生产油和气，
评价井：它们被用于评价被证实的烃积聚的性质(如流速)，
勘探井：它们被钻井纯粹是为了在一个新区域勘探性目的(信息收集)，
初探井(wildcat well)：基于大的希望，在对地表知之甚少的边远地区钻井。
【681】本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于任何井或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，例如，可以与如Hewson等人的美国专利申请公开第20070089910号中所述的方法、设备和/或钻井作业联合使用，所述美国专利申请描述了例如形成支持的地层井孔的方法和应用，例如容积式泥浆马达(positivedisplacement mud motor)。
【682】本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于Bohnsack；C等人的美国专利申请公开第20070084638中所述的方法、设备和/或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，所述美国专利申请描述了例如用来自容器的钻井流体促进沉淀的固体流动的系统，该系统包括：具有至少一个喷嘴的压力喷嘴装置，在压力下流体可从所述喷嘴中流出；动力旋转装置，用于选择性旋转压力喷嘴装置，因而当流体通过至少一个喷嘴被泵入容器中时，所述至少一个喷嘴在容器内是可移动的；和在一方面，平移装置，用于当流体在压力下被泵入到所述至少一个旋转喷嘴时，相对于所述容器移动所述压力喷嘴装置。也描述了泥浆罐和泥浆槽，并且本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于任何这些流体或与任何这些流体一起使用，和/或用于在这些类型的作业中使用的任何泥浆罐和泥浆槽。
本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于例如Csutak；S等人的美国专利申请公开第20070081157号中所述的方法、设备和/或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，所述美国专利申请描述了例如用于评估井下流体的性质的装置，该装置包括：紫外(UV)光源，用于将光感应到流体中，波长为产生拉曼散射光的波长，比响应于该感应光由流体反射的实质荧光的波长短；检测器，其检测拉曼散射光的光谱并且提供相应于检测到的光谱的信号；和处理器，其处理信号以提供所述流体性质的评估。本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于或与任何这些流体一起使用，和/或用在评估地层流体中过滤物污染的作业中。例如，这些方法包括以至少一种成分的多种波长检测拉曼散射，所述至少一种成分存在于非天然存在于该地层中的油基泥浆中，并且本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于帮助提高这种检测的精确性。
【683】本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于Chen，S等人的美国专利申请公开第20070075706号中所述的方法、设备和/或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，所述美国专利申请描述了例如评价地层的方法，其包括用井下工具在地层的井孔中进行测量；在进行测量的深度测量井下工具的天线的品质因素(Quality factor)；并且应用测量的Q和井孔中泥浆的电阻系数以及地层的电阻系数，和/或井孔大小指示器(BSI)，来评估另外的地层电阻系数和BSI，包括测量井孔中泥浆的电阻系数。本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于任何这些流体或与任何这些流体一起使用，和/或用于评价地层的作业中。本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于Barry，M.等人的美国专利申请公开第20070068675号中所述的方法、设备和/或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，所述美国专利申请描述了例如钻井和完成砾石填充井的方法，其包括用钻井流体钻出井孔，调节钻井流体，用调节的钻井流体运行砾石填充装配工具到井孔中的深度，并且用完井液(completion-fluid)砾石填充井孔层段。所述完井液可以与钻井流体相同。所述方法可以与替代途径滤砂网技术(alternate-path sand screen technology)结合以保证砾石填充的正确分布。用于钻井、砾石填充和滤砂网安装的合适流体对于完井(well completion)成功是必须的。需要仔细的计划、良好的准备和完井实施(completion execution)以增加完井生产率和寿命。通常，最少三种流体已经被用于钻井和完成砾石填充井。第一种流体是用于钻完井层段的带有固体的钻井流体。第二种流体是不含固体的完井流体，所述完井流体被用于在通常不含固体的环境中置换带有固体的钻井流体并且运行排砂设备和砾石填充工具。第三种流体是携砂液，用于在完井层段的砾石填充过程中运载砾石。本发明的酶、酶混合物和方法可以用于或与任何这些流体(包括带有固体的钻井流体、不含固体的完井流体和/携砂液)一起使用，和/或用于钻井和砾石填充井完井的作业中。
【684】本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于Bicerano；J等人的美国专利申请公开第20070066491号中所述的方法、设备和/或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，所述美国专利申请描述了将颗粒用于油和天然气井的建造、钻井、完井和/或压裂增产中；例如，用作支持剂部分的单层、支持剂装填物、砾石填充完井的完整成分、球轴承(ball bearing)、固体润滑剂、钻探泥浆成分和/或水泥添加剂，包括热固性聚合物颗粒的使用，用于需要具有高硬度、强度、耐温性和/或耐侵略性环境的轻质颗粒的应用。本发明的酶、酶混合物和方法可以用于这些砾石填充物、球轴承、固体润滑剂、钻探泥浆成分、水泥添加剂和/或描述的热固性聚合物颗粒的任何一种中，或与这些砾石填充物、球轴承、固体润滑剂、钻探泥浆成分、水泥添加剂和/或描述的热固性聚合物颗粒的任何一种一起使用。本发明的酶、酶混合物和方法可以用于纳米填料和/或纳米复合材料或与纳米填料和/或纳米复合材料一起使用，包括非均相的纳米复合材料形态。
【685】本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于Robertson；B等人的美国专利申请公开第20070039735号中所述的方法、设备和/或钻井作业中、与之结合使用和/或与之一起实施，所述美国专利申请描述了例如在地下岩层内密封可渗透的区域的方法，包括：制备包含油、粘土、氯化镁和氧化镁粉末的堵塞组合物；并且将所述堵塞组合物与地下岩层中的水接触，以使所述堵塞组合物形成密封物质，从而基本密封地下岩层内的可渗透区域。
【686】本发明的酶、酶混合物和方法可以用于可变密度钻探泥浆中、与之结合使用和/或与之一起实施，所述可变密度钻探泥浆包含可压缩的微粒材料，例如，如在Polizzotti；R.等人的美国专利申请公开第20070027036号所述。本发明的酶、酶混合物和方法可以被用于钻探泥浆或与钻探泥浆一起使用，所述钻探泥浆包括钻探泥浆中的可压缩的微粒材料，其中所述钻探泥浆的密度由于可压缩微粒材料的体积变化而变化，而体积相应于压力或温度变化而变化；并且其中可压缩微粒材料被配置来维持在孔压力梯度和压裂梯度之间的钻探泥浆的密度，这基于可压缩微粒材料的体积相应于在某些深度的压力变化而发生变化。
【687】本发明的酶、酶混合物和方法可以用于改变钻探泥浆的粘度——单独使用或与所描述的(参见，Polizzotti；R.等人)可压缩的材料联合使用，例如以使流体粘度在可泵性要求之内，和/或调节孔压力梯度和压裂梯度。本发明的酶、酶混合物和方法可以用于实现钻探泥浆的体积改变，例如，其中所述钻探泥浆的流变性质被配置为获得期望的复合钻探泥浆流变性质。
【688】在一方面，本发明的酶、酶混合物和方法可以用于改变钻探泥浆的性质，以提供期望的复合物泥浆凝胶点，例如，能够在钻井作业期间悬浮井孔环空中的岩石碎片的泥浆凝胶点；和/或用于与可压缩的中空物体联合或单独(不与中空物体联合)改变钻探泥浆的粘度(参见Polizzotti；R.等)，以改变可泵性要求。
【689】在一方面，本发明的酶、酶混合物和方法可以用于改变井流体的性质，所述井流体包括钻探泥浆、清井壁流体、修井液(workover fluid)、隔离液(spacerfluid)、砾石填充流体、酸化流体和/或压裂流体。在一方面，本发明的酶、酶混合物和方法被用于应用可变密度流体促进钻井、完井和/或刺激地下岩层，以及用于改变可变密度流体。
【690】在一方面，本发明的酶、酶混合物和方法被用于使用可变密度流体例如通过改变和/或“调节”流体的浓度，进行钻井、完井和/或刺激地下岩层的方法中；例如，包括下列步骤的方法(见Polizzotti；R等人)：将具有作为压力函数变化的密度的流体引入到地下岩层中，其中所述流体包括基液(base fluid)和一部分弹性颗粒；并且使用可变密度流体(其可以包括本发明的酶、酶混合物，或已经由本发明的方法改变)进行钻井、完井和/或刺激地下层。
【691】在一方面，本发明的酶、酶混合物和方法与美国专利第4,099,583号中描述的方法和组合物一起使用，所述美国专利描述了例如，双梯度钻井系统，其中较轻的流体被注入到泥浆返回环空(典型地在溢流口)中或其它途径以降低注入点以上的泥浆密度，并且本发明的酶、酶混合物和方法可以改变和/或“调节”该流体的密度。
【692】在一方面，本发明的酶、酶混合物和方法与美国专利第6,530,437号和6,588,501号；美国专利第6,422,326、6,156,708、5,910,467和5,881,826号中所描述的方法和组合物一起使用，美国专利第6,530,437号和6,588,501号描述了用于降低海底溢流口中的静水压的多梯度钻井方法和装置；美国专利第6,422,326、6,156,708、5,910,467和5,881,826号描述了加入各种流体aphrons(微泡沫钻井液)到钻井泥浆制剂中。
【693】在一方面，本发明的酶、酶混合物和方法和美国专利第6,497,289号中所述的方法和组合物一起使用，所述美国专利描述了固体可膨胀衬管的用途，例如，用作到达井中并膨胀的管系统。
【694】在可选的实施方式中，本发明的酶、酶混合物和方法被用于使钻探泥浆密度与深度相适应，以便在所有深度在孔压力和压裂梯度之间保持有效的泥浆重量。可以通过用本发明的酶、酶混合物和方法改变流体的性质来获得必需的泥浆密度的变化，以修改/改变体积和密度，从而引起相应于压力的变化。本发明的酶、酶混合物和方法可以与任何微粒成分一起使用，所述微粒成分例如各种形状，如球形、立方形、金字塔形、椭圆形或长球体形、圆柱形、枕形和/或其它形状或结构。本发明的酶、酶混合物和方法可以与任何微粒成分一起使用，例如，充满加压气体的可压缩中空物体，或可压缩固体材料或物体，如Polizzotti；R.等人在前所述。
【695】在可选的方面，本发明的酶、酶混合物和方法可以用于任何井或钻井作业或与其一起使用，例如包括定向钻井，有时称为斜钻井——钻非垂直的井；包括在定向钻井三大组的任何一组中使用；油田定向钻井，设备安装定向钻井(一般称为H.D.D/水平定向钻井/定向钻孔)；和/或矿层内定向钻井(in-seam directionaldrilling)(煤床甲烷(Coal-Bed methane))。
【696】在一方面，本发明的酶、酶混合物和方法可以与测井——一种在油和气工业中用于记录岩石和流体特性以在地壳内的地质层中找到烃区的技术——联合使用。可以进行测井来测量实践本发明的方法的效果，例如，将包含本发明的酶或酶混合物的流体泵到井中。测井程序可以包括：将金属线末端上的“测井工具”降到油井(或孔)中，以测量地层的岩石和流体特性。然后解释这些测量结果以定位和量化包含油和气(烃类)的潜在的深度区。测井工具已发展了多年，可测量岩石和其包含的流体的电学、声学、放射性、电磁以及其它性质。测井一般在测井工具被拉出孔时进行。该数据被记录到称为“测井图”(Well Log)的打印记录上，并且通常被数字化传送到办公室位置。测井在钻井期间不同层段进行，并且当钻到全部深度时进行，深度可以在300米到8000米(1000英尺到25000英尺)或者更深的范围。
【697】除了此处描述的方法、酶和酶混合物，用于实践本发明的方法、酶泥浆和其它钻井流体可以包括(使用)可含有膨润土(凝胶)的水基钻探泥浆，并且在一些方面，也可以包括添加剂如硫酸钡(重晶石)、碳酸钙(白垩)或赤铁矿。各种增稠剂也可以用于影响流体的粘度，例如木质素磺酸盐、黄原胶、瓜尔胶、乙二醇、羧甲基纤维素、聚阴离子纤维素(PAC)或淀粉。在此描述的用于实践本发明的酶或酶混合物可以用于改变流体的性质(例如流体的粘度)，例如以改变木质素磺酸盐、黄原胶、瓜尔胶、乙二醇、羧甲基纤维素、聚阴离子纤维素(PAC)或淀粉的性质。
【698】在此描述的用于实践本发明的方法、酶或酶混合物可以用于改变下述物质的性质：抗絮凝剂，其被用于降低粘土基泥浆的粘度；阴离子聚电解质，例如丙烯酸盐、多磷酸盐、木质素磺酸盐(Lig)或鞣酸衍生物，如白雀树皮(Quebracho)(红色泥浆是白雀树皮基混合物的名称，按红色鞣酸盐的颜色命名；其一般在二十世纪四十年代至五十年代使用，随后在可以利用木质素磺酸盐时被废弃)。
【699】在此描述的用于实践本发明的方法、酶或酶混合物可以被用在(例如，被加到)水注射剂中，用于将水注射到层中，或者用于保持油层压力或仅仅除掉烃产生的水(例如，因为即使在处理之后，其将含太多油或含太多盐而不被认为清洁以便倾倒，例如，在海岸油井的情况下倾倒到船外或倾倒到新鲜水源中)。因此，本发明的方法和组合物(例如酶混合物、固定化的酶)与水注射一起用作为油层管理和产生水的处理的元素。
在此描述的用于实践本发明的方法、酶或酶混合物可以被用于(例如被加到)蓄水层产生处(aquifer producer)中，例如有意产生用于再注入的储层水(reservoirwater)(例如，在井孔中)以控制压力；这有效地将储层水从其没有用的地方转移到其更有用的地方。这些井通常只有在油或气产生处产生的水不足以用于油层控制目的时才被使用。因此，在一方面，本发明的方法和组合物(例如酶混合物、固定化的酶)与蓄水层产生的水和/或海水一起使用。
改变木质素磺酸盐或磺化木质素的性质
【700】在此描述的用于实践本发明的方法、酶或酶混合物可以用于在任何过程中改变木质素磺酸盐或磺化木质素的性质。例如，在此描述的用于实践本发明的方法、酶或酶混合物可以用于改变任何水溶性阴离子聚电解质聚合物的性质，所述阴离子聚电解质聚合物包括用于生产木浆的酸式亚硫酸盐和/或亚硫酸盐方法的磺化木质素和木质素副产品，包括“黑液”。
【701】在此描述的用于实践本发明的方法、酶或酶混合物可以用于改变木质素磺酸盐的性质，所述木质素磺酸盐被用作在油钻井中使用的钻井泥浆中的抗絮凝剂(其中它替换了Quebracho)。在可选的实施方式中，在此描述的用于实践本发明的方法、酶或酶混合物可以用于改变在水泥工业中作为生料浆(raw mix slurry)的抗絮凝剂的木质素磺酸盐；在混凝土中用作增塑剂和/或用作乳液稳定剂。
增稠、悬浮和稳定含水系统
【702】本发明提供了在商业-工业过程中使用多糖增稠、悬浮或稳定含水系统的方法。例如，在一方面，本发明的方法被用于改变或调节印染浆中的多糖聚合物和表面活性剂的性质。在一方面，本发明的方法用于改变或调节多糖聚合物和表面活性剂的性质以产生凝胶并且充当絮凝物、粘合剂、润滑剂，以用作膜性质的改性剂。
【703】在一方面，本发明的组合物和方法用于改变或调节多糖聚合物和表面活性剂的性质，所述多糖聚合物和表面活性剂充当例如絮凝物、粘合剂、润滑剂、膜和/或凝胶的流变参数调节剂。
【704】在一方面，本发明的组合物和方法用于改变或调节多糖聚合物和表面活性剂的性质，所述多糖聚合物和表面活性剂在分散剂、润湿剂、乳化剂和防沫剂中充当絮凝物、粘合剂、润滑剂和/或表面活性剂。在一方面，本发明的方法用于改变或调节多糖聚合物和表面活性剂的性质，所述多糖聚合物和表面活性剂以不同浓度和温度下使用的不同取代水平和不同制造者改性多糖增稠剂如瓜尔胶的性质。
其它的工业、医学、农业、研究应用
【705】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以用于广泛的工业、研究、农业和医学应用，包括本文描述的那些应用，以及除本文描述的那些应用外，应用于洗涤剂、处理纺织品或纤维、处理或制备食物、动物饲料和饮料、处理废物、口腔护理产品、医学和研究应用、生物质转化应用、用于例如油和气的钻井应用和类似的应用。
【706】在一方面，本发明的组合物和方法用于改性用作阻垢剂和分散剂的多糖聚合物，其中改性的聚合物被用于在含水系统中使用的组合物中，例如用于洗涤剂制剂、水处理、分散剂和油田应用中以及用作纤维玻璃粘合剂，例如在Rodrigues；K等人的美国专利申请公开第20070015678号中所述的。在一方面，本发明的组合物和方法和助洗剂、表面活性剂、酶、溶剂、水溶助长剂、填充剂、漂白剂、香料和/或着色剂一起用于含水系统中，例如用于洗涤剂制剂、水处理、分散剂和油田应用中以及用作纤维玻璃粘合剂。在一方面，本发明的组合物和方法用于改性多糖聚合物，所述多糖聚合物用于含水系统，如锅炉水或蒸汽产生系统、冷却水系统、气体擦洗系统、纸浆和造纸厂系统、脱盐系统、织物、餐具和硬表面清洁系统以及在气、油和地热井生产期间遇到的井下系统中。
【707】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以用于许多其它的应用。例如，可选的用途包括采用本发明的组合物(例如，探针和抗体)和筛选方法来鉴定和/或分离新的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶；这些新的酶通过筛选现有的文库(例如，DNA文库)和由不同环境来源构建的文库被发现，所述由不同环境来源构建的文库包括从嗜温和中等嗜热地点以及从目标来源包括消化道菌群、海洋微生物、动物粪便、土壤细菌和高碱性生境构建的文库。应用动物饲料物质中含葡聚糖的基质和/或不溶性多糖部分的生物陷阱(biotrap)和初级富集策略也是有用的；参见例如美国专利第7,018,793；6,790,605；6,361,974；5,939,250号。
【708】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶可以与涉及纤维素消化的其它的酶如纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶联合使用，参见本发明的酶“鸡尾酒”的讨论，如本文所述。
【709】本发明的酶可以用于改善产奶奶牛中乳蛋白生产的质量和数量(参见例如，Kung，L.等人，J.Dairy Science，2000 Jan 83：115-122)，增加猪的胃和小肠中可溶性糖类的数量(参见例如，van der Meulen，J.等人，Arch.Tierernahr，200154：101-115)，提高母鸡的后期鸡蛋生产效率和鸡蛋产量(参见例如，Jaroni，D.，等人，Poult.Sci.，1999 June 78：841-847)。
【710】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的另外的用途包括：在水溶性膳食纤维中的用途(参见例如，美国专利第5,622,738号)；在改善淀粉的滤过性、分离和生产中的用途(参见例如，美国专利第4,960,705和5,023,176号)；在促进家畜分泌奶和改善奶质量的酶组合物中的用途(参见例如，美国专利第4,144,354号)；在减少植物材料的粘度中的用途(参见例如，美国专利第5,874,274)。
【711】本发明的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶的各种用途包括：产乙醇的微生物的转化(参见例如，PCT申请第WO99/46362号)，酿酒单宁和酶组合物的生产(参见例如，PCT申请第WO0164830号)，刺激植物的自然防御(参见例如，PCT申请第WO0130161号)，从半纤维素基质生产糖(参见例如，PCT申请第WO9203541号)，水果、蔬菜、含泥浆或粘土的土壤的清洁(参见例如，PCT申请第WO9613568号)，清洁啤酒过滤膜(参见例如，PCT申请第WO9623579号)，用于杀死或抑制微生物细胞的方法(参见例如，PCT申请第WO9732480号)以及用于通过应用两次UV吸收测量值之比并且比较光谱，确定来自木浆漂白的工艺水的特征(参见例如，PCT申请第WO9840721号)。
【712】本发明的酶可以用于空气和/或水净化系统，例如，用于空气或水过滤介质和系统，如，例如在美国专利申请第20060117958号中所述，该美国专利申请描述了具有与耐水性和防水性有关的干拉伸强度、湿拉伸强度的空气净化系统，并且显示了应用酶反应(如本发明的酶)的杀菌/灭菌或抗菌方法的性质。
【713】两种筛选模式(基于活性的和基于序列的)被用于发现新的葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。基于活性的方法是应用底物如AZO-大麦β葡聚糖(Megazyme)在琼脂板上直接筛选葡聚糖酶活性。可选地，可以使用基于序列的方法，其依赖于生物信息学和分子生物学来设计探针，用于杂交和生物筛选。参见例如，美国专利第6,054,267、6,030,779、6,368,798、6,344,328号。对来自筛选的命中(hit)进行纯化、测序、表征(例如，确定最佳的特异性、温度和pH)，应用生物信息学进行分析，亚克隆并且表达，以获得基本的生物化学表征。这些方法可以用于筛选葡聚糖酶(或纤维素酶)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶，上述酶可用于大量的应用中，包括面团调理和用作动物饲料添加剂酶。
【714】在表征从筛选获得的酶时，可以评价其在面团加工和烘焙应用中的示例性应用。表征可以包括，例如底物特异性的测量(葡聚糖、CMC、BBG)、温度和pH稳定性以及比活性。商业上的酶可以用作基准。在一方面，本发明的酶在pH≥7和25-36℃具有显著的活性，对不溶性的葡聚糖没有活性，在50-67％的蔗糖中稳定并具有活性。
【715】在另一方面，可以从候选酶的表征评价作为饲料添加剂的效用。表征可以包括例如底物特异性的测量(葡聚糖、CMC、BBG)、温度和pH稳定性、比活性以及胃稳定性。在一方面，饲料被设计用于单胃动物，并且在另一方面，饲料被设计用于反刍动物。在一方面，本发明的酶在pH 2-4和35-40℃具有显著的活性，在胃酸中半衰期为30分钟以上，在85℃制剂(在缓冲液或细胞中)半衰期为5分钟以上并且被用作单胃动物饲料添加剂。在另一方面，本发明的酶具有下列特征的一个或多个：在pH 6.5-7.0和35-40℃具有显著的活性，在瘤胃液中半衰期为30分钟以上，制剂稳定性如干粉一样稳定并且被用作反刍动物饲料添加剂。
【716】酶对广泛的天然和非天然底物有活性，因而使得能够对实质上任何有机铅化合物进行改性。此外，不象传统的化学催化剂，酶是高度对映异构-和区域选择性的。酶所显示的高度的官能团特异性使技术人员能够跟踪生成新的活性化合物的合成顺序中的每一个反应。酶也能够催化与它们在自然界中的生理功能无关的多种不同的反应。例如，过氧化物酶催化苯酚被过氧化氢的氧化。过氧化物酶也可以催化与该酶的天然功能无关的羟基化反应。其它的例子是催化多肽分解的葡聚糖酶。在有机溶液中，一些葡聚糖酶还可以对糖进行酰化，这是与这些酶的天然功能无关的功能。
【717】本发明利用了酶的独特催化性质。鉴于生物催化剂(即，纯化的或粗的酶，无生命的或活的细胞)在化学转化中的应用通常需要鉴定与具体起始化合物反应的特定生物催化剂，本发明利用了对存在于许多起始化合物中的官能团特异的经选择的生物催化剂和反应条件。每一种生物催化剂对于一种官能团或几种相关的官能团是特异的，并且能够与许多包含这种官能团的起始化合物反应。生物催化反应从单一起始化合物产生衍生物群。这些衍生物可以进行另一轮生物催化反应，以产生第二个衍生化合物群。每一次生物催化衍生化的重复，可以产生数以千计的原始化合物的变异。
【718】酶在起始化合物的特异位点反应而不影响该分子的其余部分，这是使用传统的化学方法非常难以达到的过程。这种高度的生物催化特异性提供了鉴定文库内单个活性化合物的方法。所述文库由一系列用于产生该文库的生物催化反应来表征，即所谓的“生物合成历史”。就生物学活性筛选文库和追踪生物合成历史鉴定出产生活性化合物的具体反应顺序。重复该反应序列并且确定所合成的化合物的结构。不象其它的合成和筛选方法，这种鉴定方式不需要固定技术，以及化合物可以被合成并应用实际上任何类型的筛选试验在溶液中被自由测试。重要的是，注意到，酶反应对于官能团的高度特异性允许追踪生成生物催化产生的文库的特异酶促反应。
【719】许多程序步骤应用机器人自动化进行，机器人自动化使每天能够执行数以千计的生物催化反应和筛选试验，并确保高水平的正确性和重复性。结果，衍生化合物文库可以在数周内产生，而使用目前的化学方法将需要数年产生该衍生文库。(对于分子修饰，包括对小分子修饰的进一步教导，参见PCT/US94/09174)。
酶鸡尾酒或混合物
【720】在可选的实施方式中，本发明的任何组合物、方法、产品或工艺可以包括一种或任何其它酶(一种或多种)的任何组合，或本发明的多种酶的混合物，或与同类或不同类的其它酶的混合物：所谓的本发明的“酶鸡尾酒”。这些酶混合物或鸡尾酒可以包括例如其它的葡聚糖酶、其它的甘露聚糖酶、其它的木聚糖酶、任何水解酶(例如，蛋白水解酶、酯酶等)、过氧化氢酶、葡聚糖酶、纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂酶、酯酶、磷脂酶、脂氧化酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、果胶酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、肌醇六磷酸酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶——它们的任何组合。
【721】例如，如上所述，本发明的“酶鸡尾酒”可以用于油或气钻探工艺，例如，地下岩层酶处理方法，其包括使用至少一种本发明的酶和任何其它酶(一种或多种)的任何组合，所述任何其它酶诸如淀粉酶、黄原胶酶、糖苷酶、纤维素酶、色氨酸酶或酪氨酸脱羧酶、漆酶、过氧化氢酶、漆酶、其它的纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-漆酶、淀粉葡糖苷酶、其它的葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂酶、磷脂酶、脂氧化酶、β-漆酶、内切-β-1，3(4)-漆酶、角质酶、过氧化物酶、其它的淀粉酶、黄原胶酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、肽酶、蛋白水解酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、其它的纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。
【722】本发明将关于下列实施例进行进一步描述；然而，应理解，本发明不限于这样的实施例。
实施例
实施例1：基于平板的内切糖苷酶发现：表达筛选
【723】下列实施例显示了本发明的示例性酶和核酸的分离和酶活性的确定。这些试验也可以用于确定多肽是否具有在本发明的范围内的必需的酶(例如，葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)活性。
λ文库的滴度测定：将1.0μL的λZap Express扩增的文库储液加入600μL大肠杆菌MRF细胞(OD600＝1.0)中。用10mM MgSO4稀释MRF储液。在37℃温育混合物15分钟，然后将悬液转移到5-6毫升50℃的NZY顶层琼脂并轻轻混合。立即将琼脂溶液倾倒到大的(150毫米)NZY培养平板上，并且使顶层琼脂完全固化(大约30分钟)。颠倒平板。将平板在39℃温育8-12小时。(估计噬菌斑的数目。噬菌体滴度确定为产生50,000pfu/平板。如果需要，用SM缓冲液稀释文库噬菌体的等分试样)。
底物筛选：将来自扩增文库的λZap Express(50,000pfu)加入到600μL大肠杆菌MRF细胞(OD600＝1.0)中并且在37℃温育15分钟。当噬菌体/细胞悬液温育时，加入1.0毫升期望的多糖染料标记的底物(通常1-2w/v)到5.0毫升50℃ NZY顶层琼脂并充分混合。(溶液保持在50℃直到需要)。将细胞悬液转移到底物/顶层琼脂溶液并且轻轻地混合。立即将溶液倾倒到大的(150毫米)NZY培养基平板上。使顶层琼脂完全固化(大约30分钟)，然后颠倒平板。将平板在39℃温育8-12小时。观测平板上噬菌斑周围的清澈区域(晕)。将具有晕的噬菌斑从琼脂挖出，并且转移到无菌的微管(200微升的大孔移液管头很好地移取(挖出)含有期望噬菌斑的琼脂块)。将噬菌体重悬在500μL SM缓冲液中。加入20μL氯仿，以抑制任何进一步的细胞生长。
纯克隆的分离：将5μL重悬的噬菌体悬液加入500μL大肠杆菌MRF细胞(OD600＝1.0)。在37℃温育15分钟。当噬菌体/细胞悬液温育时，加入600μL期望的多糖染料标记的底物(通常1-2w/v)到3.0毫升50℃ NZY顶层琼脂并且完全混合。(溶液保持在50℃直到需要)。将细胞悬液转移到底物/顶层琼脂溶液并且轻轻地混合。立即将溶液倾倒到小的(90毫米)NZY培养基平板上并且使顶层琼脂完全固化(大约30分钟)，然后颠倒平板。将平板在39℃温育8-12小时。观察单个噬菌斑(纯克隆)周围的清澈区域(晕)。(如果单个的噬菌斑不能分开，则调整滴度并且重铺噬菌体悬液)。将噬菌体重悬在500μL SM缓冲液中并加入20μL氯仿，以抑制任何进一步的细胞生长。
纯克隆的切取：使纯的噬菌体悬液在室温温育2到3小时或在4℃温育过夜。将100μL纯的噬菌体悬液加入到200μL大肠杆菌MRF细胞(OD600＝1.0)中。加入1μL ExAssist辅助噬菌体(1×106pfu/mL；Stratagene)。在37℃温育悬浮液15分钟。将3.0毫升2×YT培养基加入到细胞悬浮液。在37℃温育2-2.5小时，同时摇动。将管转移到70℃ 20分钟。将50-100μL的噬菌粒悬液转移到含有200μL大肠杆菌Exp 505细胞(OD600＝1.0)的管中。在37℃温育悬浮液45分钟。将100μL细胞悬液平铺到LBkan50培养基上(具有50μg/ml的卡那霉素的LB培养基)。将平板在37℃温育8-12小时。观测平板上的克隆。任何生长的克隆都包括纯的噬菌粒。挑选克隆，并使小量(3-10毫升)液体培养物生长8-12小时。培养基为液体LBkan50。
活性确定：将1.0ml液体培养物转移入无菌微管中。以13200rpm(16000g’s)离心1分钟。丢弃上清液并且加入200μL pH6.2的磷酸盐缓冲液。使用微枪头在冰上超声处理5至10秒钟。加入200μL合适的底物，轻轻混合并且在37℃温育1.5-2小时。只含有缓冲液和底物的阴性对照也应该进行温育。加入1.0毫升无水乙醇(200标准强度)到悬液并且混合。以13200rpm离心10分钟。观察上清液的颜色。着色的量可能变化，但是任何具有比对照更多着色的管被认为是活性阳性的。如果非常期望或需要，分光光度计可以用于此步骤(对于Azo-大麦β葡聚糖，Megazyme，在590nm读数)。
来自相同文库的纯克隆的RFLP：将1.0毫升的液体培养物转移到无菌微管中。以13200rpm(16000g)离心1分钟。根据QIAprep旋转迷你试剂盒(QIAprep spinmini kit)(Qiagen)的质粒分离方案，使用40μL纯净水(holy water)作为洗脱缓冲液。将10μL质粒DNA转移到无菌微管中。加入1.5μL缓冲液3(New England Biolabs)，1.5μL 100×BSA溶液(New England Biolabs)和2.0μL纯净水。向此混合物加入1.0μL Not I和1.0μL Pst I限制性内切核酸酶(New England Biolabs)。在37℃温育1.5小时。加入3.0μL 6×加样缓冲液(Invitrogen)。15μL消化的样品在1.0％琼脂糖凝胶上在120伏特下跑胶1-1.5小时。用凝胶成像仪观看该凝胶。用不同的消化模式对所有克隆进行序列分析。
【724】图5是含有本发明SEQ ID NO：2的示例性“亲本”酶的表征的表，包括总结了本发明的几种示例性酶在不同条件例如变化的pH和温度下的相对活性，如上面所讨论的。
实施例2：活性分析
【725】下列实施例显示了本发明的示例性酶的酶活性。这些试验也可以用于确定多肽是否具有在本发明的范围之内的必需的酶(例如，葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)活性。
【726】本发明的多肽被显示具有葡聚糖酶活性，如下所述。应用BCA还原糖试验确定了对大麦β-葡聚糖(BBG)或羧甲基纤维素(CMC)的比活性。1单位(U)的葡聚糖酶活性＝在37℃，pH 5.3释放的1微摩尔/分钟-1葡萄糖还原等价物。
Figure A20078003687102651
【727】本发明的示例性多肽在各种最适pH和温度时，显示具有碱性内切葡聚糖酶/纤维素酶活性。可以应用纤维素酶活性试验(BCA还原性终产物试验(BCAreducing ends assay))测定活性，如在下面实施例3中详细描述的。
实施例3：纤维素活性分析：BCA还原终产物分析
【728】下列实施例描述了试验，纤维素酶活性试验(BCA还原性终产物试验)，其可以用于确定多肽是否具有在本发明的范围之内的必需的酶(例如，葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)活性，例如碱性内切葡聚糖酶/纤维素酶活性(参见上面的实施例2)。
【729】设计本试验以测量在以高通量多样品96-孔格式酶促降解羧甲基纤维素(CMC)期间产生的还原性终产物的量。
材料：
【730】底物溶液：
1％CMC
在100ml的pH～4的50Mm Britton-Robinson缓冲液中溶解1gm CMC，在沸水浴中加热CMC溶液，并同时混合20-40分钟，直到其溶解(溶液将仍然呈现轻微的乳状，但是半透明的)。用1M NaOH或HCl调节到期望的pH。
溶液A：
64毫克/毫升碳酸钠一水合物
24毫克/毫升碳酸氢钠
1.95毫克/毫升BCA(4，4’-二羧基-2，2’-联喹啉二钠盐(Sigma Chemical分类号D-8284)
将上述物质加入到蒸馏水(dH20)中，
可能需要加热溶解BCA，加热不超过～80℃。
溶液B：
1.24毫克/毫升硫酸铜五水合物
1.26毫克/毫升L-丝氨酸
将上述物质加入到蒸馏水中。
【731】工作试剂：
1∶1的溶液A和B，每天制备新鲜的工作试剂混合物(通常只制备足够用于每次试验的量)，每周制备新鲜的溶液A和B。
葡萄糖储存溶液：
10mM葡萄糖在dH2O中。0.2μM滤器过滤，于4℃储存。
葡萄糖标准品：
在期望的pH，在1％CMC中稀释10mM葡萄糖储液；至0、100、200、300、400、500μM的终浓度。由于通过将10μl的标准品加入到工作试剂中确定曲线，其计算出0-0.005微摩尔葡萄糖/孔。需要对每一平板的样品时间点，产生标准曲线，这是因为加热周期可能影响观察到的信号的量。
方法：
设置：
【732】将1毫升的底物溶液(1％CMC)等分分装到深孔板(如果使用环境温度)或加热块(hot-block)中的Acme管，在加热块或加热的水浴中平衡至期望的温度(～5分钟)。
【733】当溶液平衡时，制备10毫升的工作试剂并且将100μL等分分装到96孔PCR板中。将板放置在冰上。
反应/取样
【734】在温度平衡完成之后，向底物溶液加入酶溶液。立即通过上/下吸移混合。立即将10μL等分分装到PCR板中(这是t＝0，零时间点)。在每一期望的时间点(例如，0、2、5、10、15、20、30分钟)将10μL等分分装到PCR板中。
【735】板上最后一排不加入10μL葡萄糖标准品(即，在孔中应该只具有100μL工作试剂)。
分析显色：
【736】当收集所有的时间点并加入标准品时，覆盖板并使用PCR仪加热至100℃ 10分钟。在冰上冷却板5-10分钟(或设置PCR仪至1℃ 10分钟)。
【737】向孔中加入100μL水。混合。将100μL混合物等分分装到透明的平底96孔板中并且在560nm读取吸光度。
产生标准曲线：
【738】绘制A560对葡萄糖微摩尔数的图，所述葡萄糖来自含葡萄糖标准品的孔。采用线性回归计算斜率(S标准品)。
产生反应斜率的图
【739】绘制A560对时间点的图。根据每一样品自己的T＝0，调整每一样品的时间点(即，从同一样品的所有其它时间点减去样品的T＝0吸光度)。
产生每一组样品时间点(A560/时间)的斜率(Srxn)。
活性测定
【740】Srxn除以Sstd并且乘以100(因为检测的产物微摩尔数是在试验中使用的10μL中的还原性终产物的量，不是在1毫升酶反应中产生的总量)。
比活性测定
【741】活性(单位为微摩尔/分钟)除以加入到1毫升反应中的蛋白质的总毫克数。通过Bradford或类似试验测定蛋白质浓度。
蛋白质浓度除以使用的任何稀释度。
乘以在反应中使用的体积(毫升)。
所有的点应该重复两次，重复三次更好。
下述表列出了一组示例性的数据(“样品数据”)，其在图6中以图的形式作为“标准曲线”图解说明。
样品数据
  日期   mg/ml   稀释   ul/rxn   0分钟   5分钟   8分钟   12分钟   24分钟   36分钟   45分钟
 Enzx   06/09   20   500   20   0.1252   0.1654   0.1889   0.2315   0.3386   0.4036   0.4695
标准曲线的斜率：                        88.375 A560/微摩尔葡萄糖
反应的斜率                              0.0076 A560/分钟
活性(反应斜率/标准斜率)：               8.70061E-05微摩尔/分钟
真实活性/1ml rxn(＝活性×100)：         0.0087微摩尔/分钟
比活性：                                10.87微摩尔/分钟，毫克
实施例4：酶活性试验
【742】下列实施例描述了示例性酶活性试验，并且提供了显示/确定本发明的示例性酶的酶活性的数据。这些试验也可以用于确定多肽是否具有在本发明的范围之内的必需的酶(例如葡聚糖酶(或纤维素酶)，例如内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、黄原胶酶和/或糖苷酶，例如纤维二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)活性。例如，本发明的酶可以催化下述物质的水解：大麦和/或燕麦葡聚糖和/或半乳甘露聚糖(由甘露糖骨架和半乳糖侧基组成的多糖；底物的更具体的例子包括(1-4)-联接的β-D-吡喃甘露糖骨架，其具有来自它们联接到α-D-半乳糖的6-位的支化点，即，1，6-联接的α-D吡喃半乳糖；例如，如在瓜尔胶、tara、刺槐豆胶或角豆胶或葫芦巴(Trigonella foenum-graecum)中发现的)。在另一方面，应用葡聚糖酶底物(它们中的许多在本领域是熟知的)，例如含有大麦和/或燕麦葡聚糖和/或半乳甘露聚糖的组合物，测试酶以确定它们是否在本发明的范围之内。
由SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶的比活性
【743】应用下列方案，证明具有如在“亲本”SEQ ID NO：2(由例如SEQ ID NO：1编码的)中列出的序列的本发明示例性酶的比活性：
【744】应用离子交换层析将由“亲本”SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶纯化为具有均一性。采用BCA还原糖试验，在37℃在pH 5.3的50mM醋酸钠缓冲液中于1％底物上测定比活性。1单位(U)的葡聚糖酶活性＝在37℃，pH 5.3释放的1摩尔/分钟葡萄糖还原等价物。
o大麦β葡聚糖(BBG)：30U/mg
o燕麦β葡聚糖(OBG)：38U/mg
o羧甲基纤维素(CMC)：40U/mg
o豆角半乳甘露聚糖：0.3U/mg
SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶的温度曲线
【745】在三种独立的底物(BBG、OBG和CMC)上测定温度曲线。由“亲本”SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶在较高的温度具有最高的活性。SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶在80℃时在BBG和CMC上的比活性比在37℃见到的活性好10倍。在甘露聚糖存在的情况下，SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶在100℃显示了最高的活性，如图7所示。
【746】通过在底物(CMC、BBG或甘露聚糖)存在的情况下温育SEQ ID NO：2(由SEQ ID NO：1编码)来测定温度曲线。应用BCA还原糖试验和醋酸钠缓冲液pH 5.3测定起始速率。标准化起始速率，并且以％活性作图，如图7中所说明的。
SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶的半衰期测定
【747】在85℃和90℃测定“亲本”SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶的半衰期。在85℃和90℃热攻击SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶不同的时间，并且在37℃测量残余活性。SEQ ID NO：2编码的葡聚糖酶在85℃温育10分钟后，其活性保留了60％以上。在90℃，2分钟后没有残余活性留下，如图8所示。
【748】如图8所示，通过在指定温度(85℃和90℃)加热攻击酶30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟和10分钟，测定SEQ ID NO：2(由SEQ ID NO：1编码)的半衰期，并且采用BCA还原糖在标准条件下监测活性。
实施例5：酶活性分析
【749】下列实施例描述了本发明的示例性的酶、“亲本”或“野生型”SEQ IDNO：2的变体以及表明它们的活性的数据。本发明提供了对“亲本”(或“野生型”)SEQ ID NO：2(由SEQ ID NO：1编码)具有特定残基变化的序列，如上面表1中(部分)和下面表2中总结的，和：
MGVDPFERNKILGRGINIGNALEAPNEGDWGVVIKDEFFDIIKEAGFSHVRIP
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          ↓↓↓               ↓  ↓
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表2
  位置：   38   61   69   70   71   94   166   183   191   212   231   276   277   280   297   301
  突变：   Y   Q   E   P   S   Q   V   R   A   P   V   A   S   G   P   Q
  7X   Y   Q   E   Q   R   A   A
  10X-1   Y   Q   E   Q   V   R   A   P   A   G
  10X-2   Y   Q   E   Q   V   A   P   A   G   P
  11X-1   Y   Q   E   Q   V   R   A   P   A   G   P
  11X-2   Q   E   Q   V   R   A   P   A   G   P   Q
  12X-1   Q   E   S   Q   V   R   A   P   A   G   P   Q
  12X-2   Y   Q   E   S   Q   R   A   P   A   G   P   Q
  12X-3   Q   P   S   Q   V   R   A   P   A   G   P   Q
  12X-4   Y   Q   S   Q   V   R   A   P   A   G   P   Q
  12X-5   Q   E   P   Q   V   R   A   P   A   G   P   Q
  12X-6   Q   E   P   S   V   R   A   D   A   G   P   Q
  12X-7   Q   E   Q   V   R   A   P   V   A   G   P   Q
  13X-1   Y   Q   E   S   V   R   A   P   V   A   G   P   Q
  13X-2   Y   Q   E   P   S   Q   V   A   P   A   G   P   Q
  13X-3   Y   Q   P   S   Q   V   R   A   P   A   G   P   Q
  13X-4   Y   Q   E   P   Q   V   R   A   D   V   A   G   P
  13X-5   Y   Q   E   P   S   Q   V   R   A   A   G   P   Q
  13X-6   Y   Q   E   P   Q   V   R   A   P   A   S   G   P
  13X-7   Y   Q   E   P   S   Q   R   A   P   A   G   P   Q
  14X   Y   Q   E   P   S   Q   V   R   A   P   V   A   G   P
【750】相比亲本“野生型”SEQ ID NO：2和表2的酶变体亚组(所谓的“7×变体“)，使用的纯化的酶，测量示例性变体的热耐受性，如图9和图10所示；其中所说明的数据表明所测试的示例性多肽(亲本或“野生型”SEQ ID NO：2的变体)在96℃到100℃的热耐受性。在这些图中，纯化的酶在图中显示的温度被加热30分钟，并在37℃测量残留(耐热)活性。在84℃到95℃之间的加热温度轻微地激活“耐热”变体(亲本或“野生型”SEQ ID NO：2的变体)，导致具有比初始活性水平高的残留(耐热的)活性(即大于100％)(可能由于在冷却时改善的折叠所致)。如此，残余活性被归一化至100％。图9图解说明了除了野生型以外的被标识为“10X-1”、“12X-1”、“13X-1”、“12X-6”、“11X-1”、“11X-2”和“7X”的本发明酶的这些耐热性研究数据的图形概要；图10是图9的一部分的特写图。
【751】因此，在一方面，本发明的酶是耐热的和/或热稳定的；例如，本发明的酶可以在95℃2分钟之后保留至少75％的残余活性(例如，葡聚糖酶活性)；并且在另一方面，在95℃加热30分钟之后保留100％的活性。而在另一方面，本发明的酶在96℃、97℃、98℃或99℃加热30分钟之后保留100％的活性。仍在另一方面，本发明的酶在100℃加热30分钟之后保留至少90％的活性。
【752】在一方面，本发明的这些酶被用在饲料酶产品中，例如，单胃粗谷类饲料或食品，其中所述单胃动物包括猪(猪、家畜猪)、绵羊、兔、鸟、马、宠物和人。
实施例6：设计出可选的起始位点
【753】本发明还提供葡聚糖酶编码序列，其是编码“亲本”SEQ ID NO：2的示例性核酸SEQ ID NO：1的变体，其被特异性地修饰以除去，或更确切地改变SEQ IDNO：1内的第二翻译起始位点。该第二翻译起始位点在非天然宿主中产生不想要的截短形式的蛋白质(非天然在上下文中指用于表达蛋白质的宿主不是最初获得酶的生物体)。当示例性SEQ ID NO：2酶从其天然生物体——海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8——中表达时，不产生这种截短的蛋白质。然而，当具有该第二(隐蔽的)SEQ ID NO：1翻译起始位点的核酸被置于非天然宿主中时，该第二翻译起始位点被识别，从而导致产生截短的蛋白质。
【754】为了破坏这种不想要的翻译(在非天然宿主中截短的蛋白质的翻译)，改变SEQ ID NO：1(编码SEQ ID NO：2)。具体而言，潜在的核糖体结合位点(RBS)和在氨基酸(aa)残基32处的第二(2nd)起始位点的密码子被改变，如下所示。具体地，SEQ ID NO：1的核苷酸残基84从A变为C，并且SEQ ID NO：1的核苷酸残基96从G变为C(所得到的修饰的序列被显示在SEQ ID NO：3中)。核苷酸变化没有引起改变的SEQ ID NO：1编码的多肽的任何氨基酸变化。
潜在的RBS                    第二起始位点
                             在残基32
SEQ ID NO：1(“WT”)的残基77-106：
ATGAGGGAGACTGGGGAGTGGTGATAAAAG
变体，SEQ ID NO：3的残基77-106：
ATGAGGGCGACTGGGGAGTCGTGATAAAAG
【755】在核糖体结合位点(RBS)和在第二起始位点中，进行这种举例说明的改变，以确保截短的蛋白质不在“非天然的”宿主中表达。
【756】图11图解了SDS-PAGE凝胶的显微照相的照片，用于对采用未修饰的“野生型(WT)(或SEQ ID NO：2蛋白)和修饰的(就在上面举例说明的变体)转录体在非天然的荧光假单胞菌宿主中产生的蛋白质大小分级，以显示这种RBS和第二起始位点改变对葡聚糖酶转录表达的影响。在图11中图解的凝胶显示了以未诱导和未改变的“基因”、或编码序列(泳道2)、诱导的和未改变的基因(泳道3-5，同样的基因做三次)、未诱导和改变的基因(泳道6)以及诱导并改变的基因(泳道7-9)产生的蛋白质。如由该数据所说明的，改变使活性的量加倍。在图11中，每一泳道加载5μl的10 OD600/ml的全细胞裂解产物。从第一起始密码子(ATG)翻译的葡聚糖酶以黑色箭头表示(正好在第9栏的左侧)；从第二起始密码子(GTG)翻译的截短的蛋白质以内部的较长箭头表示(在第5排内部结束)。在图11中：
【757】泳道1：是蛋白质MW标记物；泳道2是SEQ ID NO：2(未诱导的)＝0.22U/OD600；泳道3是SEQ ID NO：2，样品1＝1.82U/OD600；泳道4是SEQ IDNO：2，样品2＝2.00U/OD600；泳道5是SEQ ID NO：2，样品3＝1.93U/OD600；泳道6是SEQ ID NO：3(未诱导的)＝0.20U/OD600；泳道7是SEQ ID NO：3，样品1＝3.79U/OD600；泳道8是SEQ ID NO：3，样品3＝3.60U/OD600；泳道9是SEQ IDNO：3，样品3＝4.03U/OD600。
【758】虽然这些数据说明这些核酸序列修饰解决了在示例性表达宿主荧光假单胞菌中的隐蔽转录起始位点问题，但是这些消除隐蔽起始位点(一个或多个)的修饰或等同修饰可以被用在任何宿主中，例如，用在任何原核表达宿主中。也就是说，无论什么宿主细胞被用于表达本发明的酶，隐蔽转录起始位点问题可以被容易识别并且用序列修饰消除，该技术在本领域中是已知的，并且与本实施例中阐明的那些技术类似。在可选的方面，宿主细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞，例如细菌细胞可以是在埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)或葡萄球菌属(Staphylococcus)内的任何种，或大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
实施例7：包含酶的食品或饲料食物
【759】本发明也提供了包含本发明酶的食品或饲料(其包括两者的补充剂)，所述本发明的酶包括SEQ ID NO：2的酶变体，例如在上面表1或2中所描述的。在一方面，喂给动物包含本发明酶的食物将增加含酶食品或饲料的营养价值。在一方面，喂给动物包含本发明酶的食物将降低动物中的肠液粘度和饲料通过率(其可以如在Sieo(2005)Poult.Sci.May；84(5)：734-741中所描述的检测/确定)。将本发明的酶(单独地，或与另一种酶例如木聚糖酶和/或已知的β葡聚糖酶或肌醇六磷酸酶一起)加入到动物的饮食中可以增加肠绒毛大小和绒毛高度与隐窝深度的比，增加小肠内含物中结合的胆酸的浓度，提高营养可消化性和动物(例如禽类、鸡)性能(可能通过增加的绒毛表面和结合的胆酸的肠浓度来提高小肠的吸收能力；参见例如Mathlouthi(2002)J.Animal Sci.Nov；80(11)：2773-2779)。在一些方面，包含本发明酶的食品或饲料以特定的食物被喂给动物，例如，禽类被喂给基于黑麦的食物；饲料中的黑麦可以降低烤鸡(broiler)性能并且增加消化物粘度和腿病的发生——施用含有本发明的酶的食品或饲料可以减少这种问题的数量；参见例如，Lazaro(2004)Poult.Sci.Feb；83(2)：152-160。
【760】在一方面，本发明的饲料或食品(或药物、食品强化剂等)可以包括一种、两种、三种或更多种不同的本发明的多核苷酸；或在一方面，本发明的饲料或食品可以包含本发明的酶和本发明的另一种多肽(例如，酶、肽)或任何已知的酶的组合。所述食品或饲料可以是片剂、凝胶片(geltab)、丸剂、植入物、丸粒、干的预混合物、固体、粉末或液体食品强化剂和类似物的形式。
【761】本发明的特定酶在膳食中的价值可以使用任何食品或饲料系统来检测，例如通过喂给动物例如单胃动物能量限制的食物如玉米大豆食物，补充或没有补充本发明的酶来进行。
【762】例如，可以设计一个示例性的研究以确定：当以能量限制的玉米大豆食物喂养时，与“亲本”或“野生型”SEQ ID NO：2相比，在本发明的两个变体(即“亲本”SEQ ID NO：2的序列变体)的高温(90℃，在模面上)加工的食物中是否有任何益处。
【763】一个示例性的测试系统包括使用禽类，例如鸡，如炙烤仔鸡(例如，Cobb X Cobb品系，商业杂种，起源Cobb-Vantress孵化场，Cleveland，GA)；和：
  饲料可用性   随意(Ad libitum)
  水可用性   随意
  试验的起始龄期   1天
  试验的结束龄期   28天
  光照安排   24小时
示例性饮食配方：
                                   Agri-Stats                      Agri-Stats
                                   0-18                            18-28
成分            Agri-Stats 0-18    阴性对照  Agri-Stats 18-28      阴性对照
玉米            61.78％            62.18％   65.03％               66.07％
家禽副产物粉    5.00％             3.17％    5.00％                5.00％
大豆粉48        28.96％            30.84％   26.02％               25.62％
小麦麸          0.00％             0.52％    0.00％                0.74％
家禽脂肪        1.12％             0.00％    1.38％                0.00％
盐              0.23％             0.22％    0.19％                0.19％
DL甲硫氨酸      0.27％             0.27％    0.19％                0.19％
盐酸赖氨酸      0.15％             0.15％    0.00％                0.00％
石灰石          0.48％             0.49％    0.57％                0.57％
Defluor Phos    1.49％             1.64％    1.10％                1.09％
球虫抑制剂
(Coban-莫能菌素)    0.02％     0.02％    0.02％    0.02％
维生素预混合物      0.50％     0.50％    0.50％    0.50％
粗蛋白％            22.26      22.22     20.93     20.94
家禽ME千卡/千克     3,060.00   2,985.00  3,110.00  3,035.00
钙％                0.90       0.90      0.80      0.80
磷(phos)％          0.71       0.72      0.63      0.63
可用磷％            0.44       0.44      0.37      0.37
脂肪％              4.57       3.29      4.93      3.63
纤维％              2.54       2.63      2.52      2.59
Met％               0.63       0.63      0.54      0.53
Cys％               0.36       0.36      0.34      0.35
Me+Cys％            0.99       0.99      0.88      0.88
Lys％               1.30       1.30      1.10      1.10
His％               0.59       0.59      0.56      0.56
Tryp％              0.24       0.25      0.23      0.23
Thr％               0.85       0.85      0.80      0.80
Arg％               1.47       1.47      1.38      1.38
Iso％               0.91       0.92      0.86      0.86
Leu％               1.91       1.92      1.84      1.84
Phe％               1.06       1.07      1.00      1.00
Tyr％               0.78       0.79      0.74      0.74
Val％               1.03       1.03      0.97      0.97
Gly％               1.09       1.02      1.05      1.05
Ser％               1.11       1.09      1.05      1.05
Phe+Tyr％           1.84       1.85      1.74      1.74
Na％                0.20       0.20      0.17      0.17
Cl％                0.23       0.22      0.18      0.18
K％                 0.85       0.89      0.80      0.80
亚油酸％            1.62       1.32      1.73      1.43
Na+K-Cl             240.11     252.28    225.51    225.93
DUA                 435.81     450.57    418.92    420.42
镁                  0.19       0.19      0.19      0.19
胆碱                1,471.59   1,424.01  1,411.46  1,417.75
铜                  0.30       0.33      0.22      0.22
家禽ME MJ/千克      12.80      12.49     13.01     12.70
Gly+ser      2.21      2.11      2.10      2.10
成本￡/MT    112.67    111.05    107.14    105.36
痕量矿物质预混合物
  钙(Ca)最小值   3.20％
  钙(Ca)最大值   4.20％
  铁(Fe)最小值   2.63％
  镁(Mg)最小值   2.68％
  锰(Mn)最小值   13.40％
  锌(Zn)最小值   10.70％
  铜(Cu)最小值   4000ppm
  碘(I)最小值   1000ppm
  硒(Se)最小值   400ppm
预混合物以每吨饲料1.5磅的比率被加入。
维生素预混合物
  维生素A，I..U./LB   1,000,000
  维生素D3，I..U./LB   200,000
  维生素E，I..U./LB   2,000
  维生素B-12，MG./LB   2.20
  核黄素，MG./LB   800
  烟酸，MG./LB   8,000
  d-泛酸，MG./LB   2,000
  胆碱，MG./LB   34,720
  甲萘醌，MG./LB   132
  叶酸，MG./LB   100
  维生素B1，MG./LB   400
  维生素B6，MG./LB   400
  生物素，MG./LB   20
  乙氧基喹啉，MG./LB   23,000
预混合物以每吨饲料5.0磅的比率被加入。
Figure A20078003687102771
示例性处理方案
【764】在研究开始之前处理掉显示出状况不佳的动物。首先如果开始时剩下的动物不足以满足研究所必需的数目，那么将订购新一批的动物。合适的雇员将在整个试验中检查动物的健康状况。
【765】采用公认的随机技术，将动物分配到处理组。如果需要单独的动物数据，则在施用测试物质开始之前对动物进行独特地标识，关养动物的畜栏将被独特地标记。
示例性酶
【766】本发明的任何酶，包括本发明的任何SEQ ID NO：2酶变体，例如，如在上面表1或2中所述，可以被单独使用或与本发明的食品或饲料联合使用。因此，示例性测试系统和方案可以单独使用本发明的任何一种酶或与本发明的其它酶或已知的酶组合使用。在一方面，喂给动物包含本发明酶的食物将增加含酶食品或饲料的膳食价值。
处理
Trt#                                酶包含率
        处理        食物基础        克/千克食物        待加入的酶
1    阳性对照        阳性对照        0
2    阴性对照        阴性对照        0
3    SEQ ID NO：2
     40DNS U/kg      阴性对照                在混合器中
4    SEQ ID NO：2    阴性对照
     80DNS U/kg                              在混合器中
5    SEQ ID NO：2    阴性对照
     120DNS U/kg                             在混合器中
6    “7X”变体      阴性对照
     40DNS U/kg                              在混合器中
7    “7X”变体      阴性对照
     80DNS U/kg                              在混合器中
8    “7X”变体      阴性对照
     120DNS U/kg                             在混合器中
9    “13-1X”变体   阴性对照
     40DNS U/kg                              在混合器中
10   “13-1X”变体   阴性对照
     80DNS U/kg                              在混合器中
11   “13-1X”变体   阴性对照
     120DNS U/kg                             在混合器中
【767】对于葡聚糖酶SEQ ID NO：2的“13-1X”和“7X”变体，见上面的表2和讨论。术语“DNS U/kg”意即“每千克饲料的DNS单位”。DNS＝3，5-二硝基水杨酸，是用于量化由葡聚糖酶对多糖作用而释放的游离还原末端的试剂。DNS指DNS分析方法被用于测定葡聚糖酶活性。
【768】所有的鸟都将被人道地处理。只有被美国兽医学会批准的方法将被用于对鸟实施安乐死。所有的鸟将被掩埋在处理坑内并且不进入食物链。
【769】每天由适当资格的人观察所有的动物并且记录任何外观或行为的变化。如果任何动物处于不良状况，其将被更频繁地观察。如果认为不太可能活下来，或遭受疼痛或痛苦，该动物将被挑选出并进行尸检。所有的死者也都应该进行尸检以确定死亡或痛苦的原因。在所有的情况下，应该对动物进行称重并且记录死亡日期。如果在研究过程中观测到不利的处理效果，对来自每一受到影响的处理组的动物进行尸检并且对组织进行组织病理学评价。
测量值
  参数   龄期   注解
  体重   1、18和28天龄
  畜栏饲料摄取(Pen feed intake)   1、18和28天龄
  FCR   18和28天龄
  死亡   死亡的龄期和体重   与畜栏中动物重量分开记录
  丸粒模具温度(Pellet die temperature)   记录并报告每一食物模面温度。见处理表
  饲料葡聚糖酶分析   见样品分析讨论
所有测试材料和喂食测试材料的动物必须以这样的方式处理，该处理方式防止进入其它的动物饲料和/或人食物链。
  样品类型   样品鉴定   分析   其它
  谷物-玉米   玉米  三份200g的样品
  蛋白质来源   大豆粉  三份200g的样品
  酶预混合物   SEQ ID NO：2，干的   葡聚糖酶  25克样品
  酶预混合物   “7X”变体   葡聚糖酶  25克样品
  酶预混合物   “13-1X”变体   葡聚糖酶  25克样品
  丸化之前的食物   食物1成为丸粒之前   葡聚糖酶  两份400克的样品*
  丸化之前的食物   食物2成为丸粒之前   葡聚糖酶  两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物3成为丸粒之前   葡聚糖酶  两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物4成为丸粒之前   葡聚糖酶  两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物5成为丸粒之前   葡聚糖酶  两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物6成为丸粒之前   葡聚糖酶  两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物7成为丸粒之前   葡聚糖酶  两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物8成为丸粒之前   葡聚糖酶  两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物9成为丸粒之   葡聚糖酶  两份400克的样品
  前
  丸化之前的食物   食物10成为丸粒之前   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物11成为丸粒之前   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之前的食物   食物12成为丸粒之前   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物1成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物2成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物3成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物4成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物5成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物6成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物7成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物8成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物9成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物10成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物11成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
  丸化之后的食物   食物12成为丸粒之后   葡聚糖酶   两份400克的样品
【770】*注意，对于两份400克的丸化之前和丸化之后的样品，各由三份单独的200克随机样品(grab sample)制备，其被混合并随后减少到400克。从混合器的不同部分收集醪液样品，在制造的起始、中点和结束时收集丸化的样品，并且相应地进行标记。成为丸粒后的样品被带入后冷却器，并且冷却过程的一些描述被提供给承包人，成为丸粒前的醪液样品被从混合器的不同点取走。上述丸化的样品不与温度测试混淆。
【771】对于葡聚糖酶SEQ ID NO：2的变体“13-1X”和“7X”，见上面表2和讨论。
实施例8：制备本发明的食品或饲料丸粒的方法
【772】本发明还提供包含本发明的一种或多种酶的食品或饲料丸粒(其在一方面可被看作“食品或饲料补充剂”)，和制备和使用它们的方法。本发明还提供包含本发明的酶的丸粒，其包括SEQ ID NO：2的酶变体，例如如在上面表1或2中所述，用作食品或饲料。本实施例描述了一个用于制备本发明的食品或饲料丸粒的示例性方法。
【773】设计本研究以产生在70℃、83℃、86℃、89℃、92℃或95℃丸化的本发明饲料葡聚糖酶的强耐热曲线。酶在每一温度的一个水平(250U/千克)被服用以形成基于本发明的新进料分析(in-feed assay)方法的活性曲线。第二种葡聚糖酶在两个温度(70℃和95℃)被丸化并且与前面的产品相比较。同样，QUANTUMXTTM PHYTASE(或“QPXT”)(Syngenta Biotechnology Inc.，Research Triangle Park，NC)被补充到两轮空白饲料中，用作内部标记物。
材料和方法
饮食配方
【774】食物将被配制为典型的商业烤鸡食物(基于玉米/大豆粉/肉类和骨粉)。只使用一种基础食物和三种实验食物：(1)不含添加的葡聚糖酶的对照食物(但是含有添加的QUANTUM XTTM PHYTASE(Syngenta Biotechnology Inc.，ResearchTriangle Park，NC)200g/mt)；(2)含有250U/kg饲料的葡聚糖酶SEQ ID NO：2的对照食物；和(3)含有250U/kg饲料的7X葡聚糖酶(见上面表2和实施例5)的对照。
饮食介绍/添加剂
  食物形式   丸化的
  在确定的温度丸化   记录在丸粒冲模表面
  丸化的，冲模表面温度   70℃、83℃、86℃、89℃、92℃或95℃
  食物阶段饲养程序   起始食物(starter)或生长食物(grower)
  起始食物中的球虫抑制剂(类型和   NA
  ppm)
  生长食物/完成食物(finisher)1中的球虫抑制剂(类型和ppm)   无
  完成食物2中的球虫抑制剂(类型和ppm)   无
  维生素预混合物含量和包含水平   维生素混合物
  矿物质预混合物含量和包含水平   矿物质混合物
饮食丸化和取样
丸化程序——
【775】·在测试开始之前首先清洁并检查1-mt混合器。基于持续运行需要的饲料的量混合足够的饲料，以在每次运行中获得6个目标温度升高(在稳态)。
·以食物配方的顺序将所有干的成分加入到混合器中(对于葡聚糖酶食物，其被加入到混合器中代替少量的玉米)，并且混合器运行2-3分钟，然后加入油，混合最后产品1-2分钟。总的运行时间是3-4分钟。
·在丸粒运行之前，对于每一次测试运行，从混合器中移去醪液的两种复合样品(每一样品各自大约500克)。
·在最低的温度开始丸化饲料，并且一旦在稳态达到目标温度，收集样品。在冲模后运行的中间收集大约5×500克样品，在最后装袋和鉴定(标记)之前将这些样品冷却。
·在收集饲料样品之后，热空气吹过样品以降低水分水平，然后在冷却室中冷却至环境温度。
·样品袋被标记运行轮次(重复次数)、温度和酶水平。每一单独的测试食物重复运行三次。在一种食物中对于每一温度(6)有5个饲料样品，进行三次重复(运行)，每一测试食物产生总计90个丸化饲料样品；加上每一测试食物有三个复合糖化样品。
·如下标记袋子：
·样品标签：运行轮次/酶/温度/样品。
【776】·其中：运行数是1-3，剂量是空白，SEQ ID NO：2或7X(SEQ ID NO：2的变体，见上面的表2和讨论)，温度是70、83、86、89、92或95，并且样品在1-5的范围内。例如，标记1/SEQ ID NO：2/92/1描述了在92℃在SEQ ID NO：2的第一次运行期间取的样品，并且是该运行轮次收集的第一个样品。
实验设计
Figure A20078003687102821
Figure A20078003687102831
【777】*对于丸化温度，各个值之间需要保持至少3℃的差异，同时在整个运行中物料通过量(保留时间)没有变化。
【778】＊＊一批饲料被混合并且用于一个测试食物内的全部运行，在6个温度，一旦温度达到并且稳定，收集样品并且冷却。对于在一个运行内的每一温度收集一组5个样品，每一运行产生总计30个饲料样品。丸化的饲料样品的全部总数是210个样品，不包括糖化样品。
事件的测量和时间表
如果第一天不能完成所有的丸化运行，在第二天的早晨完成它们。关键的步骤是在达到高的丸化温度时不改变调节器内的保留时间(使其加快)。
所有的饲料通过填埋处理。
结果
【779】证实丸化之后本发明的酶的热稳定性的研究结果被示于图12中，其中“野生型”(或WT)，即SEQ ID NO：2，和命名为“7X变体”的变体，其具有SEQ ID NO：2的序列变异，所述序列变异由氨基酸残基改变：38Y、61Q、69E、94Q、183R、191A和276A组成(见上述的表2和讨论)。图12中的数据说明本发明的这两种酶在三次运行期间在大约70℃到大约100℃的丸化温度范围中的热温定性；所述数据比较了在测试温度的酶残余活性百分比(％)与其在相对于“丸化温度”的70℃时的活性。
实施例9：修饰本发明的酶以避免“参差的N-端(Ragged N-Termini)”
【780】本发明还提供酶编码序列，和编码它们的核酸，其中所述序列被修饰，以产生更好的识别序列，用于蛋白酶切割信号序列。
【781】例如，如在图13中所述，两个密码子被插入在酶(葡聚糖酶)编码序列的第二密码子(即，没有ATG起始位点)(来自SEQ ID NO：1)和α因子信号序列(前导序列)之间。这两个额外的密码子编码氨基酸残基谷氨酸(Glu)和丙氨酸(Ala)。这两个额外的密码子的加入产生了更好的蛋白酶识别序列，所述蛋白酶切割信号序列和葡聚糖酶之间的蛋白质。切割发生在Glu-Ala序列的N-末端侧，并且因此，成熟蛋白质的N-端以Glu-Ala开始。如果没有这些额外的氨基酸，则初始蛋白质的加工不完全，导致产生不均一的蛋白质，其具有所谓的“参差的N-端”。Glu-Ala(或“EA”)序列的加入产生具有“整齐的”(或，不“参差的”或均一的)氨基末端(N-末端)的均一的蛋白质。所有这些通过N-端测序来证实。图13说明了SEQID NO：2的双联体N-端测序。
【782】图14说明了毕赤酵母表达的本发明葡聚糖酶的N-端测序结果，该葡聚糖酶命名为“12X-6”和“13X-1”，是SEQ ID NO：2的变体，见上面表2和讨论。图14A说明SDS-PAGE凝胶的放射照相照片，显示了由不一致的信号加工引起的葡聚糖酶双联体；图14B说明了SDS-PAGE凝胶的放射照相照片，显示了37KDa的条带；其被切下并且测序，如图所示。这些数据说明Glu-Ala序列的插入，如上所述(插入到EAGVDPFERN)，导致“整齐的”氨基末端。
【783】虽然这些数据表明在前导(信号)序列和酶序列之间加入额外的氨基酸残基解决了表达在示例性毕赤酵母表达宿主中的重组葡聚糖酶中的“参差末端”的问题，但是这些修饰或等同修饰可以用于在任何宿主中表达，例如在任何原核或真核表达宿主中，例如，和在细菌宿主细胞中。在可选的方面，所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞，例如，细菌细胞可以是在埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)或葡萄球菌属(Staphylococcus)内的任何种，或大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡质芽孢杆菌(Bacilluscereus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。
实施例10：表达在转基因植物和种子中的本发明的酶
【784】本发明的一个实施方式提供包含编码本发明的酶的序列的转基因植物(或从其获得的植物细胞)和种子。如上所讨论的，转基因植物(或植物细胞)或种子可以被工程化为组成型地、诱导型地、或以组织优选的方式表达本发明的酶，例如，通过选择适当的启动子或其它转录调节子进行表达，如上所讨论的。任选地，酶可以被靶向到特异的亚细胞区室。在一方面，本发明的转基因植物或种子被修饰以表达“植物优化的”耐热性酶，例如，如在本发明的一种示例性植物中，转基因植物直接在细胞或种子中——例如直接在玉米种子——表达内切葡聚糖酶，例如用于食品或饲料，如单胃动物饲料或用于需要分解纤维素的工业过程。本实施例描述了酶在(玉米)玉米种子中的直接表达；尤其是，描述了直接在(玉米)玉米种子中表达的耐热内切葡聚糖酶，用于改善饲料利用或用在需要分解纤维素的工业过程中。表达在植物中的酶的输送可以用作纯化的或未纯化的酶源，表达在原料本身中的酶用在需要分解纤维素的工业过程中或用作饲料成分。
