WO2001030161A1 - Procede de stimulation des defenses naturelles des plantes - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method of stimulating the natural defenses of plants by the production by them of phytoalexins and peroxidases under the action of elicitors.
  • the invention also relates to the use of said specific elicitors for different cultures as well as the corresponding compositions.
  • the search for means of protecting plants against diseases has until now been rather directed towards a direct fight against pathogens by the use of different phytosamestic products, the plant being considered as a support more than a living being. able to defend themselves.
  • Another possibility of inducing this resistance is to modify the genetic heritage of the plant so that it itself produces the compounds responsible for setting up defense mechanisms.
  • GMOs genetically modified organisms
  • Chemical elicitors Many products are known as elicitors. In fact, in addition to mercuric ions, arachidonic acid and phosphorous acid are also known as stimulators of the natural defense mechanisms of plants sensitive to phycomycetes.
  • Natural compounds such as oligosaccharides are known for their activity as elicitors.
  • the chitosan (chitin derivative) polymer of 1,4-BD-glycosamine is used to increase the resistance of plants to environmental stress and pathogens.
  • Fiedler et al. Patent, W0-8906687 is an essential reference for these types of elicitor.
  • the authors claim the process of increasing the enzymatic activities responsible for the synthesis of dyes, alkaloids or phytoalexins when we put micro-organisms and inactivated bacteria, their fragments or their excretions containing elicitors in contact with cell cultures of plants.
  • An exhaustive list of microorganisms and bacteria is given there; many are not included, including trichoderma.
  • chitanases are known to degrade the wall of fungi consisting of chitin (polymer of N-acetyl-1,4-BD-glycosamine) and glucanases as for them, are capable of hydrolyzing polymers of 1, 3 (4) -B-glucans, essential constituents of the wall of certain fungi. They act in synergy with chitinases to degrade cells of pathogens and allow fungicides to act more effectively.
  • the invention relates to the production of enzymes from plant extracts and more particularly from exotic plants.
  • Example No. 1 Protease production Protease production can be carried out from sap or from the epidermis of fruits, in particular euphorbiaceae.
  • the assays are carried out in this same buffer using gaiacol as a substrate.
  • the results are expressed in ⁇ DO / min / gMF. Spraying the protease leaves with wetting agents causes an increase in peroxidase and chitinic activity 5 to 6 times greater than plants treated without protease.
  • the method according to the invention is characterized in that it comprises the foliar, root or injection application to said plants of mixtures of plant extracts comprising at least one protein of the enzymatic type belonging to proteases, lipases, pectinases and also B1, 3-glucanases, xylanases, galactanases, mannanases, chitinases or of the non-enzymatic peptide type.
  • the active substance of the non-enzymatic type comprises peptides whose number of animated acids is at least equal to 2.
  • Enzymatic proteins and non-enzymatic peptides are obtained from all types of plants.
  • the proteins in question are used incorporated in a support or vehicle authorized in agriculture of the wetting and penetrating types.
  • composition can be in the liquid form, in particular in the form of an aqueous solution. It can also be presented in the solid form, in particular of powders or of granules or in coating of seeds.
  • - cereals in particular wheat, maize and rice, the attack of oidiums, septoria, rust, fusarioses, pyricularis and bacterial diseases
  • - oilseeds in particular soybeans, sunflowers and rapeseed, the attack of oidiums, Phoma, bacterial diseases
  • composition according to the invention is therefore characterized in that it comprises:

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Abstract

L'invention concerne un procédé de stimulation des défenses naturelles des plantes par la production par celles-ci de phytoalexines et de péroxydases sous l'action d'éliciteurs. Elle concerne également les utilisations et compositions correspondantes. Le procédé en question se caractérise en ce qu'il comprend l'application foliaire, racinaire ou par injection auxdites plantes de mélanges d'extraits végétaux comprenant au moins une protéine du type enzymatique appartenant aux protéases, aux lipases, aux pectinases et aussi aux B-1, 3-glucanases, aux xylanases, aux galactanases, aux mannanases, aux chitinases ou du type peptide non enzymatique.

Description

PROCEDE DE STIMULATION DES DEFENSES NATURELLES DES PLANTES
DESCRIPTION
L'invention concerne un procédé de stimulation des défenses naturelles des plantes par la production par celles-ci de phytoalexines et de peroxydases sous l'action d'éliciteurs.
L'invention concerne également l'utilisation desdits éliciteurs spéci- fiques aux différentes cultures ainsi que les compositions correspondantes. Les recherches de moyens de protection des plantes contre les maladies étaient jusqu'à nos jours plutôt dirigés vers une lutte directe contre les pathogènes par l'utilisation de différents produits phytosam- taires, la plante étant considérée comme un support plus qu'un être vivant pouvant se défendre.
