CN104387485A

CN104387485A - 一种复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法

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Publication number: CN104387485A
Application number: CN201410631892.5A
Authority: CN
Inventors: 王广慧
Original assignee: Suihua University
Current assignee: Suihua University
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2014-11-12
Publication date: 2015-03-04

Abstract

本发明公开了一种复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其步骤如下：一、向金针菇子实体干粉中加入缓冲液，再加入一定量的复合酶进行的酶解反应。二、酶解后，进行高压热水浸提。三、提取后进行离心，取上清液，浓缩，采用Sevage法除蛋白，离心，将上清液醇沉过夜，离心，所得沉淀用无水乙醇洗涤，将沉淀干燥得到金针菇多糖。本发明通过复合酶解和高压热水浸提相结合的方法提取金针菇中的多糖，提取率可达12.18%。本发明有效提高了原料利用率，且节约能源，工艺路线简捷，设备投入少，是一种金针菇综合加工利用的有效方法，易于生产和推广，是一种金针菇综合加工利用的有效方法。

Description

一种复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种金针菇多糖的提取方法，尤其涉及一种利用复合酶解协同高压热水浸提法从金针菇中快速、高效提取多糖的新工艺。

背景技术

金针菇（Flammulina velutiper (Fr.) Sing），学名毛柄金钱菌，属担子菌纲伞菌目白蘑科金钱菌属，是最常见的食用菌之一。其营养丰富，多糖为其主要有效成分。研究表明，金针菇多糖具有广泛的药理活性，可抑制肿瘤的发生、发展与转移，并能增强体液免疫和细胞免疫，具有抗逆转录病毒活性和降血脂、抗衰老、护肝等作用，且毒副作用很小。目前实验室多采用热水浸提法，或以超声波、微波及酶等辅助热水浸提。这些方法不仅浸提时间长，而且提取率普遍不高。而在目前企业所采用的金针菇多糖生产工艺中，多采用热水浸提法，能耗大，提取时间长，且提取率不高。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺点，提供一种复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，即提供一种可以部分取代现有生产工艺的简便易行、高效、快速、成本低并减少环境污染的新方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，包括以下步骤：

一、按照料液比为1:30~70g/mL的比例向金针菇子实体干粉中加入缓冲液，再加入一定量的复合酶进行的酶解反应，其中复合酶的添加量为金针菇子实体干粉质量的0.5~1.5%，反应时间为50~90 min，酶解温度为30~70℃，酶解pH值为3~7。

二、酶解后，进行高压热水浸提，控制浸提温度为75~121℃，浸提时间为40~120 min。

三、提取后进行离心，取上清液，浓缩，采用Sevage法除蛋白，离心，将上清液醇沉过夜，离心，所得沉淀用无水乙醇洗涤2~3次，将沉淀干燥得到金针菇多糖。

本发明中，所述金针菇子实体干粉，是经高速粉碎机粉碎后过60目筛得到的。

本发明中，所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

本发明中，所述料液比优选1:60g/mL。

本发明中，所述复合酶由比活力为10000U/g的纤维素酶和比活力为50000U/g的木瓜蛋白酶按1:1的质量比混合而成。

本发明中，所述复合酶的添加量优选为金针菇子实体干粉质量的1.25%。

本发明中，所述酶解反应时间优选80 min、酶解温度优选50℃、酶解pH值优选6。

本发明中，所述高压热水浸提温度优选108℃，浸提时间优选80 min。

本发明中，所述高压浸提后对离心的上清液所采取的浓缩方法可以是减压浓缩或在70℃水浴下蒸发浓缩到原体积的1/2。

本发明中，所述Sevage法除蛋白是采用氯仿-正丁醇混合溶液（体积比为4:1的混合液）按与样物提取液4:1(v:v)添加，充分振摇30 min后静置12 h。

本发明中，所述醇沉是将除蛋白后经离心得到的上清液与95%乙醇按1:3(v:v)混合，置4℃下沉淀12 h。

本发明中，所述离心都是以3500 r/min的转速离心15 min。

本发明具有如下优点：

1、由于复合酶解法提取具有效率高，产品质量好，反应条件更加温和等优点，而高压提取又可将被提取物的组织细胞及亚细胞结构解体，使细胞内的化学成分与溶媒充分接触得到直接溶解。本发明通过复合酶解和高压热水浸提相结合的方法提取金针菇中的多糖，提高了金针菇多糖的提取率。经本发明方法生产的金针菇多糖提取率可达12.18%。