【785】植物密码子优化的耐热内切葡聚糖酶的玉米种子特异性表达允许这种酶直接在农作物中输送，所述农作物是动物饲料的一种基本成分的来源(膳食玉米)。在玉米中的表达也提供了本发明这种或任何其它酶的低成本、大规模和灵活生产。所述酶可以作为干种子和以研磨的形式储存，用于单独或与其它饲料酶和饲料成分联合直接加入到饲料中。
【786】可选地，植物密码子优化的耐热内切葡聚糖酶的玉米种子优化表达可以允许所述酶输送到生物质原料中，用于将纤维素水解成可发酵的糖。可发酵的糖具有许多用途，包括糖发酵成醇，用作能量或燃料。植物表达的酶可以被加入到原料或实际上表达在用于产生可发酵糖的原料中。植物表达的酶可以被靶向亚细胞位置，以防止进入到底物并且因此防止底物的过早降解。然后酶和底物可以通过任何方法集合在一起，所述方法是分解亚细胞组织所需要的，如碾磨、磨碎、加热和类似的方法。液体的加入可以改进底物的降解。因此，在原料水解之前或期间，磨碎和碾磨的玉米种子可以被加入到任何原料中。
【787】第二个重要的特征是酶耐受原料丸化过程的严酷条件(高温和蒸汽)的能力。因此，在一个实施方式中，酶正确的亚细胞靶向到内质网(ER)以实现高水平表达而不消极地影响种子发育也是重要的(请参见WO 2005/096704)。为了实现该实施方式，可以使用合成的基因序列和种子特异性表达载体，并且在本实施例中描述了这样的序列。
【788】对每一个克隆制备甘油储液，7X(SEQ ID NO：7，由SEQ ID NO：6编码)、12X-1(SEQ ID NO：13，由SEQ ID NO：12编码)、12X-6(SEQ ID NO：9，由SEQID NO：8编码)和13X-1(SEQ ID NO：11，由SEQ ID NO：10编码)。对于每一克隆，制备DNA并且测序。
【789】采用Vector NTI 9.0(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的回译程序(backtranslation program)，设计了葡聚糖酶变体7X(SEQ ID NO：7，由SEQ ID NO：6编码)、12X-6(SEQ ID NO：9，由SEQ ID NO：8编码)和13X-1(SEQ ID NO：11，由SEQ IDNO：10编码)的玉米优化基因。合成基因通过Entelechon GmbH(德国)合成。额外的序列被添加到每一变体的5’和3’端。这些序列包括BamHI克隆位点、Kozak序列、5’端γ玉米蛋白信号序列、SEKDEL ER保留序列(retention sequence)(Munro和Pelham(1987)Cell，48：899-907)和3’端的SacI克隆位点。通过将基因(AGGATCCcgat...AGAATCCcgat)的5’端附近的精氨酸(R69)的DNA序列从AGG突变为AGA，从每一玉米优化基因中除去内部的BamHI限制性位点。
【790】最终的玉米优化的变体序列被翻译并且与每一微生物序列的翻译序列比对。发现由玉米优化的序列编码的蛋白质推断的序列与由微生物序列编码的推断的蛋白质序列100％匹配。下面示出了玉米优化的葡聚糖酶变体和其野生型葡聚糖酶变体之间的DNA和蛋白质序列的相关性。
  野生型葡聚糖酶变体   玉米优化的(MO)葡聚糖酶变体
  7X(SEQ ID NO：7，由SEQ ID NO：6编码)   7XMO(SEQ ID NO：19，由SEQ ID NO：18编码)
  12X-6(SEQ ID NO：9，由SEQ ID NO：8编码)   12X-6MO(SEQ ID NO：21，由SEQ ID NO：20编码)
  13X-1(SEQ ID NO：11，由SEQ ID NO：10编码)   13X-1MO(SEQ ID NO：23，由SEQ ID NO：22编码)
植物转化载体的构建
【791】每一个玉米优化的葡聚糖酶变体被克隆在水稻谷蛋白启动子(prGTL，Takaiwa等人，(1991)Plant Mol.Biol.16(1)，49-58)和玉米γ玉米蛋白启动子(prGzein，WO 2005/096704)之后，用于在玉米种子的胚乳中表达。用于所有构建物的终止子是35S终止子(WO 2005/096704)。如上所述，额外的序列被加入，用于将蛋白质靶向到胚乳的内质网(ER)。从最初的Entelechon克隆载体，pMBL中切下每一个基因，为BamHI-SacI片段(1039bp)。为了构建水稻谷蛋白启动子构建物，所述1039bp片段被克隆到pSM323的BamHI-SacI位点。对于γ玉米蛋白启动子构建物，所述1039bp片段被克隆到pSH231。从克隆载体的每一个中切下启动子-GOI片段，为HindIII-KpnI片段并且亚克隆到agro载体，pNOV2117(二元载体(binary vector)，见Negrotto等，(2000)Plant Cell Reports 19：798-803)。所有Agro载体的DNA序列通过测序分析来证实。所述载体可以如下描述：
  载体类别编号   基因  启动子   靶向序列   终止子
  15666   13X-1MO(SEQ ID NO：23，由SEQ ID NO：22编码)  prGZein   ER保留序列   35S终止子
  15674   7XMO(SEQ ID NO：19，由SEQ ID NO：18编码)  prGZein   SEKDEL   35S终止子
  15714   12X-6MO(SEQ ID NO：21，由SEQ ID NO：20编码)  prGZein   ER保留序列   35S终止子
  15660   12X-6MO(SEQ ID NO：21，由SEQ ID NO：20编码)  prGTL   SEKDEL   35S终止子
  15662   13X-1MO(SEQ ID NO：23，由SEQ ID NO：22编码)  prGTL   SEKDEL   35S终止子
  15671   7XMO(SEQ ID NO：19，由SEQ ID NO：18编码)  prGTL   SEKDEL   35S终止子
【792】根据Negrotto等人，(2000)Plant Cell Rep 19：798-803，构建物15660和15671被转化到农杆菌(Agrobacterium)菌株LBA4404中。含有植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在YEP(酵母提取物(5克/升)，蛋白胨(10克/升)，NaCl(5克/升)，15克/升琼脂，pH 6.8)固体培养基上在28℃生长2-4天。大约0.8×109个农杆菌悬浮在补充有100μM As的LS-感染培养基中。在此培养基中，细菌被预先诱导30-60分钟。
【793】如在Negrotto等，(2000)Plant Cell Rep 19：798-803中所一般描述的进行玉米幼胚的转化。简要地，从8-12天大的玉米穗中切离玉米自交系JHAX707的幼胚放入到液体LS-inf+100μM As中。用新鲜的感染培养基冲洗胚一次。然后加入农杆菌溶液，将胚旋转30秒钟并且使其与细菌一起沉淀5分钟。然后，所述胚被盾盖侧朝上地转移到LSA培养基中，并且在黑暗中培养两到三天。随后，每个培养皿板(petri plate)20到25个胚被转移到用头孢噻肟(250毫克/升)和硝酸银(1.6毫克/升)补充的LSDc培养基中，并且在28℃黑暗中培养10天。
【794】产生胚发生愈伤组织的幼胚被转移到LSD1M0.5S培养基。在第三周用亚培养步骤，在该培养基上选择培养物6周。存活的愈伤组织被转移到用甘露糖补充的Reg1培养基。在光照下(16小时光照/8小时黑暗的方案)培养之后，绿色组织然后被转移到没有生长调节剂的Reg2培养基中并温育1-2周。小植株被转移到含有Reg3培养基的Magenta GA-7盒(Magenta Corp，Chicago Ill)并且在光照下生长。2-3周后，通过PCR测试植物是否存在PMI基因和其它感兴趣的基因。从PCR分析得到的阳性植物被转移到温室并且生长以结出种子。
【795】为了测试葡聚糖酶活性，进行下列试验。
试验中使用的试剂：
提取缓冲液在pH 5.30缓冲并且含有100mM醋酸钠，100mM NaCl，1毫克/毫升明胶，1mM EDTA，0.02％吐温-20(Tween-20)和0.02％NaN3。
DNS试剂：1升DNS试剂包含5.0克3，5-二硝基水杨酸，150克酒石酸钾钠四水合物和0.36摩尔氢氧化钠。
底物溶液：pH为5.3并且包含0.7％(w/v)燕麦β-葡聚糖，100mM醋酸钠pH 5.3和0.02％(w/v)叠氮钠。
碾磨和提取：
【796】应用Kleco Model 8200 8小罐球磨机研磨总共16粒转基因的种子。然后100毫克的研磨粉在室温在10毫升提取缓冲液中振荡抽提30分钟。然后离心该混合物并且移去上清液。
分析提取的酶
【797】上清液在提取缓冲液中以1∶50稀释。10微升稀释提取物被加入到50微升的0.7％燕麦β-葡聚糖底物中并且在80℃温育1小时。在较低的温度，如70℃温育混合物也是可能的。50微升的DNS试剂被立即加入并且在95℃加热10分钟。通过将50微升DNS试剂与50微升底物溶液和10微升提取物混合，制备0时间点的样品。通过将10微升已知浓度的葡萄糖(溶解在提取缓冲液中)与50微升底物溶液和50微升DNS试剂混合，制备标准品。然后，标准品、0和60分钟时间点的样品在95℃温育10分钟，然后冷却至室温。这之后在A540处读取样品的吸光度。通过比较样品和标准物的吸光度读数，测定所产生的还原性终产物的量(以微摩尔计)。
【798】1单位活性是每分钟产生1微摩尔还原性终产物的酶量。种子的酶组成报告为：酶单位/克面粉。
【799】总计达306个转基因种子样品被分析。对于包含构建物15660的情况，分析了164个样品的葡聚糖酶活性。对于包含构建物15671的情况，分析了142个样品的葡聚糖酶活性。包含构建物15660的最高表达情况具有3527U/g(+/-49U/g)的活性水平，而包含构建物15671的最高表达情况具有2794U/g(+/-80U/g)的活性水平。
实施例11：在饲料试验中的葡聚糖酶活性
在试验中使用的试剂：
【800】提取缓冲液在pH 5.30缓冲并且含有100mM醋酸钠，100mM NaCl，1毫克/毫升明胶，1mM EDTA，0.02％吐温-20(Tween-20)和0.02％NaN3。
DNS试剂：1升DNS试剂包含5.0克3，5-二硝基水杨酸，150克酒石酸钾钠四水合物和0.36摩尔氢氧化钠。
底物溶液：pH为5.3并且包含0.7％(w/v)燕麦β-葡聚糖，100mM醋酸钠pH 5.3和0.02％(w/v)叠氮钠。
碾磨和提取步骤：
经通过装备有0.8毫米筛的实验室锤磨机(Perten 3100)碾碎饲料样品。在提取缓冲液中通过振荡从饲料提取酶。在60℃用10克缓冲液/1克碾磨的饲料进行提取。温度升高可以增加提取效率。
分析提取的酶
【801】在70℃进行酶分析，同时通过在0至60分钟测量还原性终产物的增加来监测活性。通过将50微升DNS试剂与50微升底物溶液和10微升提取物混合，制备0时间点的样品。通过将50微升底物溶液和10微升提取物混合，在70℃温育60分钟，然后加入50微升DNS试剂，制备60分钟时间点的样品。通过将10微升已知浓度的葡萄糖(溶解在提取缓冲液中)与50微升底物溶液和50微升DNS试剂混合来制备标准品。然后，标准品、0和60分钟时间点的样品在95℃温育10分钟，然后冷却至室温。这之后在A540处读取样品的吸光度。通过比较样品和标准物的吸光度读数，测定所产生的还原性终产物的量(以微摩尔计)。
【802】1单位活性是每分钟产生1微摩尔还原性终产物的酶量。饲料的酶组成被报告为：酶单位/克饲料。
实施例12：当喂给含酶食物时的烤鸡性能
【803】在高温(在冲模表面90℃)处理之前，酶被加入到能量-限制的玉米/大豆食物中。食用含酶的能量限制食物的鸡的性能与食用不含酶的能量限制食物(阴性对照食物)的鸡的性能以及与食用非能量限制食物(阳性对照食物)的鸡的性能相比较。在毕赤酵母中表达并产生所述酶。
【804】一日龄的雄性Cobb x Cobb小鸡被喂养28天。鸡在第1-18天被喂起始食物(starter diet)并在第18-28天被喂生长食物。采用8种处理，每种处理6个重复，并且每个重复6只鸡。所述处理和食物被总结在下表中。
Figure A20078003687102891
Figure A20078003687102901
【805】下表显示了鸡在各种处理中的表现。FCR意指饲料转化率，例如，饲料(kg)/体重增加(kg)。收集来自每种处理的饲料样品并分析酶活性。经检测，除了处理3的第0-18天食物之外，酶活性达到预期水平或预期水平以上。
【806】如在下表中见到的，饲喂能量充足的食物的鸟(阳性对照)比饲喂阴性对照的鸟具有更好的体重增加；70克的重量差异经济上是显著的。在一些接近阳性对照水平的剂量，酶总体上增加鸟的体重增加。修正的饲料转化率(FCRc)不是同样地明确(clear-cut)。在此试验中，SEQ ID NO：7(由例如SEQ ID NO：6编码)和SEQ ID NO：9(由例如SEQ ID NO：8编码)各自具有至少一个能产生比阴性对照明显更好的(更低)FCR的剂量。然而，SEQ ID NO：11(由例如SEQ ID NO：10编码)的FCR与阴性对照的FCR相似。
表：0-28天性能
Figure A20078003687102921
*针对死亡率修正的FCR
实施例13：酶在丸化饲料中的稳定性
【807】通过测量从不同温度丸化的醪液饲料提取的酶活性，确定例如由SEQID NO：6编码的SEQ ID NO：7葡聚糖酶从丸粒的回收。这些结果列于图15中。食物被配制为典型的商业炙烤仔鸡食物(基于玉米/大豆粉/肉和骨粉)。如所示制备基础食物，并且用例如SEQ ID NO：6编码的SEQ ID NO：7以250U/kg的量补充。制备三种糖化样品，用于每一丸化操作。在丸化操作期间，温度从70℃升高到95℃。磨粉机被仔细的监测以确保样品的滞留不随温度的增加而增加。在每一温度从醪液和丸粒收集样品(每种500克)，并且根据实施例11的方案分析葡聚糖酶活性。
【808】操作1和2显示在95℃丸化时，葡聚糖酶活性没有损失。但是，操作3显示当在95℃丸化时，大约30％的酶活性损失。酶可能在95℃以上温度的溶液中失去活性，从在95℃时的86％的活性下降到在97℃时的大约8％的活性。因此，丸化温度的变化可以解释第三次丸化操作中例如由SEQ ID NO：6编码的SEQ IDNO：7的回收变化。
实施例14葡聚糖酶的五次饲养试验的统计学分析
【809】对“野生型”葡聚糖酶和三种变体(SEQ ID NO：11(由例如，SEQ IDNO：10编码)、SEQ ID NO：9(由例如，SEQ ID NO：8编码)和SEQ ID NO：7(由例如，SEQ ID NO：6编码))进行了测试，测试了它们在提高炙烤仔鸡性能中的功效，所述炙烤仔鸡被饲喂了能量稍微不足但氨基酸充足的食物。阳性结果将被视为比阴性对照更好的恢复性能的变体。
【810】设置一系列5个同样设计的实验，由此鸟类被饲喂Agri-stats标准玉米-大豆食物作为阳性对照，而阴性对照在所有方面相同，除了定量配给的能量水平被降低80-90千卡/千克(取决于试验)。所述试验持续0-28天(3个试验)或0-35天(2个试验)的龄期。(典型试验的实验设计的细节，见实施例xy)。
所有变体数据的全分析(Holo-analysis)
【811】进行所有组合数据的全分析以确定酶对鸟类性能影响的量度。对FCR(饲料转化率)、体重增加和从饲料回收酶进行了分析。
·N＝总共78次测试(其中测试＝在酶存在的试验中的一次处理)
·FCR模式——没有显著的酶或剂量效果
·体重增加模式——具有显著的酶或剂量效果
·变体(SEQ ID NO：7(由例如，SEQ ID NO：6编码)、SEQ ID NO：11(由例如，SEQ ID NO：10编码)和SEQ ID NO：9(由例如，SEQ ID NO：8编码))从饲料的酶回收比野生型酶更好。
【812】使用下列项，应用逐步回归将酶存在对于体重增加的影响模型化：截距、酶的对数剂量、玉米％、光照方案(小时/每天)、阴性对照体重增加、阳性对照体重增加和酶的对数剂量。下面给出评估的参数。
参数评估
项                               估计     标准误差    t比率    概率＞|t|
截距                             -395.44  117.80      -3.36    0.0013
产品[野生型]：对数剂量           33.84    36.59       0.92     0.3584
产品[SEQ ID NO：7(由例如，       89.69    32.07       2.80     0.0068
SEQ ID NO：6编码)]：对数剂量
产品[SEQ ID NO：11(由例如        25.29    33.76       0.75     0.4564
SEQ ID NO：10编码)]：对数剂量
产品[SEQ ID NO：9(由例如         77.23    43.75       1.77     0.0821
SEQ ID NO：8编码)]：对数剂量
玉米％                           4.154    1.921       2.16     0.0342
光照                             2.562    0.914       2.80     0.0067
阴性对照体重增加                 -0.262   0.085       -3.08    0.0030
阳性对照体重增加                 0.240    0.089       2.70     0.0088
产品[野生型]                     54.70    61.05       0.90     0.3735
产品[SEQ ID NO：7(由例如         -76.58   58.87       -1.30    0.1978
SEQ ID NO：6编码)]
产品[SEQ ID NO：11(由例如        54.14    58.02       0.93     0.3542
SEQ ID NO：10编码)]
【813】所有四种酶对体重增加具有剂量效应。最大的剂量效应与SEQ ID NO：7(由例如，SEQ ID NO：6编码)和SEQ ID NO：9(由例如，SEQ ID NO：8编码)相关。
【814】下表分析了总的拟合优度(goodness of fit)(P＜0.0001)和各种参数。组合来自酶的数据，具有显著的酶剂量效应(P＜0.05)。
拟合总结
R平方                                0.743
R平方Adj                             0.700
均方根误差(Root Mean Square          26.34
Error)
平均响应(Mean of Response)           -6.85
观测值(或体重(Wgts)之和)             78
方差分析
信源    DF    平方和    均方        F比
信源    DF    平方和       均方       F比
模型    11    132117.31    12010.7    17.3106
误差    66    45792.84     693.8      概率＞F
总计    77    177910.15               ＜.0001
效果测试
信源                Nparm    DF      平方和     F比     概率＞F
对数剂量[产品]      4        4       8535.7520  3.0756  0.0220
玉米％              1        1       3245.1270  4.6771  0.0342
光照                1        1       5448.9483  7.8534  0.0067
阴性对照体重增加    1        1       6568.3975  9.4669  0.0030
阳性对照体重增加    1        1       5064.0781  7.2987  0.0088
产品                3        3       1937.1962  0.9307  0.4309
【815】虽然本发明已经详细描述了关于其某些示例性方面，应理解，各种改进和变化在所描述的和所要求保护的精神和范围之内。
序列表
<110>维莱尼姆公司
先正达公司
B.斯蒂尔
S.希利
A.埃斯特拉利安
K.巴瑞特
S.M.米立斯
R.奎奥特
<120>葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
<130>564462014540
<140>尚未授予
<141>与此同时
<150>US 60/835,734
<151>2006-08-04
<150>US 60/909
<151>2007-03-20
<150>US 60/938,410
<151>2007-05-16
<160>23
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>954
<212>DNA
<213>海栖热袍菌(Thermotoga maritima)
<400>1
atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat     60
gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gttcttcgac    120
attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct    180
tacgcgtttc ctccttataa aatcatggat cgcttcttca aaagagtgga tgaagtgata    240
aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaata ttcatcacta cgaggagtta    300
atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat    360
cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat    420
cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt    480
gacaaaaagc acactataat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa    540
aaactgtctg tcccaaaatg ggaaaaaaat tctatagtta caattcacta ctacaatcct    600
ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtggaaggat ctgagaaatg gttgggaaga    660
aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa    720
tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct    780
gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaaatgga gaaaaggaga    840
tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatac tctgagaaaa    900
acctggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataa          954
<210>2
<211>317
<212>PRT
<213>海栖热袍菌
<220>
<221>结构域
<222>(19)...(296)
<223>纤维素酶(糖基水解酶家族5)
<400>2
Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile
1               5                   10                  15
Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val
            20                  25                  30
Val Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser
        35                  40                  45
His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Tyr Ala Phe Pro
    50                  55                  60
Pro Tyr Lys Ile Met Asp Arg Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile His His
                85                  90                  95
Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu
            100                 105                 110
Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr
        115                 120                 125
Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu
    130                 135                 140
Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile
145                 150                 155                 160
Asp Lys Lys His Thr Ile Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile
                165                 170                 175
Ser Ala Leu Glu Lys Leu Ser Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ser Ile
            180                 185                 190
Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala
        195                 200                 205
Glu Trp Val Glu Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser
    210                 215                 220
Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu
225                 230                 235                 240
Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala
                245                 250                 255
Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val
            260                 265                 270
Val Arg Glu Met Glu Lys Arg Arg Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe
        275                 280                 285
Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Thr Leu Arg Lys Thr Trp Asn Lys
    290                 295                 300
Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu
305                 310                 315
<210>3
<211>954
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多核苷酸
<400>3
atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat     60
gcgcttgaag caccaaatga gggcgactgg ggagtcgtga taaaagatga gttcttcgac    120
attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct    180
tacgcgtttc ctccttataa aatcatggat cgcttcttca aaagagtgga tgaagtgata    240
aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaata ttcatcacta cgaggagtta    300
atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat    360
cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat    420
cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt    480
gacaaaaagc acactataat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa    540
aaactgtctg tcccaaaatg ggaaaaaaat tctatagtta caattcacta ctacaatcct    600
ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtggaaggat ctgagaaatg gttgggaaga    660
aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa    720
tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct    780
gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaaatgga gaaaaggaga    840
tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatac tctgagaaaa    900
acctggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataa          954
<210>4
<211>102
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：2的α交配因子加氨基酸2-18
<400>4
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
        35                  40                  45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
    50                  55                  60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Glu Lys Arg Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu
                85                  90                  95
Gly Arg Gly Ile Asn Ile
            100
<210>5
<211>104
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：2的α交配因子加氨基酸″E″和″A″加氨基酸2-18
<400>5
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
        35                  40                  45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
    50                  55                  60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys
                85                  90                  95
Ile Leu Gly Arg Gly Ile Asn Ile
            100
<210>6
<211>974
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多核苷酸
<400>6
atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat     60
gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gtatttcgac    120
attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct    180
caggcgtttc ctccttataa aatcgaggat cgcttcttca aaagagtgga tgaagtgata    240
aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaatc agcatcacta cgaggagtta    300
atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat    360
cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat    420
cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt    480
gacaaaaagc acactataat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa    540
aaactgaggg tcccaaaatg ggaaaaaaat gcgatagtta caattcacta ctacaatcct    600
ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtggaaggat ctgagaaatg gttgggaaga    660
aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa    720
tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct    780
gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagctga gaaaaggaga    840
tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatac tctgagaaaa    900
acctggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataacaccat    960
tccaagatgg cgtg                                                      974
<210>7
<211>323
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多肽
<400>7
Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile
1               5                   10                  15
Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val
            20                  25                  30
Val Ile Lys Asp Glu Tyr Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser
        35                  40                  45
His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro
    50                  55                  60
Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Arg Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Gln His His
                85                  90                  95
Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu
            100                 105                 110
Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr
        115                 120                 125
Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu
    130                 135                 140
Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile
145                 150                 155                 160
Asp Lys Lys His Thr Ile Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile
                165                 170                 175
Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile
            180                 185                 190
Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala
        195                 200                 205
Glu Trp Val Glu Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser
    210                 215                 220
Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu
225                 230                 235                 240
Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala
                245                 250                 255
Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val
            260                 265                 270
Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Arg Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe
        275                 280                 285
Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Thr Leu Arg Lys Thr Trp Asn Lys
    290                 295                 300
Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu His His Ser
305                 310                 315                 320
Lys Met Ala
<210>8
<211>954
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多核苷酸
<400>8
atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat     60
gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gttcttcgac    120
attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct    180
caggcgtttc ctccttataa aatcgagcct tctttcttca aaagagtgga tgaagtgata    240
aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaata ttcatcacta cgaggagtta    300
atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat    360
cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat    420
cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt    480
gacaaaaagc acactgtgat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa    540
aaactgaggg tcccaaaatg ggaaaaaaat gcgatagtta caattcacta ctacaatcct    600
ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtgcctggat ctgagaaatg gttgggaaga    660
aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa    720
tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct    780
gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagccga gaaaaggggg    840
tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatcc tctgagaaaa    900
cagtggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataa          954
<210>9
<211>317
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多肽
<400>9
Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile
1               5                   10                  15
Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val
            20                  25                  30
Val Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser
        35                  40                  45
His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro
    50                  55                  60
Pro Tyr Lys Ile Glu Pro Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile His His
                85                  90                  95
Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu
            100                 105                 110
Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr
        115                 120                 125
Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu
    130                 135                 140
Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile
145                 150                 155                 160
Asp Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile
                165                 170                 175
Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile
            180                 185                 190
Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala
        195                 200                 205
Glu Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser
    210                 215                 220
Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu
225                 230                 235                 240
Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala
                245                 250                 255
Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val
            260                 265                 270
Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe
        275                 280                 285
Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp Asn Lys
    290                 295                 300
Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu
305                 310                 315
<210>10
<211>954
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多核苷酸
<400>10
atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat     60
gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gtatttcgac    120
attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct    180
caggcgtttc ctccttataa aatcgaggat tctttcttca aaagagtgga tgaagtgata    240
aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaata ttcatcacta cgaggagtta    300
atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat    360
cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat    420
cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt    480
gacaaaaagc acactgtgat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa    540
aaactgaggg tcccaaaatg ggaaaaaaat gcgatagtta caattcacta ctacaatcct    600
ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtgcctggat ctgagaaatg gttgggaaga    660
aagtggggat ctccagatga tcagaaacat gtgatagaag aattcaattt tatagaagaa    720
tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct    780
gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagccga gaaaaggggg    840
tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatcc tctgagaaaa    900
cagtggaata aagatctttt agaagctcta ataggaggag atagcattga ataa          954
<210>11
<211>317
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多肽
<400>11
Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile
1               5                   10                  15
Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val
            20                  25                  30
Val Ile Lys Asp Glu Tyr Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser
        35                  40                  45
His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro
    50                  55                  60
Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile His His
                85                  90                  95
Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu
            100                 105                 110
Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr
        115                 120                 125
Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu
    130                 135                 140
Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile
145                 150                 155                 160
Asp Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile
                165                 170                 175
Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile
            180                 185                 190
Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala
        195                 200                 205
Glu Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser
    210                 215                 220
Pro Asp Asp Gln Lys His Val Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu
225                 230                 235                 240
Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala
                245                 250                 255
Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val
            260                 265                 270
Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe
        275                 280                 285
Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp Asn Lys
    290                 295                 300
Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu
305                 310                 315
<210>12
<211>954
<212>DNA
<213>人工序列
<223>合成产生的多核苷酸
<400>12
atgggtgttg atccttttga aaggaacaaa atattgggaa gaggcattaa tataggaaat     60
gcgcttgaag caccaaatga gggagactgg ggagtggtga taaaagatga gttcttcgac    120
attataaaag aagccggttt ctctcatgtt cgaattccaa taagatggag tacgcacgct    180
caggcgtttc ctccttataa aatcgaggat tctttcttca aaagagtgga tgaagtgata    240
aacggagccc tgaaaagagg actggctgtt gttataaatc agcatcacta cgaggagtta    300
atgaatgatc cagaagaaca caaggaaaga tttcttgctc tttggaaaca aattgctgat    360
cgttataaag actatcccga aactctattt tttgaaattc tgaatgaacc tcacggaaat    420
cttactccgg aaaaatggaa tgaactgctt gaggaagctc taaaagttat aagatcaatt    480
gacaaaaagc acactgtgat tataggcaca gctgaatggg ggggtatatc tgcccttgaa    540
aaactgaggg tcccaaaatg ggaaaaaaat gcgatagtta caattcacta ctacaatcct    600
ttcgaattta cccatcaagg agctgagtgg gtgcctggat ctgagaaatg gttgggaaga    660
aagtggggat ctccagatga tcagaaacat ttgatagaag aattcaattt tatagaagaa    720
tggtcaaaaa agaacaaaag accaatttac ataggtgagt ttggtgccta cagaaaagct    780
gaccttgaat caagaataaa atggacctcc tttgtcgttc gcgaagccga gaaaaggggg    840
tggagctggg catactggga attttgttcc ggttttggtg tttatgatcc tctgagaaaa    900
cagtggaata aagatctttt agaagcttta ataggaggag atagcattga ataa          954
<210>13
<211>317
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多肽
<400>13
Met Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile
1               5                   10                  15
Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val
            20                  25                  30
Val Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser
        35                  40                  45
His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro
    50                  55                  60
Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile
65                  70                  75                  80
Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Gln His His
                85                  90                  95
Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu
            100                 105                 110
Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr
        115                 120                 125
Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu
    130                 135                 140
Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile
145                 150                 155                 160
Asp Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile
                165                 170                 175
Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile
            180                 185                 190
Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala
        195                 200                 205
Glu Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser
    210                 215                 220
Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu
225                 230                 235                 240
Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala
                245                 250                 255
Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val
            260                 265                 270
Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe
        275                 280                 285
Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp Asn Lys
    290                 295                 300
Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu
305                 310                 315
<210>14
<211>1311
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多核苷酸
<400>14
atggccaagt actccgagct ggaaaagggc ggggtcataa tgcaggcgtt ctactgggac     60
gtgccttcag gaggaatatg gtgggacaca atacggcaga agataccgga gtggtacgat    120
gccggaatct ccgcaatatg gattcccccg gcgagcaagg gcatgggcgg cgcctattcg    180
atgggctacg acccctacga cttctttgac ctcggtgagt acgaccagaa gggaacggta    240
gagacgcgct ttggctccaa gcaggagctc gtgaacatga taaacaccgc ccacgcctat    300
ggcatgaagg taatagccga tatagtcatc aaccaccgcg ccggcggtga cctggagtgg    360
aaccccttcg tgaacgacta tacctggacc gacttctcaa aggtcgcgtc gggtaaatac    420
acggccaact acctcgactt ccacccgaac gagctccatg cgggcgattc cggaacattt    480
ggaggctatc ccgacatatg ccacgacaag agctgggacc agtactggct ctgggccagc    540
caggagagct acgcggcata tctcaggagc atcggcatcg atgcctggcg cttcgactac    600
gtcaagggct atgctccctg ggtcgtcaag gactggctga actggtgggg aggctgggcg    660
gttggagagt actgggacac caacgtcgac gctgttctca actgggcata ctcgagcggt    720
gccaaggtct ttgacttcgc cctctactac aagatggatg aggcctttga caacaaaaac    780
attccagcgc tcgtctctgc ccttcagaac ggccagactg ttgtctcccg cgacccgttc    840
aaggccgtaa cctttgtagc aaaccacgac accgatataa tctggaacaa gtatccagcc    900
tacgcgttca tcctcaccta cgagggccag ccgacaatat tctaccgcga ctacgaggag    960
tggctcaaca aggataagct caagaacctc atctggatac atgagaacct cgccggagga    1020
agcaccgaca tagtctacta cgataacgat gaactcatct tcgtcaggaa cggctacggg    1080
gacaagccgg ggcttataac ctacatcaac ctaggctcga gcaaggccgg aaggtgggtt    1140
tatgtgccga agttcgcggg cgcgtgcatc cacgagtata ctggtaacct cggaggctgg    1200
gtagacaagt acgtctactc aagcggctgg gtctatctcg aagctccagc ttacgaccct    1260
gccaacgggc agtatggcta ctccgtgtgg agctactgcg gggtgggctg a             1311
<210>15
<211>436
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多肽
<400>15
Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Lys Gly Gly Val Ile Met Gln Ala
1               5                   10                  15
Phe Tyr Trp Asp Val Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg
            20                  25                  30
Gln Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile
        35                  40                  45
Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp
    50                  55                  60
Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gln Lys Gly Thr Val
65                  70                  75                  80
Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gln Glu Leu Val Asn Met Ile Asn Thr
                85                  90                  95
Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Val Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His
            100                 105                 110
Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Val Asn Asp Tyr Thr
        115                 120                 125
Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr
    130                 135                 140
 Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gln Tyr Trp
                165                 170                 175
Leu Trp Ala Ser Gln Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly
            180                 185                 190
Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Val
       195                 200                 205
Val Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr
    210                 215                 220
Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala Val Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly
225                 230                 235                 240
Ala Lys Val Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe
                245                 250                 255
Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Val Ser Ala Leu Gln Asn Gly Gln
            260                 265                 270
Thr Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn
        275                 280                 285
His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile
    290                 295                 300
Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu
305                 310                 315                 320
Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Glu Asn
                325                 330                 335
Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Val Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu
            340                 345                 350
Ile Phe Val Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr
        355                 360                 365
Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Val Tyr Val Pro Lys
    370                 375                 380
Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp
385                 390                 395                 400
Val Asp Lys Tyr Val Tyr Ser Ser Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro
                405                 410                 415
Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gln Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr
            420                 425                 430
Cys Gly Val Gly
        435
<210>16
<211>972
<212>DNA
<213>热袍菌某种(Thermotoga sp.)
