CN105567661A - 一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法 - Google Patents

一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法 Download PDF

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    • C12Y302/01058—Glucan 1,3-beta-glucosidase (3.2.1.58)

Abstract

本发明提供了一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法，属于蛋白质制备领域。本发明的方法包括将脱脂的莜麦粉用4-6倍体积的100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6)，在4℃低温条件下抽提8-12小时，利用硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose4B阴离子柱、Chitin-Sepharose4B几丁质亲和纯化柱、Sephacryl-200凝胶柱，除去莜麦其他蛋白，获得电泳纯的莜麦β-1,3-葡聚糖酶。本发明莜麦β-1,3-葡聚糖酶的提取方法，操作简单、对设备要求低，且所得到的β-1,3-葡聚糖酶纯度高，可用于植物抗真菌、饲料添加、啤酒及制糖等领域。

Description

一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法
技术领域
本发明涉及莜麦蛋白质制备领域，具体是一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法。
背景技术
β-1,3-葡聚糖酶是一类葡聚糖水解酶家族的一员，广泛存在植物、动物、微生物中，它可有效水解很多植物病原真菌细胞壁中的β-1,3-葡聚糖，帮助植物抵御病原真菌的侵染。将外源β-1,3-葡聚糖酶基因转入植物中可以提高植物抗病性能。在啤酒生产和制糖工业中，可以用于糖化，有利于改善麦汁的过滤性能、提高麦汁的收得率以及有效降低粮食消耗。此外，β-1,3-葡聚糖酶还可作为一种新型添加剂被加入饲料当中，有效消除饲料(尤其麦类作物及其副产品)中β-葡聚糖的抗营养作用，使麦类饲料的营养更易被动物消化吸收。
β-1,3-葡聚糖酶一般纯化过程大都通过盐析、再结合多步柱层析的方法进行分离，存在步骤较复杂、成本高、蛋白纯度低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种从莜麦蛋白粉中分离β-1,3-葡聚糖酶的方法，该方法简便易操作，能够实现用较低成本提取到高纯度的β-1,3-葡聚糖酶。
本发明提供的一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将莜麦蛋白粉用4-6倍体积100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6)溶解，4℃低温下抽提蛋白8-12小时，高速离心去除沉淀，保留上清即得到β-1,3-葡聚糖酶粗提液；
(2)β-1,3-葡聚糖酶粗提液经20％-70％硫酸铵分级沉淀；
(3)硫酸铵分级沉淀样品经透析除盐，上样于经100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6)平衡的Q-Sepharose4B阴离子交换柱，收集穿透样品；
(4)Q-Sepharose4B阴离子交换柱穿透样品，上样于经100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6)平衡的几丁质亲和纯化柱Chitin-Sepharose4B，收集穿透样品；
(5)几丁质亲和纯化柱穿透样品浓缩后上样于经100mM磷酸缓冲液(pH为6.4-6.6)平衡的Sephacryl-200凝胶柱进行纯化，获得电泳纯的莜麦β-1,3-葡聚糖酶。
所述步骤中pH优选为6.5。
本发明从脱脂莜麦粉中分离得到了β-1,3-葡聚糖酶，分子量约为34kDa。