2、本发明有效提高了原料利用率，且节约能源，工艺路线简捷，设备投入少，是一种金针菇综合加工利用的有效方法，易于生产和推广，是一种金针菇综合加工利用的有效方法。

附图说明

图1为苯酚-硫酸法的标准曲线；

图2为DNS法的标准曲线；

图3为不同方法提取金针菇多糖得率的比较。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，具体内容如下：

1、材料与方法

1.1试验材料

以金针菇为试材，购于绥化市华辰超市。药剂有苯酚、3,5-二硝基水杨酸（DNS）、无水乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸等，均为国产分析纯；木瓜蛋白酶和纤维素酶，购于武汉诺辉化工有限公司。试验仪器有752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；BL-50A型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司。

1.2测定方法及试验参数的确定

以葡萄糖为标准样，用DNS法测定还原糖含量，用苯酚-硫酸法测定总糖含量。

多糖量=总糖量-还原糖量

多糖提取率/%=多糖量/子实体干重 ×100%

1.3复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的操作方法

金针菇经除杂、干燥、粉碎等预处理后，得到金针菇子实体干粉。准确称取金针菇粉若干份，每份1 g。将每份金针菇粉按一定比例加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再加入一定量的复合酶（纤维素酶和木瓜蛋白酶按质量比1:1混合），酶解一段时间后进行高压热水浸提。提取后进行离心，上清液用70 ℃水浴浓缩到原体积的1/2，采用Sevage法除蛋白，3 500 r/min离心10 min，将上清液适当浓缩后与95%乙醇按1:3(v:v)混合，置4 ℃下醇沉12 h，3 500 r/min离心10 min，所得沉淀用无水乙醇洗涤2 ~ 3次，最后用60 ℃蒸馏水溶解沉淀并定容。采用DNS法测定还原糖含量、苯酚-硫酸法测定总糖含量，重复3次。

Sevage除蛋白法：采用氯仿-正丁醇混合溶液（体积比为4:1的混合液）按与样物提取液4:1 (v:v)添加，充分振摇30 min后静置12 h。

1.4复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的最佳工艺条件的确定

1.4.1单因素试验设计

（1）料液比对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉在加入样品量的1.25%复合酶，酶解温度50 ℃，酶解pH值为6，反应80 min，分别设置料液比为1:30、1:40、1:50、1:60、1:70（g/mL）的条件下提取多糖。然后改在108 ℃下高压热水浸提80 min。后面的处理方法如1.3所述。

（2）酶添加量对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液，分别在复合酶添加量为0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%，酶解温度50 ℃，酶解pH值为6的条件下反应80 min。然后改在108 ℃下高压热水浸提80 min。以后的处理方法如1.3所述。

（3）酶反应时间对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液, 添加最适酶量，在酶解温度50 ℃，酶解pH为6的条件下，调节复合酶反应时间，分别在50 min、60 min、70 min、80 min、90 min时提取多糖。然后改在108 ℃下高压热水浸提80 min。以后的处理方法如1.3所述。

（4）酶反应温度对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液，按最适添加量加入复合酶，在最适酶解时间，酶解pH为6的条件下，调节复合酶反应温度，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃时提取多糖。然后改在108 ℃下高压热水浸提80 min。后面的处理方法如1.3所述。

（5）酶反应pH对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液，按最适添加量加入复合酶，在最适酶解温度、最适酶解时间的条件下，调节复合酶反应pH，分别在3、4、5、6、7时提取多糖。然后改在108 ℃下高压热水浸提80 min。后面的处理方法如1.3所述。

（6）高压热水浸提时间对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液，按最适添加量加入复合酶，在最适酶解温度、最适酶解时间、最适酶反应pH的条件下进行酶解，然后分别于108℃下高压热水浸提40min、60min、80min、100min、120min。后面的处理方法如1.3所述。

（7）高压热水浸提温度对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液，按最适添加量加入复合酶，在最适酶解温度、最适酶解时间、最适酶反应pH的条件下进行酶解，然后分别于75℃、90℃、108℃、115℃、121℃下高压热水浸提80min。后面的处理方法如1.3所述。