<400>16
atggaacagt cagttgctga aagtgatagc aactcagcat ttgaatacaa caaaatggta     60
ggtaaaggag taaatattgg aaatgcttta gaagctcctt tcgaaggagc ttggggagta    120
agaattgagg atgaatattt tgagataata aagaaaaggg gatttgattc tgttaggatt    180
cccataagat ggtcagcaca tatatccgaa aagccaccat atgatattga caggaatttc    240
ctcgaaagag ttaaccatgt tgtcgatagg gctcttgaga ataatttaac agtaatcatc    300
aatacgcacc attttgaaga actctatcaa gaaccggata aatacggcga tgttttggtg    360
gaaatttgga gacagattgc aaaattcttt aaagattacc cggaaaatct gttctttgaa    420
atctacaacg agcctgctca gaacttgaca gctgaaaaat ggaacgcact ttatccaaaa    480
gtgctcaaag ttatcaggga gagcaatcca acccggattg tcattatcga tgctccaaac    540
tgggcacact atagcgcagt gagaagtcta aaattagtca acgacaaacg catcattgtt    600
tccttccatt actacgaacc tttcaaattc acacatcagg gtgccgaatg ggttaatccc    660
atcccacctg ttagggttaa gtggaatggc gaggaatggg aaattaacca aatcagaagt    720
catttcaaat acgtgagtga ctgggcaaag caaaataacg taccaatctt tcttggtgaa    780
ttcggtgctt attcaaaagc agacatggac tcaagggtta agtggaccga aagtgtgaga    840
aaaatggcgg aagaatttgg attttcatac gcgtattggg aattttgtgc aggatttggc    900
atatacgata gatggtctca aaactggatc gaaccattgg caacagctgt ggttggcaca    960
ggcaaagagt aa                                                        972
<210>17
<211>323
<212>PRT
<213>热袍菌某种
<400>17
Met Glu Gln Ser Val Ala Glu Ser Asp Ser Asn Ser Ala Phe Glu Tyr
1               5                   10                  15
Asn Lys Met Val Gly Lys Gly Val Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala
            20                  25                  30
Pro Phe Glu Gly Ala Trp Gly Val Arg Ile Glu Asp Glu Tyr Phe Glu
        35                  40                  45
Ile Ile Lys Lys Arg Gly Phe Asp Ser Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp
    50                  55                  60
Ser Ala His Ile Ser Glu Lys Pro Pro Tyr Asp Ile Asp Arg Asn Phe
65                  70                  75                  80
Leu Glu Arg Val Asn His Val Val Asp Arg Ala Leu Glu Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Thr Val Ile Ile Asn Thr His His Phe Glu Glu Leu Tyr Gln Glu Pro
            100                 105                 110
Asp Lys Tyr Gly Asp Val Leu Val Glu Ile Trp Arg Gln Ile Ala Lys
        115                 120                 125
Phe Phe Lys Asp Tyr Pro Glu Asn Leu Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu
    130                 135                 140
Pro Ala Gln Asn Leu Thr Ala Glu Lys Trp Asn Ala Leu Tyr Pro Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Lys Val Ile Arg Glu Ser Asn Pro Thr Arg Ile Val Ile Ile
                165                 170                 175
Asp Ala Pro Asn Trp Ala His Tyr Ser Ala Val Arg Ser Leu Lys Leu
            180                 185                 190
Val Asn Asp Lys Arg Ile Ile Val Ser Phe His Tyr Tyr Glu Pro Phe
        195                 200                 205
Lys Phe Thr His Gln Gly Ala Glu Trp Val Asn Pro Ile Pro Pro Val
    210                 215                 220
Arg Val Lys Trp Asn Gly Glu Glu Trp Glu Ile Asn Gln Ile Arg Ser
225                 230                 235                 240
His Phe Lys Tyr Val Ser Asp Trp Ala Lys Gln Asn Asn Val Pro Ile
                245                 250                 255
Phe Leu Gly Glu Phe Gly Ala Tyr Ser Lys Ala Asp Met Asp Ser Arg
            260                 265                 270
Val Lys Trp Thr Glu Ser Val Arg Lys Met Ala Glu Glu Phe Gly Phe
        275                 280                 285
Ser Tyr Ala Tyr Trp Glu Phe Cys Ala Gly Phe Gly Ile Tyr Asp Arg
    290                 295                 300
Trp Ser Gln Asn Trp Ile Glu Pro Leu Ala Thr Ala Val Val Gly Thr
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu
<210>18
<211>1042
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多核苷酸
<400>18
ggatccacca tgagggtgtt gctcgttgcc ctcgctctcc tggctctcgc tgcgagcgcc     60
accagcggcg tggacccgtt cgagaggaac aagatcctgg gcaggggcat caacatcggc    120
aacgccctgg aggccccgaa cgagggcgac tggggcgtgg tgatcaagga cgagtacttc    180
gacatcatca aggaggccgg cttcagccac gtgagaatcc cgatcaggtg gagcacccac    240
gcccaggcct tcccgccgta caagatcgag gacaggttct tcaagagggt ggacgaggtg    300
atcaacggcg ccctgaagag gggcctggcc gtggtgatca accagcacca ctacgaggag    360
ctgatgaacg acccggagga gcacaaggag aggttcctgg ccctgtggaa gcagatcgcc    420
gacaggtaca aggactaccc ggagaccctg ttcttcgaga tcctgaacga gccgcacggc    480
aacctgaccc cggagaagtg gaacgagctg ctggaggagg ccctgaaggt gatcaggagc    540
atcgacaaga agcacaccat catcatcggc accgccgagt ggggcggcat cagcgccctg    600
gagaagctga gggtgccgaa gtgggagaag aacgccatcg tgaccatcca ctactacaac    660
ccgttcgagt tcacccacca gggcgccgag tgggtggagg gcagcgagaa gtggctgggc    720
aggaagtggg gcagcccgga cgaccagaag cacctgatcg aggagttcaa cttcatcgag    780
gagtggagca agaagaacaa gaggccgatc tacatcggcg agttcggcgc ctacaggaag    840
gccgacctgg agagcaggat caagtggacc agcttcgtgg tgagggaggc cgagaagagg    900
aggtggagct gggcctactg ggagttctgc agcggcttcg gcgtgtacga caccctgagg    960
aagacctgga acaaggacct gctggaggcc ctgatcggcg gcgacagcat cgagagcgag    1020
aaggacgagc tgtgagagct ca                                             1042
<210>19
<211>341
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多肽
<400>19
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Ala Thr Ser Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg
            20                  25                  30
Gly Ile Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp
        35                  40                  45
Gly Val Val Ile Lys Asp Glu Tyr Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly
    50                  55                  60
Phe Ser His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala
65                  70                  75                  80
Phe Pro Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Arg Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu
                85                  90                  95
Val Ile Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Gln
            100                 105                 110
His His Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg
        115                 120                 125
Phe Leu Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr
145                 150                 155                 160
Pro Glu Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg
                165                 170                 175
Ser Ile Asp Lys Lys His Thr Ile Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly
            180                 185                 190
Gly Ile Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn
        195                 200                 205
Ala Ile Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Ala Glu Trp Val Glu Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp
225                 230                 235                 240
Gly Ser Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile
                245                 250                 255
Glu Glu Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe
            260                 265                 270
Gly Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser
        275                 280                 285
Phe Val Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Arg Trp Ser Trp Ala Tyr Trp
    290                 295                 300
Glu Phe Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Thr Leu Arg Lys Thr Trp
305                 310                 315                 320
Asn Lys Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu Ser
                325                 330                 335
Glu Lys Asp Glu Leu
            340
<210>20
<211>1042
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多核苷酸
<400>20
ggatccacca tgagggtgtt gctcgttgcc ctcgctctcc tggctctcgc tgcgagcgcc     60
accagcggcg tggacccgtt cgagaggaac aagatcctgg gcaggggcat caacatcggc    120
aacgccctgg aggccccgaa cgagggcgac tggggcgtgg tgatcaagga cgagttcttc    180
gacatcatca aggaggccgg cttcagccac gtgagaatcc cgatcaggtg gagcacccac    240
gcccaggcct tcccgccgta caagatcgag ccgagcttct tcaagagggt ggacgaggtg    300
atcaacggcg ccctgaagag gggcctggcc gtggtgatca acatccacca ctacgaggag    360
ctgatgaacg acccggagga gcacaaggag aggttcctgg ccctgtggaa gcagatcgcc    420
gacaggtaca aggactaccc ggagaccctg ttcttcgaga tcctgaacga gccgcacggc    480
aacctgaccc cggagaagtg gaacgagctg ctggaggagg ccctgaaggt gatcaggagc    540
atcgacaaga agcacaccgt gatcatcggc accgccgagt ggggcggcat cagcgccctg    600
gagaagctga gggtgccgaa gtgggagaag aacgccatcg tgaccatcca ctactacaac    660
ccgttcgagt tcacccacca gggcgccgag tgggtgccgg gcagcgagaa gtggctgggc    720
aggaagtggg gcagcccgga cgaccagaag cacctgatcg aggagttcaa cttcatcgag    780
gagtggagca agaagaacaa gaggccgatc tacatcggcg agttcggcgc ctacaggaag    840
gccgacctgg agagcaggat caagtggacc agcttcgtgg tgagggaggc cgagaagagg    900
ggctggagct gggcctactg ggagttctgc agcggcttcg gcgtgtacga cccgctgagg    960
aagcagtgga acaaggacct gctggaggcc ctgatcggcg gcgacagcat cgagagcgag    1020
aaggacgagc tgtgagagct ca                                             1042
<210>21
<211>341
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多肽
<400>21
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Ala Thr Ser Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg
            20                  25                  30
Gly Ile Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp
        35                  40                  45
Gly Val Val Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly
    50                  55                  60
Phe Ser His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala
65                  70                  75                  80
Phe Pro Pro Tyr Lys Ile Glu Pro Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu
                85                  90                  95
Val Ile Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile
            100                 105                 110
His His Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg
        115                 120                 125
Phe Leu Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr
145                 150                 155                 160
Pro Glu Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg
                165                 170                 175
Ser Ile Asp Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly
            180                 185                 190
Gly Ile Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn
        195                 200                 205
Ala Ile Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Ala Glu Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp
225                 230                 235                 240
Gly Ser Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile
                245                 250                 255
Glu Glu Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe
            260                 265                 270
Gly Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser
        275                 280                 285
Phe Val Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp
    290                 295                 300
Glu Phe Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp
305                 310                 315                 320
Asn Lys Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu Ser
                325                 330                 335
Glu Lys Asp Glu Leu
            340
<210>22
<211>1042
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多核苷酸
<400>22
ggatccacca tgagggtgtt gctcgttgcc ctcgctctcc tggctctcgc tgcgagcgcc     60
accagcggcg tggacccgtt cgagaggaac aagatcctgg gcaggggcat caacatcggc    120
aacgccctgg aggccccgaa cgagggcgac tggggcgtgg tgatcaagga cgagtacttc    180
gacatcatca aggaggccgg cttcagccac gtgagaatcc cgatcaggtg gagcacccac    240
gcccaggcct tcccgccgta caagatcgag gacagcttct tcaagagggt ggacgaggtg    300
atcaacggcg ccctgaagag gggcctggcc gtggtgatca acatccacca ctacgaggag    360
ctgatgaacg acccggagga gcacaaggag aggttcctgg ccctgtggaa gcagatcgcc    420
gacaggtaca aggactaccc ggagaccctg ttcttcgaga tcctgaacga gccgcacggc    480
aacctgaccc cggagaagtg gaacgagctg ctggaggagg ccctgaaggt gatcaggagc    540
atcgacaaga agcacaccgt gatcatcggc accgccgagt ggggcggcat cagcgccctg    600
gagaagctga gggtgccgaa gtgggagaag aacgccatcg tgaccatcca ctactacaac    660
ccgttcgagt tcacccacca gggcgccgag tgggtgccgg gcagcgagaa gtggctgggc    720
aggaagtggg gcagcccgga cgaccagaag cacgtgatcg aggagttcaa cttcatcgag    780
gagtggagca agaagaacaa gaggccgatc tacatcggcg agttcggcgc ctacaggaag    840
gccgacctgg agagcaggat caagtggacc agcttcgtgg tgagggaggc cgagaagagg    900
ggctggagct gggcctactg ggagttctgc agcggcttcg gcgtgtacga cccgctgagg    960
aagcagtgga acaaggacct gctggaggcc ctgatcggcg gcgacagcat cgagagcgag    1020
aaggacgagc tgtgagagct ca                                             1042
<210>23
<211>341
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成产生的多肽
<400>23
Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Ala Thr Ser Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg
            20                  25                  30
Gly Ile Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp
        35                  40                  45
Gly Val Val Ile Lys Asp Glu Tyr Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly
    50                  55                  60
Phe Ser His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala
65                  70                  75                  80
Phe Pro Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu
                85                  90                  95
Val Ile Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile
            100                 105                 110
His His Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg
        115                 120                 125
Phe Leu Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr
145                 150                 155                 160
Pro Glu Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg
                165                 170                 175
Ser Ile Asp Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly
            180                 185                 190
Gly Ile Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn
        195                 200                 205
Ala Ile Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln
    210                 215                 220
Gly Ala Glu Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp
225                 230                 235                 240
Gly Ser Pro Asp Asp Gln Lys His Val Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile
                245                 250                 255
Glu Glu Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe
            260                 265                 270
Gly Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser
        275                 280                 285
Phe Val Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp
    290                 295                 300
Glu Phe Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp
305                 310                 315                 320
Asn Lys Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu Ser
                325                 330                 335
Glu Lys Asp Glu Leu
            340

Claims (133)

1.分离的、合成的或重组的核酸，该核酸包含：
(a)，(i)与如下核酸序列在至少大约20、30、40、50、60、70、75、80、90、100、125、150、175、200或225或更多个残基的区域内，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22，或(ii)在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：22的核酸杂交的核酸(多核苷酸)序列，并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在0.2×SSC中在大约65℃的温度洗涤大约15分钟，其中任选地，所述核酸的长度是至少大约20、30、40、50、60、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个残基，或基因的全长或转录体的全长；
其中，(i)或(ii)所述的核酸编码至少一种具有葡聚糖酶活性的多肽，或编码这样的多肽或肽，所述多肽或肽能够产生与具有下列序列的多肽特异性结合的抗体：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23，
并且，(i)或(ii)所述的核酸序列包含至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多种或所有下列基于SEQ ID NO：1的序列的核苷酸残基变化：
在位置4至6的核苷酸是AAT或AAC，
在位置37至39的核苷酸是AAT或AAC，
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置169至171的核苷酸是GAT或GAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置181至183的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置184至186的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置187至189的核苷酸是CAT或CAC，
在位置187至189的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置205至207的核苷酸是CAT或CAC，
在位置205至207的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置205至207的核苷酸是TAT或TAC，
在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置211至213的核苷酸是GAA或GAG，
在位置211至213的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是CAA或CAG，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置211至213的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置220至222的核苷酸是GAA或GAG，
在位置220至222的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置220至222的核苷酸是ATG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置301至303的核苷酸是TAT或TAC，
在位置307至309的核苷酸是TGT或TGC，
在位置307至309的核苷酸是CAA或CAG，
在位置316至318的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置325至327的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置346至348的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置346至348的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置388至390的核苷酸是TAT或TAC，
在位置391至393的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置442至444的核苷酸是CAT或CAC，
在位置484至486的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置547至549的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置556至558的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置556至558的核苷酸是GAT或GAC，
在位置556至558的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置556至558的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置571至573的核苷酸是TGT或TGC，
在位置571至573的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置601至603的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置601至603的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置601至603的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置646至648的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置688至690的核苷酸是AAA或AAG，
在位置688至690的核苷酸是CAA或CAG，
在位置688至690的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置691至693的核苷酸是ATG，
在位置691至693的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置700至702的核苷酸是GAT或GAC，
在位置736至738的核苷酸是CAA或CAG，
在位置736至738的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TAT或TAC，
在位置784至786的核苷酸是CAT或CAC，
在位置784至786的核苷酸是ATG，
在位置784至786的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置784至786的核苷酸是CAA或CAG，
在位置808至810的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置811至813的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是TGT或TGC，
在位置826至828的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置829至831的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置868至870的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置892至894的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置892至894的核苷酸是AAT或AAC，
在位置892至894的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置892至894的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置892至894的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置898至900的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG，
在位置913至915的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置934至936的核苷酸是ATT、ATC或ATA，和/或
在位置943至945的核苷酸是ATT、ATC或ATA；
并且任选地，所述序列同一性通过运用序列比较算法的分析或通过视觉检查来确定，并且任选地所述序列比较算法是BLAST版本2.2.2算法，其中过滤设置被设置为blastall-p blastp-d“nr pataa”-F F，并且所有其它选项被设置为默认值；
(b)，(a)所述的核酸(多核苷酸)序列，其编码具有葡聚糖酶活性但是缺乏信号序列或前原蛋白序列或同源启动子序列的多肽；
(c)，(a)或(b)所述的核酸(多核苷酸)，其编码具有葡聚糖酶活性并且进一步包括异源氨基酸序列的多肽，或(a)或(b)所述的核酸(多核苷酸)，其包括异源的核苷酸序列；
(d)，(c)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源氨基酸序列包含编码异源(前导)信号序列或标记物或表位的序列，或由编码异源(前导)信号序列或标记物或表位的序列组成，或者所述异源核苷酸序列包含异源的启动子序列；
(e)，(c)或(d)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源的核苷酸序列编码异源(前导)信号序列，所述异源(前导)信号序列包括N-端和/或C-端突出端，或由之组成，用于靶向内质网(ER)或内膜，或靶向玉米内质网(ER)或内膜系统，或者所述异源的序列编码限制性位点；
(f)，(d)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源的启动子序列包括组成型或诱导型启动子、细胞类型特异性启动子、或植物特异性启动子、或玉米特异性启动子，或由之组成；