Malheureusement, l'utilisation de ces produits ne sont pas sans conséquence sur l'environnement et sur l'alimentation à cause des résidus subsistant dans la plante. Aujourd'hui, on s'intéresse davantage aux moyens de déclencher au sein de la plante elle même des réactions de défense efficaces ou celles existant déjà.
La stimulation des défenses naturelles se traduit par le développement d'un ensemble de modifications biologiques qui confèrent à cette plante une résistance immédiate et une présensibilisation grâce à laquelle elle devient capable de réagir plus efficacement à une nouvelle attaque. Cette présensibilisation est désignée par l'expression "résistance systématique acquise".
On connaît des produits appelés éliciteurs ou sensibilisateurs qui, mis au contact de la plante, sont capables de provoquer préventivement dans celle-ci , la résistance immédiate et la présensibilisation ou résistance systématique acquise dont il vient d'être question. On observe une stimulation très rapide de métabolismes secondaires qui conduisent par exemple :
- à la production de phytoalexines (Chappel et al., Plant Physiology (1991) 97, 693-698):
- à un renforcement de la paroi cellulaire (Glazener, Physiological Plant Pathology ( 1982) 20 , 11-25) ;
- à la production de protéines de défense (Kim et al., Physiological
Plant Pathology (1994) 45,195-209).
Une autre possibilité d'induire cette résistance est de modifier le patrimoine génétique de la plante pour qu'elle produise elle même les composés responsables de la mise en place des mécanismes de défense
(Schulein et al., brevet FR-9611262).
Cette technologie est assez répandue de nos jours. Elle donne naissance à de nouvelles variétés appelées couramment "organismes génétiquement modifiés" (OGM). Pour l'instant, l'impact sur l'environnement et la sécurité alimentaire de ces OGM sont méconnus.
Dans le souci d'abaisser les coûts de production agricole par la diminution de l'usage de produits phytosanitaires, le déposant s'est donné comme programme de recherche la découverte et la mise en exploi- tation de nouveaux éliciteurs.
Il ressort de nombreuses recherches bibliographiques effectuées, que différents composés sont décrits comme éliciteurs. Ils sont d'origines chimiques, biochimiques, fongiques ou enzymatiques.
Les éliciteurs chimiques De nombreux produits sont connus comme éliciteurs. En effet, outre les ions mercuriques, l'acide arachidonique, l'acide phosphoreux sont aussi connus comme stimulateurs des mécanismes naturels de défense des végétaux sensibles aux phycomycètes.
Le cuivre sous la forme d'hydroxyde ou de sulfate des bouillies borde- laises déclenche des réactions de défense de la vigne. De même le chlorure d'aluminium (A1C13) déclenche la synthèse du resveratrol dans la vigne.
De nombreux dérivés de l'acide salicylique ont été testés pour leur potentialité d 'éliciteurs, les acides oxi-fulviques sont commercialisés comme éliciteurs sachant que les acides fulviques et humiques sont des macromolécules constituées de motifs monomères carboxy-phénoliques rappelant l'acide salicylique. Des tests en laboratoire ont été effectués sur des jeunes plants de melon et les résultats sont satisfaisants.
Les éliciteurs biochimiques
Des composés naturels tels que les oligosaccharides sont connus pour leur activité d 'éliciteurs. En effet, le chitosan (dérivé de la chitine) polymère de 1,4-B-D—glycosamine est employé pour accroître la résistance de plantes au stress environnemental et aux agents pathogènes.
L'utilisation de fragments de polysaccharides de tout genre comme stimu- lateurs de mécanisme de défense des plantes a ainsi fait l'objet de nombreuses expérimentations. Les éliciteurs fongiques
Le brevet Fiedler et al., W0-8906687 est une référence incontournable pour ces genres d'éliciteurs. Dans celui-ci, les auteurs revendiquent le procédé d'accroître les activités enzymatiques responsables de la synthèse de colorants, alcaloides ou phytoalexines lorsque l'on met des micro-organismes et les bactéries inactivées, leurs fragments ou leurs excrétions contenant des éliciteurs en contact avec des cultures cellulaires de plantes. Une liste exhaustive de micro-organismes et de bactéries y est donnée; beaucoup n'y figurent pas y compris le trichoderma.
De plus ils revendiquent la mise en contact de fragments de microorganismes ou bactéries avec des cultures cellulaires alors que le programme de recherche du déposant s'est orienté vers une composition pour application foliaire ou racinaire sur une plante entière. Les éliciteurs enzymatiques
Par rapport aux composés chimiques, très peu d'enzymes sont utilisées comme éliciteurs. Les premiers travaux décrivent la synthèse de phytoalexines, notamment du capsidiol par les cellules de plants de tabac lorsque l'on ajoute de la cellulase produite par du Trichoderma viride dans le milieu de culture.