与现有技术相比本发明的有益效果：β-1,3-葡聚糖酶一般纯化过程大都通过盐析、再结合柱层析的方法进行分离，而本发明的优点在于与一般方法正好相反，不是将目标蛋白结合在不同柱材料上，而是使其不结合其上，大大降低了纯化难度，此分离方法对设备的要求低，节约了成本。获得了电泳纯的莜麦β-1,3-葡聚糖酶，可用于植物抗真菌、动物饲料添加剂、啤酒及制糖等应用领域。
附图说明
图1为蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1.β-1,3-葡聚糖酶粗提液；泳道2.20％-70％硫酸铵分级沉淀；泳道3.Q-Sepharose4B柱穿透的蛋白样品；泳道4.几丁质亲和柱Chitin-Sepharose4B穿透样品；泳道5.Sephacryl-200柱分离样品。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1
β-1,3-葡聚糖酶分离提取：取适量去壳后的莜麦种子，用高速粉碎机粉碎后，称取粉末80g，加入6倍体积的丙酮充分脱脂8h后于通风橱自然风干直至丙酮完全挥发得到莜麦蛋白粉。取莜麦蛋白粉71.2g，加入6倍体积100mM磷酸缓冲液(pH6.5)于4℃过夜抽提蛋白。抽提液于4℃高速冷冻离心机13000r/min离心30min后，收集上清进行硫酸铵分级沉淀操作，当加硫酸铵粉末使溶液饱和度至20％时，在4℃层析柜中静置2h，再以13000rmp/min离心30min，收集20％硫酸铵沉淀后的上清液。向其中继续加硫酸铵粉末至饱和度达到70％，4℃层析柜中静置2h，13000rmp/min离心30min，收集20％-70％硫酸铵沉淀样品。以5mM磷酸缓冲液(pH6.5)为透析平衡液，将20％-70％硫酸铵沉淀样品在4℃下透析直至无SO4 2-。将透析后的样品上样至用100mM磷酸缓冲液(pH为6.5)平衡的Q-Sepharose4B层析柱(购自GE公司)，收集穿透蛋白样品。再将穿透样品上样于用100mM磷酸缓冲液(pH为6.5)平衡的几丁质亲和柱Chitin-Sepharose4B(购自NewEnglandBiolabs公司)，收集穿透并浓缩后上样于100mM磷酸缓冲液(pH6.5)平衡好的Sephacryl-S-200凝胶层析柱(购自GE公司)，收集β-1,3-葡聚糖酶目标蛋白，进行SDS-PAGE分析和计算纯化效率(见图1，表1)
表1莜麦种子中β-1,3-葡聚糖酶提取总表
莜麦β-1,3-葡聚糖酶活性测定：在10mL的试管中加入950μL含有终浓度为0.1mg/mL的昆布多糖(购自Solarbio公司)的磷酸缓冲液(终浓度为20mM，pH6.5)，放置于37℃恒温水浴条件下保存10min，随后向其中加入50μL在各纯化阶段得到的β-1,3-葡聚糖酶样液，再次放置于37℃水浴条件下反应90min，该实验中选择缓冲液为空白对照。反应完毕后加入1mLDNS(3.5二硝基水杨酸)溶液并混合均匀，沸水浴显色反应进行10min，反应完毕迅速冷却，向试管中加入1mLH2O，将溶液稀释并定容至3mL，测量并记录β-1,3-葡聚糖酶实验组在分光光度计上540nm处对空白组的吸光度，并计算酶活力。酶活力单位在本实验中被定义为：37℃条件下，1h产生的葡萄糖所需的酶量。

Claims (2)

1.一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将莜麦蛋白粉用4-6倍体积的pH为6.4-6.6的100mM磷酸缓冲液溶解，4℃低温下抽提蛋白8-12小时，高速离心去除沉淀，保留上清即得到β-1,3-葡聚糖酶粗提液；
(2)β-1,3-葡聚糖酶粗提液经20％-70％硫酸铵分级沉淀；
(3)硫酸铵分级沉淀样品经透析除盐，上样于经pH为6.4-6.6的100mM磷酸缓冲液平衡的Q-Sepharose4B阴离子交换柱，收集穿透样品；
(4)Q-Sepharose4B阴离子交换柱穿透样品，上样于经pH为6.4-6.6的100mM磷酸缓冲液平衡的几丁质亲和纯化柱Chitin-Sepharose4B，收集穿透样品；
(5)几丁质亲和纯化柱穿透样品浓缩后上样于经pH为6.4-6.6的100mM磷酸缓冲液平衡的Sephacryl-200凝胶柱进行纯化，获得电泳纯的莜麦β-1,3-葡聚糖酶。
2.如权利要求1所述的一种从莜麦蛋白粉中提取β-1,3-葡聚糖酶的方法，其特征在于所述步骤中pH为6.5。
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