(g)，(a)到(f)的任一项所述的核酸(多核苷酸)，其中所述葡聚糖酶活性包括：内切葡聚糖酶活性；催化内切1，4-β-D-糖苷键或内部的β-1，3-糖苷键的水解，水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖以产生较小分子量的多糖或寡聚体；内切-β-1，4-内切葡聚糖酶活性；1，4-β-D-糖苷键活性，包括水解纤维素、纤维素衍生物、地衣聚糖或谷物、或包括羧甲基纤维素或羟乙基纤维素的纤维素衍生物、或包括β-D-葡聚糖或木葡聚糖的谷物中的1，4-β-D-糖苷键；水解包含1，4-β-糖苷-联接的D-吡喃型葡萄糖的多糖；水解纤维素、纤维素衍生物或半纤维素；水解在木材或纸浆或木材或纸品中的纤维素或半纤维素；催化在饲料、食品或饮料、或包含基于谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、面团、水果或蔬菜的饲料、食品或饮料中的葡聚糖的水解；催化在微生物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或植物细胞中的葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖的水解；
(h)，(a)到(g)的任一项所述的核酸(多核苷酸)，其中所述葡聚糖酶活性是热稳定的，或所述多肽在包含如下温度范围的条件下保持葡聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约37℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃，或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高的温度；或
(i)，(a)到(g)的任一项所述的核酸(多核苷酸)，其中所述葡聚糖酶活性是耐热的，或所述多肽在暴露于如下范围内的温度之后保持葡聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约37℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃，或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高的温度；
(j)，(h)或(i)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述多肽在如下酸性pH下是耐热的或热活性的：约pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0或更低pH，或所述多肽在如下pH下是耐热的或热活性的：约pH7.0、pH7.5、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0或更高pH；
(k)，(a)到(j)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中在隐蔽性转录起始位点中的核苷酸残基被修饰以除去大多数或所有截短的转录体的产生；
(l)，(k)所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中在隐蔽性转录起始位点中的所述核苷酸残基的修饰包括核糖体结合位点(RBS)的改变；
(m)，(k)或(l)所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中在隐蔽性转录起始位点中的所述核苷酸残基的修饰包括在SEQ ID NO：3的残基77到106中的下列修饰：ATGAGGGCGACTGGGGAGTCGTGATAAAAG；或等价物；或
(n)，与(a)到(n)的任一项所述的核苷酸序列完全互补的核酸序列。
2.权利要求1所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述核酸包含SEQID NO：1的序列修饰，并且
(a)所述修饰包括一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多种或所有下列核苷酸变化，或由这些数目的下列变化组成：
在位置4至6的核苷酸是AAT或AAC，
在位置37至39的核苷酸是AAT或AAC，
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置169至171的核苷酸是GAT或GAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置181至183的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置184至186的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置187至189的核苷酸是CAT或CAC，
在位置187至189的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置205至207的核苷酸是CAT或CAC，
在位置205至207的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置205至207的核苷酸是TAT或TAC，
在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置211至213的核苷酸是GAA或GAG，
在位置211至213的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是CAA或CAG，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置211至213的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置220至222的核苷酸是GAA或GAG，
在位置220至222的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置220至222的核苷酸是ATG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置301至303的核苷酸是TAT或TAC，
在位置307至309的核苷酸是TGT或TGC，
在位置307至309的核苷酸是CAA或CAG，
在位置316至318的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置325至327的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置346至348的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置346至348的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置388至390的核苷酸是TAT或TAC，
在位置391至393的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置442至444的核苷酸是CAT或CAC，
在位置484至486的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置547至549的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置556至558的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置556至558的核苷酸是GAT或GAC，
在位置556至558的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置571至573的核苷酸是TGT或TGC，
在位置571至573的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置601至603的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置601至603的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置601至603的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置646至648的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置688至690的核苷酸是AAA或AAG，
在位置688至690的核苷酸是CAA或CAG，
在位置688至690的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置691至693的核苷酸是ATG，
在位置691至693的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置700至702的核苷酸是GAT或GAC，
在位置736至738的核苷酸是CAA或CAG，
在位置736至738的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TAT或TAC，
在位置784至786的核苷酸是CAT或CAC，
在位置784至786的核苷酸是ATG，
在位置784至786的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置784至786的核苷酸是CAA或CAG，
在位置808至810的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置811至813的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是TGT或TGC，
在位置826至828的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置829至831的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置868至870的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置892至894的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置892至894的核苷酸是AAT或AAC，
在位置892至894的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置892至894的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置892至894的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置898至900的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG，
在位置913至915的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置934至936的核苷酸是ATT、ATC或ATA，和/或
在位置943至945的核苷酸是ATT、ATC或ATA；
(b)，(a)所述的核酸序列，其中所述修饰由一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多种或所有下列变化组成：
在位置4至6的核苷酸是AAT或AAC，
在位置37至39的核苷酸是AAT或AAC，
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置169至171的核苷酸是GAT或GAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置181至183的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置184至186的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置187至189的核苷酸是CAT或CAC，
在位置187至189的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置205至207的核苷酸是CAT或CAC，
在位置205至207的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置205至207的核苷酸是TAT或TAC，
在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置211至213的核苷酸是GAA或GAG，
在位置211至213的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是CAA或CAG，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置211至213的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置220至222的核苷酸是GAA或GAG，
在位置220至222的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置220至222的核苷酸是ATG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置301至303的核苷酸是TAT或TAC，
在位置307至309的核苷酸是TGT或TGC，
在位置307至309的核苷酸是CAA或CAG，
在位置316至318的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置325至327的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置346至348的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置346至348的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置388至390的核苷酸是TAT或TAC，
在位置391至393的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置442至444的核苷酸是CAT或CAC，
在位置484至486的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置547至549的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置556至558的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置556至558的核苷酸是GAT或GAC，
在位置556至558的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置556至558的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置571至573的核苷酸是TGT或TGC，
在位置571至573的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置601至603的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置601至603的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置601至603的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置646至648的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置688至690的核苷酸是AAA或AAG，
在位置688至690的核苷酸是CAA或CAG，
在位置688至690的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置691至693的核苷酸是ATG，
在位置691至693的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置700至702的核苷酸是GAT或GAC，
在位置736至738的核苷酸是CAA或CAG，
在位置736至738的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TAT或TAC，
在位置784至786的核苷酸是CAT或CAC，
在位置784至786的核苷酸是ATG，
在位置784至786的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置784至786的核苷酸是CAA或CAG，
在位置808至810的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置811至813的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是TGT或TGC，
在位置826至828的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置829至831的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置868至870的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置892至894的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置892至894的核苷酸是AAT或AAC，
在位置892至894的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置892至894的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置892至894的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置898至900的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG，
在位置913至915的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置934至936的核苷酸是ATT、ATC或ATA，和/或
在位置943至945的核苷酸是ATT、ATC或ATA；
(c)，(b)所述的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO：1的序列并且包含所有的下列变化，或由所有下列变化组成：
在位置4至6的核苷酸是AAT或AAC，
在位置37至39的核苷酸是AAT或AAC，
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置169至171的核苷酸是GAT或GAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置181至183的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置184至186的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置187至189的核苷酸是CAT或CAC，
在位置187至189的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置205至207的核苷酸是CAT或CAC，
在位置205至207的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置205至207的核苷酸是TAT或TAC，
在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置211至213的核苷酸是GAA或GAG，
在位置211至213的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是CAA或CAG，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置211至213的核苷酸是ACT、ACC、ACA或ACG，
在位置220至222的核苷酸是GAA或GAG，
在位置220至222的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置220至222的核苷酸是ATG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置301至303的核苷酸是TAT或TAC，
在位置307至309的核苷酸是TGT或TGC，
在位置307至309的核苷酸是CAA或CAG，
在位置316至318的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置325至327的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置346至348的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置346至348的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置388至390的核苷酸是TAT或TAC，
在位置391至393的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置442至444的核苷酸是CAT或CAC，
在位置484至486的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置547至549的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置556至558的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置556至558的核苷酸是GAT或GAC，
在位置556至558的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置556至558的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置571至573的核苷酸是TGT或TGC，
在位置571至573的核苷酸是TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG，
在位置601至603的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置601至603的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置601至603的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置646至648的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置688至690的核苷酸是AAA或AAG，
在位置688至690的核苷酸是CAA或CAG，
在位置688至690的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置691至693的核苷酸是ATG，
在位置691至693的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置700至702的核苷酸是GAT或GAC，
在位置736至738的核苷酸是CAA或CAG，
在位置736至738的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置772至774的核苷酸是TAT或TAC，
在位置784至786的核苷酸是CAT或CAC，
在位置784至786的核苷酸是ATG，
在位置784至786的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置784至786的核苷酸是CAA或CAG，
在位置808至810的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置811至813的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置826至828的核苷酸是TGT或TGC，
在位置826至828的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置829至831的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置868至870的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置892至894的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置892至894的核苷酸是AAT或AAC，
在位置892至894的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置892至894的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置892至894的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置898至900的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG，
在位置913至915的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置934至936的核苷酸是ATT、ATC或ATA，和/或
在位置943至945的核苷酸是ATT、ATC或ATA；
(d)，(a)到(c)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述修饰包含下列变化，或由下列变化组成：
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，和
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
(e)，(a)到(c)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述修饰包含下列变化，或由下列变化组成：
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，和
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG；
(f)，(a)到(c)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述修饰包含下列变化，或由下列变化组成：
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，和
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT；
(g)，(a)到(c)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述修饰包含下列变化，或由下列变化组成：
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，和
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG；
(h)，(a)到(c)任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述修饰包含下列变化，或由下列变化组成：
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置280至282的核苷酸是CAA或CAG，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，和
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG；
(i)，(a)到(c)任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述修饰包含下列变化，或由下列变化组成：
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置208至210的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，和
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG；或
(j)，(a)到(c)的任一项所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述修饰包含下列变化，或由下列变化组成：
在位置112至114的核苷酸是TAT或TAC，
在位置181至183的核苷酸是CAA或CAG，
在位置205至207的核苷酸是GAA或GAG，
在位置211至213的核苷酸是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
在位置496至498的核苷酸是GTT、GTC、GTA或GTG，
在位置547至549的核苷酸是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
在位置571至573的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置634至636的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，
在位置691至693的核苷酸是ATT、ATC或ATA，
在位置826至828的核苷酸是GCT、GCC、GCA或GCG，
在位置838至840的核苷酸是GGT、GGC、GGA或GGG，
在位置889至891的核苷酸是CCA、CCC、CCG或CCT，和
在位置901至903的核苷酸是CAA或CAG。
3.权利要求2所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述核酸序列编码具有下列氨基酸序列的多肽：
(a)，SEQ ID NO：2的氨基酸序列且所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：2的至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或更多种或所有下列氨基酸残基变化：
在氨基酸位置2的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置13的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置57的丝氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置61的酪氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置62的丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置70的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置71的精氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置101的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置106的谷氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置109的谷氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置130的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置131的苯丙氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置148的谷氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置162的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置216的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置230的组氨酸是赖氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置234的谷氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置246的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置246的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置262的亮氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置270的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置271的苯丙氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置277的谷氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置290的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置300的赖氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置305的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置312的甘氨酸是异亮氨酸，和/或
在氨基酸位置315的丝氨酸是异亮氨酸；或
(b)，(a)所述的多肽，其具有SEQ ID NO：2的序列并且由SEQ ID NO：2上的至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或所有下列氨基酸残基变化组成：
在氨基酸位置2的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置13的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置57的丝氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置61的酪氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置62的丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置70的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置71的精氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置101的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置106的谷氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置109的谷氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置130的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置131的苯丙氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置148的谷氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置162的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置216的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置230的组氨酸是赖氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置234的谷氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置246的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置246的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置262的亮氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置270的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置271的苯丙氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置277的谷氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置290的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置300的赖氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置305的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置312的甘氨酸是异亮氨酸，和/或
在氨基酸位置315的丝氨酸是异亮氨酸。
4.鉴定编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸的探针，其中所述探针包含具有这样的序列的核酸，所述这样的序列包含：
(a)，(i)权利要求1至3任一项所述序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或150或更多个连续碱基；或(ii)权利要求1至3任一项所述的序列，其中所述的探针通过结合或杂交识别所述核酸；或
(b)，(a)所述的核酸探针，其中所述的探针包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含权利要求1至3任一项所述序列的至少大约10到50、大约20到60、大约30到70、大约40到80、大约60到100或大约50到150个连续碱基。
5.用于扩增编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸的扩增引物对，其中
(a)，所述引物对能够扩增包含权利要求1至3任一项所述的序列的核酸；
(b)，(a)所述的扩增引物对，其中所述扩增引物对的成员包含寡核苷酸，其包含所述序列的至少大约10到50个连续碱基，或所述序列的大约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个连续碱基；或
(c)，所述的引物对包含第一成员和第二成员，所述第一成员由权利要求1-3任一项所示序列的大约前(5’)12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个残基所示的序列组成，所述第二成员具有所述第一成员的互补链的大约前(5’)12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个残基所示的序列。
6.编码葡聚糖酶的核酸，包括：(a)，使用权利要求5所述的扩增引物对通过扩增多核苷酸产生的序列；(b)，(a)所述的序列，其中所述扩增通过聚合酶链反应(PCR)进行；(c)，(a)或(b)所述的序列，其中所述核酸通过扩增基因文库产生；或(d)，(c)所述的序列，其中所述基因文库是环境文库。
7.分离的、合成的或重组的葡聚糖酶，其由权利要求6所述的编码葡聚糖酶的核酸编码。
8.扩增编码具有葡聚糖活性的多肽的核酸的方法，该方法包括：(a)用能够扩增权利要求1至3任一项所述的核酸序列或其子序列的扩增引物对来扩增模板核酸；或(b)，(a)所述的方法，其中所述扩增引物对包含权利要求5所述的扩增引物对或由之组成。
9.表达盒、载体或克隆载体，其包括(a)，权利要求1至3任一项所述的核酸序列；(b)，(a)所述的表达盒、载体或克隆载体，包括病毒载体、质粒、噬菌体、噬粒、粘粒、fos-质粒、细菌噬菌体或人工染色体，或被插入到其中；(c)，(b)所述的表达盒、载体或克隆载体，其中所述病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体；或(d)，(a)、(b)或(c)所述的表达盒、载体或克隆载体，其包括细菌人工染色体(BAC)、质粒、细菌噬菌体P1衍生载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)或被插入到其中。
10.转化细胞：(a)，包括含有权利要求1-3之一所述的序列的核酸；(b)，包含权利要求9所述的表达盒、载体或克隆载体；(c)，(a)或(b)所述的转化细胞，其中所述细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞；或(d)，(c)所述的转化细胞，其中所述细菌细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)或葡萄球菌属(Staphylococcus)内的任何种、或大肠杆菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
11.转基因非人动物：(a)，包含权利要求1至3任一项所述的序列，或权利要求9所述的表达盒、载体或克隆载体，或权利要求10所述的转化细胞；或(b)，(a)所述的转基因非人动物，其中所述动物是小鼠。
12.转基因植物：(a)，包含权利要求1至3任一项所述的序列，或权利要求9所述的表达盒、载体或克隆载体，或权利要求10所述的转化细胞；或(b)，(a)所述的转基因植物，其中所述植物是玉米植株、高粱植株、马铃薯植株、番茄植株、小麦植株、油菜植株、油菜籽植株、大豆植株、稻植株、大麦植株、草类、烟草植株；或饲草和/或动物或反刍动物的饲料植物，并且任选地，所述饲草或饲料植物是干草、玉米、粟米、大豆、小麦、荞麦、大麦、紫花苜蓿、黑麦、一年生草、高粱、苏丹草、费尔德草原的草或绿毛蒺藜草。
13.转基因种子：(a)，包含权利要求1至3任一项所述的序列，或权利要求9所述的表达盒、载体或克隆载体，或权利要求10所述的转化细胞；或(b)，(a)所述的转基因种子，其中所述种子是玉米种子、小麦粒、油菜、油菜籽、大豆种子、棕榈仁、向日葵种子、芝麻种子、稻、大麦、花生或烟草植物种子；或来自任何饲草和/或动物或反刍动物的饲料植物的种子，并且任选地，所述饲草或饲料植物是干草、玉米、粟米、大豆、小麦、荞麦、大麦、紫花苜蓿、黑麦、一年生草、高粱、苏丹草、费尔德草原的草或绿毛蒺藜草。
14.反义寡核苷酸，(a)，包括与权利要求1-3任一项所述的序列或其子序列互补的核酸序列，或能够与权利要求1-3任一项所述的序列或其子序列在严格条件下杂交的核酸序列；(b)，(a)所述的反义寡核苷酸，其中所述核酸序列的长度在约10至50、约20至60、约30至70、约40至80或约60至100个碱基之间。
15.抑制葡聚糖酶信息在细胞中翻译的方法，该方法包括给所述细胞施用反义寡核苷酸或在所述细胞中表达反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含与权利要求1-3任一项所述的序列互补的核酸序列，或能够与权利要求1-3任一项所述的序列在严格条件下杂交的核酸序列。
16.双链抑制性RNA(RNAi)分子，(a)，含有权利要求1-3任一项所述的序列的子序列，其中任选地，所述RNAi是siRNA或抑制性微RNA(miRNA)；或(b)，(a)所述的双链抑制性RNA(RNAi)分子，其中所述RNAi的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。
17.抑制葡聚糖酶在细胞中表达的方法，该方法包括给所述细胞施用或在所述细胞中表达双链抑制性RNA(iRNA)，其中所述RNA包括权利要求1至26任一项所述的序列的子序列；或(b)，(a)所述的方法，其中所述RNAi是siRNA或miRNA。
18.分离的、合成的或重组的多肽，其包含：
(a)，(i)氨基酸序列，其由包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列的核酸或由之组成的核酸编码，或(ii)具有如在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和/或SEQ ID NO：23中示出的氨基酸序列，并且包含SEQ ID NO：2上的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或所有下列氨基酸残基变化，或由之组成：