D'autres travaux ont confirmé cette découverte sur des cellules de pomme de terre ou de poivre. Par ailleurs, sur des cellules de vigne on observe la synthèse d'autres types de phytoalexines et notamment du resveratrol.
Des découvertes similaires ont été faites lorsque l'on utilise de la xylanase produite par le Trichoderma viride.
Tous les travaux en question ont été effectués in vitro, sur des suspensions de cellules de plantes. Il n'a jamais été question d'appli- cation ou de pulvérisation directe d'une composition à base de cellulase ou de toute autre enzyme de la classe des hydrolases sur des plantes pour déclencher des réactions de défense de la plante.
Seules, des applications à base de compositions fongicides contenant des produits phytosanitaires connus en combinaison avec des enzymes chitinolytiques et glucanolytiques
En effet, la présence de ces enzymes dans la composition augmente l'activité de ces fongicides car les chitanases sont connues pour dégrader la paroi des champignons constituée de chitine (polymère de N-acétyl- 1 ,4-B-D-glycosamine) et les glucanases quant à elles, sont capables d'hydrolyser des polymères de 1 ,3(4)-B-glucanes, constituants essentiels de la paroi de certains champignons. Elles agissent en synergie avec les chitinases pour dégrader les cellules des agents pathogènes et permettre aux fongicides d'agir plus efficacement.
Dans ces applications, il n'est pas également question de stimulation des mécanismes naturels de défense des végétaux mais plutôt d'accroître l'efficacité de produits phytosanitaires déjà existants.
L'invention concerne la production d'enzymes à partir d'extraits végétaux et plus particulièrement de plantes exotiques. Exemple n°l Production de protéase La production de protéase peut se faire à partir de sève ou d' épiderme de fruits notamment des euphorbiacées.
Ces extraits sont broyés puis filtrés et standardisés quant à leur activité enzymatique.
Exemple n°2 Protocole pour le dosage des proteases 1% de Caséine est dissout dans un tampon TRIS-P040.05M, pH 7.8.
Les tubes contenant 5 ml de solution sont incubés à 37°C pendant 5 minutes. Dix à vingt microlitres d'extrait végétal sont rajoutés à la solution. Dix minutes après avoir ajouté l'extrait, la réaction enzymatique est stoppée par 5 ml de TCA, puis filtrée. L'activité enzymatique est déterminée par la lecture de 1 'absorbance à 280 nm. Exemple N°3
Pour mettre en évidence les propriétés élicitrices des proteases, quelle que soit leur origine, sur les plantes, diverses expériences ont été réalisées sur différentes espèces végétales afin de mesurer l'induction de la résistance contre les agents pathogènes (melon, vigne, tomate, concombre ... ) .
Compte tenu αe l'importance des peroxydase et des chinitases (enzymes endogènes aux plantes) dans la résistance des plantes (protéines liées à la pathogénèse), nous avons utilisé ces activités comme marqueur de la résistance.
L'infiltration d'une solution de protéase dans les feuilles des jeunes plants de melon âgés de 15 jours, provoque l'augmentation de l'activité peroxydasique 6 fois supérieure à celle détectée dans les plans témoins infiltrés avec l'eau. Afin de doser les activités peroxy- dasiques, les feuilles sont broyées en milieu tampon tris-maléate pH 6. L'extrait est ensuite mis en présence de gaiacol et de l'eau oxygénée et une réaction rapide se fait : le gaiacol est transformé en tétra- gaiacol.L'apparition du tétragaïacol dans le milieu, nous permet de calculer l'activité peroxydasique.
Les dosages sont effectués dans ce même tampon en utilisant le gaiacol comme substrat. Les résultats sont exprimés en ΔDO/mn/gMF. La pulvérisation sur les feuilles de protéase associée à des mouillants provoque une augmentation d'activité peroxydasique et chitinasique 5 à 6 fois supérieure aux plants traités sans protéase. Exemple n°4
Des résultats similaires sont obtenus à grande échelle sur plants développant le fruit en serre. Suite à une infiltration ou pulvérisation de protéase , les plants de melons sont inoculés parle fusarium oxysporum fsp melonis. Parallèlement, les feuilles d'un lot de plantule ont été infiltrées ou pulvérisées avec de l'eau. Dix jours après l'inoculation, les symptômes apparaissent uniquement chez les plants inoculés traités avec de l'eau. Trois semaines après l'infection, les jeunes plants infectés se dessèchent et meurent. Les plants inoculés et traités avec la protéase ne présentent pas de symptômes avant 6 semaines et continuent ensuite à se développer normalement.
Ces résultats expriment clairement le pouvoir d'éliciteur de la protéase sur la résistance des plants de melon vis à vis du fusarium sp. Exemple n°5 En infiltrant ou pulvérisant de la protéase sur les plants de melon, on observe un effet similaire de protection par rapport à l'oiodium.