1.4.2正交试验设计

在单因素试验的基础上选择对金针菇多糖提取率影响较大的因素和水平进行正交试验，以确定提取金针菇多糖的最佳工艺条件。

1.5不同方法提取金针菇多糖的对比研究

比较热水浸提法、微波辅助热水浸提法、复合酶法、高压热水浸提法和复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的研究。

高压热水浸提法的操作方法：将1 g金针菇粉按照料液比1:50加蒸馏水，然后在108 ℃下高压热水浸提80 min。过滤，滤液用70 ℃水浴浓缩到原体积的1/2，采用Sevage法脱蛋白，3 500 r/min离心10 min，将上清液适当浓缩后与95%乙醇按1:3(v∶v)混合，置4 ℃下醇沉12 h，3 500 r/min离心10 min，所得沉淀用无水乙醇洗涤2 ~ 3次，最后用60 ℃蒸馏水溶解沉淀并定容。

2、结果与分析

2.1测定方法及试验参数的确定

2.1.1苯酚硫酸法测总糖的标准曲线

根据试验获得的数据结果如图1，得到总糖测定的线性回归方程为：

y=0.0071 x－0.0049

R ²=0.9902

2.1.2DNS法测还原糖的标准曲线

根据试验获得的数据结果如图2，得到还原糖测定的线性回归方程为：

y=0.001x+0.0658

R²=0.9981

2.2复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的试验结果

2.2.1单因素试验结果

（1）料液比对金针菇多糖提取率的影响

试验设5个不同的料液比，分别为1:30，1:40，1:50，1:60，1:70，提取率分别为5.44%，8.35%，6.12%，，11.36%，8.56%。由此结果可知，金针菇多糖的最佳料液比为1:60。

（2）酶添加量对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按最佳料液比加缓冲液，分别设置5个不同的复合酶添加量，分别为0.5%，0.75%、1.0%、1.25%、1.5%，得到的提取率分别是4.32%，10.63%，11.56%，12.18%， 11.36%。由此结果可知，复合酶添加量为样品的1.25%时，多糖提取率最好。

（3）酶解时间对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按1:60料液比添加缓冲液，添加样品量1.25%的复合酶，在酶解温度50 ℃，酶解pH为6的条件下，设置5组不同的酶解反应时间，分别为50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，进行多糖提取。提取率分别为8.46%，9.37%，11.74%，12.18%，9.15%。由此结果可知，反应时间为80 min时，多糖提取率最好。

（4）酶解温度对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按1:60料液比添加缓冲液，添加样品量1.25%的复合酶，在酶解pH为6，酶解时间为80 min的条件下，设置5组不同的酶解温度，分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃。得到的提取率分别为9.63%，11.25%，12.18%，10.57%，7.41%。由此结果可知，金针菇多糖提取的最佳酶解温度为50℃。

（5）酶解pH对金针菇多糖提取率的影响

将每份金针菇粉按1:60料液比添加缓冲液，添加样品量1.25%的复合酶，在酶解时间为80 min，酶解温度为50 ℃时，设置5组不同的酶解pH，分别为3、4、5、6、7。得到的提取率分别为7.53%，9.86%，10.45%，12.18%，8.64%。由此结果可知，金针菇多糖提取的最佳酶解pH为6。

（6）高压热水浸提时间对金针菇多糖提取率的影响

当高压热水浸提时间分别设置为40min、60min、80min、100min、120min时，得到的金针菇多糖提取率分别为11.23%，11.74%，12.18%，11.83%，11.42%。可见最佳高压热水浸提时间为80min。

（7）高压热水浸提温度对金针菇多糖提取率的影响

当高压热水浸提温度分别设置为75℃、90℃、108℃、115℃、121℃时，得到的金针菇多糖提取率分别为11.54%，11.92%，12.18%，11. 63%，11.25%。可见最佳高压热水浸提温度为108℃。

2.2.2正交试验结果

在单因素试验的基础上选择对金针菇多糖提取率影响较大的因素和水平进行L₁₆(4⁵)正交试验，以确定复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的最佳工艺条件。试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表L₁₆(4⁵)