在氨基酸位置2的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置13的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置57的丝氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置61的酪氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置62的丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置70的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置71的精氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置101的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置106的谷氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置109的谷氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置130的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置131的苯丙氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置148的谷氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置162的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置216的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置230的组氨酸是赖氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置234的谷氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置246的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置246的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置262的亮氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置270的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置271的苯丙氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置277的谷氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置290的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置300的赖氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置305的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置312的甘氨酸是异亮氨酸，和/或
在氨基酸位置315的丝氨酸是异亮氨酸；
(b)，(a)所述的多肽，其具有葡聚糖酶活性但是缺乏：信号序列或前蛋白序列；
(c)，(a)所述的多肽，其具有葡聚糖酶活性并且进一步包括异源序列；
(d)，(c)所述的多肽，其中所述异源氨基酸序列包含异源(前导)信号序列、或标记物或表位，或由异源(前导)信号序列、或标记物或表位组成；
(e)，(c)或(d)所述的多肽，其中所述异源(前导)信号序列包括N-端和/或C-端突出端或由N-端和/或C-端突出端组成，所述突出端用于靶向内质网(ER)或内膜，或靶向玉米内质网(ER)或内膜系统，或所述异源氨基酸序列包括酶靶位点或由酶靶位点组成；
(f)，(a)到(e)任一项所述的多肽，其中所述葡聚糖酶活性包括：内切葡聚糖酶活性；催化1，4-β-D-糖苷键或内部的β-1，3-糖苷键的水解，水解葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖以产生较小分子量的多糖或寡聚体；内切-1，4-β-内切葡聚糖酶活性；1，4-β-D-糖苷键活性，包括水解纤维素、纤维素衍生物、地衣聚糖或谷物、或包括羧甲基纤维素或羟乙基纤维素的纤维素衍生物、或包括β-D-葡聚糖或木葡聚糖的谷物中的1，4-β-D-糖苷键；水解包含1，4-β-糖苷-联接的D-吡喃型葡萄糖的多糖；水解纤维素、纤维素衍生物或半纤维素；水解在木材或纸浆或木材或纸品中的纤维素或半纤维素；催化在饲料、食品或饮料、或包含基于谷物的动物饲料、麦芽汁或啤酒、面团、水果或蔬菜的饲料、食品或饮料中的葡聚糖的水解；催化在微生物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞或植物细胞中的葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖的水解；
(g)，(a)到(f)任一项所述的多肽，其中(i)，所述多肽是糖基化的，或所述多肽包括至少一个糖基化位点，(ii)，(i)所述的多肽，其中所述糖基化是N-联接糖基化或O-联接糖基化；(iii)，(i)或(ii)所述的多肽，其中所述多肽是在酵母细胞中表达后被糖基化；或(iv)，(iii)所述的多肽，其中所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)；
(h)，(a)到(g)任一项所述的多肽，其中所述葡聚糖酶活性是热稳定的，或所述多肽在包括如下温度范围的条件下保持葡聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约37℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃，或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高的温度；
(i)，(a)到(g)任一项所述的多肽，其中所述葡聚糖酶活性是耐热的，或所述多肽在暴露于如下范围内的温度之后保持葡聚糖酶活性：约-100℃至约-80℃、约-80℃至约-40℃、约-40℃至约-20℃、约-20℃至约0℃、约0℃至约37℃、约0℃至约5℃、约5℃至约15℃、约15℃至约25℃、约25℃至约37℃、约37℃至约45℃、约45℃至约55℃、约55℃至约70℃、约70℃至约75℃、约75℃至约85℃、约85℃至约90℃、约90℃至约95℃、约95℃至约100℃、约100℃至约105℃、约105℃至约110℃、约110℃至约120℃，或95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃或更高温度；或其中所述耐热性包括在被加热到升高的温度后，在37℃保持葡聚糖酶比活性的至少一半；或其中所述耐热性包括在被加热到升高的温度后，在37℃保持每毫克蛋白从大约500至大约1200单位范围内的比活性；
(j)，(a)或(h)任一项所述的多肽，其中所述葡聚糖酶活性包括在大约37℃每毫克蛋白大约100至大约1000单位、每毫克蛋白大约500至大约750单位、每毫克蛋白大约500至大约1200单位、或每毫克蛋白大约750至大约1000单位范围内的比活性；
(k)，(a)或(j)任一项所述的多肽，其中所述多肽在包括约pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0或更低pH的条件下保持葡聚糖酶活性；或，所述多肽在包括约pH7.5、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0、pH12.5或更高pH的条件下保持葡聚糖酶活性；或
(l)，(a)或(k)任一项所述的多肽，其中(i)，所述多肽进一步包括在信号序列(前导序列或前导肽)和所述酶之间的额外的氨基酸残基，或(ii)，(i)所述的多肽，其中所述额外的氨基酸残基包括Glu-Ala。
19.权利要求18所述的分离的、合成的或重组的多肽，其中
(a)，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：2上的至少一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一(11)、十二(12)、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70或所有下列氨基酸残基变化，或由之组成：
在氨基酸位置2的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置13的甘氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置57的丝氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置61的酪氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置62的丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置63的苯丙氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置70的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置71的精氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是苏氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置74的赖氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置101的甲硫氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置103的天冬氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置106的谷氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置109的谷氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置116的赖氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置130的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置131的苯丙氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置148的谷氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置162的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置186的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置201的苯丙氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置216的赖氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置230的组氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置230的组氨酸是赖氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是异亮氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置234的谷氨酸是天冬氨酸，
在氨基酸位置246的赖氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置246的赖氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置258的精氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置262的亮氨酸是组氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是甲硫氨酸，
在氨基酸位置262的亮氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置270的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置271的苯丙氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是半胱氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置277的谷氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置290的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是天冬酰胺，
在氨基酸位置298的亮氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置298的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置300的赖氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置305的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置312的甘氨酸是异亮氨酸，和/或
在氨基酸位置315的丝氨酸是异亮氨酸；
(b)，(a)所述的多肽，其中SEQ ID NO：2上的所述氨基酸残基变化(修饰)包括下列变化，或由下列变化组成：
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，和
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸；
(c)，(a)所述的多肽，其中SEQ ID NO：2上的所述氨基酸残基变化(修饰)包括下列变化，或由下列变化组成：
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，和
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸；
(d)，(a)所述的多肽，其中SEQ ID NO：2上的所述氨基酸残基变化(修饰)包括下列变化，或由下列变化组成：
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，和
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸；
(e)，(a)所述的多肽，其中SEQ ID NO：2上的所述氨基酸残基变化(修饰)包括下列变化，或由下列变化组成：
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，和
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺；
(f)，(a)所述的多肽，其中SEQ ID NO：2上的所述氨基酸残基变化(修饰)包括下列变化，或由下列变化组成：
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置94的异亮氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，和
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺；
(g)，(a)所述的多肽，其中SEQ ID NO：2上的所述氨基酸残基变化(修饰)包括下列变化，或由下列变化组成：
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置70的天冬氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，和
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺；或
(h)，(a)所述的多肽，其中SEQ ID NO：2上的所述氨基酸残基变化(修饰)包括下列变化，或由下列变化组成：
在氨基酸位置38的苯丙氨酸是酪氨酸，
在氨基酸位置61的酪氨酸是谷氨酰胺，
在氨基酸位置69的甲硫氨酸是谷氨酸，
在氨基酸位置71的精氨酸是丝氨酸，
在氨基酸位置166的异亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置183的丝氨酸是精氨酸，
在氨基酸位置191的丝氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置212的谷氨酸是脯氨酸，
在氨基酸位置231的亮氨酸是缬氨酸，
在氨基酸位置276的甲硫氨酸是丙氨酸，
在氨基酸位置280的精氨酸是甘氨酸，
在氨基酸位置297的苏氨酸是脯氨酸，和
在氨基酸位置301的苏氨酸是谷氨酰胺。
20.蛋白质制剂，其包含权利要求7或18所述的多肽，其中所述蛋白质制剂包括液体、固体或凝胶。
21.异源二聚体：(a)，包括权利要求7或18所述的多肽，和第二结构域；(b)，(a)所述的异源二聚体，其中所述第二结构域包括多肽，并且所述异源二聚体是融合蛋白；或(c)，(a)所述的异源二聚体，其中所述第二结构域包括表位或标记物。
22.同源二聚体，其包括权利要求7或权利要求18所述的多肽。
23.固定化的多肽：(a)，其中所述多肽包括权利要求7或权利要求18所述的多肽，或其子序列；或(b)，(a)所述的固定化多肽，其中所述多肽被固定在细胞、金属、树脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微电极、石墨颗粒、珠子、凝胶、平板、阵列或毛细管上。
24.阵列，其包含：(a)，固定化多肽，其中所述多肽包括权利要求7或权利要求18所述的多肽，或由权利要求7或权利要求18所述的多肽组成；(b)，固定化的权利要求1至3任一项所述的核酸；(c)，(a)或(b)的任何组合。
25.分离的、合成的或重组的抗体：(a)，其与权利要求7或权利要求18所述的多肽特异性结合；或(b)，(a)所述的抗体，其中所述单体是单克隆抗体或多克隆抗体。
26.杂交瘤，其包括与权利要求7或权利要求18所述的多肽特异性结合的抗体；或杂交瘤，其产生权利要求25所述的抗体。
27.分离或鉴定具有葡聚糖酶活性的多肽的方法，其包括如下步骤：
(a)提供如权利要求25中所述的抗体；
(b)提供包含多肽的样品；和
(c)将步骤(b)所述的样品与步骤(a)所述的抗体在所述抗体能与所述多肽特异性结合的条件下接触，从而分离或鉴定具有葡聚糖酶活性的多肽。
28.制备抗葡聚糖酶抗体的方法，其包括：(a)以足以产生体液免疫应答的量向非人动物施用权利要求1至3任一项所述的核酸或其子序列，由此制备抗葡聚糖酶抗体；或，(b)以足以产生体液免疫应答的量向非人动物施用权利要求7或18所述的多肽或其子序列，由此制备抗葡聚糖酶抗体。
29.产生重组多肽的方法，其包括：
(i)，(a)提供与启动子可操作地连接的核酸，其中所述核酸包括权利要求1到3的任一项所述的核酸；和(b)在允许所述多肽表达的条件下表达步骤(a)所述的核酸，从而产生重组多肽；或
(ii)，(i)所述的方法，进一步包括括用步骤(i)(a)所述的核酸转化宿主细胞，随后表达步骤(a)所述的核酸，从而在转化细胞中产生重组多肽。
30.用于鉴定具有葡聚糖酶活性的多肽的方法，包括如下步骤：
(a)提供权利要求7或权利要求18所述的多肽；
(b)提供葡聚糖酶的底物；和
(c)将所述多肽与步骤(b)的底物接触，并且检测底物量的降低或反应产物量的增加，其中底物量的降低或反应产物量的增加检测出具有葡聚糖酶活性的多肽。
31.用于鉴定葡聚糖酶底物的方法，包括如下步骤：
(a)提供权利要求7或权利要求18所述的多肽；
(b)提供测试底物；和
(c)将步骤(a)所述的多肽与步骤(b)所述的测试底物接触，并且检测底物量的降低或反应产物量的增加，其中底物量的降低或反应产物量的增加鉴定出作为葡聚糖酶底物的所述测试底物。
32.确定测试化合物是否与多肽特异性结合的方法，包括如下步骤：
(a)在允许核酸翻译为多肽的条件下表达核酸或包括所述核酸的载体，其中所述核酸具有权利要求1至3任一项所述的核酸；
(b)提供测试化合物；
(c)将所述多肽与所述测试化合物接触；和
(d)确定步骤(b)所述的测试化合物是否与所述多肽特异性结合。
33.确定测试化合物是否与多肽特异性结合的方法，包括如下步骤：
(a)提供权利要求7或权利要求18所述的多肽；
(b)提供测试化合物；
(c)将所述多肽与所述测试化合物接触；和
(d)确定步骤(b)所述的测试化合物是否与所述多肽特异性结合。
34.用于鉴定葡聚糖酶活性的调节剂的方法，其包括：
(i)，(a)提供权利要求7或权利要求18所述的多肽；
(b)提供测试化合物；
(c)将步骤(a)的多肽与步骤(b)的测试化合物接触，并测定葡聚糖酶活性，其中在存在所述测试化合物的情况下测定的葡聚糖酶活性与不存在所述测试化合物的情况下测定的活性相比的变化，确定了该测试化合物调节葡聚糖酶活性；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述葡聚糖酶活性通过提供葡聚糖酶底物并检测底物量的降低或反应产物量的增加，或底物量的增加或反应产物量的降低来测量；
(iii)，(ii)所述的方法，其中与没有测试化合物时底物或反应产物的量相比，有测试化合物时底物量的降低或反应产物量的增加鉴定出作为葡聚糖酶活性的激活剂的测试化合物；或
(iv)，(ii)所述的方法，其中与没有测试化合物时底物或反应产物量相比，有测试化合物时底物量的增加或反应产物量的降低鉴定出作为葡聚糖酶活性的抑制剂的测试化合物。
35.计算机系统：(a)，包括处理器和数据存储设备，其中所述数据存储设备上已经存储了多肽序列或核酸序列，其中所述多肽序列包括权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列，或所述核酸序列包括权利要求1至3任一项所述的核酸序列；(b)，(a)所述的计算机系统，进一步包括序列比较算法和数据存储设备，所述数据存储设备上具有至少一个参考序列；(c)，(a)或(b)所述的计算机系统，其中所述序列比较算法包括可指出多态性的计算机程序；或(d)，(a)、(b)或(c)所述的计算机系统，进一步包括鉴定所述序列中一个或多个特征的鉴定器。
36.计算机可读介质，其上已经存储了多肽序列或核酸序列，其中所述多肽序列包含权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列，或所述核酸序列包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列。
37.用于鉴定序列中的特征的方法，包括如下步骤：(a)使用鉴定多肽或核酸序列中的一个或多个特征的计算机程序读取序列，其中所述多肽序列包含权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列，或所述核酸序列包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列；和(b)用所述计算机程序鉴定所述多肽或核酸序列中的一个或多个特征。
38.将第一序列与第二序列进行比较的方法，包括
(i)，(a)通过使用比较序列的计算机程序读取第一序列和第二序列，其中所述第一序列包含多肽序列或核酸序列，其中所述多肽序列包含权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列，或所述核酸序列包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列；和(b)用所述计算机程序确定所述第一序列和所述第二序列之间的差异；
(ii)，(i)所述的方法，其中比较序列的所述计算机程序进一步包括鉴定序列中的一个或多个特征的鉴定器；
(iii)，(i)或(ii)所述的方法，其中所述确定第一序列和第二序列之间的差异的步骤进一步包括鉴定多态性的步骤；或
(iv)，(iii)所述的方法，包括使用计算机程序读取第一序列并且鉴定所述序列中的一个或多个特征。
39.从样品中分离或回收编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸的方法，包括：
(A)，(i)(a)提供权利要求5所述的扩增引物对；
(b)从样品中分离核酸，或处理所述样品，以便所述样品中的核酸可达到与所述扩增引物对杂交；和
(c)将步骤(b)所述的核酸与步骤(a)所述的扩增引物对结合，并从所述样品中扩增核酸，从而从样品中分离或回收编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述扩增引物序列对的每一成员包含寡核苷酸，该寡核苷酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22的序列或其子序列的至少大约10到50个连续碱基；
(iii)，(i)或(ii)所述的方法，其中所述样品包括环境样品；
(iv)，(iii)所述的方法，其中所述环境样品包括水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品；或
(v)，(iv)所述的方法，其中所述生物样品来源于细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞；或
(B)，(i)(a)提供权利要求4所述的多核苷酸探针，或包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列的探针；
(b)从所述样品分离核酸，或处理所述样品，以便所述样品中的核酸可达到与步骤(a)的多核苷酸探针杂交；
(c)将步骤(b)分离的核酸或处理的样品与步骤(a)的多核苷酸探针结合；和
(d)分离与步骤(a)的多核苷酸探针特异性杂交的核酸，从而从样品中分离或回收编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述样品包括环境样品；
(iii)，(ii)所述的方法，其中所述环境样品包括水样品、液体样品、土壤样品、空气样品或生物样品；或
(iv)，(iii)所述的方法，其中所述生物样品来源于细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
40.产生编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸变体的方法，其包括：
(i)，(a)提供包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列的模板核酸；和
(b)在所述模板序列中修饰、删除或添加一个或多个核苷酸，或进行修饰、删除或添加的组合，以产生所述模板核酸的变体，
其中任选地，所述方法进一步包括表达所述变体核酸，以产生变体葡聚糖酶多肽；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述修饰、添加或删除通过如下方法引入，包括易错PCR、改组、寡核苷酸诱导的定向突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、嵌合核酸多聚体生成或它们的组合；
(iii)，(i)或(ii)所述的方法，其中所述方法被反复重复，直到产生与所述模板核酸编码的多肽相比具有改变的或不同的活性或者改变的或不同的稳定性的变体葡聚糖酶多肽；
(iv)，(iii)所述的方法，其中所述变体葡聚糖酶多肽是耐热的，并且在暴露于升高的温度之后保留一些活性，或与所述模板核酸编码的葡聚糖酶相比，所述变体葡聚糖酶多肽具有增加的糖基化，或所述变体葡聚糖酶多肽在高温下具有葡聚糖酶活性，其中由所述模板核酸编码的葡聚糖酶在所述高温下没有活性；
(v)，(iii)所述的方法，其中所述方法被反复重复，直到产生与所述模板核酸的密码子使用相比具有改变的密码子使用的葡聚糖酶编码序列；或
(vi)，(iii)所述的方法，其中所述方法被反复重复，直到产生与所述模板核酸的信息表达或稳定性相比具有更高或更低水平的信息表达或稳定性的葡聚糖酶基因。
41.在编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸中修饰密码子以增加其在宿主细胞中表达的方法，该方法包括：
(a)提供编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸，所述核酸包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列；和
(b)鉴定步骤(a)的所述核酸中非优选或较不优选的密码子，用优选的或中度使用的密码子来代替之，所述优选或中度使用的密码子编码与所述被代替的密码子相同的氨基酸，其中优选密码子是在所述宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子，非优选或较不优选密码子是在所述宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰所述核酸以增加其在所述宿主细胞中的表达。
42.修饰编码葡聚糖酶多肽的核酸中的密码子的方法，所述方法包括：
(a)提供编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸，所述核酸包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列；和
b)鉴定步骤(a)的所述核酸中的密码子，并用不同的密码子来代替之，所述不同的密码子编码与被代替的密码子相同的氨基酸，从而修饰在编码葡聚糖酶的核酸中的密码子。
43.在编码葡聚糖酶多肽的核酸中修饰密码子以增加其在宿主细胞中表达的方法，所述方法包括：
(i)，(a)提供编码葡聚糖酶多肽的核酸，该核酸包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列；和
(b)鉴定步骤(a)的所述核酸中的非优选或较不优选密码子，并用优选的或中度使用的密码子来代替之，所述优选或中度使用的密码子编码与所述被代替的密码子相同的氨基酸，其中优选密码子是在所述宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子，非优选或较不优选密码子是在所述宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰所述核酸以增加其在所述宿主细胞中表达；或
(ii)，(i)所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
44.在编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸中修饰密码子以减少其在宿主细胞中表达的方法，所述方法包括：
(i)，(a)提供编码葡聚糖酶多肽的核酸，该核酸包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列；和
(b)鉴定步骤(a)的所述核酸中的至少一个优选的密码子，并用非优选的或较不优选的密码子来代替之，所述非优选的或较不优选的密码子编码与所述被代替的密码子相同的氨基酸，其中优选密码子是在所述宿主细胞的基因的编码序列中过度表现的密码子，非优选或较不优选密码子是在所述宿主细胞的基因的编码序列中表现不足的密码子，从而修饰所述核酸以减少其在所述宿主细胞中表达；或
(ii)，(i)所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
45.用于产生核酸文库的方法，所述核酸文库编码许多修饰的葡聚糖酶活性位点或底物结合位点，其中所述修饰的活性位点或底物结合位点来源于第一核酸，所述第一核酸包含编码第一活性位点或第一底物结合位点的序列，所述方法包括：
(i)，(a)提供第一核酸，其编码第一活性位点或第一底物结合位点，其中所述第一核酸序列包含在严格条件下与权利要求1到3任一项所述的核酸序列或其子序列杂交的序列，所述核酸编码葡聚糖酶活性位点或葡聚糖酶底物结合位点；
(b)提供一组诱变寡核苷酸，其在所述第一核酸的多个目标密码子处编码天然发生的氨基酸变体；和
(c)使用该组诱变寡核苷酸，产生一组编码活性位点或编码底物结合位点的变体核酸，其在被诱变的每一氨基酸密码子处编码一定范围的氨基酸变异，从而产生编码多个修饰的葡聚糖酶活性位点或底物结合位点的核酸文库；或
(ii)，(i)所述的方法，其进一步包括通过包括如下的方法诱变步骤(a)的所述第一核酸：优化的定向进化系统、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成连接重装配(SLR)、易错PCR、改组、寡核苷酸诱导的定向突变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、整体诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、嵌合核酸多聚体生成或它们的组合。
46.制备小分子的方法，其包括：
(a)提供多个能合成或修饰小分子的生物合成酶，其中这些酶中的一种酶包括由包含权利要求1到3任一项所述的核酸序列的核酸编码的葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶；
(b)为步骤(a)的至少一种酶提供底物；和
(c)将步骤(b)的所述底物与所述这些酶在能促进多个生物催化反应的条件下进行反应，以通过一系列生物催化反应产生小分子。
47.修饰小分子的方法，包括如下步骤：
(i)，(a)提供葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶，其中所述酶包括权利要求7或权利要求18所述的多肽，或由包含权利要求1至3的任一项所述的核酸序列的核酸编码的多肽；
(b)提供小分子；和
(c)将步骤(b)的所述小分子与步骤(a)的所述酶在能促进由所述葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶催化的酶促反应的条件下进行反应，从而通过葡聚糖酶酶促反应修饰小分子；
(ii)，(i)所述的方法，其进一步包括为步骤(a)的所述酶提供多个小分子底物，从而产生通过由葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶催化的至少一种酶促反应产生的修饰的小分子的文库；
(iii)，(i)或(ii)所述的方法，进一步包括提供多种其它的酶，这在促进这些酶的多个生物催化反应的条件下提供，以形成由所述多个酶促反应产生的修饰小分子的文库；
(iv)，(iii)的方法，进一步包括测试所述文库以确定所述文库中是否存在表现出期望活性的特定修饰的小分子的步骤；或
(v)，(iv)所述的方法，其中所述测试所述文库的步骤进一步包括步骤：系统地去除所有但保留一个用于产生所述文库中多个所述修饰的小分子中的一部分的生物催化反应，这通过测试所述修饰的小分子的所述部分中存在或不存在具有期望活性的所述特定修饰的小分子进行；并鉴定出产生具有期望活性的所述特定修饰的小分子的至少一个特定生物催化反应。
48.确定葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶的功能片段的方法，包括：
(i)，(a)提供葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶，其中所述酶包括权利要求7或权利要求18所述的多肽或由权利要求1至3任一项所述的核酸序列编码的多肽；和
(b)从步骤(a)的序列删除多个氨基酸残基，并测试剩余的子序列的葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性，从而确定葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶的功能片段；或
(ii)，(i)所述的方法，其中所述葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性通过提供葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶底物并检测底物量的减少或反应产物量的增加来测量。
49.通过使用实时代谢流分析进行新的或修饰的表型的全细胞工程改造的方法，所述方法包括：
(i)，(a)通过修饰细胞的遗传组成制备修饰的细胞，其中所述遗传组成通过将包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列的核酸加入到所述细胞来修饰；
(b)培养所述修饰的细胞以产生多个修饰的细胞；
(c)通过实时监控步骤(b)的所述细胞培养物来测量所述细胞的至少一个代谢参数；和
(d)分析步骤(c)的数据，以确定被测量的参数是否与在类似条件下未修饰细胞中的参照测量值不同，从而使用实时代谢流分析鉴定细胞中工程改造的表型；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述细胞的遗传组成通过包括在细胞中序列的删除或序列的修饰，或敲除基因的表达的方法来修饰；
(iii)，(ii)所述的方法，进一步包括选择含有新的工程改造的表型的细胞；或
(iv)，(iii)所述的方法，进一步包括培养所述被选择的细胞，从而产生包含新的工程改造的表型的新细胞株。
50.分离的、合成的或重组的信号序列，其由在权利要求7或权利要求18所述的多肽的(氨基端)氨基酸残基1至14、1至15、1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、1至21、1至22、1至23、1至24、1至25、1至26、1至27、1至28、1至29、1至30、1至31、1至32、1至33、1至34、1至35、1至36、1至37、1至38、1至40、1至41、1至42、1至43或1至44中所示的序列组成。
51.嵌合多肽，其包含：
(i)至少第一结构域和至少第二结构域，所述至少第一结构域包含具有权利要求50所述的序列的信号肽(SP)，所述至少第二结构域包含异源多肽或肽，其中所述异源多肽或肽不与所述信号肽(SP)天然相关；
(ii)，(i)所述的嵌合多肽，其中所述异源多肽或肽不是葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶；或
(iii)，(i)所述的嵌合多肽，其中所述异源多肽或肽可以在所述信号肽(SP)、或葡聚糖酶或内切葡聚糖酶催化结构域(CD)的氨基端、羧基端或两端。
52.编码嵌合多肽的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述嵌合多肽包含至少第一结构域和至少第二结构域，所述至少第一结构域包含具有权利要求50所述的序列的信号肽(SP)，所述至少第二结构域包含异源多肽或肽，其中所述异源多肽或肽不与所述信号肽(SP)天然相关。
53.增加葡聚糖酶多肽的耐热性或热稳定性的方法，所述方法包括糖基化葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶，其中所述多肽包括权利要求7或权利要求18所述的多肽或由权利要求1-3任一项所述的核酸序列编码的多肽的至少25、30、35、40、45、55、60、65、70、75、100、150、200、250或更多个连续氨基酸，从而增加葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶的耐热性或热稳定性。
54.在细胞中过量表达重组葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶的方法，包括表达含有权利要求1-3任一项所述的核酸的载体，其中过量表达通过使用高活性启动子、双顺反子载体或通过所述载体的基因扩增来实现。
55.制备转基因植物的方法，其包括：
(i)，(a)将异源核酸序列引入细胞中，其中所述异源核酸序列包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列，从而产生转化的植物细胞；和
(b)从所述转化的细胞产生转基因植物；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述步骤(a)进一步包括通过DNA粒子轰击、电穿孔或显微注射植物细胞原生质体引入所述异源核酸序列；或
(iii)，(i)所述的方法，其中所述步骤(a)包括通过DNA粒子轰击或通过使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主直接将所述异源核酸序列引入到植物组织中。
56.在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，其包括如下步骤：
(a)用与启动子可操作地连接的异源核酸序列转化所述植物细胞，其中所述异源核酸序列包含权利要求1-3任一项所述的核酸序列；
(b)在所述异源核酸序列在所述植物细胞中表达的条件下培养所述植物。
57.水解、分解或破坏包括葡聚糖、木聚糖和/或甘露聚糖的组合物的方法，其包括下列步骤：
(a)提供权利要求7或权利要求18所述的具有葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性的多肽，或权利要求1-3任一项所述的核酸序列编码的多肽；
(b)提供包含葡聚糖、木聚糖和/或甘露聚糖的组合物；和
(c)在葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶水解、分解或破坏包含葡聚糖、木聚糖和/或甘露聚糖的组合物的条件下，将步骤(b)的组合物与步骤(a)的多肽接触，
其中任选地，所述组合物包括植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。
58.面团或面包产品，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
59.面团调理的方法，其包括在足以调理所述面团的条件下，将面团或面包产品与权利要求7或权利要求18所述的至少一种多肽接触。
60.饮料，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
61.饮料的生产方法，其包括：
(a)，在足以降低所述饮料粘度的条件下，施用权利要求7或权利要求18所述的至少一种多肽至饮料或饮料前体；或
(b)，(a)所述的方法，其中所述饮料或饮料前体是麦芽汁或啤酒。
62.食品、饲料、食品添加剂、饲料添加剂、营养补充剂或食品强化剂，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
63.利用葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶作为人或动物膳食中的营养补充剂或食品强化剂的方法，该方法包括：
(i)制备营养补充剂或食品强化剂，所述营养补充剂或食品强化剂含有葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶，这些酶包含权利要求7或权利要求18所述多肽的至少25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250或更多个连续氨基酸；和
将所述营养补充剂或食品强化剂施用给所述人或动物以提高包含在被所述人或动物摄取的食品或饲料中的木聚糖的利用；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述动物是反刍动物或单胃动物；
(iii)，(i)或(ii)所述的方法，其中所述葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶通过在选自细菌、酵母、植物、昆虫、真菌和动物的生物体中表达编码葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶的多核苷酸来制备；
(iv)，(iii)所述的方法，其中所述生物体选自荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母(pichiapastoris)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属某种(Streptomyces sp)、芽孢杆菌属某种(Bacillus sp.)和乳酸杆菌属某种(Lactobacillus sp.)；或
(v)，(i)至(iv)的任一项所述的方法，其中所述动物是家养动物、或单胃动物。
64.可食用的酶递送基质，其包含(a)热稳定的重组葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶；或，(b)权利要求7或权利要求18所述的多肽。
65.递送葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶补充物至人或动物的方法，所述方法包括：
(i)，(a)制备丸粒形式的可食用酶递送基质，其包含颗粒状可食用载体和热稳定的重组聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶，其中所述丸粒容易将其中含有的聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶分散至含水介质中，和