En effet, 5 jours après l'inoculation par l'oidium, les symptômes apparaissent sur les plants traités préalablement avec de l'eau, et jaunissent peu à peu. Les plants traités avec la protéase ne présentent que peu ou pas de symptômes et continuent de se développer normalement
3 semaines après l'inoculation.
Exemple n°6
L'infiltration et la pulvérisation de la protéase sur les feuilles de vigne provoque également une forte augmentation d'activité peroxydasique.
Le procédé selon l'invention se caractérise en ce qu'il comprend l'application foliaire, racinaire ou par injection auxdites plantes de mélanges d'extraits végétaux comprenant au moins une protéine du type enzymatique appartenant aux proteases, aux lipases, aux pectinases et aussi aux B-l ,3-glucanases, aux xylanases, aux galactanases, aux mannanases, aux chitinases ou du type peptide non enzymatique.
La substance active du type non enzymatique comprend des peptides dont le nombre d'acides animés est au moins égal à 2.
Les protéines enzymatiques et peptides non enzymatiques sont obtenues à partir de tout type de végétaux.
Les protéines en question sont utilisées incorporées à un support ou véhicule autorisé en agriculture des types mouillant et pénétrant.
La composition précitée peut se présenter sous la forme liquide, notamment sous forme de solution acqueuse. Elle peut se présenter également sous la forme solide, notamment de poudres ou de granulés ou en enrobage de semences.
Les protéines en question ont pour effet de réduire considérablement, lorsqu'elles sont appliquées :
- à la vigne, l'attaque de l'oidium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques;
- aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des oidiums, des tavelures, les monilioses, les maladies bactériennes;
- aux céréales, notamment le blé, le mais et le riz, l'attaque des oidiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses, des pyricula- rioses et des maladies bactériennes; - aux oléagineux, notamment le soja, le tournesol et le colza, l'attaque des oidiums, du Phoma, des maladies bactériennes;
- aux plantes légumières, notamment les tomates, les melons, les carottes, le chou-fleur et les pommes de terre, l'attaque des oidiums, des mildious, des pythiacées (Phytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Sclerotinia, Pyrenochaeta, des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium) , les maladies bactériennes;
- aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oidiums, maladies bactériennes. La composition selon l'invention se caractérise donc en ce qu'elle comporte :
- au moins une protéine du type enzymatique appartenant à la classe des hydrolases;
- et/ou au moins une protéine du type peptide non enzymatique.

Claims

REVENDICATIONS
1- Procédé de stimulation des défenses naturelles des plantes par la production par celles-ci de phytoalexines et de peroxydases sous l'action d 'éliciteurs; caractérisé en ce qu'il comprend l'application foliaire, racinaire ou par injection auxdites plantes de mélanges d'extraits végétaux comprenant au moins une protéine du type enzymatique appartenant aux proteases, aux lipases, aux pectinases et aussi aux B-l ,3-glucanases, aux xylanases, aux galactanases, aux mannanases, aux chitinases ou du type peptide non enzymatique. 2- Procédé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que la substance active du type peptide non enzymatique comprend des peptides dont le nombre d'acides animés est au moins égal à 2.
3- Procédé, selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les protéines enzymatiques et peptides non enzyma- tiques sont obtenues à partir de tous types de végétaux.
4- Utilisation d'une protéine telle que définie dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est incorporée à un support ou véhicule autorisé en agriculture des types mouillant et pénétrant. 5- Utilisation d'une protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce que la composition précitée se présente sous la forme liquide, notamment sous forme de solution aqueuse.
6— Utilisation d'une protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce que la composition précitée se présente sous la forme solide, notam- ment de poudres ou de granulés ou en enrobage de semences.
7- Utilisation d'une protéine telle que définie dans l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait qu'elle a pour effet de réduire considérablement, lorsqu'elle est appliquée :
- à la vigne, l'attaque de l'oidium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques;
- aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des oidiums, des tavelures, des monilioses, des maladies bactériennes;
- aux céréales, notamment le blé, le mais et le riz, l'attaque des oidiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses, des pyricula- rioses et des maladies bactériennes; - aux oléagineux, notamment le soja, le tournesol et le colza, l'attaque des oidiums, du Phoma, des maladies bactériennes;
- aux plantes légumières, notamment les tomates, les melons, les carottes, le chou-fleur et les pommes de terre, l'attaque des oidiums, des mildious, des pythiacées (Phytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Sclerotinia, Pyrenochaeta, des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium) , des maladies bactériennes;
- aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oidiums, maladies bactériennes. 8- Composition pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et pour les utilisations selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une protéine du type enzymatique appartenant à la classe des hydrolases. 9- Composition pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et pour les utilisations selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 , caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une protéine du type peptide non enzymatique.
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