正交试验结果如表2：

表2 正交试验结果

序号	A	B	C	D	E	提取率（%）
							实验1	1	1	1	1	1	9.76
实验2	1	2	2	2	2	10.14
							实验3	1	3	3	3	3	11.75
实验4	1	4	4	4	4	10.64
							实验5	2	1	2	3	4	10.52
实验6	2	2	1	4	3	10.47
							实验7	2	3	4	1	2	10.42
实验8	2	4	3	2	1	10.86
							实验9	3	1	3	4	2	10.54
实验10	3	2	4	3	1	11.85
							实验11	3	3	1	2	4	11.48
实验12	3	4	2	1	3	10.26
							实验13	4	1	4	2	3	10.84
实验14	4	2	3	1	4	10.63
							实验15	4	3	2	4	1	10.34
实验16	4	4	1	3	2	11.86
							均值1	10.572	10.415	10.893	10.268	10.703
均值2	10.568	10.773	10.315	10.830	10.740
							均值3	11.033	10.998	10.945	11.495	10.830
均值4	10.918	10.905	10.938	10.497	10.818
							极差	0.465	0.583	0.630	1.227	0.127

由表2可知各因素对提取率的影响依次为D（酶解温度）> C（酶解时间）> B（酶添加量）> A（料液比）> E（酶解pH）。由此确定金针菇多糖提取率的最优条件为D₃C₃B₃A₃E₃，即：料液比为1:60（g/mL），酶添加量为1.25%，酶解时间为80min，酶解温度为50℃，酶解pH为6。在此条件下做验证实验，得到金针菇多糖提取率为12.18%。

2.3不同方法提取金针菇多糖的对比研究

用设计中的五种方法提取金针菇多糖，测定多糖提取率（图3），可见采用复合酶协同高压热水浸提法所获得的金针菇多糖提取率最高。

3、小结

本发明通过单因素实验和正交实验对复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的工艺进行了优化。金针菇细胞内成分复杂，除多糖外还含有其它的生物大分子物质，如蛋白质和纤维素等。这些物质的存在无疑会影响到多糖从细胞内的释放。由于酶促反应具有专一性、高效性、反应条件温和等优点，因此在本发明中加入由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶体系。两种酶的共同作用能够有效降解细胞中蛋白质、纤维素等杂质，使多糖更容易从细胞中释放，而高压提取又可将被提取物的组织细胞及亚细胞结构解体，使细胞内的化学成分与溶媒充分接触得到直接溶解。复合酶协同高压热水浸提法综合了两种提取技术的优点，所以提取效率较高。其最适提取条件为：料液比为1:60（g/mL），酶添加量为1.25%，酶解时间为80min，酶解温度为50℃，酶解pH为6。在此条件下金针菇多糖提取率为12.18%。

Claims

1.一种复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述方法步骤如下：

一、按照料液比为1:30~70g/mL的比例向金针菇子实体干粉中加入缓冲液，再加入一定量的复合酶进行的酶解反应，其中复合酶的添加量为金针菇子实体干粉质量的0.5~1.5%，反应时间为50~90 min，酶解温度为30~70℃，酶解pH值为3~7；

二、酶解后，进行高压热水浸提，控制浸提温度为75~121℃，浸提时间为40~120 min；

2.根据权利要求1所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

3.根据权利要求1所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述料液比为1:60g/mL。

4.根据权利要求1所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述复合酶由纤维素酶和木瓜蛋白酶按1:1的质量比混合而成。

5.根据权利要求1或4所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述复合酶的添加量为金针菇子实体干粉质量的1.25%。

6.根据权利要求1所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述酶解反应时间为80 min、酶解温度为50℃、酶解pH值为6。

7.根据权利要求1所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述高压热水浸提温度为108℃，浸提时间为80 min。

8.根据权利要求1所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述高压浸提后对离心的上清液所采取的浓缩方法是减压浓缩或在70℃水浴下蒸发浓缩到原体积的1/2。

9.根据权利要求1所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述Sevage法除蛋白是采用氯仿-正丁醇混合溶液按与样物提取液4:1体积比添加，充分振摇30 min后静置12 h。

10.根据权利要求1所述复合酶协同高压热水浸提法提取金针菇多糖的方法，其特征在于所述醇沉是将除蛋白后经离心得到的上清液与95%乙醇按1:3体积比混合，置4℃下沉淀12 h。