(b)将所述可食用的酶递送基质施用给所述人或动物；
(ii)，(i)所述的方法，其中所述重组葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶包括权利要求7或权利要求18所述的多肽；
(iii)，(i)或(ii)所述的方法，其中所述颗粒状可食用载体包括选自如下的载体：谷物胚芽、无油谷物胚芽、干草、紫花苜蓿、梯牧草、大豆壳、向日葵花籽粕和次粉；
(iv)，(i)至(iii)的任一项所述的方法，其中所述可食用载体包括无油谷物胚芽；
(v)，(i)至(iv)的任一项所述的方法，其中所述递送基质通过丸化包含谷物胚芽和葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶的混合物而形成；
(vi)，(i)至(v)的任一项所述的方法，其中所述葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶被糖基化，以提供在丸化条件下的热稳定性；或
(vii)，(vi)所述的方法，其中所述丸化条件包括应用蒸汽，或所述丸化条件包括应用超过大约80℃的温度大约5分钟，并且所述酶保持每毫克酶至少350至大约900单位的比活性。
66.分离的、合成的或重组的核酸，其包括：
(a)，编码具有葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性和信号序列的多肽的序列，其中所述核酸包含权利要求1至3任一项所述的核酸序列；或，
(b)，(a)所述的核酸，其中所述信号序列来源于另一葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶或非葡聚糖酶、非木聚糖酶和/或非甘露聚糖酶。
67.分离的、合成的或重组的核酸，其包含编码具有葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性的多肽的序列，其中所述序列不包含信号序列，并且所述核酸包含权利要求1至3的任一项所述的核酸序列。
68.含纤维素或纤维素衍生物的组合物，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
69.木材、木浆或木产品，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
70.纸、纸浆或纸产品，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
71.减少纸、木材或木产品中的木质素的方法，其包括将所述纸、木材或木产品与权利要求7或权利要求18所述的多肽接触。
72.清洁剂组合物，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
73.药物组合物，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
74.从动物除去包含葡聚糖、甘露聚糖、阿糖基木聚糖或木聚糖的微生物或保护动物免于所述微生物伤害的方法，该方法包括(a)施用权利要求7或权利要求18所述的多肽；或(b)，(a)的方法，其中所述微生物是细菌，或所述微生物是沙门氏菌或芽孢杆菌。
75.燃料，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽。
76.制备燃料的方法，其包括将生物质与权利要求7或权利要求18所述的多肽接触。
77.乳制品，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽，其中任选地，所述乳制品包括乳、冰激凌、奶酪或酸奶。
78.改善乳制品质地和风味的方法，其包括下列步骤：(a)提供权利要求7或权利要求18所述的多肽；(b)提供乳制品；和(c)将步骤(a)的多肽和步骤(b)的乳制品在所述葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶能够改善所述乳制品的质地和风味的条件下接触。
79.分离的、合成的或重组的多肽，其包含：
(a)，权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列和至少一个氨基酸残基保守置换；
(b)，(a)所述的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述保守置换包括用另一脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基酸；用苏氨酸置换丝氨酸，或反之；用另一酸性残基置换酸性残基；用具有酰胺基的另一残基置换具有酰胺基的残基；用另一碱性残基交换碱性残基；或者，用另一芳香族残基置换芳香族残基，或它们的组合；或
(c)，(b)所述的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成的等价物，或所述酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物，或所述包含酰胺基的残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物，或所述碱性残基包括赖氨酸、精氨酸或其合成的等价物，或所述芳香族残基包括苯并氨酸、酪氨酸或其合成的等价物。
80.可食用的酶递送基质，其包含具有权利要求7或权利要求18所述多肽的氨基酸序列的分离的、合成的或重组的多肽。
81.药物组合物，其包含(a)，具有权利要求7或权利要求18所述多肽的氨基酸序列的分离的、合成的或重组的多肽；或(b)，(a)所述的药物组合物，其中所述组合物被配制为液体、喷剂、气溶胶、膜、喷剂、脂质体、粉末、食品、饲料、添加剂、小粒、片剂、丸剂、凝胶、水凝胶或胶囊化形式。
82.乳制品，其包含具有权利要求7或权利要求18所述多肽的氨基酸序列的分离的、合成的或重组的多肽。
83.饲料、食品、饲料添加剂、食品添加剂、食品强化剂或营养补充剂，其包含：
具有权利要求7或权利要求18所述多肽的氨基酸序列的分离的、合成的或重组的多肽；其中(a)，所述饲料或食品、饲料添加剂、食品添加剂、食品强化剂或营养补充剂任选地被配制用作单胃动物的单胃粗谷物饲料或用作单胃动物的食品；
(b)，(a)所述的饲料、食品、饲料添加剂、食品添加剂、食品强化剂或营养补充剂，其中所述单胃动物是猪类、猪、家养猪、野猪、棉羊、兔、家禽、鸟、马或人；
(c)，(a)或(b)所述的饲料、食品、饲料添加剂、食品添加剂、食品强化剂或营养补充剂，其中所述多肽具有耐热的葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性；
(d)，(c)所述的的饲料、食品、饲料添加剂、食品添加剂、食品强化剂或营养补充剂，其中所述耐热的葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性包括在95℃2分钟之后至少保持75％的残余葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性，或等同活性；
(e)，(c)或(d)所述的饲料、食品、饲料添加剂、食品添加剂、食品强化剂或营养补充剂，其中所述耐热的葡聚糖酶、木聚糖酶和/或甘露聚糖酶活性包括在95℃加热30分钟之后至少保持100％的活性，或等同活性；
(f)，(a)到(e)的任一项所述的饲料、食品、饲料添加剂、食品添加剂、食品强化剂或营养补充剂，进一步包括木聚糖酶和/或肌醇六磷酸酶，或
(g)，(a)到(f)的任一项所述的饲料、食品、饲料添加剂、食品添加剂、食品强化剂或营养补充剂，其包括小麦、大豆、饲草、干草、玉米(例如青贮)、水稻、粟米、荞麦、大麦、紫花苜蓿、黑麦、一年生草、高粱、苏丹草、费尔德草原的草、绿毛蒺藜草或它们的组合。
84.权利要求1所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述SEQ ID NO：1的核酸序列的修饰包括下列修饰，或由下列修饰组成：
(i)SEQ ID NO：1的位置112至114的等同位置的核苷酸被改变为TAT或TAC，
SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，
SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，和
SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG；
(ii)SEQ ID NO：1的位置112至114的等同位置的核苷酸被改变为TAT或TAC，
SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，
SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，
SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，
SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，和
SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG；
(iii)SEQ ID NO：1的位置112至114的等同位置的核苷酸被改变为TAT或TAC，
SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，
SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，
SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，
SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，和
SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT；
(iv)SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，
SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，
SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，
SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，
SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，和
SEQ ID NO：1的位置901至903的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG；
(v)SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，
SEQ ID NO：1的位置211至213的等同位置的核苷酸被改变为TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
SEQ ID NO：1的位置280至282的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，
SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，
SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，
SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，和
SEQ ID NO：1的位置901至903的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG；
(vi)SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，
SEQ ID NO：1的位置208至210的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，
SEQ ID NO：1的位置211至213的等同位置的核苷酸被改变为TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，
SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，
SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，
SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，和
SEQ ID NO：1的位置901至903的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG；或
(vii)SEQ ID NO：1的位置112至114的等同位置的核苷酸被改变为TAT或TAC，
SEQ ID NO：1的位置181至183的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG，
SEQ ID NO：1的位置205至207的等同位置的核苷酸被改变为GAA或GAG，
SEQ ID NO：1的位置211至213的等同位置的核苷酸被改变为TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC，
SEQ ID NO：1的位置496至498的等同位置的核苷酸被改变为GTT、GTC、GTA或GTG，
SEQ ID NO：1的位置547至549的等同位置的核苷酸被改变为CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG，
SEQ ID NO：1的位置571至573的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置634至636的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，
SEQ ID NO：1的位置691至693的等同位置的核苷酸被改变为ATT、ATC或ATA，
SEQ ID NO：1的位置826至828的等同位置的核苷酸被改变为GCT、GCC、GCA或GCG，
SEQ ID NO：1的位置838至840的等同位置的核苷酸被改变为GGT、GGC、GGA或GGG，
SEQ ID NO：1的位置889至891的等同位置的核苷酸被改变为CCA、CCC、CCG或CCT，以及
SEQ ID NO：1的位置901至903的等同位置的核苷酸被改变为CAA或CAG。
85.权利要求57所述的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的修饰包括下列变化，或由下列变化组成：
(i)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的氨基酸被改变为酪氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，以及
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的等同位置的氨基酸被改变为酪氨酸；
(ii)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的氨基酸被改变为酪氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，以及
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸；
(iii)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的氨基酸被改变为酪氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，以及
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸；
(iv)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，以及
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置301苏氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺；
(v)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置71精氨酸的氨基酸被改变为丝氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置94异亮氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，以及
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置301苏氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺；
(vi)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置70天冬氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置71精氨酸的氨基酸被改变为丝氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，以及
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置301苏氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺；或
(vii)在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置38苯丙氨酸的氨基酸被改变为酪氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置61酪氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置69甲硫氨酸的氨基酸被改变为谷氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置71精氨酸的氨基酸被改变为丝氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置166异亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置183丝氨酸的氨基酸被改变为精氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置191丝氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置212谷氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置231亮氨酸的氨基酸被改变为缬氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置276甲硫氨酸的氨基酸被改变为丙氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置280精氨酸的氨基酸被改变为甘氨酸，
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置297苏氨酸的氨基酸被改变为脯氨酸，以及
在等同SEQ ID NO：2氨基酸位置301苏氨酸的氨基酸被改变为谷氨酰胺。
86.燃料，其包含权利要求7或权利要求18所述的多肽，
其中任选地，所述燃料来源于植物材料，其任选地包括马铃薯、大豆(油菜籽)、大麦、黑麦、玉米、燕麦、小麦、甜菜或甘蔗、水稻、柳枝稷或芒(Miscanthus)、含油种子作物、大豆、低芥酸菜子、油菜籽、亚麻、棉花、棕榈、花生、树木、杨树或羽扇豆；
并且任选地，所述燃料包括液体或气体，
并且任选地，所述燃料是生物燃料或合成燃料，或所述燃料包括生物乙醇、生物甲醇、生物丙醇或生物丁醇，或所述燃料包括汽油-乙醇混合物、汽油-甲醇混合物、汽油-丙醇混合物和/或汽油-丁醇混合物。
87.制备燃料的方法，其包括：
(A)，将包含纤维寡糖、阿糖基木聚糖寡聚体、木质素、木质纤维素、木聚糖、葡聚糖、纤维素或可发酵糖的组合物与权利要求7或权利要求18所述的多肽接触，
(B)，(A)所述的方法，其中所述包括纤维寡糖、阿糖基木聚糖寡聚体、木质素、木质纤维素、木聚糖、葡聚糖、纤维素或可发酵糖的组合物包括植物、植物产品或植物衍生物；
(C)，(A)或(B)所述的方法，其中所述植物或植物产品包括蔗糖植物或植物产品、甜菜或制糖甜菜、小麦、玉米、大豆、马铃薯、水稻或大麦；
(D)，(C)所述的方法，其中所述植物是.单子叶植物或双子叶植物，或所述植物是单子叶玉米、甘蔗、水稻、小麦、大麦、柳枝稷或芒；或所述植物是双子叶含油种子作物、大豆、低芥酸菜子、油菜籽、亚麻、棉花、棕榈油、花生、树木、杨树或羽扇豆；
(E)，(A)、(B)、(C)或(D)所述的方法，其中所述多肽具有活性，包括纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶活性，其中任选地，所述组合物进一步包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶-1(β-葡糖苷酶)或葡萄糖氧化酶-2(β-木糖苷酶)，
(F)，(A)、(B)、(C)、(D)或(E)所述的方法，其中所述燃料包括液体和/或气体，或所述燃料包括生物燃料和/或合成燃料，或所述燃料包括生物乙醇、生物甲醇、生物丙醇和/或生物丁醇；和/或汽油-乙醇混合物、汽油-甲醇混合物、汽油-丁醇混合物和/或汽油-丙醇混合物。
88.制备生物乙醇、生物甲醇、生物丙醇和/或生物丁醇的方法，其包括：
(A)，将包含纤维寡糖、阿糖基木聚糖寡聚体、木质素、木质纤维素、木聚糖、葡聚糖、纤维素或可发酵糖的组合物与权利要求7或权利要求18所述的多肽接触；
(B)，(A)所述的方法，其中所述组合物包括植物、植物产品或植物衍生物，并且任选地，所述植物或植物产品包括蔗糖植物或植物产品、甜菜或制糖甜菜、小麦、玉米、大豆、马铃薯、水稻或大麦，
(C)，(A)或(B)所述的方法，其中所述多肽具有活性，包括木质纤维素酶和/或纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶活性，其中任选地，所述组合物进一步包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶-1(β-葡糖苷酶)或葡萄糖氧化酶-2(β-木糖苷酶)；
(D)，(A)、(B)或(C)所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，或所述植物是单子叶玉米、甘蔗、水稻、小麦、大麦、柳枝稷或芒；或所述植物是双子叶含油种子作物、大豆、低芥酸菜子、油菜籽、亚麻、棉花、棕榈油、糖甜菜、花生、树木、杨树或羽扇豆；或
(E)，(A)、(B)、(C)或(D)所述的方法，进一步包括处理和/或配制生物乙醇、生物甲醇、生物丙醇和/或生物丁醇作为液体燃料和/或气体燃料，其中任选地，所述燃料包括生物燃料和/或合成燃料，或所述燃料包括生物乙醇、生物甲醇、生物丙醇和/或生物丁醇；和/或汽油-乙醇混合物、汽油-甲醇混合物、汽油-丁醇混合物和/或汽油-丙醇混合物。
89.处理生物质材料的方法，包括将生物质材料与权利要求7或权利要求18所述的多肽接触，
其中任选地，包含木质纤维素的所述生物质材料源自农业作物，是食品或饲料生产的副产品，是木质纤维素废产品，或是植物残余物或废纸或废纸产品，并且任选地，所述多肽具有活性，包括木质纤维素酶和/或纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶活性，其中任选地，所述组合物进一步包含葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶-1(β-葡糖苷酶)或葡萄糖氧化酶-2(β-木糖苷酶)，
并且任选地，所述植物残余物包括茎、叶、壳、皮、玉米或玉米穗、玉米秸秆、干草、禾秆、木材、木片、木桨、木材废物和锯屑，
并且任选地，所述纸废物包括丢弃的或用过的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字机纸、报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料，
并且任选地，所述生物质材料的处理产生生物醇、生物乙醇、生物甲醇、生物丁醇或生物丙醇。
90.钻井、或油和气井洗涤和/或压裂方法，其包括：
(I)提供至少一种聚合物降解(“聚合物分解”)酶，其包括
(a)由权利要求1至3的任一项所述的核酸序列编码的多肽；
(c)具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ IDNO：23的序列的多肽；或
(d)分离的、合成的或重组的多肽，其具有权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列；
(e)多肽，其具有(a)到(d)所述的氨基酸序列，并保持酶活性和包含至少一个氨基酸残基保守置换，
其中任选地，保守置换包括用另一脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基酸；用苏氨酸置换丝氨酸，或反之；用另一酸性残基置换酸性残基；用具有酰胺基的另一残基置换具有酰胺基的残基；用另一碱性残基交换碱性残基；或者，用另一芳香族残基置换芳香族残基，或它们的组合，
并且任选地，所述脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成的等价物；所述酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物；所述包括酰胺基的残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物；所述碱性残基包括赖氨酸、精氨酸或其合成的等价物；或所述芳香族残基包括苯并氨酸、酪氨酸或其合成的等价物；和
(II)将所述酶加入到在油或气钻井操作过程中使用的钻井流体中，或将所述酶加入到用于油和气井洗涤和/或压裂操作的钻井流体中。
91.权利要求90所述的方法，其中所述淀粉酶、黄原胶酶或纤维素酶活性包括：
(a)内切葡聚糖酶活性，或纤维二糖水解酶活性、或β-葡糖苷酶活性或甘露聚糖酶活性，或内切纤维素酶活性，或纤维素酶活性，包括水解葡聚糖产生较小分子量的多糖或寡聚体，或包括催化1，4-β-D-糖苷键的水解，内切-1，4-β-内切纤维素酶活性或1，4-β-D-糖苷键活性，包括催化在纤维素、纤维素衍生物、地衣多糖或谷物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，或包括催化葡聚糖酶键的水解或催化β-1，4-和/或β-1，3-葡聚糖酶键或内切葡聚糖酶键的水解，或包括催化水解内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性，或包括催化内部内切-β-1，4-葡聚糖酶键和/或β-1，3-葡聚糖酶键的水解，或包括催化内部β-1，3糖苷键的水解，或包括水解包含吡喃葡萄糖的多糖，或包括水解包含1，4-β-糖苷-联接的D-吡喃葡萄糖的多糖，或包括水解纤维素、纤维素衍生物或半纤维素；或
(b)淀粉酶活性，或所述淀粉酶活性包括水解糖苷键，或包括葡糖淀粉酶活性，或包括1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性，或包括α-淀粉酶活性，或包括外切淀粉酶活性，或包括β-淀粉酶活性，或包括水解包括α-1，4-糖苷键或α-1，6-糖苷键在内的糖苷键，或包括水解淀粉中的糖苷键，或包括水解淀粉中的糖苷键以产生麦芽糊精，或包括切割淀粉的未还原端的麦芽糖或D-葡萄糖单位。
92.权利要求90所述的方法，其中所述酶作为流体加入。
93.权利要求92所述的方法，其中所述流体包含淀粉作为增粘剂。
94.权利要求90至93任一项所述的方法，其中所述酶以相对高的碱度被配制。
95.权利要求94所述的方法，其中所述相对高的碱度是pH9至pH9.5。
96.权利要求90至95任一项所述的方法，其中所述酶为酸性-到-中性酶。
97.权利要求90至96任一项所述的方法，其中所述酶在所述钻井流体或油和气井洗涤和/或压裂流体以及在所述流体失去水后在地层表面形成的泥饼(“滤饼”)中保持无活性状态。
98.权利要求97所述的方法，其中为了激活酶，所述泥饼可以用酸性溶液洗涤，其中所述酸将中和所述泥饼(“滤饼”)的碱度，并提供激发对淀粉或其它聚合物的酶活性和水解功能的酸性环境。
99.权利要求90至98任一项所述的方法，其中所述酶进行“酸洗涤”。
100.权利要求99所述的方法，其中所述酸洗涤在钻井操作和/或井清洗操作期间应用，以从所述地层中去除碳酸钙沉积物。
101.权利要求100所述的方法，其中一旦被所述酸性环境激活，所述酶将降解淀粉或其它聚合物，并且将从井筒去除所述泥饼(“滤饼”)。
102.钻井、或油和气井洗涤和/或压裂方法，其包括：
(I)提供至少一种聚合物降解(“聚合物分解”)酶，该酶包括
(a)由权利要求1至3任一项所述的核酸序列编码的多肽；
(c)具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ IDNO：23的序列的多肽；或
(d)分离的、合成的或重组的多肽，其具有权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列；
(e)多肽，其具有(a)到(d)所述的氨基酸序列，并保持酶活性和包含至少一个氨基酸残基保守置换，
其中任选地，保守置换包括用另一脂肪族氨基酸替换脂肪族氨基酸；用苏氨酸替换丝氨酸，或反之；用另一酸性残基替换酸性残基；用另一具有酰胺基的残基替换具有酰胺基的残基；用另一碱性残基交换碱性残基，或者，用另一芳香族残基替换芳香族残基，或它们的组合，
并且任选地，所述脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成的等价物；所述酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物；所述包括酰胺基的残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物；所述碱性残基包括赖氨酸、精氨酸或其合成的等价物；或所述芳香族残基包括苯并氨酸、酪氨酸或其合成的等价物；和
(II)将所述聚合物降解(“聚合物分解”)酶混合物加入到在油和气井钻井操作期间使用的钻井流体中，或将所述酶混合物加入到用于油和气井洗涤和/或压裂操作的钻井流体中。
103.钻井或油和气井洗涤和/或压裂方法，其包括：
(a)提供聚合物降解(“聚合物分解”)酶的混合物，其中至少一种所述酶是聚合物降解(“聚合物分解”)酶，并且任选地，所述聚合物降解(“聚合物分解”)酶是木质素降解酶，木质素过氧化物酶、多糖降解(“聚合物破裂”)酶、蛋白质降解酶、淀粉酶、黄原胶酶、葡聚糖酶、蛋白水解酶、糖苷酶和/或纤维素酶；和
(b)将所述聚合物降解(“聚合物分解”)酶混合物加入到在油和气钻井操作期间使用的钻井流体中，或将所述酶混合物加入到用于油和气井洗涤和/或压裂操作的钻井流体中。
104.权利要求102或103所述的方法，其中所述淀粉酶、黄原胶酶或纤维素酶活性包括：
(a)内切葡聚糖酶活性，或纤维二糖水解酶活性、或β-葡糖苷酶活性或甘露聚糖酶活性，或内切纤维素酶活性，或纤维素酶活性，包括水解葡聚糖产生较小分子量的多糖或寡聚体，或包括催化1，4-β-D-糖苷键的水解，内切-1，4-β-内切纤维素酶活性或1，4-β-D-糖苷键活性，包括催化在纤维素、纤维素衍生物、地衣多糖或谷物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，或包括催化葡聚糖酶键的水解或催化β-1，4-和/或β-1，3-葡聚糖酶键或内切葡聚糖酶键的水解，或包括催化水解内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性，或包括催化内部内切-β-1，4-葡聚糖酶键和/或β-1，3-葡聚糖酶键的水解，或包括催化内部β-1，3糖苷键的水解，或包括水解包含吡喃葡萄糖的多糖，或包括水解包含1，4-β-糖苷-联接的D-吡喃葡萄糖的多糖，或包括水解纤维素、纤维素衍生物或半纤维素；或
(b)淀粉酶活性，或所述淀粉酶活性包括水解糖苷键，或包括葡糖淀粉酶活性，或包括1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性，或包括α-淀粉酶活性，或包括外切淀粉酶活性，或包括β-淀粉酶活性，或包括水解包括α-1，4-糖苷键或α-1，6-糖苷键在内的糖苷键，或包括水解淀粉中的糖苷键，或包括水解淀粉中的糖苷键以产生麦芽糊精，或包括切割淀粉的未还原端的麦芽糖或D-葡萄糖单位。
105.权利要求102至104任一项所述的方法，其中所述酶作为流体加入。
106.权利要求105所述的方法，其中所述流体包含淀粉作为增粘剂。
107.权利要求102至106任一项所述的方法，其中所述酶以相对高的碱度被配制。
108.权利要求107所述的方法，其中所述相对高的碱度是pH9至pH9.5。
109.权利要求102至108任一项所述的方法，其中所述酶为酸性-到-中性酶。
110.权利要求102至109任一项所述的方法，其中所述酶在所述钻井流体或油和气井洗涤和/或压裂流体以及在所述流体失去水后在地层表面形成的泥饼(“滤饼”)中保持无活性状态。
111.权利要求110所述的方法，其中为了激活酶，所述泥饼(“滤饼”)可以用酸性溶液洗涤，其中所述酸将中和所述泥饼的碱度，并提供激发对淀粉或其它聚合物的酶活性和水解功能的酸性环境。
112.权利要求111所述的方法，其中所述酶进行“酸洗涤”。
113.权利要求112所述的方法，其中所述酸洗涤在钻井操作和/或井清洗操作期间应用，以从所述地层中去除碳酸钙沉积物。
114.权利要求111至113所述的方法，其中一旦被所述酸性环境激活，所述酶将降解淀粉或其它聚合物，并且将从井筒去除所述泥饼(“滤饼”)。
115.用于降解黄原胶、瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆、瓜尔胶、瓜尔胶粉末、木质化的瓜尔豆种子外皮或固化的瓜尔胶的方法，其包括
(I)提供至少一种聚合物降解(“聚合物分解”)酶，其包括
(a)由权利要求1至3的任一项所述的核酸序列编码的多肽；
(c)具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ IDNO：23的序列的多肽；或
(d)分离的、合成的或重组的多肽，其具有权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列；
(e)多肽，其具有(a)到(d)所述的氨基酸序列，并保持酶活性和包含至少一个氨基酸残基保守置换，
其中任选地，保守置换包括用另一脂肪族氨基酸替换脂肪族氨基酸；用苏氨酸替换丝氨酸，或反之；用另一酸性残基替换酸性残基；用具有酰胺基的另一残基替换具有酰胺基的残基；用另一碱性残基交换碱性残基；或者，用另一芳香族残基替换芳香族残基，或它们的组合，
并且任选地，所述脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成的等价物；所述酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物；所述包括酰胺基的残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等价物；所述碱性残基包括赖氨酸、精氨酸或其合成的等价物；或所述芳香族残基包括苯并氨酸、酪氨酸或其合成的等价物；和
(II)将所述聚合物降解(“聚合物分解”)酶混合物加入到瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆、瓜尔胶、瓜尔胶粉末、木质化的瓜尔豆种子外皮或固化的瓜尔胶中。
116.用于降解黄原胶、瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆、瓜尔胶、瓜尔胶粉末、木质化的瓜尔豆种子外皮或固化的瓜尔胶的方法，其包括
(a)提供聚合物降解(“聚合物分解”)酶的混合物，其中至少一种所述酶是聚合物降解(“聚合物分解”)酶，并且任选地，所述聚合物降解(“聚合物分解”)酶是木质素降解酶，木质素过氧化物酶、多糖降解酶、蛋白质降解酶、淀粉酶、黄原胶酶、葡聚糖酶、蛋白水解酶、糖苷酶和/或纤维素酶；和
(b)将所述聚合物降解(“聚合物分解”)酶混合物加入到瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆、瓜尔胶、瓜尔胶粉末、木质化的瓜尔豆种子外皮或固化的瓜尔胶中，所加入的量足以降解瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆、瓜尔胶、瓜尔胶粉末、木质化的瓜尔豆种子外皮或固化的瓜尔胶。
117.权利要求115或116所述的方法，其中所述淀粉酶、黄原胶酶或纤维素酶活性包括
(a)内切葡聚糖酶活性，或纤维二糖水解酶活性、或β-葡糖苷酶活性或甘露聚糖酶活性，或内切纤维素酶活性，或纤维素酶活性，包括水解葡聚糖产生较小分子量的多糖或寡聚体，或包括催化1，4-β-D-糖苷键的水解，内切-1，4-β-内切纤维素酶活性或1，4-β-D-糖苷键活性，包括催化在纤维素、纤维素衍生物、地衣多糖或谷物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，或包括催化葡聚糖酶键的水解或催化β-1，4-和/或β-1，3-葡聚糖酶键或内切葡聚糖酶键的水解，或包括催化水解内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性，或包括催化内部内切-β-1，4-葡聚糖酶键和/或β-1，3-葡聚糖酶键的水解，或包括催化内部β-1，3糖苷键的水解，或包括水解包含吡喃葡萄糖的多糖，或包括水解包含1，4-β-糖苷-联接的D-吡喃葡萄糖的多糖，或包括水解纤维素、纤维素衍生物或半纤维素；或
(b)淀粉酶活性，或所述淀粉酶活性包括水解糖苷键，或包括葡糖淀粉酶活性，或包括1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶活性，或包括α-淀粉酶活性，或包括外切淀粉酶活性，或包括β-淀粉酶活性，或包括水解包括α-1，4-糖苷键或α-1，6-糖苷键在内的糖苷键，或包括水解淀粉中的糖苷键，或包括水解淀粉中的糖苷键以产生麦芽糊精，或包括切割淀粉的未还原端的麦芽糖或D-葡萄糖单位。
118.权利要求115至116任一项所述的方法，其中所述酶作为流体加入。
119.权利要求118所述的方法，其中所述流体包含淀粉作为增粘剂。
120.权利要求115至120任一项所述的方法，其中所述酶以相对高的碱度被配制。
121.权利要求120所述的方法，其中所述相对高的碱度是pH9至pH9.5。
122.权利要求115至120任一项所述的方法，其中所述酶为酸性-到-中性酶。
123.权利要求115至122任一项所述的方法，其中所述酶在所述钻井流体或油和气井洗涤和/或压裂流体以及在所述流体失去水后在地层表面形成的泥饼(“滤饼”)中保持无活性状态。
124.权利要求123所述的方法，其中为了激活酶，所述泥饼可以用酸性溶液洗涤，其中所述酸将中和所述泥饼(“滤饼”)的碱度，并提供激发对淀粉或其它聚合物的酶活性和水解功能的酸性环境。
125.权利要求124所述的方法，其中所述酶进行“酸洗涤”。
126.权利要求125所述的方法，其中所述酸洗涤在钻井操作和/或井清洗操作期间应用，以从所述地层中去除碳酸钙沉积物。
127.权利要求124至126任一项所述的方法，其中一旦被所述酸性环境激活，所述酶将降解淀粉或其它聚合物，并且将从井筒去除所述泥饼(“滤饼”)。
128.权利要求115至127任一项所述的方法，其中所述酶混合物包括选自下列酶的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或全部：木质素降解酶、α淀粉酶、β淀粉酶、葡糖淀粉酶、糊精酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、漆酶、木质素过氧化物酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、黄原胶裂解酶、黄原胶解聚酶、支链淀粉酶、地衣多糖酶、茯苓聚糖酶、脂肪酶、蛋白水解酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、肽酶和过氧化氢酶；或淀粉酶、黄原胶酶、糖苷酶、纤维素酶，使用和其它酶的任何组合，所述其它酶例如色氨酸酶或酪氨酸脱羧酶、漆酶、过氧化氢酶、漆酶、其它纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-漆酶、淀粉葡糖苷酶、其它葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂肪酶、磷酸脂酶、脂氧化酶、β-漆酶、内切-β-1，3(4)-漆酶、角质酶、过氧化物酶、其它淀粉酶、黄原胶酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木漆酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白水解酶、肽酶、蛋白酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、其它纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。
129.权利要求90至128任一项所述的方法，其中所述在油和气钻井操作期间使用的钻井流体被用于生产井、注入井、裸眼井段、管井、水平井或天然的或人工的裂缝中；或者，所述酶混合物被加入到包括生产井、注入井、裸眼井段、管井、水平井或天然或人工裂缝的油和气井洗涤和/或压裂操作中。
130.权利要求90至129任一项所述的方法，其中被所述酶或酶混合物(“鸡尾酒”)降解的所述聚合物包括木质素、淀粉、纤维素、瓜尔豆、羟烷基瓜尔豆、羧烷基瓜尔豆、瓜尔胶、瓜尔胶粉末、木质化的瓜尔豆种子外皮或固化的瓜尔胶或黄原胶。
131.权利要求90至130任一项所述的方法，其中所述酶、多种酶或酶混合物(“鸡尾酒”)被配制为包含：(a)淀粉、黄原胶和/或纤维素粉末；或(b)缓冲盐和酶(一种或多种)的混合物，其中任选地，所述配制被用于制备泥浆。
132.改变或调节多糖增稠剂；凝胶、絮凝物、粘合剂或润滑剂中的多糖增稠剂的流变性质；或膜中的多糖的流变性质以改变所述膜的性质的方法，所述方法包括：
(I)提供酶混合物，或至少一种聚合物降解(“聚合物分解”)酶，其包括
(a)由权利要求1至3任一项所述的核酸序列编码的多肽；
(b)具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ IDNO：23的序列的多肽；或
(c)分离的、合成的或重组的多肽，其具有聚合物降解活性，或淀粉酶、黄原胶酶、葡聚糖酶、蛋白水解酶和/或糖苷酶或纤维素酶活性并且具有权利要求7或权利要求18所述的氨基酸序列；和
(II)将所述多种酶的混合物或酶加入到所述多糖增稠剂；凝胶、絮凝物、粘合剂或润滑剂中的所述多糖增稠剂；或膜中的所述多糖中，从而调节或改变所述凝胶、絮凝物、粘合剂、润滑剂或膜的性质。
133.权利要求132所述的方法，其中所述多种酶的混合物包括选自下列酶的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或全部：木质素降解酶、α淀粉酶、β淀粉酶、葡糖淀粉酶、糊精酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡聚糖酶、葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、漆酶、木质素过氧化物酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、黄原胶裂解酶、黄原胶解聚酶、支链淀粉酶、地衣多糖酶、茯苓聚糖酶、脂肪酶、蛋白水解酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、肽酶和过氧化氢酶；或淀粉酶、黄原胶酶、糖苷酶、纤维素酶，使用和其它酶的任何组合，所述其它酶例如色氨酸酶或酪氨酸脱羧酶、漆酶、过氧化氢酶、漆酶、其它纤维素酶、内切糖苷酶、内切-β-1，4-漆酶、淀粉葡糖苷酶、其它葡糖苷酶、葡萄糖异构酶、糖基转移酶、脂肪酶、磷酸脂酶、脂氧化酶、β-漆酶、内切-β-1，3(4)-漆酶、角质酶、过氧化物酶、其它淀粉酶、黄原胶酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、脱羧酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木漆酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、蛋白水解酶、肽酶、蛋白酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、转谷氨酰胺酶、果胶甲基酯酶、其它纤维二糖水解酶和/或转谷氨酰胺酶。
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